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Genetics

स्तनधारी सिस्टम्स के लिए CRISPR गाइड आरएनए क्लोनिंग

Published: October 2, 2018 doi: 10.3791/57998
Automatic Translation
*1,2, *1,2,3, 1,2, 1,2, 1, 1, 1,4,5,6,7, 1,2
1Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering, Harvard University, 2Department of Genetics, Harvard Medical School, 3Department of Pathology, Massachusetts General Hospital, 4Institute for Medical Engineering & Science, Massachusetts Institute of Technology, 5Synthetic Biology Center, Massachusetts Institute of Technology, 6Department of Biological Engineering, Massachusetts Institute of Technology, 7Broad Institute
* These authors contributed equally

Summary

यहां, एक सरल, कुशल, और sgRNA क्लोनिंग की लागत प्रभावी तरीका रेखांकित किया है ।

Abstract

रेखांकित प्रोटोकॉल कुशल और लागत प्रभावी Cas9-संबद्ध मार्गदर्शिका RNAs के उत्पादन के लिए सुव्यवस्थित विधियों का वर्णन करता है । गाइड आरएनए के लिए दो वैकल्पिक रणनीति (gRNA) क्लोनिंग संगत वैक्टर का एक सेट के साथ संयोजन में प्रकार आईआईएस प्रतिबंध एंजाइम BsmBI के उपयोग के आधार पर उल्लिखित हैं । सैंज अनुक्रमण सेवाओं के लिए उपयोग के बाहर उत्पन्न वैक्टर को मान्य करने के लिए, कोई विशेष उपकरण या एजेंट उन है कि आधुनिक आणविक जीव विज्ञान प्रयोगशालाओं के लिए मानक कर रहे हैं से अलग आवश्यक हैं. रेखांकित विधि मुख्य रूप से एक समय में एक एकल gRNA या एक युग्मित gRNA-व्यक्त वेक्टर क्लोनिंग के लिए करना है । यह प्रक्रिया gRNAs के हजारों युक्त पुस्तकालयों की पीढ़ी के लिए अच्छी तरह से पैमाने पर नहीं है । उन प्रयोजनों के लिए, इस तरह के oligo के रूप में oligonucleotide संश्लेषण के वैकल्पिक स्रोतों चिप संश्लेषण की सिफारिश कर रहे हैं. अंत में, जबकि इस प्रोटोकॉल स्तनधारी वैक्टर का एक सेट पर केंद्रित है, सामांय रणनीति प्लास्टिक है और किसी भी जीव के लिए लागू होता है अगर उचित gRNA वेक्टर उपलब्ध है ।

Introduction

CRISPR-जुड़े प्रोटीन 9 (Cas9) एक शाही सेना निर्देशित endonuclease जो एक वांछित जीनोमिक लक्ष्य की दिशा में निर्देशित किया जाता है जब एक उचित रूप से डिजाइन छोटे गाइड आरएनए (gRNA)1,2के साथ जटिल है । gRNAs एक 20-न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम (protospacer) है, जो जीनोमिक लक्ष्य अनुक्रम के पूरक है शामिल हैं । जीनोमिक लक्ष्य अनुक्रम के बगल में एक ' 3 protospacer-जुड़े आकृति (पाम) है, जो Cas9 बंधन के लिए आवश्यक है । स्ट्रेप्टोकोकस Pyogenes Cas9 (SpCas9) के मामले में, यह क्रम NGG है । डीएनए लक्ष्य पर बाध्यकारी, Cas9 डीएनए के दोनों किस्में सट, जिससे मरंमत तंत्र उत्तेजक है कि ब्याज की लोकस को संशोधित शोषण किया जा सकता है । त्रुटि प्रवण गैर मुताबिक़ अंत में शामिल होने (NHEJ) मार्ग के सक्रियकरण एक लक्ष्य जीन के व्यवधान पैदा कर सकता है । वैकल्पिक रूप से, मरंमत एक मुताबिक़ पुनर्संयोजन के द्वारा बनाई गई एक वांछित डीएनए अनुक्रम के लक्षित एकीकरण को उत्तेजित अगर एक दाता टेंपलेट6प्रदान की जाती है सकते हैं । Nuclease-डेड Cas9 (dCas9) वेरिएंट को Cas9 के भीतर अवशेषों को रूपांतरित करके3 भी जेनरेट किया जा सकता है जो endonucleolytic गतिविधि के लिए आवश्यक हैं । dCas9 डीएनए बाध्यकारी के लिए सक्षम रहता है, लेकिन उसके बंधे लक्ष्य में कटौती नहीं करता है । dCas9 करने के लिए विभिंन प्रभाव डोमेन से इनकार कर रही है और यह एक जीन transcriptional शुरू साइट के पास निर्देशन करके, dCas9 चयनात्मक जीन प्रेरण या आंशिक जीन मुंह बंद करने4,5के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

जबकि अविश्वसनीय रूप से शक्तिशाली, Cas9 का उपयोग करने की क्षमता के लिए ब्याज की एक जीनोमिक अनुक्रम लक्ष्य की आवश्यकता है कि एक उपयोगकर्ता पहले एक gRNA लक्ष्य साइट (ओं) के लिए अद्वितीय उत्पंन करता है । gRNA अभिव्यक्ति वैक्टर के निर्माण के लिए तरीकों की एक किस्म पहले से वर्णित किया गया है, अलग दक्षता और लागत6,7,8के कई । स्टैंड-अलोन पीसीआर amplicons तेजी से स्क्रीनिंग के लिए gRNAs के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, oligonucleotide प्रसव से कई घंटे के भीतर अभिकर्मक के लिए जा रहा; हालांकि, इस Ultramer (पर १०० बीपी) oligo संश्लेषण, जो9महंगा है की आवश्यकता है । यह भी Ultramers से अधिक लागत प्रभावी रहे हैं कि gBlocks खरीद करने के लिए संभव है. के रूप में Cas9 तेजी से आधुनिक आणविक जीवविज्ञान toolkit, एक सरल, सस्ता है, और gRNA क्लोनिंग के लिए अत्यधिक कुशल तरीका क्षेत्र के लिए एक वरदान होगा की एक अभिंन घटक बन गया है । विधि यहां वर्णित हमारे समूह में कार्यरत है और पिछले कई वर्षों के लिए सहयोग प्रयोगशालाओं को २,००० से अधिक अद्वितीय gRNAs4उत्पंन किया गया है ।

उल्लिखित विधि lentiviral संगत वैक्टर की क्लोनिंग के लिए तकनीक पर केंद्रित है जिसमें एक एकल gRNA या अधिकतम दो gRNAs हैं । दो से अधिक gRNAs युक्त plasmids की पीढ़ी के लिए, या gRNAs की एक पुस्तकालय क्लोन करने के लिए, वैकल्पिक दृष्टिकोण9,10,11,12की सिफारिश कर रहे हैं ।

