Summary
Här beskrivs en enkel, effektiv och kostnadseffektiv metod för sgRNA kloning.
Abstract
Protokollet beskrivs beskriver strömlinjeformad metoder för effektiv och kostnadseffektiv produktion av Cas9-associerade guide RNAs. Två alternativa strategier för guide RNA (gärna) kloning beskrivs baserat på användning av typ IIS begränsning enzymet BsmBI i kombination med en uppsättning kompatibel vektorer. Förutom tillgång till Sanger sekvensering tjänster att validera de genererade vektorerna, krävs ingen speciell utrustning eller reagenser bortsett från de som är standard till moderna molekylärbiologiska laboratorier. Metoden beskrivs är främst avsett för kloning en enda gärna eller en parkopplad gärna-uttryckande vektor i taget. Detta förfarande skalas inte väl för generering av bibliotek som innehåller tusentals gRNAs. För dessa ändamål rekommenderas alternativa energikällor oligonukleotiden syntes såsom oligo-chip syntes. Slutligen, medan detta protokoll fokuserar på en uppsättning av däggdjur vektorer, den allmänna strategin är plast och är tillämplig på någon organism om lämpliga gärna vektorn är tillgängliga.
Introduction
CRISPR-associerade protein 9 (Cas9) är ett RNA-guidad Amiiiiin som riktas mot en önskad genomisk mål när komplex med en lämpligt utformad liten guide RNA (gärna)1,2. gRNAs består av en 20-nukleotidsekvensen (protospacer), som kompletterar sekvensen genomisk mål. Bredvid målet genomiska är sekvensen ett 3' protospacer-associerade motiv (PAM), som krävs för Cas9 bindande. När det gäller Streptococcus Pyogenes Cas9 (SpCas9), detta har sekvensen NGG. Vid bindande målet DNA, klyver Cas9 båda delarna av DNA, därmed stimulera reparationsmekanismer som kan utnyttjas för att ändra locus av intresse. Aktivering av felbenägna icke-homolog slutet-anslutning (NHEJ) vägen kan orsaka störningar av en målgenen. Alternativt, reparationer görs via en homolog rekombination kan stimulera riktade integrationen av en önskad DNA-sekvens om en givare mall ges6. Nuclease-döda Cas9 (dCas9) varianter kan också vara genererade3 genom muterar de restsubstanser inom Cas9 som är väsentliga för endonucleolytic verksamhet. dCas9 förblir behöriga för DNA bindande men klipper inte sitt bundna mål. Fusing olika effektor domäner till dCas9 och styra det nära en genens transkriptionell startwebbplats, kan dCas9 användas för selektiv gen induktion eller partiell nedtystning4,5.
Otroligt kraftfull, kräver förmågan att använda Cas9 för att rikta en genomiska sekvensen av intresse att en användare först genererar en gärna unika för målet industriområden. En mängd metoder för att bygga gärna uttryck vektorer har tidigare beskrivits, många av varierande effektivitet och kostnad6,7,8. Fristående PCR-amplikoner kan användas som gRNAs för snabb screening, kommer från oligonukleotiden leverans till transfection inom flera timmar; Detta kräver dock Ultramer (över 100 bp) oligo-syntes, vilket är dyra9. Det är också möjligt att köpa gBlocks som är mer kostnadseffektiv än Ultramers. Cas9 har snabbt blivit en integrerad del av modern molekylärbiologi toolkit, skulle en enkel, billig och mycket effektiv metod för gärna kloning vara en välsignelse för fältet. Den metod som beskrivs här har varit anställd i vår grupp och samverkande laboratorier för de senaste åren för att generera över 2.000 unika gRNAs4.
Metoden beskrivs fokuserar på tekniker för kloning av lentiviral kompatibel vektorer som innehåller en enda gärna eller högst två gRNAs. För generering av plasmider som innehåller fler än två gRNAs, eller att klona ett bibliotek av gRNAs, rekommenderas alternativa metoder9,10,11,12.
Protocol
Obs: Följande protokoll beskriver hur du utför gärna design använda online-verktyg (steg 1.1-1.4), som är gemensamma för alla metoder för gärna plasmid konstruktion detalj i detta manuskript. När de önskade gRNAs identifieras, beskrivs stegen för att beställa de nödvändiga oligonukleotider tillsammans med flera olika metoder för att införa oligonukleotider i uttrycket vektorer (t.ex., pSB700). Presenterade finns 2 metoder för kloning enda guide-uttryckande vektorer baserat på antingen ligatur i en predigested uttryck vektor (steg 2-7,3) eller Golden Gate kloning (steg 8-8.4). Vidare beskrivs är en strategi för kloning Parade guide-uttryckande vektorer med hjälp av polymeras-kedjereaktion (PCR) följt av Golden Gate kloning (steg 11-16). Slutligen sammanfattas också gemensamma metoder för att utföra en E. coli kemisk omvandling (steg 9-9,6) och ett uttryck vektor sekvens validering (steg 10 till 10.2.3).
