Summary
Hier is een eenvoudige, efficiënte en kosteneffectieve methode van sgRNA klonen geschetst.
Abstract
Het overzicht protocol worden gestroomlijnd methoden beschreven voor de efficiënte en kosteneffectieve generatie van Cas9-geassocieerde gids RNAs. Twee alternatieve strategieën voor het klonen van de RNA (gRNA) van de gids worden beschreven op basis van het gebruik van het Type IIS restrictie-enzym BsmBI in combinatie met een reeks van compatibele vectoren. Buiten de toegang tot Sanger sequencing diensten voor het valideren van de gegenereerde vectoren, zijn geen speciale apparatuur of de reagentia vereist afgezien van degenen die standaard aan moderne moleculaire biologie laboratoria. De geschetste methode is voornamelijk bedoeld voor het klonen van één enkele gRNA of een gekoppelde gRNA-uiten vector tegelijk. Deze procedure schaalt niet goed voor de generatie van bibliotheken met duizenden gRNAs. Voor deze doeleinden, worden alternatieve bronnen van oligonucleotide synthese zoals oligo-chip synthese aanbevolen. Tot slot, terwijl dit protocol is gericht op een aantal zoogdieren vectoren, de algemene strategie is van kunststof en is van toepassing op elk organisme als de passende gRNA vector beschikbaar is.
Introduction
CRISPR-geassocieerde proteïne 9 (Cas9) is een RNA-geleide endonuclease die is gericht op een gewenste genomic doelgroep wanneer complexvorm met een adequaat opgezet kleine gids RNA (gRNA)1,2. gRNAs bestaat uit een 20-nucleotide-volgorde (de protospacer), die complementair aan de genomic doel-reeks is. Naast de genomic doelstelling is volgorde een 3' protospacer-geassocieerde motief (PAM), die vereist voor de Cas9 binding is. In het geval van Streptococcus Pyogenes Cas9 (SpCas9), dit heeft de volgorde NGG. Op de bindende het doelwit van DNA, cleaves Cas9 beide strengen van DNA, waardoor het stimuleren van herstelmechanismes die kunnen worden benut om het wijzigen van de locus van belang. De activering van de vergissing-geneigd niet-homologe einde-toetreding (NHEJ) traject kan leiden tot de ontwrichting van een target-gen. Als alternatief, herstelde items via een homologe recombinatie kunnen stimuleren de gerichte integratie van een gewenste DNA-sequentie als een donor-sjabloon wordt geleverd met6. Nuclease-dode Cas9 (dCas9) varianten kunnen ook gegenereerde3 door het muteren van de residuen in Cas9 die essentieel voor de endonucleolytic activiteit zijn. dCas9 blijft bevoegd voor DNA-bindende maar haar afhankelijke doelstelling niet knippen. Door het versmelten van verschillende effector domeinen te dCas9 en het regisseren in de buurt van een genes transcriptionele start site, kan dCas9 worden gebruikt voor selectieve gene inductie of gedeeltelijke gene monddood maken van de4,5.
Terwijl het ongelooflijk krachtig, vereist de mogelijkheid om het gebruik van Cas9 te richten een genomic opeenvolging van belang dat een gebruiker eerst een gRNA die uniek zijn voor het doel site (s genereert). Een verscheidenheid van methoden voor het bouwen van gRNA expressievectoren eerder beschreven, veel van verschillende efficiëntie en kosten6,7,8. Zelfstandige PCR waarbij kan worden gebruikt als gRNAs voor snelle screening, gaande van oligonucleotide levering aan transfectie binnen enkele uren; Dit vereist echter Ultramer (meer dan 100 bp) oligo synthese, die duur9 is. Het is ook mogelijk voor de aankoop van gBlocks die goedkoper dan Ultramers zijn. Zoals Cas9 is snel uitgegroeid tot een integraal onderdeel van de moderne moleculaire biologie-toolkit, zou een eenvoudige, goedkope en zeer efficiënte methode voor het klonen van de gRNA een zegen voor het veld. De hier beschreven methode is werkzaam in onze fractie en de samenwerkende laboratoria voor de afgelopen jaren voor het genereren van meer dan 2.000 unieke gRNAs4.
De geschetste methode richt zich op technieken voor het klonen van lentivirale compatibel vectoren met een enkele gRNA of hooguit twee gRNAs. Voor de generatie van plasmiden, met meer dan twee gRNAs, of om een kloon van een bibliotheek van gRNAs, worden alternatieve benaderingen aanbevolen9,10,11,12.
Protocol
Opmerking: Het volgende protocol schetst het uitvoeren van gRNA design met behulp van online hulpmiddelen (stappen 1.1-1.4), die voor alle methoden van gRNA plasmide bouw gedetailleerde in dit manuscript gelden. Zodra de gewenste gRNAs worden geïdentificeerd, worden stappen voor het bestellen van de nodige oligonucleotides beschreven samen met verschillende methoden voor de invoering van de oligonucleotides in expressievectoren (bijvoorbeeld, pSB700). Gepresenteerd zijn 2 methodes voor het klonen van één gids-uiten vectoren gebaseerd op beide afbinding in een vereenvoudigd expressie vector (stappen 2-7.3) of Golden Gate klonen (stappen 8-8.4). Verder geschetst is een strategie voor klonen gepaarde gids-uiten vectoren met behulp van de polymerase-kettingreactie (PCR) gevolgd door Golden Gate klonen (stappen 11-16). Veelgebruikte methoden voor het uitvoeren van een chemische transformatie van E. coli (stappen 9-9.6) en een expressie vector reeks validatie (in stappen van 10 naar 10.2.3) zijn ten slotte ook beschreven.
