Summary
Her, er en enkel, effektiv og kostnadseffektiv metode for sgRNA kloning skissert.
Abstract
Skissert protokollen beskriver strømlinjeformet metoder for effektiv og kostnadseffektiv generasjon av Cas9-assosiert guide RNAs. To alternative strategier for guide RNA (gRNA) kloning er beskrevet, basert på bruken av typen IIS begrensning enzymet BsmBI i kombinasjon med en kompatibel vektorer. Utenfor tilgang til Sanger sekvensering tjenester å validere genererte vektorer, er ingen spesielt utstyr eller reagenser nødvendig bortsett fra de som standard til moderne molekylærbiologi laboratorier. Metoden skissert er primært ment for kloning en enkelt gRNA eller en tilkoblet gRNA-uttrykke vektor samtidig. Denne fremgangsmåten gjør målestokken ikke bra for generering av biblioteker som inneholder tusenvis av gRNAs. For disse formål anbefales alternative kilder til oligonucleotide syntese som oligo-chip syntese. Til slutt, mens denne protokollen fokuserer på et sett av pattedyr vektorer, den generelle strategien er plast og gjelder alle organisme, hvis riktig gRNA vektoren er tilgjengelig.
Introduction
CRISPR-assosiert protein 9 (Cas9) er en RNA-guidede endonuclease som er rettet mot et ønsket genomisk mål når kompleksbundet med en riktig utformet liten guide RNA (gRNA)1,2. gRNAs består av en sekvens med 20-nukleotid (protospacer), hvilke er supplerende å genomisk målet sekvensen. Genomic målet er sekvensen et 3 protospacer-assosiert motiv (PAM), som kreves for Cas9 binding. Når det gjelder Streptococcus Pyogenes Cas9 (SpCas9), har rekkefølgen NGG. Ved bindende DNA målet, kløyver Cas9 begge tråder av DNA, derved stimulere reparasjon mekanismer som kan utnyttes til å endre locus interesse. Aktivering av feilutsatte ikke-homologe slutten-begynte (NHEJ) veien kan forårsake avbrudd med et mål. Alternativt kan reparasjoner utført via en homologe rekombinasjon stimulere målrettet integrering av en ønsket DNA sekvens hvis en donor mal gis6. Nuclease-død Cas9 (dCas9) varianter kan også bli generert3 ved å mutere rester i Cas9 som er avgjørende for endonucleolytic aktivitet. dCas9 forblir kompetent for DNA bindingen men kutte ikke bundet målet. Fusing ulike effektor domener til dCas9 og beordrer nær et gen transcriptional startwebstedet, kan dCas9 brukes for selektiv genet induksjon eller delvis genet stanse4,5.
Mens det er utrolig kraftig, krever muligheten til å bruke Cas9 til å målrette en genomisk sekvens av interesse at en bruker først genererer en gRNA som er unike for målet (r). En rekke metoder for å bygge gRNA uttrykk vektorer har tidligere blitt beskrevet, mange av varierende effektivitet og koster6,7,8. Frittstående PCR-amplicons kan brukes som gRNAs for rask screening, kommer fra oligonucleotide levering til transfection i flere timer; Dette krever imidlertid Ultramer (over 100 bp) oligo syntese, som er dyre9. Det er også mulig å kjøpe gBlocks som er mer kostnadseffektive enn Ultramers. Som Cas9 har raskt blitt en integrert del av det moderne molekylærbiologi verktøyet, ville en enkel, rimelig og svært effektiv metode for gRNA kloning være en boon til feltet. Metoden beskrevet her har vært ansatt i vår gruppe og samarbeidende laboratorier for de siste flere år å generere over 2000 unike gRNAs4.
Metoden skissert fokuserer på teknikker for kloning av lentiviral kompatibel vektorer som inneholder en enkelt gRNA eller minst to gRNAs. For generering av plasmider som inneholder mer enn to gRNAs, eller å klone et bibliotek med gRNAs, anbefales alternative tilnærminger9,10,11,12.
Protocol
Merk: Følgende protokollen beskriver hvordan du utfører gRNA design bruke nettverktøy (trinn 1.1-1.4), som er felles for alle metoder for gRNA plasmider konstruksjon i dette manuskriptet. Når de ønskede gRNAs er identifisert, er trinnene for bestilling de nødvendige oligonucleotides beskrevet med flere forskjellige metoder for å introdusere oligonucleotides i uttrykket vektorer (f.eks, pSB700). Presenteres er 2 metoder for kloning enkelt guide-uttrykke vektorer basert på enten hemorroider i en predigested uttrykk vektor (trinn 2-7.3) eller Golden Gate kloning (trinn 8-8.4). Videre skissert er en strategi for kloning sammenkoblede guide-uttrykke vektorer ved hjelp av polymerasekjedereaksjons (PCR) etterfulgt av Golden Gate kloning (trinn 11-16). Til slutt, markeres også vanlige metoder for å utføre en E. coli kjemiske transformasjon (trinn 9-9.6) og en uttrykk vektor sekvens validering (trinn 10 til 10.2.3).