Protocol

नोट: निम्नलिखित प्रोटोकॉल की रूपरेखा कैसे gRNA डिजाइन करने के लिए ऑनलाइन उपकरण का उपयोग कर (चरण १.१-१.४), जो इस पांडुलिपि में विस्तृत gRNA प्लाज्मिड निर्माण के सभी तरीकों के लिए आम हैं. एक बार वांछित gRNAs की पहचान कर रहे हैं, आवश्यक oligonucleotides आदेश देने के लिए कदम अभिव्यक्ति वैक्टर में oligonucleotides शुरू करने के लिए कई विभिंन तरीकों के साथ वर्णित है (जैसे, pSB700) । प्रस्तुत एकल गाइड का क्लोनिंग के लिए 2 तरीके हैं, वैक्टर एक अपच अभिव्यक्ति वेक्टर में या तो बंधाव पर आधारित (कदम 2-७.३) या गोल्डन गेट क्लोनिंग (8 कदम-८.४) । इसके अलावा उल्लिखित युग्मित गाइड क्लोनिंग पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) गोल्डन गेट क्लोनिंग (11-16 कदम) के बाद का उपयोग कर वैक्टर के लिए एक रणनीति है । अंतत:, एक ई. कोलाई रासायनिक परिवर्तक (चरण 9-९.६) और एक व्यंजक वेक्टर अनुक्रम मान्यता (चरण 10 करने के लिए 10.2.3) निष्पादित करने के लिए सामान्य विधियाँ भी उल्लिखित हैं ।