- Ontwerp gRNA oligonucleotides met behulp van online tools als volgt.
- Ontwerp gRNAs met behulp van online hulpmiddelen zoals de sgRNA Scorer 2.0 online hulpmiddel (https://crispr.med.harvard.edu/sgRNAScorerV2/)13 of alternatieven zoals de brede sgRNA design tool (http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/ sgrna-ontwerp)14 en verscheidene anderen15.
- Gebruik de gene naam, symbool of ruwe doel opeenvolgingen van DNA te genereren van potentiële gRNA sequenties.
Opmerking: Een werkbladbestand (.csv/.xls) met alle mogelijke gRNAs tegen de gen of de verstrekte sequentie wordt gemaakt. De kwaliteit van de potentiële gRNAs zal worden gerapporteerd als Score als de online tool sgRNA Scorer 2.0 wordt gebruikt, of als op-procent efficiëntie als de brede sgRNA design tool wordt gebruikt. Beide maatregelen worden afgeleid op op basis van de activiteit op de doelsoort snijden. - Overwegen de Off-target activiteit in de gRNA selectie bij ranking van de gRNAs.
Opmerking: Optimale gidsen zijn degenen met de grootste op de doelsoort efficiency en de minst off-target activiteit. Voor activering (CRISPRa), zijn gRNAs ontworpen om te richten op de regio van 1-200 bp stroomopwaarts van de transcriptionele start site (TSS)4,15. Voor remming (CRISPRi), gRNAs zijn ontworpen om te richten op de regio van 50 bp stroomopwaarts van de TSS tot 300 bp stroomafwaarts van de TSS5. Als u wilt uitschakelen een gen met behulp van de Cas9 snijden, zijn gRNAs ontworpen om het richten van de eerste 10-50% van de codering volgorde stroomafwaarts van de initiatiefnemende codon (als gRNAs gericht op de 3'-eind van het gen is gebleken dat minder effectief)13. - Zorgen geen interne BsmBI sites zijn aanwezig als oligonucleotides worden gebruikt voor het Golden Gate klonen, aangezien dit in het ontharde oligonucleotides resulteren zal13wordt verteerd.
- De genomische doel-sequenties te selecteren en verwijderen de 3' NGG PAM (verlaten alleen de volgorde van de protospacer) voor de enkele gRNA oligonucleotide reeks wijziging (bijvoorbeeldbeginnend volgorde: CGCGTGCTCTCCCTCATCCATGG).
Opmerking: Als een werkblad gebruikt, is de volgende formule verwijdert 3' NGG: =LEFT(A2,LEN(A2)-3), waar de A2 de cel is met de volgorde van de doelgroep en de PAM.- CACCG aan het einde 5' van de oligo toevoegen.
Opmerking: Op afbinding met de pSB700-backbone, deze reeks bestaat uit de 3'-eind van de promotor van de U6 rijden de transcriptie van de gRNA. De volgorde van de "CACC" zorgt ervoor dat de oligo verenigbaar met het overhangen van de BsmBI-verteerd pSB700 vector is. De "G" is een eis van Polymerase III initiatiefnemers en zorgt voor de efficiënte inleiding van de transcriptie van de gRNA. Gebruik de volgende formule in een werkblad voor het uitvoeren van deze taak: =CONCATENATE("CACCG",(B2)), waar B2 de cel is met de protospacer reeks [bijvoorbeeldhet toevoegen van de 5' CACCG volgorde aan de protospacer: CACCGCGCGTGCTCTCCCTCATCCA (dit is de laatste voorwaartse oligo die is besteld)]. - Maak een omgekeerde aanvulling (rc) van de protospacer-reeks.
Opmerking: het omgekeerde complement van de bovengenoemde protospacer is bijvoorbeeld TGGATGAGGGAGAGCACGCG. - Voeg AAAC aan het einde 5' van de rc protospacer. Voeg een extra C aan het einde 3' van de rc protospacer (omgekeerde oligo).
Opmerking: De volgorde van de "AAAC" zorgt ervoor dat de oligo compatibel voor het klonen in de BsmBI-verteerd pSB700 vector. De extra "C" aan de 3'-kant is nodig om de volgorde aan de initiatiefnemende "G" toegevoegd aan de voorwaartse oligo anneal. Gebruik de volgende formule in een werkblad voor het uitvoeren van deze taak =CONCATENATE("AAAC",(C2),"C"), waar de C2 is de cel met de omgekeerde aanvulling volgorde [bv, AAACTGGATGAGGGAGAGCACGCGC (dit is de laatste omgekeerde oligo thats besteld)].
- CACCG aan het einde 5' van de oligo toevoegen.
- Bestel de oligonucleotides, zonder aanvullende wijzigingen op de oligonucleotides.