- Utforme gRNA oligonucleotides bruke nettverktøy som følger.
- Design gRNAs med nettbaserte verktøy som sgRNA Scorer 2.0 online verktøy (https://crispr.med.harvard.edu/sgRNAScorerV2/)13 eller alternativer som verktøyet for bred sgRNA design (http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/ sgrna-design)14 og flere andre15.
- Bruke genet navn, symbol eller rå DNA målet sekvenser for å generere potensielle gRNA sekvenser.
Merk: En regnearkfil (.csv/.xls) med alle mulige gRNAs mot genet eller angitte sekvensen er opprettet. Kvaliteten på den potensielle gRNAs vil bli rapportert som Score hvis sgRNA Scorer 2.0 online verktøyet brukes, eller som % effektivitet på målet hvis bred sgRNA design verktøyet brukes. Begge målene er utledet på basert på på målet kutte aktiviteten. - Vurdere Off-målet aktivitet i gRNA valg når rangering i gRNAs.
Merk: Optimal guider er de største på målet effektiviteten og minste off-målet aktiviteten. For aktivisering (CRISPRa), er gRNAs utformet for å målrette regionen fra 1-200 bp oppstrøms av transcriptional start området (TSS)4,15. For hemming (CRISPRi), gRNAs er utformet for å målrette regionen fra 50 bp oppstrøms av TSS inntil 300 bp nedstrøms av TSS5. Hvis du vil deaktivere et gen bruker Cas9 kutte, er gRNAs utformet for å målrette de første 10-50% av koding sekvensen nedstrøms av initiering codon (som gRNAs målgruppe 3 slutten av genet har vist seg å være mindre effektive)13. - Sikre ingen interne BsmBI områder er tilstede hvis oligonucleotides blir brukt til Golden Gate kloning, da dette vil føre til glødet oligonucleotides blir fordøyd13.
- Velg sekvensene som genomisk mål og fjerne det 3' NGG PAM (forlater bare protospacer sekvensen) for enkelt gRNA oligonucleotide sekvens endringen (f.eksstarte sekvensen: CGCGTGCTCTCCCTCATCCATGG).
Merk: Hvis du bruker et regneark, fjernes følgende formel 3-' NGG: =LEFT(A2,LEN(A2)-3), der A2 er cellen som inneholder målet sekvensen og PAM.- Legg CACCG til 5' nederst i oligo.
Merk: På hemorroider til pSB700 ryggraden, denne sekvensen vil omfatte hele 3 U6 arrangøren kjøring transkripsjon av gRNA. "CACC" serien sikrer at oligo er kompatibel med overheng av BsmBI-fordøyd pSB700 vektoren. "G" er et krav for Polymerase III arrangører og sikrer effektiv initiering av transkripsjon av gRNA. Bruk følgende formel i et regneark til å utføre denne oppgaven: =CONCATENATE("CACCG",(B2)), der B2 er cellen som inneholder den protospacer sekvensen [f.ekslegge den 5' CACCG sekvens til protospacer: CACCGCGCGTGCTCTCCCTCATCCA (dette er den endelige frem oligo som er bestilt)]. - Opprette et omvendt supplement (rc) av protospacer sekvensen.
Merk: For eksempel det omvendte supplement av den nevnte protospacer er TGGATGAGGGAGAGCACGCG. - Legg AAAC 5' slutten av de radiostyrte protospacer. Legge en ekstra C 3 slutten av de radiostyrte protospacer (omvendt oligo).
Merk: "AAAC" serien sikrer at oligo er kompatibel for kloning i BsmBI-fordøyd pSB700 vektor. Flere "C" på slutten 3 er nødvendig å anneal sekvensen til initiering "G" lagt til den frem oligo. Bruk følgende formel i et regneark til å utføre denne oppgaven =CONCATENATE("AAAC",(C2),"C"), der C2 er cellen som inneholder omvendt supplement sekvensen [f.eksAAACTGGATGAGGGAGAGCACGCGC (dette er den siste omvendte oligo som er bestilt)].
- Legg CACCG til 5' nederst i oligo.
- Bestill oligonucleotides, med ingen andre endringer på oligonucleotides.
- For minimalt med oligo nødvendig, bare svært små beløp er behov for kloning reaksjonene.
- Fortynne lyofilisert primere for en siste konsentrasjon av 100 μM i 1 x TE buffer (10 mM Tris-Cl, pH 7.5 med 1 mM EDTA).
