Summary
ここでは、シンプルで効率的と sgRNA のクローニングのコスト効果の高い方法の通りです。
Abstract
輪郭を描かれたプロトコルは、効率的かつコスト効果の高い世代 Cas9 関連ガイド Rna の合理化された方法を説明します。互換性のあるベクトルのセットとの組み合わせで IIS 型制限酵素 BsmBI の使用率に基づくガイド RNA (gRNA) のクローニングのための 2 つの代替戦略のとおりです。生成されたベクトルを検証するサンガー シーケンス サービスへのアクセス、外特別な装置や試薬必要はありません以外現代分子生物学研究所に標準となっています。アウトライン メソッドは一度に 1 つの単一の gRNA または 1 つのペアの gRNA 表現のベクトルのクローニングのためのものでは主に。この手順は、gRNAs の数千を含むライブラリの生成は、スケーリングしません。それらの目的オリゴヌクレオチド合成オリゴ チップ合成などの代替エネルギー源をお勧めします。最後に、このプロトコルは哺乳類のベクトルのセットに焦点を当てて、一般的な戦略はプラスチック、すべての生物に適用できる適切な gRNA ベクトルが使用可能な場合。
Introduction
CRISPR 関連タンパク質 9 (Cas9) は、適切に設計された小さなガイド RNA (gRNA)1,2と複合体を形成するとき必要なゲノム目標に向かって指示される RNA 誘導エンドヌクレアーゼです。gRNAs は、ゲノムのターゲット シーケンスに相補的な 20 塩基配列シーケンス (protospacer) を構成します。ゲノムのターゲットの横にあるシーケンスは、3' protospacer 関連付けられたモチーフ (PAM)、Cas9 バインディングに必要であります。連鎖球菌感染症の Cas9 の場合 (SpCas9)、これは NGG のシーケンス。DNA ターゲットを結合、時に、Cas9 は、DNA、それにより関心の軌跡を変更するのには悪用することができます修復機構を刺激することの両方の鎖を裂きます。エラーが発生しやすい非相同末端結合 (NHEJ) 経路の活性化は、ターゲット遺伝子の混乱を可能性があります。また、修理で相同組換え刺激することが目的の DNA シーケンスの対象となる統合6ドナー テンプレートを指定した場合。ヌクレアーゼ死者 Cas9 (dCas9) のバリエーションも endonucleolytic 活動に欠かせない Cas9 内残基の変異によって生成された3をすることができます。dCas9 は、DNA 結合の能力のまま、そのバインドされているターゲットを切らないように。様々 なエフェクター ドメイン dCas9 を融合、遺伝子の転写開始部位に近い演出による選択的遺伝子発現誘導の部分のジーンサイレンシングの4,5dCas9 を使用できます。
信じられないほど強力なユーザーがまずターゲット サイトにユニークな gRNA を生成する Cas9 を使用して興味のゲノム シーケンスをターゲットにする能力が必要です。GRNA の発現ベクターを構築するための方法の様々 な以前、さまざまな効率の多くを説明して6,7,8のコストします。スタンドアロンの PCR 産物は、数時間内トランスフェクションするオリゴヌクレオチド配信からの急速なスクリーニングのため gRNAs として使用することがあります。ただし、Ultramer が必要です (以上 100 bp) オリゴ合成、高価な9であります。また、Ultramers よりも費用が gBlocks を購入することが可能です。Cas9 急速に現代分子生物学ツールキットの不可欠なコンポーネントとなっている、gRNA のクローニングのためのシンプル、安価で、非常に効率的な方法は、フィールドに恩恵をもたらすでしょう。ここで説明する方法は、2,000 以上のユニークな gRNAs4を生成する私たちのグループと過去数年間の共同研究所で採用されています。
アウトライン メソッドは、単一の gRNA またはせいぜい 2 つ gRNAs を含む互換性レンチウイルスベクターのクローニングのためのテクニックについて説明します。世代は、2 つ以上の gRNAs を含んでいるプラスミッドのまたは gRNAs のライブラリを複製する、代替的なアプローチは9、10、11,12が推奨されます。
Protocol