- De volgorde van de minimale hoeveelheid oligo vereist, zoals slechts zeer kleine hoeveelheden nodig zijn om de klonen reacties.
- Verdun gelyofiliseerd inleidingen om een eindconcentratie van 100 μM in 1 x TE buffer (10 mM Tris-Cl, pH 7.5 met 1 mM EDTA).
- Aliquot 1:1 voorwaartse en omgekeerde oligonucleotides (bijv, 10 μL elke) in PCR strip-cap buizen.
Opmerking: Hierdoor kan de snelle klonen van veel gRNAs in een tijd met behulp van een meerkanaalspipet.- Vortex en spin down de oligo mengsels (100 x g voor 15 s). Incubeer de reactie bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten vóór de oprichting van de afbinding.
Opmerking: Het is niet nodig om te verwarmen en vervolgens koelen de oligo mengsels om hun gloeien. Het is vermeldenswaard dat 3-4 paren van gRNA oligonucleotides kunnen worden gebundeld en gegloeid in een enkele reactie (b.v., mix 3 μL van vooruit en 3 μL van omgekeerde oligonucleotides samen van maximaal 4 gRNA oligo paren, geven een totaal volume van 24 μL). Het volume van de oligonucleotides gebruikt voor het gloeien kan worden aangepast om te voldoen aan de behoeften van een gebruiker.
Opmerking: De stappen 6-7.3 beschrijven de predigestion van pSB700. Voor een alternatieve methode, zie stap 8, waarin een-voor-stapmodus afbinding voor de beperking van de BsmBI.
- Vortex en spin down de oligo mengsels (100 x g voor 15 s). Incubeer de reactie bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten vóór de oprichting van de afbinding.
- Het verteren van 1-5 μg van de geselecteerde pSB700 gids expressie vector met BsmBI (0,5 μL per 1 μg) gedurende 1 uur bij 55 ° C15. Het gedrag van de vertering van de pSB700 gRNA expressie vector in een totaal volume van 40 μL (tabel 1).
- De spijsvertering-producten worden uitgevoerd op 1,5% (wt/vol) laag-smelten agarose gel.
- Knip de verteerd vector ruggengraat band die correspondeert met een fragment van ~ 9 kb in grootte en plaats van het gel-segment in een tube microcentrifuge 1,5 mL (Figuur 1).
- Gebruik een commerciële gel zuivering kit te uittreksel van het DNA van het agarose gel volgens de instructies van de fabrikant.
- Elueer de DNA in 10-15 μL van TE buffer (10 mM Tris, pH 7.5, 10 mM Tris, pH 8,0) te verkrijgen van een geconcentreerde eluaat.
- Het afbinden van de ontharde gRNA oligonucleotides uit stap 4 in de pSB700 BsmBI-verteerd gids expressie vector in een 20 μL reactie (tabel 2) voor het klonen van de gRNA oligonucleotides in de vooraf verteerd pSB700 expressie vector.
- Ten eerste, toevoegen van water, buffer, en DNA, dan vortex het mengsel en Voeg enzym, vortex 1 laatste keer na toevoeging van het enzym en spin down de oplossing (100 x g voor 15 s). Incubeer de reacties bij kamertemperatuur 's nachts.
- Omvatten de reactie van een neen-invoegen negatieve controle die een BsmBI-verteerd vector alleen, zonder een ontharde gRNA oligo invoegen heeft. 1 μL van water kan worden gebruikt in plaats van de 1 μL van gRNA oligonucleotides voor de negatieve controle van neen-invoegen.
- Ga naar de transformatie (stap 9).
Opmerking: Stap 8 is een alternatieve methode om de predigestion van pSB700 zoals beschreven in stappen 6-7.3.
- GRNA oligonucleotides (beschreven in stappen 1-5.1) in de vector pSB700 door het gebruik van de Golden Gate klonen voor de-voor-stapmodus BsmBI beperking afbinding introduceren.
- Monteren van de master mix (1 x) — als meerdere gRNAs zijn worden gekloond, bereiden de master mix zonder de invoegen oligonucleotides toegevoegd (tabel 3). Aliquot de meester Meng in PCR buizen en een meerkanaalspipet met de gRNA oligonucleotides vanaf stap 4.2 toevoegen. Een besturingselement van de neen-invoegen met behulp van 1 μL van water opnemen.
- Door het BsmBI enzym en T4 DNA ligase binnen dezelfde reactie, gelijktijdige beperkingsspijsvertering en Afbinding worden bereikt (d.w.z., Golden Gate klonen). De volgende eenvoudige Gate-protocol gebruiken om te verteren de vector en het afbinden van de inserts in 1 reactie: houden van de reactie bij 37 ° C gedurende 2 uur, bij 50 ° C gedurende 10 minuten, bij 65 ° C gedurende 15 minuten, bij 80 ° C gedurende 15 minuten, en ten slotte , houd het bij 4 ° C.
- Van de nota, controleert u of de oligonucleotides bevatten geen BsmBI sites voordat u deze methode gebruikt. Als de gRNAs die zijn wordt gekloond BsmBI beperkingsplaatsen bevatten, zal ze op de toevoeging van BsmBI worden verteerd. Dit zal verhinderen dat de gebruiker transformants verkrijgen.