  1. डिजाइन gRNA oligonucleotides ऑनलाइन उपकरण का उपयोग निंनानुसार है ।
    1. डिजाइन gRNAs ऐसे sgRNA गणक २.० ऑनलाइन उपकरण (https://crispr.med.harvard.edu/sgRNAScorerV2/)13 या व्यापक sgRNA डिजाइन उपकरण जैसे विकल्प के रूप में ऑनलाइन उपकरण का उपयोग कर (http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/ sgrna-डिजाइन)14 और कई अन्य15.
    2. संभावित gRNA अनुक्रम उत्पन्न करने के लिए जीन नाम, प्रतीक, या कच्चे डीएनए लक्ष्य अनुक्रम का उपयोग करें ।
      नोट: एक स्प्रेडशीट (. csv/. xls) फ़ाइल जीन या प्रदान की गई अनुक्रम के खिलाफ सभी संभावित gRNAs के साथ बनाया है । संभावित gRNAs की गुणवत्ता स्कोर के रूप में रिपोर्ट किया जाएगा अगर sgRNA गणक २.० ऑनलाइन उपकरण का इस्तेमाल किया जा रहा है, या % पर लक्ष्य दक्षता के रूप में अगर व्यापक sgRNA डिजाइन उपकरण इस्तेमाल किया जा रहा है । दोनों ही उपाय ऑन-टारगेट कटिंग गतिविधि के आधार पर प्राप्त किए जाते हैं ।
    3. gRNAs रैंकिंग करते समय gRNA चयन में ऑफ़-टारगेट गतिविधि पर विचार करें ।
      नोट: इष्टतम मार्गदर्शिकाएं सबसे बड़ी पर-लक्ष्य कुशलता और कम से बंद लक्ष्य गतिविधि के साथ वे हैं । सक्रियण (CRISPRa) के लिए, gRNAs transcriptional प्रारंभ साइट (TSS)4,15के 1-200 बीपी नदी से क्षेत्र को लक्षित करने के लिए डिज़ाइन कर रहे हैं । निषेध (CRISPRi) के लिए, gRNAs TSS के ५० बीपी ऊपर से क्षेत्र को लक्षित करने के लिए डिज़ाइन कर रहे हैं जब तक ३०० TSS के बीपी बहाव5. Cas9 काटने का उपयोग कर एक जीन को निष्क्रिय करने के लिए, gRNAs को शुरू codon के कोडन अनुक्रम बहाव के पहले 10-50% लक्ष्य डिजाइन किए है (के रूप में gRNAs के रूप में ' 3 को लक्षित जीन के अंत कम प्रभावी होना दिखाया गया है)13।
    4. सुनिश्चित करें कि कोई आंतरिक BsmBI साइटों मौजूद है अगर oligonucleotides गोल्डन गेट क्लोनिंग के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है, के रूप में यह annealed13पचा जा रहा oligonucleotides में परिणाम होगा ।
  2. जीनोमिक लक्ष्य अनुक्रम का चयन करें और 3 ' NGG पाम हटाने (केवल protospacer अनुक्रम छोड़ने) एकल gRNA oligonucleotide अनुक्रम संशोधन के लिए (जैसे, अनुक्रम शुरू: CGCGTGCTCTCCCTCATCCATGG) ।
    नोट: किसी स्प्रेडशीट का उपयोग करने पर, निम्नलिखित सूत्र 3 ' NGG: = LEFT (a2, लेन (a2)-3)को निकाल देगा, जहाँ a2 लक्ष्य अनुक्रम और पाम युक्त कक्ष है.
    1. oligo के 5 ' अंत में CACCG संलग्न करें ।
      नोट: pSB700 रीढ़ की बंधाव पर, इस अनुक्रम gRNA की प्रतिलेखन ड्राइविंग U6 प्रमोटर के 3 ' अंत शामिल होंगे । "CACC" अनुक्रम यह सुनिश्चित करता है कि oligo BsmBI-पच pSB700 वेक्टर के हैंगर के साथ संगत है । "जी" पोलीमरेज़ III प्रवर्तकों की एक आवश्यकता है और gRNA की प्रतिलिपि की कुशल दीक्षा सुनिश्चित करता है । इस कार्य को करने के लिए किसी स्प्रेडशीट में निंन सूत्र का उपयोग करें: = श्रेणीबद्ध करना ("CACCG", (b2)), जहां B2 protospacer अनुक्रम वाले कक्ष [उदा., 5 ' CACCG अनुक्रम को जोड़ने के लिए protospacer: CACCGCGCGTGCTCTCCCTCATCCA (यह अंतिम अग्रेषित oligo है जो आदेश दिया गया है)] ।
    2. protospacer अनुक्रम का एक रिवर्स पूरक (rc) बनाएँ ।
      नोट: उदाहरण के लिए, aforementioned protospacer के रिवर्स पूरक TGGATGAGGGAGAGCACGCG है ।
    3. आर सी protospacer के 5 ' अंत में AAAC संलग्न । एक अतिरिक्त सी संलग्न 3 ' के अंत में आर सी protospacer (रिवर्स oligo) ।
      नोट: "AAAC" अनुक्रम सुनिश्चित करता है कि oligo BsmBI-डाइजेस्ट pSB700 वेक्टर में क्लोनिंग के लिए संगत है । अतिरिक्त ' सी ' पर ' 3 ' के अंत में प्रारंभ करने के लिए परिक्रमा करने की आवश्यकता है ' जी ' को आगे oligo में जोड़ा गया. इस कार्य को करने के लिए किसी स्प्रेडशीट में निम्न सूत्र का उपयोग करना = श्रेणीबद्ध करना ("AAAC", (c2), "C"), जहाँ C2 कक्ष है जिसमें उल्टे पूरक अनुक्रम [उदा., AAACTGGATGAGGGAGAGCACGCGC (यह अंतिम रिवर्स oligo है आदेश दिया)].
  3. आदेश oligonucleotides, oligonucleotides पर कोई अतिरिक्त संशोधनों के साथ ।
    1. आदेश oligo की ंयूनतम राशि की आवश्यकता है, के रूप में ही बहुत कम मात्रा में क्लोनिंग प्रतिक्रियाओं के लिए आवश्यक हैं ।
  4. lyophilized प्राइमरों 1x ते बफर में १०० माइक्रोन की एक अंतिम एकाग्रता के लिए पतला (10 मिमी Tris-सीएल, 1 मिमी EDTA के साथ पीएच ७.५) ।
  5. Aliquot 1:1 आगे और रिवर्स oligonucleotides (उदा, 10 μL प्रत्येक) पीसीआर स्ट्रिप-कैप ट्यूबों में ।
    नोट: यह एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग कर एक समय में कई gRNAs की तेजी से क्लोनिंग की अनुमति देगा ।
    1. भंवर और oligo मिश्रण (15 एस के लिए १०० x g नीचे स्पिन) । बंधाव की स्थापना से पहले 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर प्रतिक्रिया की मशीन ।
      नोट: यह आवश्यक नहीं है गर्मी और फिर oligo मिश्रण शांत करने के लिए अपने एनीलिंग की सुविधा । यह ध्यान देने योग्य है कि gRNA oligonucleotides के 3-4 जोड़े को परित किया जा सकता है और एक ही प्रतिक्रिया में annealed (जैसे, मिश्रण 3 μL के आगे और रिवर्स μL के 3 oligonucleotides एक साथ 4 gRNA oligo जोड़े को, 24 μL की कुल मात्रा दे) । एनीलिंग के लिए प्रयुक्त oligonucleotides की मात्रा को किसी उपयोगकर्ता की आवश्यकताओं को समायोजित करने के लिए समायोजित किया जा सकता है ।
      नोट: चरण 6-७.३ pSB700 के अपच का वर्णन । एक वैकल्पिक विधि के लिए, चरण 8, जो एक एकल-चरण BsmBI प्रतिबंध बंधाव का वर्णन करता है देखें ।
  6. डाइजेस्ट 1-5 μg चयनित pSB700 गाइड अभिव्यक्ति वेक्टर के साथ BsmBI (०.५ μL प्रति 1 μg) के लिए 1 h पर ५५ ° c15. pSB700 gRNA अभिव्यक्ति वेक्टर के पाचन ४० μL (तालिका 1) की कुल मात्रा में आचरण ।
    1. चलाने के पाचन उत्पादों पर १.५% (wt/कम पिघलने agarose जेल ।