- Utforma gärna oligonukleotider använda online-verktyg som följer.
- Design gRNAs använda online-verktyg såsom sgRNA målskytt 2.0 online-verktyg (https://crispr.med.harvard.edu/sgRNAScorerV2/)13 eller alternativ som bred sgRNA design tool (http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/ sgrna-design)14 och flera andra15.
- Använda gen namn, symbol eller rå DNA-sekvenser för målet för att generera potentiella gärna sekvenser.
Obs: En kalkylbladsfil (.csv/.xls) med alla de potentiella gRNAs mot genen eller den medföljande sekvensen skapas. Kvaliteten på den potentiella gRNAs kommer att rapporteras som Poäng om sgRNA målskytt 2.0 online-verktyget används eller som % på målet effektivitet om den breda sgRNA designverktyget används. Båda åtgärderna härleds på baserat på aktiviteten på målet skärning. - Överväga Off-target aktivitet i gärna markeringen när placering i gRNAs.
Obs: Optimal guider är de med största på målet effektivitet och minst off-aktiviteten. För aktiveringen (CRISPRa), är gRNAs utformade för att rikta regionen från 1-200 bp uppströms av transkriptionell start webbplats (TSS)4,15. För hämning (CRISPRi), gRNAs är utformade för att rikta regionen från 50 bp uppströms av TSS tills 300 bp nedströms av TSS5. Om du vill inaktivera en gen använder Cas9 kapning, är gRNAs utformade för att rikta de första 10-50% av kodande sekvens nedströms av initierande kodon (som gRNAs inriktning 3' ände genen har visat sig vara mindre effektivt)13. - Se till inga interna BsmBI platser är närvarande om oligonukleotider används för Golden Gate kloning, eftersom detta kommer att resultera i de glödgade oligonukleotider som rötas13.
- Välj genomisk mål sekvenser och ta bort den 3' NGG PAM (lämnar endast protospacer sekvensen) för enstaka gärna oligonukleotiden sekvens modifiering (t.ex., start sekvens: CGCGTGCTCTCCCTCATCCATGG).
Obs: Om du använder ett kalkylblad, följande formel tar bort 3' NGG: =LEFT(A2,LEN(A2)-3), där A2 är cellen som innehåller sekvensen mål och PAM.- Lägga till CACCG i 5' slutet av oligo.
Obs: Vid ligatur till pSB700 stamnätet, denna sekvens kommer att omfatta 3' ände U6 arrangören kör transkriptionen av gärna. Sekvensen ”CACC” säkerställer att oligo är kompatibel med överhäng av BsmBI-smält pSB700 vektor. ”G” är ett krav av polymeras III initiativtagare och säkerställer effektiv initiering av transkriptionen av gärna. Använd följande formel i ett kalkylblad för att utföra denna uppgift: =CONCATENATE("CACCG",(B2)), där B2 är cellen som innehåller sekvensen protospacer [e.g., lägga till 5' CACCG sekvens till protospacer: CACCGCGCGTGCTCTCCCTCATCCA (detta «««är den slutliga framåt oligo som är beställt)]. - Skapa en omvänd komplement (rc) av protospacer sekvensen.
Obs: till exempel omvänd komplementet av de ovannämnda protospacer är TGGATGAGGGAGAGCACGCG. - Append AAAC 5' ände den rc protospacer. Lägga till en ytterligare C 3' ände den rc protospacer (omvänd oligo).
Obs: Sekvensen ”AAAC” säkerställer att oligo är kompatibel för kloning i den BsmBI-smält pSB700 vektorn. Ytterligare ”C” i 3'-änden behövs att glödga sekvensen-inledande ”G” till den framåt oligo. Använd följande formel i ett kalkylblad att utföra denna uppgift =CONCATENATE("AAAC",(C2),"C"), där C2 är cellen som innehåller sekvensen omvänd komplement [e.g., AAACTGGATGAGGGAGAGCACGCGC (detta är den slutliga omvänd oligo som är beställde)].
- Lägga till CACCG i 5' slutet av oligo.
- Beställ oligonukleotider, utan ytterligare ändringar på oligonukleotider.
- Beställ den minimala mängden oligo krävs, eftersom endast mycket små mängder behövs för kloning reaktioner.
- Späd frystorkade primrar till en slutlig koncentration på 100 μM i 1 x TE buffert (10 mM Tris-Cl, pH 7.5 med 1 mM EDTA).