- Aliquot 1:1 revers oligonucleotides (f.eks, 10 μL hver) i PCR strip-cap rør.
Merk: Dette vil tillate rask kloning av mange gRNAs samtidig med en flerkanals pipette.- Vortex og spinn ned oligo blandinger (100 x g 15 s). Inkuber reaksjonen ved romtemperatur for 5 min før ligation.
Merk: Det er ikke nødvendig å varme og kjøle oligo blandinger for å lette deres avspenning. Det er verdt å merke seg at 3-4 parene av gRNA oligonucleotides kan være samlet og herdet i en enkelt reaksjon (f.eks, blanding 3 μL fremover og 3 μL omvendt oligonucleotides sammen fra opptil 4 gRNA oligo par, gir et totalt volum på 24 μL). Volumet av oligonucleotides brukes for annealing kan justeres for å imøtekomme brukernes behov.
Merk: Trinn 6-7.3 beskriver predigestion av pSB700. Hvis en alternativ metode, se trinn 8, som beskriver en enkelt-trinns BsmBI begrensning ligation.
- Vortex og spinn ned oligo blandinger (100 x g 15 s). Inkuber reaksjonen ved romtemperatur for 5 min før ligation.
- Fordøye 1-5 μg i den valgte pSB700 guide uttrykk vektoren med BsmBI (0,5 μL per 1 μg) 1t 55 ° C15. Gjennomføre fordøyelsen av pSB700 gRNA uttrykk vektor i et totalt volum på 40 μL (tabell 1).
- Kjør fordøyelsen produktene på 1,5% (wt/vol) lav-smeltende agarose gel.
- Kuttet ut fordøyd vektor ryggrad bandet som tilsvarer et fragment av ~ 9 kb inne størrelse og plassere gel sektoren i en 1,5 mL microcentrifuge tube (figur 1).
- Bruk en kommersiell gel rensing kit for å ekstra DNA fra agarose gel i henhold til produsentens instruksjoner.
- Elute DNA i 10-15 μL TE buffer (10 mM Tris, pH 7,5; 10 mM Tris, pH 8.0) for å få et konsentrert eluate.
- Ligate glødet gRNA oligonucleotides fra trinn 4 i BsmBI-fordøyd pSB700 guide uttrykk vektor i en 20 μL reaksjon (tabell 2) for kloning av gRNA oligonucleotides i pre-oversikten pSB700 uttrykk vektor.
- Først legge vann, buffer, og DNA, så virvle blandingen og Legg enzymet, vortex 1 siste gang etter enzym og rotere ned løsningen (100 x g 15 s). Inkuber reaksjonene i romtemperatur over natten.
- Inkluder en nei-sette negativ kontroll reaksjon som har en BsmBI-fordøyd vektor alene, uten glødet gRNA oligo insert. 1 μL vann kan brukes i stedet for 1 μL gRNA oligonucleotides for nei-sette negative kontrollen.
- Videre til transformasjonen (trinn 9).
Merk: Trinn 8 er en alternativ metoden for predigestion av pSB700 som beskrevet i trinn 6-7.3.
- Introdusere gRNA oligonucleotides (beskrevet i trinnene 1-5.1) inn pSB700 vektor gjennom bruk av Golden Gate kloning enkeltsteg BsmBI begrensning hemorroider.
- Sett sammen master mix (1 x) – Hvis flere gRNAs er å være klonet, klargjør master blandingen uten sett inn oligonucleotides lagt (tabell 3). Aliquot master bland inn PCR rørene og bruker en flerkanals pipette til gRNA oligonucleotides fra trinn 4.2. Inkluder en nei-sette kontroll med 1 μL vann.
- Ved BsmBI enzym og T4 DNA ligase innenfor samme reaksjon, samtidig begrensning fordøyelsen og hemorroider er oppnådd (dvs., Golden Gate kloning). Bruk følgende enkle Gate protokollen å fordøye vektoren og ligate som setter inn 1 reaksjon: holde reaksjonen på 37 ° C i 2 timer ved 50 ° C i 10 min, ved 65 ° C i 15 minutter, til 80 ° C i 15 min, og til slutt , holde den på 4 ° C.
- Av notatet, kan du kontrollere at oligonucleotides ikke inneholder BsmBI nettsteder før du bruker denne metoden. Hvis gRNAs som blir samsvarer inneholder BsmBI begrensning nettsteder, vil de bli fordøyd ved tillegg av BsmBI. Dette vil hindre brukeren i å få alle transformants.