注: 次のプロトコルは、この原稿の詳細 gRNA プラスミド構築のすべての方式に共通である (1.1 から 1.4 のステップ)、オンラインのツールを使用して gRNA デザインを実行する方法をについて説明します。目的の gRNAs が識別されると、必要なオリゴヌクレオチドを注文するための手順は表現のベクトル (例えばpSB700) にオリゴヌクレオチドを導入するためのさまざまな方法と共に記載します。提示は損なった発現ベクター (ステップ 2-7.3) にどちらの結紮またはクローン作成 (手順 8 8.4) ゴールデン ゲートに基づく単一ガイドを表現するベクトルのクローニングのための 2 つの方法です。さらに説明はポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) 続いてゴールデン ゲート (手順 11 16) をクローニングを使用してクローン対ガイドを表現するベクトルの戦略です。最後に、大腸菌の化学的変化 (手順 9 9.6) と式ベクトル シーケンス検証 (ステップ 10 に 10.2.3) を実行するための一般的な方法のとおりもです。
- オンライン ツールを使用して次のように gRNA オリゴヌクレオチドをデザインします。
- SgRNA 得点 2.0 オンライン ツール (https://crispr.med.harvard.edu/sgRNAScorerV2/)13などのオンライン ツールや広範な sgRNA デザイン ツール (http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/ などの選択肢を使用してデザイン gRNAssgrna-デザイン)14といくつかの他15。
- 潜在的な gRNA のシーケンスを生成するのに遺伝子の名前、シンボル、または生の DNA ターゲット シーケンスを使用します。
注: 遺伝子または指定したシーケンスに対してすべての潜在的な gRNAs を持つスプレッドシート (.csv/.xls) ファイルが作成されます。広範な sgRNA デザイン ツールを使用している場合、潜在的な gRNAs の品質は、得点sgRNA 得点 2.0 のオンライン ツールを使用している場合、または% ターゲット効率として報告されます。両方の措置は、切削対象のアクティビティに基づいてに派生しています。 - GRNAs をランク付けするときは、gRNA 選択のターゲットからの活動を検討してください。
注: 最適なガイドは、最大のターゲットに効率と少なくともオフ対象のアクティビティ。活性化 (CRISPRa)、gRNAs 遺伝子の転写開始サイト (TSS)4,15の 1 200 bp を上流から地域を対象に設計されています。抑制 (CRISPRi)、gRNAs、50 から地域を対象に設計されています 300 まで TSS の bp を上流下流の TSS5bp。遺伝子の Cas9 の切断の使用を無効にするには、gRNAs は、開始コドン (gRNAs ターゲット遺伝子の 3' 末端がより少なく有効であること示されている) として13の下流コーディング シーケンスの最初の 10-50% をターゲットに設計されています。 - 内部の BsmBI サイトがないを確認オリゴヌクレオチドは、ゴールデン ゲートのクローン作成のために使用されている場合これは焼なましオリゴヌクレオチドになります13を消化されています。
- ゲノムのターゲット シーケンスを選択し、削除 3' NGG PAM (protospacer シーケンスのみを残して) シングル gRNA オリゴヌクレオチド シーケンス変更のため (例えばシーケンスを開始: CGCGTGCTCTCCCTCATCCATGG)。
注: ワークシートを使用する場合、次の数式は削除されます 3' NGG: =LEFT(A2,LEN(A2)-3)A2 のセルは、そのターゲット シーケンスおよび PAM 含んでいます。- オリゴの 5' 末端にCACCGを追加します。
注: pSB700 のバックボーンに結紮術は、時にこのシーケンスは、gRNA のトランスクリプションを運転する U6 プロモーターの 3' 末端を構成します。"CACC"シーケンスは、oligo BsmBI 消化 pSB700 ベクトルの張り出しと互換性のあることを保証します。"G"はポリメラーゼ III のプロモーターの要件であり、gRNA の転写の効率的な開始を確認します。スプレッドシートで次の数式を使用して、このタスクを実行する: =CONCATENATE("CACCG",(B2))B2 がセル protospacer シーケンスを含む [例えば、5' CACCG、protospacer にシーケンスを追加する: CACCGCGCGTGCTCTCCCTCATCCA (これですが注文最終前方オリゴ)] - Protospacer シーケンスの逆の補数 (rc) を作成します。
注: たとえば、前述の protospacer の逆の補数は TGGATGAGGGAGAGCACGCG です。 - Rc protospacer の 5' 末端に AAAC を追加します。Rc protospacer (逆オリゴ) の 3' 末端に追加 C を追加します。