    2. बाहर पचा वेक्टर रीढ़ बैंड जो आकार में ~ 9 केबी के एक टुकड़ा से मेल खाती है और एक १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब (चित्रा 1) में जेल टुकड़ा जगह काट ।
    3. निर्माता के निर्देशों के अनुसार agarose जेल से डीएनए निकालने के लिए एक वाणिज्यिक जेल शोधन किट का प्रयोग करें ।
    4. Elute के 10-15 μL में डीएनए (10 मिमी Tris, पीएच ७.५; 10 मिमी Tris, पीएच ८.०) एक केंद्रित eluate प्राप्त करने के लिए ।
  7. Ligate से annealed gRNA oligonucleotides में BsmBI-पच pSB700 गाइड अभिव्यक्ति वेक्टर में एक 20 μL प्रतिक्रिया (तालिका 2) में gRNA oligonucleotides की क्लोनिंग के लिए पूर्व में पचा pSB700 अभिव्यक्ति वेक्टर ।
    1. सबसे पहले, पानी, बफर जोड़ें, और डीएनए, तो मिश्रण भंवर और एंजाइम जोड़ने के बाद, भंवर 1 अंतिम समय जोड़ एंजाइम और नीचे समाधान स्पिन (15 एस के लिए १०० x जी) । रात भर कमरे के तापमान पर प्रतिक्रियाओं की गर्मी ।
    2. शामिल है एक नहीं डालने नकारात्मक नियंत्रण प्रतिक्रिया है कि एक BsmBI-पचा अकेले वेक्टर है, एक annealed gRNA oligo डालने के बिना । 1 μL के स्थान पर पानी का उपयोग किया जा सकता है 1 μL के gRNA oligonucleotides के लिए नहीं डालने के नकारात्मक नियंत्रण ।
    3. परिवर्तन करने के लिए आगे बढ़ें (चरण 9) ।
      नोट: चरण 8 चरणों 6-७.३ में वर्णित के रूप में pSB700 के अपच के लिए एक वैकल्पिक विधि है ।
  8. परिचय gRNA oligonucleotides (चरणों में उल्लिखित 1-५.१) pSB700 वेक्टर में गोल्डन गेट क्लोनिंग के उपयोग के माध्यम से एकल कदम BsmBI प्रतिबंध बंधाव ।
    1. मास्टर मिश्रण इकट्ठा (1x)-यदि एकाधिक gRNAs क्लोन किया जा रहा है, डालने oligonucleotides जोड़ा (तालिका 3) के बिना मास्टर मिश्रण तैयार करते हैं । Aliquot मास्टर मिश्रण पीसीआर ट्यूबों में और एक मल्टीचैनल पिपेट चरण ४.२ से gRNA oligonucleotides जोड़ने के लिए उपयोग करें । पानी के 1 μL का उपयोग करते हुए कोई सं मिलित नियंत्रण शामिल करें ।
    2. एक ही प्रतिक्रिया के भीतर BsmBI एंजाइम और टी-4 डीएनए ligase सहित द्वारा, एक साथ प्रतिबंध पाचन और बंधाव प्राप्त कर रहे हैं (यानी, गोल्डन गेट क्लोनिंग). वेक्टर को पचाने के लिए निंन साधारण गेट प्रोटोकॉल का उपयोग करें और 1 प्रतिक्रिया में आवेषण ligate: 2 ज के लिए ३७ ° c पर प्रतिक्रिया रखें, 10 मिनट के लिए ५० डिग्री सेल्सियस पर, ६५ ° c पर 15 मिनट के लिए, 15 मिनट के लिए ८० ° c पर, और अंत में , इसे 4 ° c पर रखें ।
      1. नोट, की जांच करें कि oligonucleotides BsmBI साइट्स इस विधि का उपयोग करने से पहले नहीं है । यदि gRNAs क्लोन किया जा रहा है BsmBI प्रतिबंध साइटों होते हैं, वे BsmBI के अलावा पर पचा जाएगा । यह उपयोगकर्ता किसी भी transformants प्राप्त करने से रोक देगा ।
    3. प्रारंभिक सरल फाटक प्रतिक्रिया के बाद, प्रत्येक प्रतिक्रिया करने के लिए BsmBI एंजाइम के एक अतिरिक्त ०.५ μL जोड़ें और उन्हें वापस ५५ डिग्री सेल्सियस पर 1 एच के लिए जगह है । पाचन के बाद, 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रिया पकड़ या इसे बदलने के लिए तैयार जब तक फ्रीज । प्रतिबंध के इस दूसरे दौर एंजाइम मशीन किसी भी अपच या religated जंगली-प्रकार pSB700 वेक्टर रीढ़ की प्रतिक्रिया मिश्रण से निकालता है ताकि केवल वैक्टर कि oligo आवेषण प्राप्त है बरकरार है और transformants उपज होगा ।
    4. परिवर्तन करने के लिए आगे बढ़ें (चरण 9) ।
  9. बदलने के ०.५ μL में प्रतिक्रिया मिश्रण के 8 μL में सक्षम ई. कोलाई [उदा, नेब DH5a (1-3 x 109 cfu/µ g of pUC19 dna) या नेब स्थिर 1-3 x 109 cfu/µ जी का pUC19 डीएनए). lentiviral plasmids के लिए, नेब स्थिर कोशिकाओं को और अधिक सुसंगत प्लाज्मिड पैदावार प्रदान करेगा ।
    1. -८० डिग्री सेल्सियस पर भंडारण से ई. कोलाई निकालें और 5-10 मिनट के लिए बर्फ पर गल ।
    2. प्रतिक्रिया मिश्रण के ०.५ μL सक्षम ई. कोलाई के 8 μL जोड़ें और 30 मिनट के लिए बर्फ पर मिश्रण रखने के लिए ।
    3. हीट शॉक ४५ एस के लिए ४२ ° c पर मिश्रण
    4. बर्फ पर यह 2 मिनट के लिए आराम करो ।
    5. नेब DH5a के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर 1 ज के लिए और नेब अस्तबल के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर समाज मीडिया के २५० μL में एक रोटरी शेखर पर संस्कृति की वसूली ।
    6. प्लेट ८० एक उपयुक्त एंटीबायोटिक प्रतिरोध Lysogeny शोरबा (पौंड) प्लेट पर संस्कृति के μL और यह नेब DH5a के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर रात भर गर्मी और नेब अस्तबल के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर [जैसे, pSB700 एम्पीसिलीन (१०० μg/एमएल) प्लेटों के साथ पौंड पर चढ़ाया जाता है] (चित्रा 3) ।
  10. gRNA अभिव्यक्ति प्लाज्मिड के अनुक्रम को मान्य करें: gRNA oligo डालने के U6 प्रवर्तक पर प्रधानमंत्री जो प्राइमर 5 '-GAGGGCCTATTTCCCATGATTCC-3 ' का उपयोग करते हुए सैंज sequencing द्वारा प्रत्येक कॉलोनी के अनुक्रम की पुष्टि.
    1. sequencing (तालिका 4) के लिए प्रति प्रतिक्रिया 2-3 कालोनियों उठाओ ।
      नोट: कई sequencing प्रदाताओं अब जो बहुत समय और लागत plasmids को अनुक्रमण करने से पहले शुद्ध करने के लिए की आवश्यकता को नष्ट करने से कम कर देता है, जो बैक्टीरियल कॉलोनियों से सीधे sequencer अनुक्रमण प्रदर्शन कर सकते हैं सेवाएं प्रदान करते हैं । वैकल्पिक रूप से, एक प्लाज्मिड आइसोलेशन किट व्यक्तिगत बैक्टीरियल क्लोन से प्लाज्मिड डीएनए को ठीक करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । शुद्ध plasmids तो अनुक्रमण के लिए प्रस्तुत किया जा सकता है । यदि कोई pooled बंधाव प्रतिक्रिया की जाती है, तो तालिका 4 का उपयोग उन कालोनियों की संख्या के लिए मार्गदर्शिका के रूप में करें जिनका चयन किया जाना चाहिए और sequencing के लिए सबमिट करना चाहिए ।
    2. अनुक्रम पुष्टिकरण के बाद, gRNA व्यंजक plasmids को अलग करें ।