- Etter den første enkelt Gate reaksjonen, legge til en ekstra 0,5 μL av BsmBI enzym i hver reaksjon og legg dem tilbake ved 55 ° C i 1 time. Etter fordøyelsen, holde reaksjonen på 4 ° C eller fryse den helt klar til å transformere. Denne andre runden av begrensning enzym inkubasjon fjerner alle ufordøyd eller religated vill-type pSB700 vektor ryggraden fra reaksjonsblandingen slik at bare vektorer har mottatt oligo skivene forblir intakt og gir transformants.
- Videre til transformasjonen (trinn 9).
- Forvandle 0,5 μL reaksjonsblandingen 8 μL kompetent E. coli [f.eksNEB DH5a (1-3 x 109 cfu/µg pUC19 DNA) eller NEB stabil 1 - 3 x 109 cfu/µg pUC19 DNA). For lentiviral plasmider gir NEB stabil celler mer konsekvent plasmider avkastning.
- Fjern E. coli fra lagring ved-80 ° C og tine det på isen i 5-10 min.
- Legge til 0,5 μL reaksjonen blanding 8 μL kompetent E. coli og beholde blandingen på is 30 min.
- Varme sjokk blandingen på 42 ° C i 45 s.
- Hvile den på isen i 2 minutter.
- Gjenopprette kulturen på en roterende shaker i 250 μL SOC media 1t 37 ° C i NEB DH5a og 30 ° C i NEB stall.
- Plate 80 μL kulturen på en passende antibiotikumet motstand Lysogeny kjøttkraft (LB) plate og Inkuber det overnatting på 37 ° C i NEB DH5a og 30 ° C i NEB stallen [f.ekspSB700 belagt på LB med ampicillin (100 μg/mL) plater] (Figur 3).
- Validere sekvensen av gRNA uttrykk plasmider: kontrollere rekkefølgen av hver koloni av Sanger sekvensering bruker primer 5'-GAGGGCCTATTTCCCATGATTCC-3' hvilke primtall på U6 arrangøren oppstrøms av gRNA oligo sett.
- Strikk 2-3 kolonier per reaksjon for sekvensering (Tabell 4).
Merk: Flere sekvensering leverandører nå tilby tjenester som kan utføre Sanger sekvensering direkte fra bakteriell koloniene, som reduserer tiden og kostnadene ved å eliminere behovet for å rense plasmider før sekvensering. Alternativt kan en plasmider isolering kit brukes til å gjenopprette plasmider DNA fra personlige bakteriell kloner. Renset plasmider kan deretter sendes for sekvenser. Hvis en gruppert ligation reaksjon er utført, kan du bruke Tabell 4 som en veiledning av kolonier som skal være valgt og sendt til sekvensering. - Etter at sekvens, isolere gRNA uttrykk plasmider.
- Bruk en steril pipette tips for å vaksinere ønsket kolonien i en 5 mL kultur av LB medium som inneholder 100 μg/mL ampicillin for pSB700 uttrykk vektorer.
- Vokse cellene i en roterende inkubator på 100 rpm på 37 ° C over natten (30 ° C hvis NEB stallen brukes).
- Isolere plasmider DNA fra kulturer bruker en plasmider prep kit, etter produsentens protokoll.
Merk: Mens ovennevnte metoder brukerne å lage enkelt gRNA inneholder vektorer, denne protokollen kan brukere å lage vektorer som inneholder 2 gRNAs, hver drevet av sin egen RNA polymerase III promoter.
- Strikk 2-3 kolonier per reaksjon for sekvensering (Tabell 4).
- For en tilkoblet gRNA design, bruk utdatafilen fra utformingsverktøyene for sgRNA beskrevet ovenfor (trinn 1.1-1.4) og velger 2 rundt.
- For en aktivisering eller undertrykkelse, velge par av guider som er minst 30 nt fra hverandre.
- For gRNAs brukes til skjæring, velger du målrette 2 forskjellige exons innen genet.
- Instruksjoner nedenfor, angi den første gRNA i tabellen gRNA-A og den andre gRNA i matrise gRNA-B, opprette en tilkoblet gRNA oligonucleotide sekvens modifikasjon.
Merk: Oligo brukes til å opprette gRNA-A vil bli kalt aktiva, og den omvendte oligo brukes til å introdusere gRNA-B vil bli referert til som rB. Kloning metoden nedenfor legger automatisk en initiering G på 5' slutten av hver av gRNAs.- Opprette riktig fA oligo som følger.
Merk: 20 nukleotider bestående av gRNA målretting sekvens for gRNA-A vil utgjøre den opprinnelige fA sekvensen som følgende vil bygge (f.eksprotospacer - aggggctacaccactcattg).- Legg TTTTCGTCTCTCACCG 5' slutten av aktiva (f.eksav sekvensen TTTTCGTCTCTCACCGaggggctacaccactcattg).