メモ:"AAAC"シーケンスは、oligo BsmBI 消化 pSB700 ベクターにクローニングに互換性があることを確認します。発信側の"G"は、前方のオリゴを追加するシーケンスをアニールする 3' 端に追加の"C"です。これを実行するワークシートに次の数式を使用してタスクの=CONCATENATE("AAAC",(C2),"C")C2 がセルを逆の補数シーケンス [例えばAAACTGGATGAGGGAGAGCACGCGC (これは、最終的な逆オリゴを含む命じた)]
- オリゴの 5' 末端にCACCGを追加します。
- オリゴヌクレオチドの追加変更なしで、オリゴヌクレオチドを注文します。
- 非常にごく少量のクローニングの反作用のために必要な最小限の必要なオリゴを注文します。
- 1 TE バッファー (10 mM Tris Cl、1 ミリメートルの EDTA、pH 7.5) x 100 μ M の最終的な集中に凍結乾燥させたプライマーを薄くしなさい。
- 分注 1:1 前方および逆引きオリゴヌクレオチド (例えば、10 μ L 各) PCR ストリップ キャップ チューブに。
注: これは、マルチ チャンネル ピペットを使用して一度に多くの gRNAs の迅速なクローニングなります。- 渦とスピン ダウン オリゴ混合物 (100 x 15 g s)。結紮を設定する前に 5 分間室温で反応を孵化させなさい。
注: 熱し、のアニーリングを容易にする oligo の混合物を冷却する必要はありません。GRNA オリゴヌクレオチドの 3-4 組のプールし、焼なましを単一の反作用で可能性があることは注目に値するがそれ (例えばフォワードのミックス 3 μ L、3 μ から逆にオリゴヌクレオチド一緒に最大 4 gRNA オリゴ ペア、24 μ L の総ボリュームを与える)。アニール用オリゴヌクレオチドのボリュームは、ユーザーのニーズに合わせて調整できます。
注: 手順 6 7.3 は、pSB700 の predigestion をについて説明します。別の方法、シングル ステップ BsmBI 制限結紮について説明します手順 8 を参照してください。
- 渦とスピン ダウン オリゴ混合物 (100 x 15 g s)。結紮を設定する前に 5 分間室温で反応を孵化させなさい。
- BsmBI で選択した pSB700 ガイド式ベクトルの 1-5 μ g を消化 (1 μ g 当たり 0.5 μ L) 55 ° C の15で 1 時間。40 μ L (表 1) の総量 pSB700 gRNA 発現ベクターの消化を行います。
- 1.5% (重量/巻) 低融点アガロース ゲルの消化力製品を実行します。
- ~ 9 kb のサイズのフラグメントに対応する消化ベクター バックボーン帯域をカットし、1.5 mL 容マイクロ チューブ (図 1) ゲルのスライスを配置します。
- 商業ゲル精製キットを使用して、製造元の指示に従って agarose のゲルから DNA を抽出します。
- 10-15 μ L TE バッファー (10 mM トリス、pH 7.5; 10 mM トリス、pH 8.0) 集中の溶出液を取得するのに DNA を溶出します。
- GRNA オリゴヌクレオチドの事前消化 pSB700 発現ベクターへのクローニングの 20 μ L 反応 (表 2) に BsmBI 消化 pSB700 ガイドの発現ベクターに手順 4 から焼鈍 gRNA オリゴヌクレオチドを縛る。
- まず、水、バッファー、および DNA、そして渦混合物を追加し、酵素、酵素とソリューションのスピンダウンを追加したら 1 の最終的な時間の渦を追加 (100 x 15 g s)。室温で反応を一晩インキュベートします。
- BsmBI 消化ベクトル焼なまし gRNA オリゴ インサートなし一人で否定的なコントロールのない挿入反応が含まれます。水 1 μ L は、ノー挿入のネガティブ コントロール用 gRNA オリゴヌクレオチドの 1 μ L の代わりに使用できます。
- 変換 (手順 9) に進みます。
注: 手順 8 は predigestion の pSB700 6-7.3 の手順で説明するように別の方法です。
- ゴールデン ゲートは、シングル ステップ BsmBI 制限結紮のクローニングを使用して pSB700 ベクトルに gRNA オリゴヌクレオチド (手順 1 5.1 で説明します) をご紹介します。
- マスター ミックス (1 x) を組み立てる — 複数の gRNAs のクローンを作成する場合 (表 3) を追加挿入オリゴヌクレオチドなしマスター ミックスを準備します。分注マスター PCR チューブにミックスし、マルチ チャンネル ピペットを使用してステップ 4.2 から gRNA オリゴヌクレオチドを追加します。水の 1 μ L を使用してなし挿入コントロールを含めます。