- Alikvotens 1:1 framåt och bakåt oligonukleotider (t.ex., 10 μL varje) i PCR-band-cap rör.
Obs: Detta gör att snabba kloning av många gRNAs i taget med hjälp av en flerkanalspipett.- Vortex och spinn ner de oligo-blandningarna (100 x g för 15 s). Inkubera reaktionen vid rumstemperatur i 5 min innan du ställer in ligering.
Obs: Det är inte nödvändigt att värma och svalka sedan av oligo blandningar för att underlätta deras glödgning. Det är värt att notera att 3-4 par gärna oligonukleotider kan vara poolade och glödgas i en enda reaktion (t.ex., mix 3 μL av framåt och 3 μL av omvänd oligonukleotider tillsammans från upp till 4 gärna oligo par, vilket ger en total volym på 24 μL). Volymen av de oligonukleotider används för glödgning kan justeras för att passa användarens behov.
Obs: Steg 6-7,3 beskriver predigestion av pSB700. Om en alternativ metod, se steg 8, som beskriver en enda steg BsmBI begränsning ligering.
- Vortex och spinn ner de oligo-blandningarna (100 x g för 15 s). Inkubera reaktionen vid rumstemperatur i 5 min innan du ställer in ligering.
- Smälta 1-5 μg vektorns valda pSB700 guide uttryck med BsmBI (0,5 μL per 1 μg) för 1 h 55 ° C15. Genomföra nedbrytning av den pSB700 gärna uttryck vektorn i en total volym på 40 μl (tabell 1).
- Kör de matsmältning produkterna på 1,5% (wt/vol) låg-smältande agarosgel.
- Klipp ut den smälta vektor ryggraden band som motsvarar ett fragment av ~ 9 kb i storlek och placera gel segmentet i ett 1,5 mL mikrocentrifug rör (figur 1).
- Använda en kommersiell gel rening kit extrahera DNA från agarosgel enligt tillverkarens anvisningar.
- Eluera DNA i 10-15 μL av TE buffert (10 mM Tris, pH 7,5; 10 mM Tris, pH 8,0) för att få en koncentrerad eluatet.
- Ligera av glödgad gärna oligonukleotider från steg 4 i den BsmBI-smält pSB700 guide uttryck vektorn i en 20 μL reaktion (tabell 2) för kloning av de gärna oligonukleotider till pre sammandrag pSB700 uttryck vektorn.
- Först lägga till vatten, buffert, och DNA, då vortex blandningen och Lägg enzym, vortex 1 sista gång efter att lägga till det enzym- och spinn ner lösningen (100 x g för 15 s). Inkubera reaktionerna i rumstemperatur över natten.
- Inkludera en no-infoga negativa kontrollreaktionen som har en BsmBI-rötas vektor ensam, utan en glödgad gärna oligo infoga. 1 μL av vatten kan användas i stället för den 1 μL av gärna oligonukleotider för no-infoga negativ kontroll.
- Fortsätt till omformningen (steg 9).
Obs: Steg 8 är en alternativ metod till predigestion av pSB700 som beskrivs i steg 6-7,3.
- Introducera gärna oligonukleotider (beskrivs i steg 1-5.1) i pSB700 vektorn med hjälp av Golden Gate kloning för den enda steg BsmBI begränsning ligering.
- Montera huvudmixen (1 x) — om flera gRNAs att vara klonade, förbereda huvudmixen utan de infoga oligonukleotider lagt till (tabell 3). Alikvotens befälhavaren blanda i PCR-rören och Lägg de gärna oligonukleotider från steg 4,2 till hjälp en flerkanalspipett. Inkludera en no-infoga kontroll använder 1 μL av vatten.
- Genom att inkludera BsmBI enzym och T4 DNA-ligase inom samma reaktion, samtidiga begränsning matsmältningen och ligatur uppnås (dvs.Golden Gate kloning). Använda följande enkla Gate protokollet att smälta vektorn och ligera skären i 1 reaktion: hålla reaktionen vid 37 ° C i 2 h, vid 50 ° C i 10 min, vid 65 ° C i 15 min, 80 ° c i 15 min, och slutligen , håll den vid 4 ° C.
- Notera, verifiera att oligonukleotider inte innehåller BsmBI platser innan du använder denna metod. Om de gRNAs som är klonade innehåller BsmBI begränsning platser, kommer de vara smält vid tillägg av BsmBI. Detta hindrar användaren från att erhålla någon transformants.
- Efter den första enkla Gate reaktionen, lägga till en ytterligare 0,5 μL av BsmBI enzym i varje reaktion och placera dem tillbaka vid 55 ° C för 1 h. Efter matsmältningen, håll reaktionen vid 4 ° C eller frysa den tills det att omvandla. Denna andra omgång restriktionsenzym inkubering avlägsnar alla osmält eller religated vildtyp pSB700 vektor ryggraden från reaktionsblandningen så att endast vektorer som har fått de oligo-skären förbli intakt och kommer att ge transformants.