- Legg GTTTTAGAGCTATGCTGAAAAGCA 3 slutten av aktiva (f.eksav sekvensen TTTTCGTCTCTCACCGaggggctacaccactcattgGTTTTAGAGCTATGCTGAAAAGCA). Dette er den endelige versjonen av fA oligo som skal bestilles.
- Opprette den nødvendige rB oligo som følger.
Merk: De 20 nukleotider bestående av gRNA målretting rekkefølgen for gRNA-B vil utgjøre første rB sekvensen som følgende vil bygge (f.eksav den første sekvensen gtcccctccaccccacagtg).- Ta det omvendte supplement av rB = (revcom) rB (f.eks, cactgtggggtggaggggac).
- Legg TTTTCGTCTCTAAAC til 5' slutten av (revcom) rB (f.eks., TTTTCGTCTCTAAACcactgtggggtggaggggac).
- Legg CGGTGACCCAGGCGGCGCACAAG til 3 slutten av (revcom) rB (f.eksTTTTCGTCTCTAAACcactgtggggtggaggggacCGGTGACCCAGGCGGCGCACAAG). Dette er den endelige versjonen av rB oligo som skal bestilles.
Merk: følgende formler kan brukes med vanlig regnearkprogram automatisk redigere oligo sekvenser: = CONCATENATE("TTTTCGTCTCTCACCG",(A2), "GTTTTAGAGCTATGCTGAAAAGCA"), hvor A2 er cellen som inneholder fA sekvens og = Concatenate("TTTTCGTCTCTAAAC",(B2),"CGGTGACCCAGGCGGCGCACAAG"), der B2 er cellen som inneholder (revcom) rB sekvensen.
- Opprette riktig fA oligo som følger.
- Bestill oligonucleotides fra en syntese leverandør av valget. Ingen andre endringer er nødvendig.
- Bruk den forberedt plasmider DNA for å utføre PCR med både fA og rB primere. Dette vil legge både Videresend og omvendt gRNAs til PCR fragment generert fra denne plasmider og vil tillate hver uttrykkes fra sin egen promoter (U6 og 7SK arrangører, ulike arrangører er brukt i denne utformingen for å hindre viral rekombinasjon).
- Bruke Phusion GC spesielle PCR-protokollen til å opprette de nødvendige fragmentet: holde blandingen ved 98 ° C i 1 min (1 syklus), til 98 ° C i 15 s, 53 ° c for 15 s, 65 ° c i 2 minutter, og ved 72 ° C i 4 min (30 sykluser) , og deretter holde den på 4 ° C (tabell 5).
- Kjøre PCR produktet på en 1% agarose gel og kontroller at 1 bandet er sett på ~ 490 bp (figur 2).
- Kuttet og ekstra PCR produktet ved hjelp av en gel utvinning kit valgfrihet. Elute DNA i 15 μL TE buffer (10 mM Tris, pH 7,5; 10 mM Tris, pH 8.0) eller destillert vann.
- Mål konsentrasjonen av utdraget produktet sammen med pSB700 vektoren med et spektrofotometer for DNA molarity beregning. Normalisere både PCR produktet og vektor til en konsentrasjon av 40 femtomoles/μL.
Merk: Flere nettsteder er tilgjengelig for å hjelpe med beregning av molarity for en gitt DNA løsning basert på DNA og konsentrasjonen i løsning (f.eksPromega: http://www.promega.com/a/apps/biomath/index.html?calc=ugpmols). Kalkulatoren bruker formel:
Her er N lengden av nukleotid sekvensen.
- Definere en samtidige begrensning fordøyelsen og ligatur reaksjon ved hjelp av protokollen som beskrevet i trinn 8-8.4 klone PCR fragmentet i en pSB700 vektor.
- I stedet for å legge til 1 μL primer løsning reaksjonen, tilsett 1 μL av 40 fmole/μL av PCR produktet. I tillegg bruk 1 μL pSB700 vektor i en konsentrasjon av 40 fmole/μL.
Merk: Like molar forhold føre til konsekvent resultater, men selv i tilfeller hvor ikke brukes nøyaktig prosenter, kolonier kan oppnås.
- I stedet for å legge til 1 μL primer løsning reaksjonen, tilsett 1 μL av 40 fmole/μL av PCR produktet. I tillegg bruk 1 μL pSB700 vektor i en konsentrasjon av 40 fmole/μL.
- Etter endt Golden Gate reaksjon prosessen (trinn 8-8.4), går du til transformasjon og rekkefølgen verifikasjon (trinn 9 - 10.2.3).