- な BsmBI 酵素と同じ反応で T4 DNA リガーゼ、同時制限の消化力および結紮術が達成される (すなわち、ゴールデン ゲートのクローン)。次の簡単なゲート プロトコルを使用してベクトルを消化し、1 の反応で挿入を縛る: 80 の ° C、15 分間で、15 分の 65 ° C で 10 分間に 50 ° c の 2 h の 37 ° C で反応を維持、最終的に、4 ° C でそれを保持します。
- 注記のうち、オリゴヌクレオチドがこのメソッドを使用する前に BsmBI サイトを含まないことを確認します。複製されている、gRNAs は、BsmBI の制限のサイトを含む場合は、BsmBI の添加によって消化されます。これにより、ユーザーが任意の形質転換体を取得できなくなります。
- 初期の単純なゲート反応後各反応に BsmBI 酵素の追加 0.5 μ L を追加し、55 ° C 1 時間に戻って配置します。消化力の後 4 ° C で反応を保持または変換する準備ができるまで凍結します。Religated 野生型 pSB700 ベクトルの反応混合物からバックボーン、オリゴ挿入を受けた唯一のベクトルはそのまま残ります、形質転換体を得るまたは制限の酵素培養のこの第二ラウンドが、未消化削除します。
- 変換 (手順 9) に進みます。
- 0.5 μ L の反応混合物を変換 8 μ l 中、有能なエシェリヒア属大腸菌[例えば、くちばし DH5a (1-3 109 cfu/μ g pUC19 DNA の x) またはくちばし安定 1 - 3 x 109 cfu/μ g pUC19 dna)。レンチ ウイルスのプラスミド NEB 安定細胞はより一貫性のあるプラスミッドの利回りを提供します。
- -80 ° c のストレージから大腸菌を削除し、5-10 分のための氷の融解します。
- 有能なエシェリヒア属大腸菌の 8 μ L を反応混合物の 0.5 μ L を追加し、30 分間氷の上混合物。
- 熱衝撃 45 42 ° C で混合 s。
- 2 分間氷の上に置きます。
- くちばし DH5a 37 ° C で、NEB の馬小屋のための 30 の ° C で 1 時間 250 μ L の SOC のメディアでシェーカーの文化を回復します。
- 適切な抗生物質耐性ホストゲノム スープ (LB) プレート上のカルチャの 80 μ L をプレートし、くちばし DH5a 37 ° C で、NEB の馬小屋のための 30 の ° C で、一晩インキュベート [例えばpSB700 でメッキされてポンドにアンピシリン (100 μ g/mL) 板] (図 3)。
- GRNA 発現プラスミドのシーケンスの検証: 各コロニー サンガー、プライマー 5'-GAGGGCCTATTTCCCATGATTCC-3 を使用してシーケンスのシーケンスを確認 ' U6 プロモーター上流でどの素数 gRNA オリゴの挿入します。
- (表 4) のシーケンス処理反応あたり 2 3 人のコロニーを拾います。
注: いくつかのシーケンス プロバイダー提供サービス今はサンガーを実行できるシーケンスの前にプラスミドを浄化する必要性を排除することによって時間とコストを大幅に削減する細菌のコロニーから直接シーケンスします。また、個々 の細菌のクローンからプラスミド DNA を回復するプラスミド分離キットを使用することがあります。精製プラスミドは、シーケンスの提出可能性があります。プールの ligation の反作用を実行する場合は、ガイドとして表 4を使用して、選択および配列のために提出すべきコロニー数の。 - 次のシーケンス確認 gRNA 発現プラスミドを分離します。
- 100 μ g/mL pSB700 発現ベクターのアンピシリンを含む LB 培地 5 mL 文化に目的のコロニーを接種するのに滅菌ピペット チップを使用します。
- 37 ° C 一晩 (30 ° C NEB の馬小屋を使用している場合) で 100 rpm で回転のインキュベーターで細胞を成長します。
- プラスミッドの準備キット、次の製造元のプロトコルを使用して文化からのプラスミッド DNA を分離します。
注: 上記の方法は、単一の gRNA を含むベクトルを作成するユーザーをできるように中、このプロトコルはそれぞれ自分の RNA ポリメラーゼ III のプロモーターによって駆動される 2 の gRNAs を含むベクトルを作成するユーザーを許可します。
- (表 4) のシーケンス処理反応あたり 2 3 人のコロニーを拾います。
- 対 gRNA デザイン (手順 1.1 1.4) 上記 sgRNA デザイン ツールから出力ファイルを使用し、興味の 2 ガイドを選択します。
- 少なくとも 30 ガイドのペアを選択アクティブ化または抑圧は、nt を離れて。