- Na de eerste reactie van de eenvoudige poort, een aanvullende 0,5 μL van BsmBI enzym aan elke reactie toevoegen en plaats ze terug bij 55 ° C gedurende 1 uur. Na de vertering, houd van de reactie bij 4 ° C of bevriezen tot klaar om te transformeren. Deze tweede ronde van restrictie-enzym incubatie verwijdert onverteerd of religated wild-type pSB700 vector ruggengraat uit het reactiemengsel zodat alleen vectoren die hebben ontvangen de oligo-inserts intact blijven en transformants zal opleveren.
- Ga naar de transformatie (stap 9).
- 0,5 μL van het reactiemengsel omvormen 8 μL van bevoegde E. coli [bijvoorbeeldNEB DH5a (1-3 x 109 cfu/µg pUC19 DNA) of NEB stabiele 1 - 3 x 109 cfu/µg pUC19 DNA). Voor lentivirale plasmiden geven stabiele NEB cellen meer consistente rendementen van de plasmide.
- E. coli verwijderen uit opslag bij-80 ° C en het ontdooien op ijs voor 5-10 min.
- Voeg toe 0,5 μL van de reactie mix aan 8 μL van bevoegde E. coli en houd het mengsel op het ijs gedurende 30 minuten.
- Warmte schok het mengsel bij 42 ° C gedurende 45 s.
- Houd het ijs gedurende 2 minuten.
- Herstellen van de cultuur op een rondschudapparaat in 250 μL van SOC media gedurende 1 uur bij 37 ° C gedurende NEB DH5a en bij 30 ° C gedurende NEB stallen.
- Plaat 80 μL van de cultuur op een passende antibiotica-resistentie lysogenie Bouillon (LB) plaat en het na een nacht bebroeden bij 37 ° C gedurende NEB DH5a en bij 30 ° C gedurende NEB stallen [bijvoorbeeldpSB700 is verzinkt op de LB met ampicilline (100 μg/mL) platen] (Figuur 3).
- De volgorde van gRNA expressie plasmide valideren: Controleer of de volgorde van elke kolonie door Sanger sequencing met behulp van de primer 5'-GAGGGCCTATTTCCCATGATTCC-3' welke priemgetallen op de U6 promotor stroomopwaarts van de gRNA-oligo invoegen.
- Kies 2-3 kolonies per reactie voor sequencing (tabel 4).
Opmerking: Diverse sequencing providers nu aanbod die diensten kunnen uitvoeren Sanger sequencing rechtstreeks vanuit bacteriële kolonies, die sterk vermindert de tijd en kosten door het elimineren van de noodzaak om te zuiveren van de plasmiden voorafgaand aan het rangschikken. Een plasmide isolatie kit kan ook, worden gebruikt om te herstellen van de plasmide-DNA van de individuele bacteriële klonen. Gezuiverde plasmiden kunnen vervolgens worden voorgelegd voor het rangschikken. Als de reactie van een gegroepeerde Afbinding wordt uitgevoerd, gebruikt u tabel 4 als een gids voor het aantal kolonies die moeten worden geselecteerd en ingediend voor het rangschikken. - Na de bevestiging van de reeks, de gRNA expressie plasmiden te isoleren.
- Gebruik een steriele Pipetteer tip om te enten van de gewenste kolonie in een cultuur van 5 mL van LB medium waarin 100 μg/mL ampicilline voor pSB700 expressievectoren.
- Het groeien van cellen in een roterende incubator op 100 rpm bij 37 ° C's nachts (30 ° C als NEB stallen worden gebruikt).
- Isoleren van de plasmide DNA uit de culturen die met behulp van een plasmide prep kit, volgens protocol van de fabrikant.
Opmerking: Hoewel de bovenstaande methoden gebruikers maken één gRNA-bevattende vectoren laten, dit protocol kunnen gebruikers maken van vectoren die 2 gRNAs, elk aangedreven door hun eigen RNA polymerase III promotor bevatten.
- Kies 2-3 kolonies per reactie voor sequencing (tabel 4).
- Voor een gekoppelde gRNA-design, gebruik van de output file van de sgRNA-ontwerpgereedschappen bovengenoemde (stappen 1.1-1.4) en selecteer 2 gidsen van belang.
- Selecteer voor een activering of onderdrukking, paren van gidsen die ten minste 30 nt uit elkaar.
- Voor gRNAs gebruikt voor het snijden, selecteert u hulplijnen die gericht zijn op 2 verschillende exons binnen het gen.
- De onderstaande instructies, wijst de eerste gRNA in de matrix gRNA-A en de tweede gRNA in de matrix gRNA-B, bij het maken van een gekoppelde gRNA oligonucleotide reeks wijziging.
Opmerking: De oligo gebruikt voor het maken van gRNA-A zal worden genoemd fA, en het omgekeerde oligo gebruikt om de gRNA-B zal worden verwezen als rB. De klonen methode hieronder voegt automatisch een initiërende G aan het eind 5' van elk van de gRNAs.- Maak de juiste VA-oligo als volgt.