- Fortsätt till omformningen (steg 9).
- Omvandla 0,5 μL av reaktionsblandningen till 8 μl av behöriga E. coli [e.g., NEB DH5a (1-3 x 109 cfu/µg av pUC19 DNA) eller NEB stabil 1 - 3 x 109 cfu/µg av pUC19 DNA). För lentiviral plasmider ger NEB stabil celler mer konsekvent plasmid avkastning.
- Ta bort E. coli från lagring vid-80 ° C och Tina den på is för 5-10 min.
- Tillsätt 0,5 μL av reaktionsblandning till 8 μl av behöriga E. coli och hålla blandningen på is i 30 min.
- Värme chock blandningen vid 42 ° C i 45 s.
- Vila den på is i 2 min.
- Återställa kulturen på en roterande skakapparat i 250 μL av SOC media för 1 h vid 37 ° C för NEB DH5a och vid 30 ° C för NEB stall.
- Tavla 80 μl av kulturen på en lämplig antibiotikaresistens Lysogeny buljong (LB) plattan och inkubera det över natten vid 37 ° C för NEB DH5a och vid 30 ° C för NEB stall [e.g., pSB700 är klädd på LB med ampicillin (100 μg/mL) plattor] (figur 3).
- Validera sekvensen av gärna uttryck plasmid: verifierar sekvensen av varje koloni av Sanger sekvensering använder primer 5'-GAGGGCCTATTTCCCATGATTCC-3' som primtal på U6 arrangören uppströms i den gärna oligo infoga.
- Välj 2-3 kolonier per reaktion för sekvensering (tabell 4).
Obs: Flera sekvensering leverantörer nu erbjuda tjänster som kan utföra Sanger sekvensering direkt från bakteriekolonier, vilket kraftigt minskar tid och kostnader genom att eliminera behovet av att rena plasmidsna före sekvensering. Alternativt kan en plasmid isolering kit användas för att återställa plasmid DNA från de enskilda bakteriell klonerna. Renat plasmider kan sedan lämnas för sekvensering. Om en sammanslagen ligering reaktion utförs, Använd tabell 4 som en guide för antalet kolonier som bör väljas och inskickad för sekvensering. - Isolera gärna uttryck plasmidsna efter bekräftelsen sekvens.
- Använd en steril pipettspetsen för att Inokulera önskad kolonin i en 5 mL kultur av LB medium innehållande 100 μg/mL ampicillin för pSB700 uttryck vektorer.
- Odla cellerna i en roterande inkubator vid 100 rpm vid 37 ° C över natten (30 ° C om NEB stall som används).
- Isolera plasmiden DNA från kulturer med hjälp av en plasmid prep kit, efter tillverkarens protokollet.
Obs: Medan ovanstående metoder möjligt för användare att skapa enda gärna innehållande vektorer, detta protokoll kommer att tillåta användare att skapa vektorer som innehåller 2 gRNAs, var och en drivs av sina egna RNA polymeras III arrangören.
- Välj 2-3 kolonier per reaktion för sekvensering (tabell 4).
- För en ihopparad gärna design, Använd utdatafilen från sgRNA designverktyg som beskrivs ovan (steg 1.1-1.4) och välj 2 guider av intresse.
- För en aktivering eller förtryck, välja par guider som är minst 30 nt isär.
- Välj guider som är inriktade på 2 olika exonerna i genen för gRNAs används för att skära.
- För instruktionerna nedan, utse den första gärna i matrisen gärna-A och den andra gärna i matrisen gärna-B, att skapa en parkopplad gärna oligonukleotiden sekvens modifiering.
Obs: De oligo som används för att skapa gärna-A kommer att kallas fA, och den omvända oligo brukade presentera gärna-B kommer att benämnas rB. Kloning metoden nedan läggs automatiskt en initierande G i 5' slutet av var och en av gRNAs.- Skapa de lämpliga fA oligo enligt följande.
Obs: De 20 nukleotider som omfattar den gärna inriktning sekvens för gärna-A kommer att utgöra första fA sekvensen som följande steg kommer att bygga (t.ex., protospacer - aggggctacaccactcattg).- Lägga till TTTTCGTCTCTCACCG i 5' slutet av fA (t.ex., av sekvensen TTTTCGTCTCTCACCGaggggctacaccactcattg).