      1. pSB700 अभिव्यक्ति वैक्टर के लिए एम्पीसिलीन के १०० μg/एमएल युक्त पौंड मध्यम की एक 5 मिलीलीटर संस्कृति में वांछित कॉलोनी inoculate करने के लिए एक बाँझ पिपेट टिप का प्रयोग करें ।
      2. ३७ डिग्री सेल्सियस रात भर में १०० rpm पर एक रोटरी मशीन में कोशिकाओं को विकसित (30 ° c अगर नेब अस्तबल इस्तेमाल किया जा रहा है) ।
      3. एक प्लाज्मिड तैयारी किट का उपयोग कर संस्कृतियों से प्लाज्मिड डीएनए को अलग, निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन ।
        नोट: इसके बाद के संस्करण तरीकों उपयोगकर्ताओं को एकल gRNA-वैक्टर युक्त बनाने के लिए सक्षम है, इस प्रोटोकॉल उपयोगकर्ताओं वैक्टर कि 2 gRNAs, प्रत्येक अपनी आरएनए पोलीमरेज़ III प्रमोटर द्वारा संचालित होते बनाने के लिए अनुमति देगा ।
  11. एक बनती gRNA डिजाइन के लिए, sgRNA डिजाइन उपकरण ऊपर उल्लिखित से उत्पादन फ़ाइल का उपयोग करें (चरण १.१-१.४) और ब्याज की 2 गाइड का चयन करें ।
    1. एक सक्रियकरण या दमन के लिए, गाइड के जोड़े का चयन करें कि कम से 30 अलग nt ।
    2. काटने के लिए इस्तेमाल gRNAs के लिए, गाइड का चयन करें कि लक्ष्य 2 जीन के भीतर विभिंन exons ।
  12. नीचे दिए गए निर्देशों के लिए, सरणी gRNA-a में पहले gRNA को निर्दिष्ट करें और सरणी gRNA-B में दूसरी gRNA, युग्मित gRNA oligonucleotide अनुक्रम संशोधन बनाने के लिए ।
    नोट: oligo gRNA बनाने के लिए इस्तेमाल किया-एक एफए बुलाया जाएगा, और रिवर्स oligo gRNA परिचय-बी आरबी के रूप में भेजा जाएगा । नीचे क्लोनिंग विधि स्वचालित रूप से gRNAs में से प्रत्येक के 5 ' अंत में एक शुरुआत जी जोड़ती है ।
    1. इस प्रकार के रूप में उपयुक्त एफए oligo बनाएं ।
      नोट: 20 न्यूक्लियोटाइड gRNA के लिए gRNA लक्ष्यीकरण अनुक्रम शामिल-एक प्रारंभिक एफए अनुक्रम है जिस पर निंनलिखित चरणों का निर्माण होगा (जैसे, protospacer-aggggctacaccactcattg) का गठन होगा ।
      1. एफए के 5 ' अंत में TTTTCGTCTCTCACCG संलग्न (जैसे, अनुक्रम TTTTCGTCTCTCACCGaggggctacaccactcattg के) ।
      2. एफए के 3 ' अंत में GTTTTAGAGCTATGCTGAAAAGCA संलग्न (जैसे, अनुक्रम TTTTCGTCTCTCACCGaggggctacaccactcattgGTTTTAGAGCTATGCTGAAAAGCAके) । यह एफए oligo कि आदेश दिया जाएगा के अंतिम संस्करण है ।
    2. आवश्यक आरबी oligo निम्नानुसार बनाएं ।
      नोट: gRNA-B के लिए gRNA लक्ष्यीकरण अनुक्रम वाले 20 न्यूक्लियोटाइड प्रारंभिक आरबी अनुक्रम का गठन करेंगे जिस पर निम्न चरणों का निर्माण होगा (उदा., प्रारंभिक अनुक्रम gtcccctccaccccacagtg का).
      1. आरबी = (revcom) आरबी (जैसे, cactgtggggtggaggggac) के रिवर्स पूरक ले लो ।
      2. (revcom) आरबी (जैसे, TTTTCGTCTCTAAACcactgtggggtggaggggac) के 5 ' अंत में TTTTCGTCTCTAAAC संलग्न ।
      3. (revcom) आरबी (जैसे, TTTTCGTCTCTAAACcactgtggggtggaggggacCGGTGACCCAGGCGGCGCACAAG) के 3 ' अंत में CGGTGACCCAGGCGGCGCACAAG संलग्न । इस आरबी oligo का अंतिम संस्करण है कि आदेश दिया जाएगा ।
        नोट: निंन सूत्रों का उपयोग सामांय स्प्रेडशीट सॉफ़्टवेयर के साथ oligo अनुक्रम को स्वचालित रूप से संपादित करने के लिए किया जा सकता है: = श्रेणीबद्ध करना ("TTTTCGTCTCTCACCG", (A2), "GTTTTAGAGCTATGCTGAAAAGCA"), जहां A2 एफए अनुक्रम वाला कक्ष है, और = श्रेणीबद्ध करें ("TTTTCGTCTCTAAAC", (b2), "CGGTGACCCAGGCGGCGCACAAG"), जहाँ B2 कक्ष है जिसमें (revcom) आरबी अनुक्रम है.
  13. विकल्प के एक संश्लेषण विक्रेता से oligonucleotides आदेश । कोई अतिरिक्त संशोधनों की आवश्यकता है ।
  14. तैयार प्लाज्मिड डीएनए का उपयोग दोनों एफए और आरबी प्राइमरों के साथ पीसीआर प्रदर्शन करने के लिए । यह आगे और रिवर्स gRNAs दोनों इस प्लाज्मिड से उत्पंन पीसीआर टुकड़ा करने के लिए संलग्न करेगा और प्रत्येक अपने स्वयं के प्रवर्तक (U6 और 7SK प्रवर्तकों से व्यक्त किया जा करने की अनुमति देगा-अलग प्रमोटर इस डिजाइन में उपयोग किया जाता है वायरल पुनर्संयोजन को रोकने के लिए) ।
    1. जरूरत टुकड़ा बनाने के लिए Phusion जीसी विशेष पीसीआर प्रोटोकॉल का प्रयोग करें: मिश्रण रखने के लिए ९८ ° c पर 1 मिनट (1 चक्र), के लिए ९८ ° c पर 15 s, ५३ ° c पर 15 s के लिए, ६५ ° c पर 2 मिनट के लिए, और पर ७२ ° c 4 मिनट के लिए (30 चक्र) , और फिर इसे 4 ° c (तालिका 5) पर रखें ।
    2. 1% agarose जेल पर पीसीआर उत्पाद चलाने के लिए और सत्यापित करें कि 1 बैंड ~ ४९० bp (चित्रा 2) पर देखा जाता है ।
    3. कट और पसंद का एक जेल निष्कर्षण किट का उपयोग कर इस पीसीआर उत्पाद निकालने । Elute के 15 μL में डीएनए को बफर (10 एमएम Tris, पीएच ७.५; 10 एमएम Tris, पीएच ८.०) या आसुत जल में डालें ।
    4. डीएनए molarity गणना के लिए एक spectrophotometer के साथ pSB700 वेक्टर के साथ कि निकाले गए उत्पाद की एकाग्रता को मापने । दोनों पीसीआर उत्पाद और वेक्टर ४० femtomoles/μL की एकाग्रता के लिए सामान्य ।
      नोट: कई वेबसाइटों डीएनए की लंबाई और समाधान में अपनी एकाग्रता के आधार पर दिया डीएनए समाधान के molarity की गणना के साथ सहायता करने के लिए उपलब्ध हैं (जैसे, विशाल: http://www.promega.com/a/apps/biomath/index.html?calc=ugpmols). कैलकुलेटर सूत्र का उपयोग करता है:
      Equation
      यहां, N न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम की लंबाई है ।
  15. एक एक साथ प्रतिबंध पाचन और बंधाव कदम 8-८.४ में उल्लिखित प्रोटोकॉल का उपयोग कर प्रतिक्रिया एक pSB700 वेक्टर में पीसीआर टुकड़ा क्लोन सेट करें ।
    1. रिएक्शन के लिए प्राइमरी सॉल्यूशन के 1 μL को जोड़ने के बजाय, पीसीआर प्रॉडक्ट के ४० fmole/μL के 1 μL जोड़ें । इसके अलावा, ४० fmole/μL की एकाग्रता पर pSB700 वेक्टर का 1 μL उपयोग करें ।
      नोट: समान दाढ़ अनुपात अनुरूप परिणाम के लिए सीसा, हालांकि मामलों में भी जहां सटीक अनुपात का उपयोग नहीं कर रहे हैं, कालोनियों प्राप्त किया जा सकता है ।
  16. गोल्डन गेट प्रतिक्रिया प्रक्रिया को पूरा करने पर (चरण 8-८.४), परिवर्तन और अनुक्रम सत्यापन (चरण 9-10.2.3) के लिए आगे बढ़ें ।