Opmerking: De 20 nucleotiden, bestaande uit de gRNA dat targeting op volgorde voor gRNA-A zal vormen de volgorde van de eerste VA-waarop de volgende stappen (bijvoorbeeldprotospacer - aggggctacaccactcattg) zal bouwen.- Voeg TTTTCGTCTCTCACCG aan het einde 5' voor fA (bijvoorbeeldvan de reeks TTTTCGTCTCTCACCGaggggctacaccactcattg).
- Voeg GTTTTAGAGCTATGCTGAAAAGCA aan het einde 3' voor fA (bijvoorbeeldvan de reeks TTTTCGTCTCTCACCGaggggctacaccactcattgGTTTTAGAGCTATGCTGAAAAGCA). Dit is de definitieve versie van de VA-oligo, die zal worden besteld.
- Maak de nodige rB oligo als volgt.
Opmerking: De 20 nucleotiden, bestaande uit de gRNA gericht op volgorde voor de gRNA-B zal de eerste rB volgorde waarop de volgende stappen (bijvoorbeeldvoor de startende volgorde gtcccctccaccccacagtg) zal bouwen.- Neem het omgekeerde complement van rB (revcom) = rB (bijvoorbeeld, cactgtggggtggaggggac).
- Toevoegen van TTTTCGTCTCTAAAC aan het einde 5' van (revcom) rB (bv., TTTTCGTCTCTAAACcactgtggggtggaggggac).
- Toevoegen van CGGTGACCCAGGCGGCGCACAAG aan de 3'-eind van (revcom) rB (bvTTTTCGTCTCTAAACcactgtggggtggaggggacCGGTGACCCAGGCGGCGCACAAG). Dit is de definitieve versie van de rB oligo, die zal worden besteld.
Opmerking: de volgende formules kunnen worden gebruikt met algemene spreadsheetsoftware automatisch bewerken de oligo-reeksen: = CONCATENATE("TTTTCGTCTCTCACCG",(A2), "GTTTTAGAGCTATGCTGAAAAGCA"), waar de cel met de VA-reeks en inhoud is van A2 = CONCATENATE("TTTTCGTCTCTAAAC",(B2),"CGGTGACCCAGGCGGCGCACAAG"), waar B2 is de cel met de volgorde van de rB (revcom).
- Maak de juiste VA-oligo als volgt.
- De oligonucleotides bestellen bij een leverancier van de synthese van keuze. Er zijn geen extra wijzigingen vereist.
- Gebruik het bereid plasmide DNA PCR uitvoeren met zowel fA en rB inleidingen. Dit zal zowel de voorwaartse hechten en de omgekeerde gRNAs aan het PCR fragment gegenereerd op basis van deze plasmide en zal toestaan dat elk van zijn eigen promotor worden uitgedrukt (U6 en 7SK initiatiefnemers — verschillende initiatiefnemers worden gebruikt in dit ontwerp om te voorkomen dat virale recombinatie).
- Phusion GC speciale PCR Protocol gebruiken om de benodigde fragment maakt: Houd het mengsel bij 98 ° C gedurende 1 minuut (1 cyclus), bij 98 ° C gedurende 15 s, bij 53 ° C gedurende 15 s, bij 65 ° C gedurende 2 minuten, en bij 72 ° C gedurende 4 minuten (30 cycli) , en houdt het bij 4 ° C (tabel 5).
- Uitvoeren van het PCR-product op een 1% agarose gel en controleer of die 1 band is te zien op ~ 490 bp (Figuur 2).
- Knippen en haal deze PCR-product met behulp van een gel extractie kit van keuze. Elueer de DNA in 15 μL van TE buffer (10 mM Tris, pH 7.5, 10 mM Tris, pH 8,0) of gedestilleerd water.
- De concentratie van het uitgepakte product samen met dat van de vector pSB700 meten met een spectrofotometer voor de berekening van de molarity DNA. Normaliseren van het PCR-product zowel de vector tot een concentratie van 40 femtomoles/μL.
Opmerking: Meerdere websites zijn beschikbaar om te helpen bij de berekening van de molarity van een bepaald DNA-oplossing op basis van de lengte van het DNA en de concentratie in de oplossing (bijvPromega: http://www.promega.com/a/apps/biomath/index.html?calc=ugpmols). De rekenmachine gebruikt de formule:
N is hier, de lengte van de nucleotide sequentie.
- Een gelijktijdige beperking spijsvertering en Afbinding reactie via het protocol beschreven in stappen 8-8.4 aan kloon van het PCR fragment in de vector van een pSB700 instellen.
- In plaats van 1 μL van primer oplossing aan de reactie toe te voegen, voeg 1 μL van 40 fmole/μl van het PCR-product. Daarnaast gebruiken 1 μL van de vector pSB700 bij een concentratie van 40 fmole/μL.
Opmerking: Gelijke molaire verhoudingen tot consistente resultaten leiden, hoewel zelfs in gevallen waarin exacte verhoudingen niet worden gebruikt, kunnen de kolonies worden verkregen.
- In plaats van 1 μL van primer oplossing aan de reactie toe te voegen, voeg 1 μL van 40 fmole/μl van het PCR-product. Daarnaast gebruiken 1 μL van de vector pSB700 bij een concentratie van 40 fmole/μL.
- Na het voltooien van de Golden Gate reactie proces (stappen 8-8.4), gaat u verder met de transformatie en volgorde verificatie (stap 9 - 10.2.3).