- Lägga till GTTTTAGAGCTATGCTGAAAAGCA till 3' ände fA (t.ex., av sekvensen TTTTCGTCTCTCACCGaggggctacaccactcattgGTTTTAGAGCTATGCTGAAAAGCA). Detta är den slutliga versionen av den fA oligo som kommer att beställas.
- Så här skapar du den nödvändiga rB oligo.
Obs: De 20 nukleotider bestående av sekvensen gärna inriktning för gärna-B kommer att utgöra första rB sekvensen som följande steg kommer att bygga (t.ex., i den Start sekvens-gtcccctccaccccacagtg).- Ta ett omvänd komplement till rB = (revcom) rB (t.ex., cactgtggggtggaggggac).
- Lägg till TTTTCGTCTCTAAAC till 5' ände (revcom) rB (t.ex., TTTTCGTCTCTAAACcactgtggggtggaggggac).
- Bifoga CGGTGACCCAGGCGGCGCACAAG 3' ände (revcom) rB (t.ex., TTTTCGTCTCTAAACcactgtggggtggaggggacCGGTGACCCAGGCGGCGCACAAG). Detta är den slutliga versionen av den rB oligo som kommer att beställas.
Obs: följande formler kan användas med vanliga kalkylprogram för automatiskt redigera oligo sekvenser: = CONCATENATE("TTTTCGTCTCTCACCG",(A2), ”GTTTTAGAGCTATGCTGAAAAGCA”), där A2 är den cell som innehåller fA sekvens och = CONCATENATE("TTTTCGTCTCTAAAC",(B2) ”, CGGTGACCCAGGCGGCGCACAAG”), där B2 är den cell som innehåller sekvensen (revcom) rB.
- Skapa de lämpliga fA oligo enligt följande.
- Beställa oligonukleotider från en syntes leverantör av val. Inga ytterligare ändringar krävs.
- Använd den beredda plasmiden DNA för att utföra PCR med både fA och rB grundfärger. Detta kommer att fästa både framåt och de omvända gRNAs till PCR-fragmentet genereras från denna plasmid och kommer att ge var och en skall uttryckas från sin egen arrangören (U6 och 7SK initiativtagare — olika initiativtagare används i denna design för att förhindra viral rekombination).
- Använda Phusion GC särskilda PCR-protokollet för att skapa nödvändiga fragmentet: hålla blandningen vid 98 ° C i 1 min (1 cykel), vid 98 ° C under 15 s, vid 53 ° C under 15 s, vid 65 ° C i 2 min och vid 72 ° C under 4 minuter (30 cykler) , och sedan hålla det vid 4 ° C (tabell 5).
- Köra PCR-produkten på en 1% agarosgel och verifierar att 1 band ses på ~ 490 bp (figur 2).
- Skär och extrahera PCR-produkten med en gel utvinning kit av val. Eluera DNA in 15 μL av TE buffert (10 mM Tris, pH 7,5; 10 mM Tris, pH 8,0) eller destillerat vatten.
- Mätning av koncentrationen av extraherade produkten tillsammans med pSB700 vector med en spektrofotometer för DNA molariteten beräkning. Normalisera både PCR-produkten och vektorn till en koncentration av 40 femtomoles/μL.
Obs: Flera webbplatser är tillgängliga att hjälpa till med beräkningen av molariteten av en viss DNA-lösning baserad på längden av DNA och dess koncentration i lösning (t.ex., Promega: http://www.promega.com/a/apps/biomath/index.html?calc=ugpmols). Räknaren använder formel:
Här är N av nukleotidsekvensen längd.
- Ställa in en samtidig inskränkning matsmältningen och ligatur reaktion använda protokollet beskrivs i steg 8-8.4 för att klona den PCR-fragmenten i en pSB700 vektor.
- Istället för att lägga 1 μL av primer lösning reaktionen, tillsätt 1 μL av 40 fmole/μl av PCR-produkten. Dessutom använda 1 μL av vektorn som pSB700 vid en koncentration på 40 fmole/μL.
Obs: Lika molara förhållanden leda till konsekventa resultat, även om även i fall där exakta nyckeltal inte används kolonier kan erhållas.
- Istället för att lägga 1 μL av primer lösning reaktionen, tillsätt 1 μL av 40 fmole/μl av PCR-produkten. Dessutom använda 1 μL av vektorn som pSB700 vid en koncentration på 40 fmole/μL.
- Efter att ha avslutat Golden Gate reaktion processen (steg 8-8,4), vidare till omvandling och sekvens kontrollen (steg 9 - 10.2.3).