Representative Results
Metodene i denne protokollen er etableringen av enten enkel eller sammenkoblede gRNA uttrykk vektorer. Enkelt gRNA uttrykke vektorer kan opprettes av enten predigesting vektor ryggraden (figur 1) etterfulgt av ligating det i en rekke korte oligonucleotides eller bruke Golden Gate kloning samtidig fordøye vektor ryggraden og ligate i en serie korte oligonucleotides i en enkelt reaksjon. Også er en metode for å produsere vektorer som inneholder 2 gRNAs, hver drives av sin egen uavhengige arrangøren, kloning et egendefinert PCR fragment (figur 2).
En vellykket kloning av disponerte protokollene vil resultere i utseendet av betydelig mer koloniene for transformasjoner med riktig DNA enn på no-sette kontroll plate (Figur 3).
Figur 1: fordøyelsen av en pSB700 gRNA uttrykk vektor. 1% agarose gel brukes. Lane 1: uncut pSB700. Lane 2: pSB700 kuttet med BsmBI.
Figur 2: sammen gRNA PCR. 1% agarose gel brukes. Lane 1: et par guide PCR fragment av ~ 490 bp.
Figur 3: vellykket kloning og transformasjon av en gRNA plasmider. Informasjonsvinduet viser en LB og ampicillin plate med vellykket forvandlet kolonier. Panelet til høyre viser en nei-sette kontroll plate viser ingen kolonier. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| pSB700 guide uttrykk vektor | 1-5 μg |
| NB Buffer 3.1 | 4 ΜL |
| BsmBI | 1 ΜL |
| Destillert vann | opptil 40 μL |
| Totalt volum | 40 ΜL |
Tabell 1: Begrensningen fordøyelsen av en pSB700 gRNA uttrykk vektor med BsmBI.
| Glødet gRNA oligos (enkelt eller grupperte reaksjon) | 1 ΜL |
| BsmBI-fordøyd pSB700 guide uttrykk vektor | 1 μL (~ 100-250 ng) |
| 10 x T4 DNA Ligase reaksjon Buffer | 2 μL (1 x siste konsentrasjon) |
| T4 DNA Ligase | 1 μL (120 enheter) |
| Destillert vann | 15 ΜL |
| Totalt volum | 20 µL |
Tabell 2: En ligatur reaksjon av gRNA oligonucleotides i en predigested pSB700 gRNA uttrykk vektor.
| Reagens | Volum (1 x) |
| H2O | 6 ΜL |
| T4 Ligase | 0,5 ΜL |
| ATP | 1 ΜL |
| BsmBI | 0,5 ΜL |
| NB Buffer 3.1 | 1 ΜL |
| Vektor (f.eks, pSB700) (40 fmol) | 1 μlL |
| Sett inn - frem og reversere oligos eller PCR fragment for dobbel guide (40fmol) | 1 μL (0,5 μL frem og 0,5 μL omvendt) |
Tabell 3: En enkeltsteg BsmBI begrensning og gRNA ligation reaksjonen blanding.
| For 1 guide | forløp 3 kolonier |
| For 2 guider | sekvens 5-10 kolonier |
| For 3 guider | sekvens 10-15 kolonier |
| For 4 guider | sekvens 15-20 kolonier |
Tabell 4: Anbefalt antall kolonier sekvensen for grupperte gRNA kloning reaksjoner.
| PCR-komponent | 50 µL reaksjon |
| 10 µM frem Primer | 2,5 ΜL |
| 10 µM omvendt Primer | 2,5 ΜL |
| 5 x Phusion HF eller GC Buffer | 10 ΜL |
| 10 mM dNTPs | 1 ΜL |
| Malen DNA | 100 ng |
| Phusion DNA Polymerase | 0,5 ΜL |
| Nuclease-fritt vann | Opptil 50 µL |
Tabell 5: En sammenkoblede gRNA PCR blanding.
Discussion
En rekke tid - og kostnadsbesparende endringer er gjort til gRNA uttrykk vektor bygging. En enkeltsteg begrensning og ligatur protokoll er beskrevet og en metode for sammenkoblede gRNA uttrykk vektor bygg. Sammenkoblede gRNA uttrykket oppnås gjennom en PCR forsterkning med oligonucleotides som inneholder både en frem gRNA målet sekvens (n20) og omvendt komplement til et annet mål (n20). Dette introduserer så en sekundær RNA Pol III promoter (7SK) og en sgRNA hale i konvensjonelt uttrykke enkelt gRNA uttrykk plasmider.
Et forsiktig oligonucleotide design vil sikre en vellykket PCR sammenkoblede gRNA bygging samt en klissete slutt ligation. Følge enkeltsteg begrensning og ligatur reaksjon, tillegg av ytterligere BsmBI vil sikre alle uforandret uttrykk vektorer i reaksjonen er kuttet. Dette vil redusere bakgrunnen på transformasjon. Bruke NEB-stabil kompetent E. coli og en vekst på 30 ° C vil øke avkastningen av en vellykket transformasjon.