Representative Results
De methoden die worden beschreven in dit protocol zijn voor de totstandbrenging van ofwel expressievectoren van enkele of gekoppelde gRNA. Enkele gRNA uiten van vectoren kan worden gemaakt door beide predigesting van de vector ruggengraat (Figuur 1) gevolgd door het ligating in een reeks van korte oligonucleotides of met behulp van de Golden Gate klonen om gelijktijdig verteren de ruggengraat van de vector en afbinden in een reeks korte oligonucleotides in een enkele reactie. Ook geboden is een methode voor het produceren van vectoren die bevatten 2 gRNAs, elk aangedreven door een eigen onafhankelijke promotor, door middel van klonen een aangepaste PCR fragment (Figuur 2).
Een succesvol klonen voor de beschreven protocollen zal resulteren in de verschijning van aanzienlijk meer koloniën voor transformaties met de juiste invoegen DNA dan op de neen-invoegen controle plaat (Figuur 3).
Figuur 1: de spijsvertering van een pSB700 gRNA expressie vector. 1% agarose gel wordt gebruikt. Lane 1: Onbesneden pSB700. Lane 2: pSB700 gesneden met BsmBI.
Figuur 2: gekoppeld gRNA PCR. 1% agarose gel wordt gebruikt. Lane 1: een gepaarde gids PCR fragment van ~ 490 bp.
Figuur 3: het succesvol klonen en de transformatie van een plasmide gRNA. Het linker paneel toont een LB en ampicilline plaat met succes getransformeerd kolonies. Het rechterpaneel bevat een neen-invoegen controle plaat tonen geen koloniën. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| pSB700 gids expressie vector | 1-5 μg |
| NEB Buffer 3.1 | 4 ΜL |
| BsmBI | 1 ΜL |
| Gedestilleerd water | maximaal 40 μL |
| Totaal volume | 40 ΜL |
Tabel 1: De beperkingsspijsvertering van een pSB700 gRNA expressie vector met BsmBI.
| Gegloeide gRNA oligos (enkele of gegroepeerde reactie) | 1 ΜL |
| PSB700 BsmBI-verteerd gids expressie vector | 1 μL (~ 100-250 ng) |
| 10 x T4 DNA Ligase reactie Buffer | 2 μL (1 x eindconcentratie) |
| T4 DNA Ligase | 1 μL (120 eenheden) |
| Gedestilleerd water | 15 ΜL |
| Totaal volume | 20 μl |
Tabel 2: Een afbinding reactie van gRNA oligonucleotides in een vereenvoudigd pSB700 vector voor de expressie van de gRNA.
| Reagens | Volume (1 x) |
| H2O | 6 ΜL |
| T4 Ligase | 0,5 ΜL |
| ATP | 1 ΜL |
| BsmBI | 0,5 ΜL |
| NEB Buffer 3.1 | 1 ΜL |
| Vector (bijvoorbeeld, pSB700) (40 fmol) | 1 μlL |
| Invoegen - vooruit en achteruit oligos of PCR fragment voor dual guide (40fmol) | 1 μL (0,5 μL vooruit en 0,5 μL omgekeerde) |
Tabel 3: Een-voor-stapmodus BsmBI beperking en gRNA afbinding reactie mix.
| Voor 1 gids | reeks 3 kolonies |
| Voor 2 gidsen | volgnummer 5-10 kolonies |
| Voor 3 gidsen | volgorde van 10-15 kolonies |
| Voor 4 gidsen | volgorde van 15-20 kolonies |
Tabel 4: Het aanbevolen aantal kolonies in reeks voor gebundelde gRNA klonen van reacties.
| PCR Component | 50 µL reactie |
| 10 µM voorwaartse Primer | 2.5 ΜL |
| 10 µM omgekeerde Primer | 2.5 ΜL |
| 5 x Phusion HF of GC Buffer | 10 ΜL |
| 10 mM dNTPs | 1 ΜL |
| Sjabloon DNA | 100 ng |
| Phusion Polymerase van DNA | 0,5 ΜL |
| Nuclease-gratis water | Maximaal 50 µL |
Tabel 5: Een gekoppelde gRNA PCR mengsel.
Discussion
De gRNA expressie vector bouw een aantal tijd - en kostenbesparende wijzigingen doorgevoerd. Een-voor-stapmodus beperking en Afbinding protocol wordt geschetst en een methode voor het gekoppelde gRNA expressie vector bouw. De gekoppelde gRNA uitdrukking wordt bereikt door middel van een PCR versterking met behulp van oligonucleotides met zowel een voorwaartse gRNA doel reeks (n20) en het omgekeerde complement van een ander doel (n20). Dit introduceert dan een secundaire RNA Pol III promotor (7SK) en een sgRNA staart in conventioneel uiten van enkele gRNA expressie plasmiden.
Een zorgvuldige oligonucleotide ontwerp zorgt voor succesvolle PCR voor de bouw van de gekoppelde gRNA evenals een kleverige-end afbinding. Na de-voor-stapmodus beperking en Afbinding reactie, de toevoeging van verdere BsmBI zal zorgen voor dat alle ongewijzigde expressievectoren in de reactie worden gesneden. Dit zal aanzienlijk verminderen de achtergrond bij de transformatie. Het gebruik van NEB-Stable bevoegde E. coli en een groei bij 30 ° C zal het verhogen van het rendement van een succesvolle transformatie.