Representative Results

इस प्रोटोकॉल में उल्लिखित विधियों या तो एकल या युग्मित gRNA अभिव्यक्ति वैक्टर के निर्माण के लिए कर रहे हैं । एकल gRNA व्यक्त वैक्टर या तो वेक्टर रीढ़ को पचाने के द्वारा बनाया जा सकता है (1 चित्रा) यह कम oligonucleotides की एक श्रृंखला में ligating द्वारा पीछा किया या गोल्डन गेट का उपयोग करने के लिए एक साथ वेक्टर रीढ़ पचाने और ligate में यह एक एक ही प्रतिक्रिया में लघु oligonucleotides की श्रृंखला । इसके अलावा प्रदान की एक विधि है वैक्टर उत्पादन कि 2 gRNAs, प्रत्येक अपनी स्वतंत्र प्रमोटर द्वारा संचालित, एक कस्टम पीसीआर टुकड़ा क्लोनिंग द्वारा (2 चित्रा) ।

उल्लिखित प्रोटोकॉल में से किसी के लिए एक सफल क्लोनिंग नहीं-डालने के नियंत्रण प्लेट (चित्रा 3) पर से उचित डालने के डीएनए के साथ रूपांतरण के लिए काफी अधिक कालोनियों की उपस्थिति में परिणाम होगा ।

Figure 1
चित्रा 1: एक pSB700 gRNA अभिव्यक्ति वेक्टर के पाचन । 1% agarose जेल का प्रयोग किया जाता है । लेन 1: बिना खतना के pSB700 । लेन 2: BsmBI के साथ pSB700 कट ।

Figure 2
चित्रा 2: युग्मित gRNA पीसीआर । 1% agarose जेल का प्रयोग किया जाता है । लेन 1: एक युग्मित गाइड पीसीआर टुकड़ा की ~ ४९० bp ।

Figure 3
चित्रा 3: सफल क्लोनिंग और एक gRNA प्लाज्मिड के परिवर्तन । बाएं पैनल सफलतापूर्वक तब्दील कालोनियों के साथ एक पौंड और एम्पीसिलीन प्लेट दिखाता है । सही पैनल कोई कालोनियों दिखा कोई डालने नियंत्रण प्लेट दिखाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

pSB700 गाइड अभिव्यक्ति वेक्टर 1-5 μg
नेब बफर ३.१ 4 μL
BsmBI 1 μL
आसुत जल ४० μL तक
कुल मात्रा ४० μL

तालिका 1: pSB700 gRNA अभिव्यक्ति वेक्टर BsmBI के साथ के प्रतिबंध पाचन ।

Annealed gRNA ओलिगोस्पर्मिया (या तो एकल या परित प्रतिक्रिया) 1 μL
BsmBI-पचता pSB700 गाइड अभिव्यक्ति वेक्टर 1 μL (~ 100-250 एनजी)
10x टी-4 डीएनए Ligase प्रतिक्रिया बफर 2 μL (1x अंतिम एकाग्रता)
टी-4 डीएनए Ligase 1 μL (१२० इकाइयां)
आसुत जल 15 μL
कुल मात्रा 20 μl

तालिका 2: gRNA oligonucleotides की एक बंधाव प्रतिक्रिया एक अपच pSB700 gRNA अभिव्यक्ति वेक्टर में ।

अभिकर्मक वॉल्यूम (1x)
एच२ओ 6 μL
टी-4 Ligase ०.५ μL
एटीपी 1 μL
BsmBI ०.५ μL
नेब बफर ३.१ 1 μL
सदिश (उदा., pSB700) (४० fmol) 1 μlL
संमिलित करें-आगे और रिवर्स ओलिगोस्पर्मिया या दोहरी गाइड (40fmol) के लिए पीसीआर टुकड़ा 1 μL (०.५ μL फॉरवर्ड और ०.५ μL रिवर्स)

तालिका 3: एक एकल कदम BsmBI प्रतिबंध और gRNA बंधाव प्रतिक्रिया मिश्रण ।

1 मार्गदर्शिका के लिए अनुक्रम 3 कालोनियों
2 मार्गदर्शिकाएँ के लिए अनुक्रम 5-10 कालोनियों
3 गाइड के लिए अनुक्रम 10-15 कालोनियों
4 मार्गदर्शिकाएँ के लिए अनुक्रम 15-20 कालोनियों

तालिका 4: पूलिंग gRNA क्लोनिंग प्रतिक्रियाओं के लिए अनुक्रम के लिए कालोनियों की अनुशंसित संख्या ।

पीसीआर कंपोनेंट ५० µ l रिएक्शन
10 µ एम फॉरवर्ड प्राइमर २.५ µ l
10 µ मीटर रिवर्स प्राइमर २.५ µ l
5x Phusion HF या GC बफर 10 µ l
10 एमएम dNTPs 1 µ l
टेंपलेट डीएनए १०० एनजी
Phusion डीएनए पोलीमरेज़ ०.५ µ l
Nuclease-मुफ्त पानी ५० तक µ l

तालिका 5: एक युग्मित gRNA पीसीआर मिश्रण ।

Discussion

समय की एक संख्या और लागत बचत संशोधनों gRNA अभिव्यक्ति वेक्टर निर्माण करने के लिए किया गया है । एक एकल-चरण प्रतिबंध और बंधाव प्रोटोकॉल के रूप में अच्छी तरह के रूप में युग्मित gRNA अभिव्यक्ति वेक्टर निर्माण की एक विधि उल्लिखित है । युग्मित gRNA अभिव्यक्ति एक पीसीआर प्रवर्धन दोनों एक आगे gRNA लक्ष्य अनुक्रम (n20) और एक और लक्ष्य (n20) के रिवर्स पूरक युक्त oligonucleotides का उपयोग कर के माध्यम से हासिल की है । यह तो एक माध्यमिक आरएनए पोल III प्रमोटर (7SK) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से पारंपरिक एकल gRNA अभिव्यक्ति plasmids व्यक्त करने में एक sgRNA पूंछ परिचय ।