Representative Results
De metoder som beskrivs i detta protokoll är för skapandet av antingen enkel eller parkopplade gärna uttryck vektorer. Enda gärna uttrycker vektorer kan skapas genom antingen predigesting vector ryggraden (figur 1) följt av ligating det i en serie av korta oligonukleotider eller använder Golden Gate kloning för att samtidigt smälta vektor ryggraden och ligera det i en serie av korta oligonukleotider i en enda reaktion. Också är en metod för att producera vektorer som innehåller 2 gRNAs, var driven av sin egen oberoende promotorn, genom kloning en anpassad PCR-fragmentet (figur 2).
En lyckad kloning för protokoll för disponerade resulterar i uppkomsten av betydligt fler kolonier för omvandlingar med lämpliga infoga DNA än på nr-infoga kontrollplattan (figur 3).
Figur 1: nedbrytning av en pSB700 gärna uttryck vektor. 1% agarosgel används. Lane 1: uncut pSB700. Lane 2: pSB700 skär med BsmBI.
Figur 2: Parade gärna PCR. 1% agarosgel används. Lane 1: en parkopplad guide PCR fragment av ~ 490 bp.
Figur 3: de framgångsrika kloning och omvandling av en gärna plasmid. Den vänstra panelen visar en LB och ampicillin tallrik med framgångsrikt förvandlade kolonier. Den högra panelen visar en no-infoga kontroll tallrik visar inga kolonier. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| pSB700 guide uttryck vektor | 1-5 μg |
| NEB buffert 3.1 | 4 ΜL |
| BsmBI | 1 ΜL |
| Destillerat vatten | upp till 40 μl |
| Totala volymen | 40 ΜL |
Tabell 1: Begränsning rötning av en pSB700 gärna uttryck vektor med BsmBI.
| Glödgad gärna oligos (antingen enkel eller poolade reaktion) | 1 ΜL |
| BsmBI-smält pSB700 guide uttryck vektor | 1 μL (~ 100-250 ng) |
| 10 x T4 DNA-Ligase reaktion buffert | 2 μL (1 x slutlig koncentration) |
| T4 DNA-Ligase | 1 μL (120 enheter) |
| Destillerat vatten | 15 ΜL |
| Totala volymen | 20 μl |
Tabell 2: En ligatur reaktion av gärna oligonukleotider i en predigested pSB700 gärna uttryck vektor.
| Reagens | Volym (1 x) |
| H2O | 6 ΜL |
| T4 Ligase | 0,5 ΜL |
| ATP | 1 ΜL |
| BsmBI | 0,5 ΜL |
| NEB buffert 3.1 | 1 ΜL |
| Vektor (t.ex., pSB700) (40 fmol) | 1 μlL |
| Infoga - fram och omvända oligos eller PCR fragment för dubbla guide (40fmol) | 1 μL (0,5 μL framåt och 0,5 μL omvänd) |
Tabell 3: En enda steg BsmBI begränsning och gärna ligering reaktionsblandning.
| För 1 guide | serie 3 kolonier |
| För 2 guider | sekvens 5-10 kolonier |
| För 3 guider | sekvensera 10-15 kolonier |
| För 4 guider | sekvensera 15-20 kolonier |
Tabell 4: Det rekommenderade antalet kolonier sekvens för poolade gärna kloning reaktioner.
| PCR-komponent | 50 µL reaktion |
| 10 µM framåt Primer | 2,5 ΜL |
| 10 µM reverse Primer | 2,5 ΜL |
| 5 x Phusion HF eller GC buffert | 10 ΜL |
| 10 mM dNTP | 1 ΜL |
| Templat-DNA | 100 ng |
| Phusion DNA-polymeras | 0,5 ΜL |
| Nuclease-gratis vatten | Upp till 50 µL |
Tabell 5: En parkopplad gärna PCR-blandning.
Discussion
Ett antal tid - och kostnadsbesparande ändringar har gjorts till gärna uttryck vektor byggandet. Ett enda steg begränsning och ligatur protokoll beskrivs liksom en metod för Parade gärna uttryck vektorn konstruktion. Parade gärna uttrycket uppnås genom en PCR-amplifiering med oligonukleotider som innehåller både en framåt gärna mål sekvens (n20) och ett omvänd komplement till ett annat mål (n20). Detta sedan införs en sekundär RNA Pol III promotor (7SK) samt en sgRNA svans konventionellt uttrycker enda gärna uttryck plasmider.
En försiktig oligonukleotiden design kommer att säkerställa en framgångsrik PCR för Parade gärna byggandet samt en klibbig-end ligering. Efter steg begränsning och ligatur reaktion, tillägg av ytterligare BsmBI kommer att garantera alla omodifierade uttryck vektorer i reaktionen skärs. Detta kommer att avsevärt minska bakgrunden vid omvandlingen. Använda NEB-stabil behöriga E. coli och en tillväxt på 30 ° C kommer att öka avkastningen av en framgångsrik omvandling.