De voordelen die deze techniek ten opzichte van gemeenschappelijke praktijken heeft omvatten een vereenvoudiging van het proces van oligonucleotide gloeien, een-voor-stapmodus beperking van de gRNA expressie vector en de afbinding van oligonucleotides, en de mogelijkheid om het gebruik maken van conventionele enkele gRNA expressievectoren voor de expressie van gepaarde gidsen. Terwijl het protocol hier richt zich op een reeks van vectoren van de zoogdieren beschreven, de algemene strategie is van kunststof en is van toepassing op elk organisme, mits de juiste gRNA vector beschikbaar is. Globaal, is het protocol beschreven bespaart tijd en kosten.
Echter, opgemerkt moet worden dat de geschetste procedure van de aankoop van afzonderlijke oligonucleotides niet schaalt goed voor de generatie van bibliotheken met duizenden gRNAs. Voor deze doeleinden, worden alternatieve bronnen van oligonucleotide synthese zoals oligo chip synthese aanbevolen.
Het is gunstig voor het opnemen van een besturingselement neen-invoegen bij het klonen van gRNAs. Deze reactie kan eenvoudig worden ingesteld in parallel met de reacties van belang en kan worden gebruikt om te bepalen of er een onvolledige spijsvertering van de startende vector heeft bijgedragen aan de kolonies waargenomen bij het einde van de procedure. Bovendien, als een van de bovenstaande klonen protocollen is mislukt als gevolg van een onvolledig verteerd vector ruggengraat of slechte afbinding efficiëntie, raden we proberen de alternatieve methode die we hebben geschetst klonen.
Bij het gebruik van Golden Gate klonen om gelijktijdig de vector verteren en afbinden in de kleine oligonucleotides binnen een enkele reactie, is het belangrijk om te controleren dat de gRNA die zijn wordt gekloond in de vector niet over een BsmBI site binnenkant van het beschikt, omdat dit tot t leiden zal Hij gRNA ingekrompen en een gebrek aan kolonies op transformatie.
De gRNA strategie die we hebben geschetst klonen maakt een snelle en kostenefficiënte generatie gRNAs op ~ 10 US dollars per gids, met het grootste deel van de kosten uit de oligonucleotide synthese en de verificatie van de reeks. Hoewel de beschreven methode is ontworpen voor gebruikers voor het genereren van gRNAs voor gebruik met SpCas9, het protocol kan gemakkelijk worden aangepast voor gebruik met Cas9 orthologues of andere enzym RNA-geleide zoals Cpf1 of C2C2, met kleine aanpassingen aan de ruggengraat van de vector en de overstek van oligonucleotide sequenties16,17.
Het bovenstaande protocol zorgt voor reeks-gecontroleerd gRNA expressie plasmiden in 3 d (beginnend met adequaat opgezet oligonucleotides), die is aanzienlijk sneller dan de huidige methoden. Dit omvat het ontwerp van de gRNA van 1 h (stappen 1-2.3), de verdunnings- en hoeveelheid van de oligonucleotides voor 10 min (stappen 3-5.1), de vertering en de zuivering van de pSB700 gRNA expressie vector van 2 h (stappen 6-6.4), het klonen van de oligonucleotides gRNA in een predi gested pSB700 gRNA expressie vector overnachting op kamertemperatuur (stappen 7-7.3), de-voor-stapmodus BsmBI beperking Afbinding van 3 h en 40 min (stappen 8-8.4), de transformatie van 16 h (stappen 9-9.6) en de validatie van de volgorde van de gRNA expressie plasmide van 24 h (met de duur afhankelijk van de beschikbaarheid van de sequencing sanger en de snelheid na de indiening van de bacteriële kolonie; stap 10). Het gekoppelde gRNA ontwerp en de wijziging van de volgorde neemt 1 h (stappen 11-13). De gekoppelde gRNA PCR duurt 3,5 h (in stappen van 14-14.4). Het klonen van het PCR fragment in de vector van een pSB700 duurt 3h en 40 min (stap 15-16).
De meest waarschijnlijke kwesties die kunnen worden geconfronteerd met dit protocol betrekking hebben op inefficiëntie in de Golden Gate vergadering en transformatie. Een neen-invoegen besturingselement opnemen tijdens de vergadering van de Golden Gate te visualiseren van de efficiëntie van de vergadering. Tijdens de transformatie, zal de positieve controle van de puc19 bepalen een transformatie efficiëntie. NEB-Stable E. coli moet worden gebruikt voor lentivirale compatibel plasmiden en vereisen vaak tot > 16 h bij 30 ° C tot zichtbare kolonies opleveren.
Disclosures
George M. Church heeft aandelen in Editas en kariboes biowetenschappen, die gericht zijn op het commercialiseren van CRISPR-Cas9 genoom technologie bewerken (voor een volledige openbaarmaking lijst, zie http://arep.med.harvard.edu/gmc/tech.html).