- 切断用 gRNAs、ターゲット遺伝子内 2 異なるエクソン ガイドを選択します。
- 以下の手順では、gRNA の配列の最初の gRNA とペア gRNA オリゴヌクレオチド シーケンス変更を作成する配列 gRNA - b の 2 番目の gRNA を指定します。
注意: gRNA A を作成するために使用するオリゴをコール、fA、および rB と呼ばれるが逆オリゴ gRNA B を紹介するために使用します。下のクローンの作成方法は、gRNAs のそれぞれの 5' 端に開始 G を自動的に追加します。- 適切な fA オリゴをとおり作成します。
注: gRNA A はシーケンスをターゲット gRNA を含む 20 ヌクレオチドは、する、次の手順を (例えばprotospacer - aggggctacaccactcattg) 建設初期の fA シーケンスを構成します。- FA (例えば、シーケンス TTTTCGTCTCTCACCGaggggctacaccactcattg の) の 5' 末端に TTTTCGTCTCTCACCG を追加します。
- FA (例えば、シーケンス TTTTCGTCTCTCACCGaggggctacaccactcattgGTTTTAGAGCTATGCTGAAAAGCAの) の 3' 末端にGTTTTAGAGCTATGCTGAAAAGCAを追加します。これは注文する fA oligo の最終版です。
- 必要な rB オリゴをとおり作成します。
注: gRNA b gRNA ターゲット シーケンスを構成する 20 のヌクレオチドはする、次の手順を (例えば、開始シーケンス gtcccctccaccccacagtg の) 建設初期の rB シーケンスを構成します。- RB の逆の補数を取る= (revcom) rB (例えばcactgtggggtggaggggac)。
- (Revcom) の 5' 端に TTTTCGTCTCTAAAC を追加 rB (e.g。、TTTTCGTCTCTAAACcactgtggggtggaggggac)。
- (Revcom) の 3' 末端にCGGTGACCCAGGCGGCGCACAAGを追加 (例えば、TTTTCGTCTCTAAACcactgtggggtggaggggacCGGTGACCCAGGCGGCGCACAAG) rB。これは注文する rB oligo の最終版です。
注: oligo シーケンスを自動的に編集するのには一般的な表計算ソフトで次の数式を使用する可能性があります: = CONCATENATE("TTTTCGTCTCTCACCG",(A2)"GTTTTAGAGCTATGCTGAAAAGCA")、A2 は fA シーケンス、およびを含むセル =CONCATENATE("TTTTCGTCTCTAAAC",(B2)、「CGGTGACCCAGGCGGCGCACAAG」)B2 は (revcom) rB シーケンスを含むセル。
- 適切な fA オリゴをとおり作成します。
- 最適な合成ベンダーからオリゴヌクレオチドを注文します。追加の変更は必要ありません。
- FA、rB のプライマーで PCR を実行するのに準備されたプラスミド DNA を使用します。これが両方の前方に接続され、このプラスミドから生成された PCR のフラグメントに逆 gRNAs はそれぞれ独自のプロモーターから発現することを許可する (U6 及び 7SK のプロモーター-異なるプロモーターは、組換えウイルスを防ぐためにこの設計で使用される)。
- Phusion GC 特別な PCR のプロトコルを使用して、必要なフラグメントを作成する: 15 98 ° C で 1 分 (1 サイクル)、98 ° C で混合物を維持 15 53 ° c s s、2 分の 65 ° c と 4 分 (30 サイクル) のための 72 ° c、し、4 ° c (表 5) 押し。
- 1% の agarose のゲルの PCR の製品を実行し、確認その 1 バンド ~ 490 見て bp (図 2)。
- カットし、選択のゲルの抽出キットを使用してこの PCR の製品を抽出します。TE バッファー (10 mM トリス、pH 7.5; 10 mM トリス、pH 8.0) の 15 μ L に DNA を溶出あるいは蒸留水します。
- DNA のモル計算の分光光度計と pSB700 ベクトルのそれと一緒に抽出した製品の濃度を測定します。PCR の製品と 40 femtomoles/μ L の濃度にベクトルを正規化します。
注: いくつかのウェブサイトが DNA とその濃度の長さに基づいて与えられた DNA 溶液のモル濃度の計算を支援するために利用できる (例えばPromega: http://www.promega.com/a/apps/biomath/index.html?calc=ugpmols)。電卓は数式を使用してください。