Fordelene denne teknikken har felles praksis er en forenkling av oligonucleotide annealing, enkeltsteg begrensningen gRNA uttrykk vektoren og ligatur av oligonucleotides og muligheten til å bruke konvensjonelle enkelt gRNA uttrykk vektorer for uttrykket av parede guider. Mens protokollen beskrevet her fokuserer på et sett av pattedyr vektorer, den generelle strategien er plast og gjelder alle organisme, forutsatt riktig gRNA vektoren er tilgjengelig. Samlet sparer protokollen beskrevet tid og kostnader.
Det bør imidlertid bemerkes at disponerte prosedyren for kjøpe individuelle oligonucleotides gjør ikke målestokken bra for generering av biblioteker som inneholder tusenvis av gRNAs. For disse formål anbefales alternative kilder til oligonucleotide syntese som oligo chip syntese.
Er det nyttig å inkludere en nei-sette kontroll når kloning gRNAs. Dette kan enkelt defineres parallelt med reaksjoner av interesse og kan brukes til å fastslå om en ufullstendig fordøyelsen av Start vektoren har bidratt til koloniene observert på slutten av prosedyren. Videre, hvis en av ovennevnte kloning protokoller har mislyktes på grunn av en ufullstendig fordøyd vektor ryggraden eller dårlig ligation effektivitet, foreslår vi prøver alternativet Klon metoden har vi skissert.
Når du bruker Golden Gate kloning samtidig fordøye vektoren og ligate i de lille oligonucleotides i en enkelt reaksjon, er det viktig å kontrollere at gRNA som blir samsvarer i vektoren ikke har et BsmBI område i det, da dette vil føre til t Han gRNA skjæring og fravær av kolonier på transformasjon.
GRNA Klon strategi har vi skissert gir en rask og kostnadseffektiv generasjon av gRNAs på ~ 10 amerikanske dollar per guide, med mesteparten av kostnadene kommer fra oligonucleotide syntese og sekvens bekreftelsen. Mens metoden beskrevet er utviklet for å tillate brukere å generere gRNAs for bruk med SpCas9, protokollen kan lett tilpasses for bruk med Cas9 orthologues eller andre RNA-guidede endonucleases som Cpf1 eller C2C2, med små endringer vektor ryggraden og oligonucleotide overheng sekvenser16,17.
Protokollen skissert ovenfor vil gi sekvens-verifiserte gRNA uttrykk plasmider i 3 d (starter med riktig utformet oligonucleotides), som er betydelig raskere enn dagens metoder. Dette inkluderer gRNA utformingen av 1t (trinn 1-2.3), fortynning og aliquot av oligonucleotides i 10 min (trinn 3-5.1), fordøyelse og rensing av pSB700 gRNA uttrykk vektoren for 2t (trinn 6-6.4), kloning av gRNA oligonucleotides i en predi gested pSB700 gRNA uttrykk vektor over natten i romtemperatur (trinn 7-7.3), enkeltsteg BsmBI begrensning ligation av 3 h og 40 min (trinn 8-8.4), transformasjonen av 16 h (trinn 9-9.6) og validering av en rekke gRNA uttrykk plasmider 24 h (med varighet avhengig av sanger sekvensering tilgjengeligheten og hastigheten etter innsending av bakteriell kolonien; trinn 10). Sammenkoblede gRNA design og sekvens endring tar 1 h (trinn 11-13). De sammenkoblede gRNA PCR tar 3,5 h (trinn 14-14.4). Kloning av PCR fragment til en pSB700 vektor tar 3h og 40 min (trinn 15-16).
Sannsynligvis problemene som kan bli møtt med denne protokollen gjelder ineffektivitet i Golden Gate montering og transformasjon. Inkluder en nei-sette kontroll da Golden Gate å visualisere effektiviteten av samlingen. Under transformasjon gir puc19 positive kontrollen en transformasjon effektivitet kontroll. NB-stabil E. coli skal brukes for lentiviral kompatibel plasmider og ofte krever opptil > 16 h på 30 ° C til synlig kolonier.
Disclosures
George M. Church har egenkapital i Editas og Caribou Biosciences, som mål å kommersialisere CRISPR-Cas9 genomet redigering teknologi (en full åpenhet liste, se http://arep.med.harvard.edu/gmc/tech.html).