Acknowledgments
Sathiji Nageshwaran wordt ondersteund door de Alliantie voor energieonderzoek van de Friedrich van ataxie (07340305 - 01) en nationale ataxie Stichting Fellowships (7355538-01). Alejandro Chavez werd gefinancierd door het National Cancer Institute subsidie 5T32CA009216-34 en de Burroughs-Wellcome Fonds Career Award voor medische wetenschappers. George M. Church wordt ondersteund door de Amerikaanse National Institutes of Health (NIH) subsidie van de National Human Genome Research Institute RM1 HG008525 en het Wyss Instituut voor biologisch geïnspireerde Engineering. James J. Collins erkent steun van de Defense bedreiging vermindering Agency-subsidie HDTRA1-14-1-0006 en de Paul G. Allen grenzen groep. Alejandro Chavez ontwikkeld de dual-gids klonen methode. Sathiji Nageshwaran, Alejandro Chavez en Nan Cher Yeo schreef het manuscript met input van alle auteurs.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BsmBI | New England Biolabs | R0580L | |
| T4 DNA ligase | Enzymatic/New England Biolabs | L6030-LC-L/M0202S | |
| Buffer 3.1 | New England Biolabs | B7203S | |
| Adenosine 5'-Triphosphate (ATP) | New England Biolabs | P0756S | |
| QIAprep spin miniprep kit | Qiagen | 27104 | |
| Chemically competent E. coli | New England Biolabs | C3019l, C2987l, or C3040H | |
| Standard microcentrifuge tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 0030 125.150 | |
| Axygen 8-Strip PCR tubes | Fischer Scientific | 14-222-250 | |
| Thermocycler with programmable temperature-stepping control | BioRad, | 1851148 | |
| UV spectrophotometer (NanoDrop 2000c) | Thermo Scientific | ||
| pSB700 plasmid | Addgene | #64046 | |
| NEB Stable Competent E. coli (High Efficiency) | New England Biolabs | c3040 | |
| Lysogeny broth (LB) | |||
| Ampicillin | |||
| TE buffer (1 mM EDTA, 10 mM Tris-Cl, pH 7.5) | |||
| pSN007 plasmid | Addgene | 102440 |
References
- Gasiunas, G., Barrangou, R., Horvath, P., Siksnys, V. Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (39), E2579-E2586 (2012).
- Jinek, M., Chylinski, K., Fonfara, I., Hauer, M., Doudna, J., Charpentier, E. A Programmable Dual-RNA-Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Shalem, O., Sanjana, N., Zhang, F. High-throughput functional genomics using CRISPR-Cas9. Nature Reviews Genetics. 16 (5), 299-311 (2015).
- Chavez, A., et al. Highly efficient Cas9-mediated transcriptional programming. Nature Methods. 12 (4), 326-328 (2015).
- Gilbert, L., et al. CRISPR-Mediated Modular RNA-Guided Regulation of Transcription in Eukaryotes. Cell. 154 (2), 442-451 (2013).
- Yang, L., Yang, J., Byrne, S., Pan, J., Church, G. CRISPR/Cas9-Directed Genome Editing of Cultured Cells. Current Protocols in Molecular Biology. , 31.1.1-31.1.17 (2014).
- Yang, L., Mali, P., Kim-Kiselak, C., Church, G. CRISPR-Cas-Mediated Targeted Genome Editing in Human Cells. Methods in Molecular Biology. 1114, 245-267 (2014).
- Vidigal, J., Ventura, A. Rapid and efficient one-step generation of paired gRNA CRISPR-Cas9 libraries. Nature Communications. 6, 8083 (2015).
- Joung, J., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening. Nature Protocols. 12 (4), 828-863 (2017).
- Kabadi, A., Ousterout, D., Hilton, I., Gersbach, C. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome engineering from a single lentiviral vector. Nucleic Acids Research. 42 (19), e147 (2014).
- Sakuma, T., Nishikawa, A., Kume, S., Chayama, K., Yamamoto, T. Multiplex genome engineering in human cells using all-in-one CRISPR/Cas9 vector system. Scientific Reports. 4 (1), (2014).
- Chari, R., Yeo, N., Chavez, A., Church, G. sgRNA Scorer 2.0: A Species-Independent Model To Predict CRISPR/Cas9 Activity. ACS Synthetic Biology. 6 (5), 902-904 (2017).
- Doench, J., et al. Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation. Nature Biotechnology. 32 (12), 1262-1267 (2014).
- Konermann, S., et al. Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex. Nature. 517 (7536), 583-588 (2014).
- The CRISPR Software Matchmaker: A New Tool for Choosing the Best CRISPR Software for Your Needs. , Available from: http://blog.addgene.org/the-crispr-software-matchmaker-a-new-tool-for-choosing-the-best-crispr-software-for-your-needs (2015).
- Engler, C., Marillonnet, S. Golden Gate Cloning. DNA Cloning and Assembly Methods. Valla, S., Lale, R. , Humana Press. New York, NY. 119-131 (2013).
- Zetsche, B., et al. Cpf1 Is a Single RNA-Guided Endonuclease of a Class 2 CRISPR-Cas System. Cell. 163 (3), 759-771 (2015).
- Abudayyeh, O., et al. C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector. Science. 353 (6299), (2016).