ここで、N は塩基配列の長さです。
- PSB700 ベクトルに PCR のフラグメントをクローンするステップ 8-8.4 で説明したプロトコルを使用して同時制限消化とライゲーション反応を設定します。
- プライマー溶液 1 μ L を反応に追加すると、代わりに 1 μ L の PCR の製品の 40 fmole/μ L を追加します。また、40 fmole/μ L の濃度で pSB700 ベクトルの 1 μ L を使用します。
注: 正確な比率を使用されない場合でも植民地を得ることができるが、等しいのモル比は、一貫性のある結果をもたらします。
- プライマー溶液 1 μ L を反応に追加すると、代わりに 1 μ L の PCR の製品の 40 fmole/μ L を追加します。また、40 fmole/μ L の濃度で pSB700 ベクトルの 1 μ L を使用します。
- 完了するとゴールデン ゲート反応プロセス (手順 8-8.4)、変換およびシーケンスの確認 (手順 9 - 10.2.3) に進みます。
Representative Results
このプロトコルで説明する方法は、どちらかのシングルまたはペアの gRNA 発現ベクターの作成です。ベクトルを表現する 1 つの gRNA を作成するいずれかの後に短いオリゴヌクレオチドのシリーズで縛ることまたはクローニング ベクター バックボーンを同時に消化し、それを縛るゴールデン ゲートを使用してベクター バックボーン (図 1) を用いなければな単一の反作用で短いオリゴヌクレオチドのシリーズ。カスタムの PCR のフラグメント (図 2) を複製することによって、独自の独立したプロモーターの駆動 2 gRNAs を含まれているベクトルを作り出す方法もまた提供されます。
アウトライン化されたプロトコルのいずれかの巧妙なクローニングは、なし挿入コントロール プレート (図 3) により適切な挿入 DNA を使用した変換のはるかに大きなコロニーの外観になります。
図 1: pSB700 gRNA 発現ベクターの消化します。1% アガロースゲルを使用します。レーン 1: ノーカット pSB700。レーン 2: pSB700 は BsmBI でカット。
図 2: gRNA PCR をペアします。1% アガロースゲルを使用します。レーン 1: ~ 490 のペア ガイド PCR フラグメント bp。
図 3: 成功のクローニングと gRNA プラスミドの変換。左側のパネルは LB を示しアンピシリン プレートは正常にコロニーを変換します。右側のパネルでは、植民地を示さないなし挿入コントロール プレートを示しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| pSB700 ガイド発現ベクター | 1-5 μ g |
| NEB バッファー 3.1 | 4 Μ L |
| BsmBI | 1 Μ L |
| 蒸留水 | 40 μ L まで |
| 総容積 | 40 Μ L |
表 1: BsmBI と pSB700 gRNA 発現ベクターの制限消化。
| 軟 gRNA oligos (単一引用符またはプールされた反応) | 1 Μ L |
| BsmBI 消化 pSB700 ガイド発現ベクター | 1 μ L (100 ~ 250 ng) |
| T4 DNA リガーゼ反応バッファー x 10 | 2 μ L (終濃度 x 1) |
| T4 DNA リガーゼ | 1 μ L (120 台) |
| 蒸留水 | 15 Μ L |
| 総容積 | 20 μ l |
表 2: 結紮の反応 gRNA オリゴヌクレオチド損なった pSB700 gRNA 発現ベクターに。
| 試薬 | ボリューム (1 x) |
| H2O | 6 Μ L |
| T4 リガーゼ | 0.5 Μ L |
| ATP | 1 Μ L |
| BsmBI | 0.5 Μ L |
| NEB バッファー 3.1 | 1 Μ L |
| ベクトル (例えばpSB700) (40 fmol) | 1 μlL |
| -前方の挿入し、逆 oligos またはデュアル ガイド (40fmol) のための PCR のフラグメント | 1 μ L (0.5 μ L 前方と逆 0.5 μ L) |
表 3: シングル ステップ BsmBI 制限と gRNA の ligation の反作用をミックスします。
| 1 ガイド | シーケンス 3 コロニー |
| 2 ガイド | 5-10 コロニーをシーケンスします。 |
| 3 ガイド | 10-15 コロニーをシーケンスします。 |
| 4 ガイド | 15-20 コロニーをシーケンスします。 |
表 4: 反応のクローン作成プール gRNA のシーケンスにコロニーの推奨される数。