Acknowledgments
Sathiji Nageshwaran støttes av Friedreichs ataksi forskning Alliance (07340305 - 01) og National ataksi Foundation stipend (7355538-01). Alejandro Chavez ble finansiert av National Cancer Institute grant 5T32CA009216-34 og Burroughs Wellcome fondet karriere Award for medisinske forskere. George M. Church er støttet av det amerikanske National Institutes of Health (NIH) National Human Genome Research Institute grant RM1 HG008525 og Wyss Institutt for biologisk inspirert Engineering. James J. Collins anerkjenner støtte fra Defense trussel reduksjon Agency stipendet HDTRA1-14-1-0006 og gruppen Paul G. Allen grenser. Alejandro Chavez utviklet metoden dobbel-guide kloning. Sathiji Nageshwaran, Alejandro Chavez og Nan Cher Yeo skrev manuskriptet med input fra alle forfattere.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BsmBI | New England Biolabs | R0580L | |
| T4 DNA ligase | Enzymatic/New England Biolabs | L6030-LC-L/M0202S | |
| Buffer 3.1 | New England Biolabs | B7203S | |
| Adenosine 5'-Triphosphate (ATP) | New England Biolabs | P0756S | |
| QIAprep spin miniprep kit | Qiagen | 27104 | |
| Chemically competent E. coli | New England Biolabs | C3019l, C2987l, or C3040H | |
| Standard microcentrifuge tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 0030 125.150 | |
| Axygen 8-Strip PCR tubes | Fischer Scientific | 14-222-250 | |
| Thermocycler with programmable temperature-stepping control | BioRad, | 1851148 | |
| UV spectrophotometer (NanoDrop 2000c) | Thermo Scientific | ||
| pSB700 plasmid | Addgene | #64046 | |
| NEB Stable Competent E. coli (High Efficiency) | New England Biolabs | c3040 | |
| Lysogeny broth (LB) | |||
| Ampicillin | |||
| TE buffer (1 mM EDTA, 10 mM Tris-Cl, pH 7.5) | |||
| pSN007 plasmid | Addgene | 102440 |
References
- Gasiunas, G., Barrangou, R., Horvath, P., Siksnys, V. Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (39), E2579-E2586 (2012).
- Jinek, M., Chylinski, K., Fonfara, I., Hauer, M., Doudna, J., Charpentier, E. A Programmable Dual-RNA-Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Shalem, O., Sanjana, N., Zhang, F. High-throughput functional genomics using CRISPR-Cas9. Nature Reviews Genetics. 16 (5), 299-311 (2015).
- Chavez, A., et al. Highly efficient Cas9-mediated transcriptional programming. Nature Methods. 12 (4), 326-328 (2015).
- Gilbert, L., et al. CRISPR-Mediated Modular RNA-Guided Regulation of Transcription in Eukaryotes. Cell. 154 (2), 442-451 (2013).
- Yang, L., Yang, J., Byrne, S., Pan, J., Church, G. CRISPR/Cas9-Directed Genome Editing of Cultured Cells. Current Protocols in Molecular Biology. , 31.1.1-31.1.17 (2014).
- Yang, L., Mali, P., Kim-Kiselak, C., Church, G. CRISPR-Cas-Mediated Targeted Genome Editing in Human Cells. Methods in Molecular Biology. 1114, 245-267 (2014).
- Vidigal, J., Ventura, A. Rapid and efficient one-step generation of paired gRNA CRISPR-Cas9 libraries. Nature Communications. 6, 8083 (2015).
- Joung, J., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening. Nature Protocols. 12 (4), 828-863 (2017).
- Kabadi, A., Ousterout, D., Hilton, I., Gersbach, C. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome engineering from a single lentiviral vector. Nucleic Acids Research. 42 (19), e147 (2014).
- Sakuma, T., Nishikawa, A., Kume, S., Chayama, K., Yamamoto, T. Multiplex genome engineering in human cells using all-in-one CRISPR/Cas9 vector system. Scientific Reports. 4 (1), (2014).
- Chari, R., Yeo, N., Chavez, A., Church, G. sgRNA Scorer 2.0: A Species-Independent Model To Predict CRISPR/Cas9 Activity. ACS Synthetic Biology. 6 (5), 902-904 (2017).
- Doench, J., et al. Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation. Nature Biotechnology. 32 (12), 1262-1267 (2014).
- Konermann, S., et al. Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex. Nature. 517 (7536), 583-588 (2014).
- The CRISPR Software Matchmaker: A New Tool for Choosing the Best CRISPR Software for Your Needs. , Available from: http://blog.addgene.org/the-crispr-software-matchmaker-a-new-tool-for-choosing-the-best-crispr-software-for-your-needs (2015).
- Engler, C., Marillonnet, S. Golden Gate Cloning. DNA Cloning and Assembly Methods. Valla, S., Lale, R. , Humana Press. New York, NY. 119-131 (2013).
- Zetsche, B., et al. Cpf1 Is a Single RNA-Guided Endonuclease of a Class 2 CRISPR-Cas System. Cell. 163 (3), 759-771 (2015).
- Abudayyeh, O., et al. C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector. Science. 353 (6299), (2016).