एक सावधान oligonucleotide डिजाइन युग्मित gRNA निर्माण के लिए एक सफल पीसीआर के साथ ही एक चिपचिपा अंत बंधाव सुनिश्चित करेगा । एकल कदम प्रतिबंध और बंधाव प्रतिक्रिया के बाद, आगे के BsmBI के अलावा सभी संशोधित प्रतिक्रिया में वैक्टर अभिव्यक्ति की कटौती सुनिश्चित करेगा । यह काफी परिवर्तन पर पृष्ठभूमि कम हो जाएगा । नेब-स्थिर सक्षम ई. कोलाई और 30 डिग्री सेल्सियस पर एक विकास का उपयोग एक सफल परिवर्तन की उपज में वृद्धि होगी ।

लाभ इस तकनीक पर आम प्रथाओं है oligonucleotide एनीलिंग, gRNA अभिव्यक्ति वेक्टर और oligonucleotides के बंधाव की एक एकल कदम प्रतिबंध की प्रक्रिया का सरलीकरण शामिल है, और पारंपरिक उपयोग करने की क्षमता एकल gRNA अभिव्यक्ति वैक्टर युग्मित गाइड की अभिव्यक्ति के लिए । जबकि प्रोटोकॉल यहां वर्णित स्तनधारी वैक्टर का एक सेट पर केंद्रित है, सामांय रणनीति प्लास्टिक की है और किसी भी जीव के लिए लागू है, बशर्ते उपयुक्त gRNA वेक्टर उपलब्ध है । कुल मिलाकर, प्रोटोकॉल का वर्णन समय और लागत बचाता है ।

तथापि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि व्यक्तिगत oligonucleotides क्रय की प्रक्रिया को अच्छी तरह से gRNAs के हजारों युक्त पुस्तकालयों की पीढ़ी के लिए पैमाने पर नहीं है । उन प्रयोजनों के लिए, इस तरह के oligo चिप संश्लेषण के रूप में oligonucleotide संश्लेषण के वैकल्पिक स्रोतों की सिफारिश कर रहे हैं.

gRNAs क्लोनिंग करते समय कोई सम्मिलित नियंत्रण शामिल करना लाभकारी होता है. यह प्रतिक्रिया आसानी से समानांतर में ब्याज की प्रतिक्रियाओं के साथ स्थापित किया जा सकता है और यह निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि क्या एक अधूरा पाचन शुरू सदिश की प्रक्रिया के अंत में मनाया कालोनियों के लिए योगदान दिया है । इसके अलावा, यदि ऊपर क्लोनिंग प्रोटोकॉल में से एक एक पूरी तरह से पचा वेक्टर रीढ़ या गरीब बंधाव दक्षता के कारण विफल रहा है, हम सुझाव वैकल्पिक क्लोनिंग विधि हम रेखांकित किया है की कोशिश कर रहा ।

जब गोल्डन गेट क्लोनिंग के साथ साथ एक ही प्रतिक्रिया के भीतर छोटे oligonucleotides में वेक्टर और ligate पचाने के लिए, यह जांच करने के लिए महत्वपूर्ण है कि gRNA कि सदिश में क्लोन किया जा रहा है यह एक BsmBI साइट के अंदर नहीं है, के रूप में यह टी के लिए नेतृत्व करेंगे वह gRNA और परिवर्तन पर कालोनियों के एक अभाव जा रहा है ।

gRNA क्लोनिंग रणनीति हम रेखांकित किया है एक तेजी से और लागत प्रभावी gRNAs की पीढ़ी ~ गाइड प्रति 10 अमेरिकी डॉलर, oligonucleotide संश्लेषण और अनुक्रम सत्यापन से आ रही लागत के थोक के साथ । जबकि उल्लिखित विधि उपयोगकर्ताओं को SpCas9 के साथ प्रयोग के लिए gRNAs उत्पंन करने की अनुमति देने के लिए डिज़ाइन किया गया है, प्रोटोकॉल को आसानी से Cas9 orthologues या अंय आरएनए-निर्देशित endonucleases के साथ उपयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है जैसे Cpf1 या C2C2, वेक्टर रीढ़ में मामूली संशोधनों के साथ और oligonucleotide बदस्तूर जुगाड़16,17.

ऊपर उल्लिखित प्रोटोकॉल अनुक्रम-सत्यापित gRNA व्यंजक plasmids को 3 d (उचित रूप से डिज़ाइन किए गए oligonucleotides के साथ प्रारंभ करना) में प्रदान करेगा, जो वर्तमान विधियों की तुलना में काफी तेज़ है. इसमें 1 ज का gRNA डिज़ाइन (स्टेप्स 1-२.३) शामिल है, कमजोर पड़ने और aliquot के oligonucleotides के 10 मिनट (चरण 3-५.१), पाचन और शुद्धि के pSB700 gRNA अभिव्यक्ति वेक्टर के 2 ज (कदम 6-६.४), क्लोनिंग के gRNA oligonucleotides में एक predi gested pSB700 gRNA अभिव्यक्ति वेक्टर कमरे के तापमान पर रातोंरात (चरण 7-७.३), एकल-चरण BsmBI प्रतिबंध बंधाव की 3 ज और ४० मिनट (चरण 8-८.४), 16 के परिवर्तन ज (चरण 9-९.६), और gRNA अभिव्यक्ति के अनुक्रम की मांयता प्लाज्मिड 24 ज (के साथ की अवधि के आधार पर सैंज अनुक्रमण उपलब्धता और गति बैक्टीरियल कॉलोनी के सबमिशन के बाद; चरण 10) । युग्मित gRNA डिजाइन और अनुक्रम संशोधन 1 ज लेता है (कदम 11-13) । युग्मित gRNA पीसीआर लेता है ३.५ ज (कदम 14-१४.४) । एक pSB700 वेक्टर में पीसीआर टुकड़ा की क्लोनिंग 3h और ४० मिनट (15-16 कदम) लेता है ।

इस प्रोटोकॉल के साथ सामना किया जा सकता है कि सबसे अधिक संभावना मुद्दों गोल्डन गेट विधानसभा और परिवर्तन में अक्षमता से संबंधित हैं । असेंबली की कार्यकुशलता को विज़ुअलाइज़ करने के लिए गोल्डन गेट असेंबली के दौरान कोई सं-मिलित नियंत्रण शामिल करें । रूपांतरण के दौरान, puc19 सकारात्मक नियंत्रण एक परिवर्तन दक्षता नियंत्रण प्रदान करेगा । नेब-स्थिर ई. कोलाई lentiviral संगत plasmids के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए और अक्सर करने के लिए की आवश्यकता होती है > 16 एच सी पर ज दिखाई कालोनियों उपज के लिए 30 डिग्री सेल्सियस ।