De fördelar som denna teknik har över gemensam praxis inkluderar en förenkling av processen för oligonukleotiden glödgning, singel-steg begränsa gärna uttryck vektorn och ligering av oligonukleotider och förmågan att utnyttja konventionell enda gärna uttryck vektorer för uttrycket av Parade guider. Medan protokollet beskrivs här fokuserar på en uppsättning däggdjur vektorer, den allmänna strategin är plast och är tillämplig på någon organism, förutsatt att lämpliga gärna vektorn är tillgängliga. Sammantaget sparar protokollet beskrivs tid och kostnader.
Det bör dock noteras att inte skalas beskrivs förfarandet för att köpa enskilda oligonukleotider väl för generering av bibliotek som innehåller tusentals gRNAs. För dessa ändamål rekommenderas alternativa energikällor oligonukleotiden syntes såsom oligo chip syntes.
Det är fördelaktigt att inkludera en no-infoga kontroll när kloning gRNAs. Denna reaktion kan vara enkelt ställa in parallellt med reaktionerna av intresse och kan användas för att avgöra huruvida en ofullständig matsmältning av start vektor har bidragit till kolonierna observerades vid slutet av förfarandet. Om något av ovanstående kloning protokoll har misslyckats på grund av ett ofullständigt smält vektor ryggraden eller dålig ligering effektivitet, föreslår vi dessutom försöker alternativet kloning metod som vi har beskrivit.
När du använder Golden Gate kloning för att samtidigt smälta vektorn och ligera i de små oligonukleotider inom en enda reaktion, är det viktigt att kontrollera att den gärna som är att vara klonade in vektorn inte har en BsmBI plats inne i den, eftersom detta kommer att leda till t han gärna skärs och frånvaro av kolonier vid omvandling.
Den gärna kloning vi har strategin gör det möjligt för en snabb och kostnadseffektiv generation av gRNAs på ~ 10 US-dollar per guide, med huvuddelen av de kostnader som kommer från oligonukleotiden syntesen och sekvens kontrollen. Metoden beskrivs är utformat för att tillåta användare att generera gRNAs för användning med SpCas9, protokollet kan enkelt anpassas för användning med Cas9 orthologues eller andra RNA-guidad endonucleases såsom Cpf1 eller C2C2, med smärre ändringar till vektor stamnätet och den oligonukleotid överhäng sekvenser16,17.
Protokollet som beskrivs ovan ger sekvens-verifierade gärna uttryck plasmider i 3 d (start med syftet lämpligt utformad oligonukleotider), som är betydligt snabbare än nuvarande metoder. Detta inkluderar gärna utformningen av 1 h (steg 1-2.3), utspädning och alikvot av oligonukleotider 10 min (steg 3-5.1), matsmältning och rening av pSB700 gärna uttryck vektor 2 h (steg 6-6,4), kloning av de gärna oligonukleotider till en predi föresla pSB700 gärna uttryck vektor över natten i rumstemperatur (steg 7-7,3), den enda steg BsmBI begränsning ligering av 3 h och 40 min (steg 8-8,4), omvandlingen av 16 h (steg 9-9,6) och validering av sekvensen av gärna uttryck plasmiden 24 h (med varaktigheten beroende på sanger sekvensering tillgången och hastigheten efter inlämnande av bakteriell kolonin; steg 10). Parade gärna design och sekvens ändring tar 1 h (steg 11-13). Den Parade gärna PCR tar 3,5 h (steg 14-14,4). Kloning av PCR-fragment i en pSB700 vektor tar 3h och 40 min (steg 15-16).
De mest sannolika frågor som kan ställas inför detta protokoll avser ineffektivitet i Golden Gate församlingen och transformation. Inkludera en no-infoga kontroll under Golden Gate församling att visualisera effektiviteten i församlingen. Under omformningen ger puc19 positiv kontroll en förvandling effektivitet kontroll. NEB-stabil E. coli ska användas för lentiviral kompatibel plasmider och ofta kräver upp till > 16 h 30 ° c att ge synliga kolonier.
Disclosures
George M. Church har kapital i Editas och Caribou biovetenskaper, som syftar till att kommersialisera CRISPR-Cas9 genomet redigering teknik (för ett fullt avslöjande lista, se http://arep.med.harvard.edu/gmc/tech.html).