| PCR コンポーネント | 50 μ L 反応 |
| 10 μ M 前方プライマー | 2.5 Μ L |
| 10 μ M 逆プライマー | 2.5 Μ L |
| 5 x Phusion HF または GC バッファー | 10 Μ L |
| 10 mM dNTPs | 1 Μ L |
| テンプレート DNA | 100 ng |
| Phusion DNA ポリメラーゼ | 0.5 Μ L |
| ヌクレアーゼ フリー水 | 50 μ L まで |
表 5: 対 gRNA PCR の混合。
Discussion
GRNA 発現ベクター構築が数時間とコストを節約変更されました。対 gRNA 発現用ベクター構築の方法だけでなく、シングル ステップ制限およびライゲーション プロトコルを説明します。対 gRNA 式は前方 gRNA ターゲット シーケンス (n20) と別のターゲット (n20) 逆の補数の両方を含むオリゴヌクレオチドを使用して pcr によって実現されます。これはそこで従来単一 gRNA 発現プラスミドを表現 sgRNA 尾だけでなく、セカンダリ RNA Pol III プロモーター (7SK) を紹介します。
注意オリゴヌクレオチド設計対 gRNA 建設だけでなく、粘着性がある端結紮のため正常な PCR が保証されます。次のシングル ステップの制限および ligation の反作用、さらに BsmBI の付加反応ですべて変更されていない表現のベクトルをカットになります。これは、変換時に背景を削減します。30 ° C で NEB 安定した有能なエシェリヒア属大腸菌と成長を使用して、成功した変換の増収します。
この手法は、一般的なベスト プラクティス メリット オリゴヌクレオチド gRNA 発現ベクターのシングル ステップの制限と、オリゴヌクレオチドおよび従来を活用する能力の結紮、熱処理の工程の簡略化単一 gRNA 対ガイドの表現のための表現のベクトル。プロトコルはここで哺乳類のベクトルのセットに焦点を当てて説明、一般的な戦略はプラスチック、すべての生物に適用できる適切な gRNA ベクトルが利用できます。全体的にみて、説明されたプロトコルは、時間とコストを保存します。
ただし、個々 のオリゴヌクレオチドを購入の輪郭を描かれたプロシージャが gRNAs の数千を含むライブラリの生成にも対応していません。それらの目的オリゴヌクレオチド合成オリゴ チップ合成などの代替エネルギー源をお勧めします。
GRNAs を複製する際の挿入コントロールを含めることが有益です。この反応は興味の反応と並行を簡単に設定することができます、開始のベクトルの不完全な消化力がプロシージャの最後で観測された植民地に貢献しているかどうかを決定するため使用することができます。さらに、不完全消化ベクター バックボーンまたは貧しいライゲーション効率のため上記のクローニング プロトコルの 1 つが故障した場合、クローニング法概説した代替をしようとしているをお勧めします。
クローニング ベクトルをダイジェストと単一の反作用の内で小さいオリゴヌクレオチドで縛ると同時にゴールデン ゲートを使用する場合それは t につながるベクターにクローンを作成する gRNA に、BsmBI サイトが設定されていないことを確認することが重要カットされて彼 gRNA と変換時にコロニーの不在。
記載されている戦略をクローン作成 gRNA は、オリゴヌクレオチドの合成とシーケンスの検証から来るコストの大部分をガイド、1 〜 10 ドルで gRNAs の迅速かつコスト効果の高い生成を有効。 にします。プロトコルは Cas9 第オーソロガスまたはベクター バックボーンにわずかな変更で Cpf1 や C2C2 などその他の RNA 誘導酵素で使用する合わせることが簡単にできるアウトライン メソッドは SpCas9 で使用するための gRNAs を生成するユーザーを許可するように設計されていますが、オリゴヌクレオチドのオーバー ハングは、16,17 をシーケンスします。
上記で説明したプロトコルは、シーケンス確認 gRNA 発現プラスミド (適切に設計されたオリゴヌクレオチドで始まる)、3 d 現在の方法よりも大幅に高速であります。これは含まれています 1 h (ステップ 1 2.3) と希釈 10 分 (ステップ 3 5.1)、消化 2 h (ステップ 6 6.4)、predi への gRNA オリゴヌクレオチドのクローニングの pSB700 gRNA 発現ベクターの浄化のオリゴヌクレオチドの因数の gRNA デザインgested pSB700 gRNA 発現ベクターは宿泊部屋の温度 (ステップ 7 7.3)、3 時間 40 分 (ステップ 8-8.4) のシングル ステップ BsmBI 制限結紮、16 h (手順 9 9.6) の変換、gRNA 発現プラスミドのシーケンスの検証24 h の (サンガー シーケンス可用性と次の細菌のコロニーの送信速度に応じて期間 10 のステップ)。対 gRNA 設計やシーケンス変更 1 h (手順 11-13) がかかります。対 gRNA PCR 3.5 h (手順 14 14.4) がかかります。3 時間 40 分 (ステップ 15-16) は、pSB700 ベクトルに PCR のフラグメントのクローニングします。