Disclosures

जॉर्ज एम चर्च Editas और कारिबू में इक्विटी है विज्ञान, जो CRISPR-Cas9 जीनोम संपादन प्रौद्योगिकी का व्यवसाय करने का लक्ष्य (एक पूर्ण प्रकटीकरण सूची के लिए, कृपया http://arep.med.harvard.edu/gmc/tech.html देखें) ।

Acknowledgments

साथीजी Nageshwaran को Friedreich के गतिभंग रिसर्च अलायंस (07340305-01) और नेशनल गतिभंग फाउंडेशन फैलोशिप (7355538-01) ने सपोर्ट किया है । ऐलेजैंड्रो Chavez राष्ट्रीय कैंसर संस्थान अनुदान 5T32CA009216-34 और चिकित्सा वैज्ञानिकों के लिए बरोज वेलकम फंड कैरियर पुरस्कार द्वारा वित्त पोषित किया गया । जॉर्ज एम चर्च स्वास्थ्य के अमेरिका के राष्ट्रीय संस्थान (NIH) राष्ट्रीय मानव जीनोम अनुसंधान संस्थान अनुदान RM1 HG008525 और जैविक रूप से प्रेरित इंजीनियरिंग के लिए Wyss संस्थान द्वारा समर्थित है । जेंस जे कोलिंस रक्षा खतरा कमी एजेंसी अनुदान HDTRA1-14-1-0006 और पॉल जी एलन फ्रंटियर्स समूह से समर्थन स्वीकार करता है । ऐलेजैंड्रो Chavez दोहरे गाइड क्लोनिंग विधि विकसित की है । साथीजी Nageshwaran, ऐलेजैंड्रो Chavez, और नण चर येओ ने सभी लेखकों से इनपुट के साथ पांडुलिपि लिखी ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BsmBI New England Biolabs R0580L
T4 DNA ligase Enzymatic/New England Biolabs L6030-LC-L/M0202S
Buffer 3.1 New England Biolabs B7203S
Adenosine 5'-Triphosphate (ATP) New England Biolabs P0756S
QIAprep spin miniprep kit Qiagen 27104
Chemically competent E. coli New England Biolabs C3019l, C2987l, or C3040H
Standard microcentrifuge tubes, 1.5 mL Eppendorf 0030 125.150
Axygen 8-Strip PCR tubes Fischer Scientific 14-222-250
Thermocycler with programmable temperature-stepping control BioRad, 1851148
UV spectrophotometer (NanoDrop 2000c) Thermo Scientific
pSB700 plasmid Addgene #64046
NEB Stable Competent E. coli (High Efficiency) New England Biolabs c3040
Lysogeny broth (LB)
Ampicillin
TE buffer (1 mM EDTA, 10 mM Tris-Cl, pH 7.5)
pSN007 plasmid Addgene 102440

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References

  1. Gasiunas, G., Barrangou, R., Horvath, P., Siksnys, V. Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (39), E2579-E2586 (2012).
  2. Jinek, M., Chylinski, K., Fonfara, I., Hauer, M., Doudna, J., Charpentier, E. A Programmable Dual-RNA-Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  3. Shalem, O., Sanjana, N., Zhang, F. High-throughput functional genomics using CRISPR-Cas9. Nature Reviews Genetics. 16 (5), 299-311 (2015).
  4. Chavez, A., et al. Highly efficient Cas9-mediated transcriptional programming. Nature Methods. 12 (4), 326-328 (2015).
  5. Gilbert, L., et al. CRISPR-Mediated Modular RNA-Guided Regulation of Transcription in Eukaryotes. Cell. 154 (2), 442-451 (2013).
  6. Yang, L., Yang, J., Byrne, S., Pan, J., Church, G. CRISPR/Cas9-Directed Genome Editing of Cultured Cells. Current Protocols in Molecular Biology. , 31.1.1-31.1.17 (2014).
  7. Yang, L., Mali, P., Kim-Kiselak, C., Church, G. CRISPR-Cas-Mediated Targeted Genome Editing in Human Cells. Methods in Molecular Biology. 1114, 245-267 (2014).
  8. Vidigal, J., Ventura, A. Rapid and efficient one-step generation of paired gRNA CRISPR-Cas9 libraries. Nature Communications. 6, 8083 (2015).
  9. Joung, J., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening. Nature Protocols. 12 (4), 828-863 (2017).
  10. Kabadi, A., Ousterout, D., Hilton, I., Gersbach, C. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome engineering from a single lentiviral vector. Nucleic Acids Research. 42 (19), e147 (2014).
  11. Sakuma, T., Nishikawa, A., Kume, S., Chayama, K., Yamamoto, T. Multiplex genome engineering in human cells using all-in-one CRISPR/Cas9 vector system. Scientific Reports. 4 (1), (2014).
  12. Chari, R., Yeo, N., Chavez, A., Church, G. sgRNA Scorer 2.0: A Species-Independent Model To Predict CRISPR/Cas9 Activity. ACS Synthetic Biology. 6 (5), 902-904 (2017).
  13. Doench, J., et al. Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation. Nature Biotechnology. 32 (12), 1262-1267 (2014).
  14. Konermann, S., et al. Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex. Nature. 517 (7536), 583-588 (2014).
  15. The CRISPR Software Matchmaker: A New Tool for Choosing the Best CRISPR Software for Your Needs. , Available from: http://blog.addgene.org/the-crispr-software-matchmaker-a-new-tool-for-choosing-the-best-crispr-software-for-your-needs (2015).
  16. Engler, C., Marillonnet, S. Golden Gate Cloning. DNA Cloning and Assembly Methods. Valla, S., Lale, R. , Humana Press. New York, NY. 119-131 (2013).
  17. Zetsche, B., et al. Cpf1 Is a Single RNA-Guided Endonuclease of a Class 2 CRISPR-Cas System. Cell. 163 (3), 759-771 (2015).
  18. Abudayyeh, O., et al. C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector. Science. 353 (6299), (2016).

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जेनेटिक्स इश्यू १४० CRISPR एसोसिएटेड प्रोटीन 9 CRISPR gRNA गाइड आरएनए sgRNA pSB700
स्तनधारी सिस्टम्स के लिए CRISPR गाइड आरएनए क्लोनिंग
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Nageshwaran, S., Chavez, A., Cher… More

Nageshwaran, S., Chavez, A., Cher Yeo, N., Guo, X., Lance-Byrne, A., Tung, A., Collins, J. J., Church, G. M. CRISPR Guide RNA Cloning for Mammalian Systems. J. Vis. Exp. (140), e57998, doi:10.3791/57998 (2018).

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