Acknowledgments
Sathiji Nageshwaran stöds av Friedreichs ataxi forskningsallians (07340305 - 01) och National Ataxia Foundation stipendier (7355538-01). Alejandro Chavez finansierades av National Cancer Institute grant 5T32CA009216-34 och Burroughs Wellcome fonden karriär Award för medicinska forskare. George M. Church stöds av den amerikanska National Institutes of Health (NIH) National Human Genome Research Institute grant RM1 HG008525 och Wyss Institutet för biologiskt inspirerade Engineering. James J. Collins medger stöd från Defense Threat minskning Agency bidraget HDTRA1-14-1-0006 och gruppen Paul G. Allen gränser. Alejandro Chavez utvecklat metoden dual-guide kloning. Sathiji Nageshwaran, Alejandro Chavez och Nan Cher Yeo skrev manuskriptet med input från alla författare.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BsmBI | New England Biolabs | R0580L | |
| T4 DNA ligase | Enzymatic/New England Biolabs | L6030-LC-L/M0202S | |
| Buffer 3.1 | New England Biolabs | B7203S | |
| Adenosine 5'-Triphosphate (ATP) | New England Biolabs | P0756S | |
| QIAprep spin miniprep kit | Qiagen | 27104 | |
| Chemically competent E. coli | New England Biolabs | C3019l, C2987l, or C3040H | |
| Standard microcentrifuge tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 0030 125.150 | |
| Axygen 8-Strip PCR tubes | Fischer Scientific | 14-222-250 | |
| Thermocycler with programmable temperature-stepping control | BioRad, | 1851148 | |
| UV spectrophotometer (NanoDrop 2000c) | Thermo Scientific | ||
| pSB700 plasmid | Addgene | #64046 | |
| NEB Stable Competent E. coli (High Efficiency) | New England Biolabs | c3040 | |
| Lysogeny broth (LB) | |||
| Ampicillin | |||
| TE buffer (1 mM EDTA, 10 mM Tris-Cl, pH 7.5) | |||
| pSN007 plasmid | Addgene | 102440 |
References
- Gasiunas, G., Barrangou, R., Horvath, P., Siksnys, V. Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (39), E2579-E2586 (2012).
- Jinek, M., Chylinski, K., Fonfara, I., Hauer, M., Doudna, J., Charpentier, E. A Programmable Dual-RNA-Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Shalem, O., Sanjana, N., Zhang, F. High-throughput functional genomics using CRISPR-Cas9. Nature Reviews Genetics. 16 (5), 299-311 (2015).
- Chavez, A., et al. Highly efficient Cas9-mediated transcriptional programming. Nature Methods. 12 (4), 326-328 (2015).
- Gilbert, L., et al. CRISPR-Mediated Modular RNA-Guided Regulation of Transcription in Eukaryotes. Cell. 154 (2), 442-451 (2013).
- Yang, L., Yang, J., Byrne, S., Pan, J., Church, G. CRISPR/Cas9-Directed Genome Editing of Cultured Cells. Current Protocols in Molecular Biology. , 31.1.1-31.1.17 (2014).
- Yang, L., Mali, P., Kim-Kiselak, C., Church, G. CRISPR-Cas-Mediated Targeted Genome Editing in Human Cells. Methods in Molecular Biology. 1114, 245-267 (2014).
- Vidigal, J., Ventura, A. Rapid and efficient one-step generation of paired gRNA CRISPR-Cas9 libraries. Nature Communications. 6, 8083 (2015).
- Joung, J., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening. Nature Protocols. 12 (4), 828-863 (2017).
- Kabadi, A., Ousterout, D., Hilton, I., Gersbach, C. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome engineering from a single lentiviral vector. Nucleic Acids Research. 42 (19), e147 (2014).
- Sakuma, T., Nishikawa, A., Kume, S., Chayama, K., Yamamoto, T. Multiplex genome engineering in human cells using all-in-one CRISPR/Cas9 vector system. Scientific Reports. 4 (1), (2014).
- Chari, R., Yeo, N., Chavez, A., Church, G. sgRNA Scorer 2.0: A Species-Independent Model To Predict CRISPR/Cas9 Activity. ACS Synthetic Biology. 6 (5), 902-904 (2017).
- Doench, J., et al. Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation. Nature Biotechnology. 32 (12), 1262-1267 (2014).
- Konermann, S., et al. Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex. Nature. 517 (7536), 583-588 (2014).
- The CRISPR Software Matchmaker: A New Tool for Choosing the Best CRISPR Software for Your Needs. , Available from: http://blog.addgene.org/the-crispr-software-matchmaker-a-new-tool-for-choosing-the-best-crispr-software-for-your-needs (2015).
- Engler, C., Marillonnet, S. Golden Gate Cloning. DNA Cloning and Assembly Methods. Valla, S., Lale, R. , Humana Press. New York, NY. 119-131 (2013).
- Zetsche, B., et al. Cpf1 Is a Single RNA-Guided Endonuclease of a Class 2 CRISPR-Cas System. Cell. 163 (3), 759-771 (2015).
- Abudayyeh, O., et al. C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector. Science. 353 (6299), (2016).