このプロトコルに直面する可能性が高い問題は、ゴールデン ゲート アセンブリの変換効率に関連します。アセンブリの効率を視覚化するゴールデン ゲート組み立て中の挿入コントロールを含めます。変換、puc19 の肯定的な制御は変換効率制御を提供します。NEB 安定大腸菌はレンチ ウイルスの互換性のあるプラスミッドのため使用する必要があり、目に見えるコロニーに屈する 30 ° c まで > 16 h を頻繁に必要があります。
Disclosures
ジョージ ・ m ・教会が Editas とカリブー生命機能研究科 CRISPR Cas9 ゲノム編集技術を商業化する目的で資本 (完全な情報開示一覧については、http://arep.med.harvard.edu/gmc/tech.html を参照してください)。
Acknowledgments
Sathiji Nageshwaran は、フリードライヒ失調症研究アライアンスによってサポートされている (07340305-01) および国民運動失調財団フェローシップ (7355538-01)。アレハンドロ チャベスは、医療科学者の国立癌研究所助成金 5T32CA009216-34 とバローズ Wellcome 基金キャリア賞によって賄われていた。ジョージ ・ m ・教会によって、米国国立衛生研究の健康 (NIH) はサポートされて国立ヒトゲノム研究所助成金 RM1 HG008525 と生物学的影響を与えた工学研究所ウィース。ジェームズ ・ j ・ コリンズは、防衛脅威の減少代理店グラント HDTRA1-14-1-0006 とポール g. アレン フロンティア グループの支援を認めています。アレハンドロ チャベスは、デュアル ガイド クローニング法を開発しました。ナン シェール ヨ、アレハンドロのチャベス大統領は、Sathiji Nageshwaran は、すべての著者から入力の原稿を書いた。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BsmBI | New England Biolabs | R0580L | |
| T4 DNA ligase | Enzymatic/New England Biolabs | L6030-LC-L/M0202S | |
| Buffer 3.1 | New England Biolabs | B7203S | |
| Adenosine 5'-Triphosphate (ATP) | New England Biolabs | P0756S | |
| QIAprep spin miniprep kit | Qiagen | 27104 | |
| Chemically competent E. coli | New England Biolabs | C3019l, C2987l, or C3040H | |
| Standard microcentrifuge tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 0030 125.150 | |
| Axygen 8-Strip PCR tubes | Fischer Scientific | 14-222-250 | |
| Thermocycler with programmable temperature-stepping control | BioRad, | 1851148 | |
| UV spectrophotometer (NanoDrop 2000c) | Thermo Scientific | ||
| pSB700 plasmid | Addgene | #64046 | |
| NEB Stable Competent E. coli (High Efficiency) | New England Biolabs | c3040 | |
| Lysogeny broth (LB) | |||
| Ampicillin | |||
| TE buffer (1 mM EDTA, 10 mM Tris-Cl, pH 7.5) | |||
| pSN007 plasmid | Addgene | 102440 |
References
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