Her, er en enkel, effektiv, og omkostningseffektiv metode til sgRNA kloning skitseret.
Den skitserede protokol beskriver strømlinet metoder til effektiv og omkostningseffektiv produktion af Cas9-associerede guide RNA’er. To alternative strategier for guide RNA (gRNA) kloning er skitseret, baseret på brugen af Type IIS begrænsning enzymet BsmBI i kombination med en række kompatible vektorer. Uden for adgang til Sanger Sekventeringen services til at validere de genererede vektorer, er ingen speciel udstyr eller reagenser påkrævet bortset fra dem, der er standard til moderne molekylærbiologiske laboratorier. Den skitserede metode er primært beregnet til kloning én enkelt gRNA eller en parret gRNA-udtrykker vektor ad gangen. Denne procedure skalerer ikke godt for generation af biblioteker, der indeholder tusindvis af gRNAs. Til disse formål anbefales alternative kilder af oligonukleotid syntese som oligo-chip syntese. Endelig, mens denne protokol fokuserer på et sæt af pattedyr vektorer, den generelle strategi er plast og finder anvendelse på enhver organisme, hvis passende gRNA vektor er tilgængelige.
CRISPR-forbundet protein 9 (Cas9) er et RNA-styrede endonuklease, som er rettet mod en ønskede genomisk mål når kompleksbundet med et passende udformet lille guide RNA (gRNA)1,2. gRNAs omfatter en 20-nucleotidsekvensen (protospacer), som supplerer genomisk target sekvens. Ved siden af genomisk målet er sekvens en 3′ protospacer-associerede motiv (PAM), som er nødvendig for Cas9 bindende. I tilfælde af Streptococcus Pyogenes Cas9 (SpCas9), dette har sekvens NGG. Ved bindende DNA mål, kløver Cas9 begge dele af DNA, dermed stimulere reparations-mekanismer, der kan udnyttes til at ændre locus af interesse. Aktivering af den fejlbehæftede ikke-homologe at deltage i slutning (NHEJ) vej kan forårsage afbrydelse af et target gen. Alternativt, reparationer foretaget via en homolog rekombination kan stimulere den målrettede integration af en ønskede DNA sekvens hvis en donor skabelon tilbydes6. Nukleasen-døde Cas9 (dCas9) varianter kan også være genereret3 af muterer restkoncentrationer i Cas9, der er væsentlige for endonucleolytic aktivitet. dCas9 forbliver ansvarlige for DNA bindende men klippe ikke sit bundne mål. Ved fusing forskellige effektor domæner til dCas9 og lede det i nærheden af et gen transcriptional startsted, kan dCas9 bruges til selektiv gen induktion eller delvis genhæmning4,5.
Mens utrolig kraftfuld, kræver evnen til at bruge Cas9 til at målrette en genomisk sekvens af interesse, at en bruger først genererer en unik til target kvadratnetsreference gRNA. En række metoder til at opbygge gRNA udtryk vektorer har tidligere været beskrevet, mange af varierende effektivitet og koste6,7,8. Enkeltstående PCR-amplikoner kan anvendes som gRNAs til hurtig screening, går fra oligonukleotid levering til Transfektion inden for flere timer; Det kræver dog Ultramer (over 100 bp) oligo syntese, hvilket er dyrt9. Det er også muligt at købe gBlocks, der er mere omkostningseffektive end Ultramers. Som Cas9 er hurtigt blevet en integreret del af den moderne Molekylærbiologi toolkit, ville en enkel, billig og meget effektiv metode til gRNA kloning være en velsignelse for feltet. Metoden beskrevet her har været ansat i vores gruppe og samarbejdende laboratorier for de sidste mange år til at generere mere end 2.000 unikke gRNAs4.
Den skitserede metode fokuserer på teknikker til kloning af lentiviral kompatibel vektorer der indeholder en enkelt gRNA eller højst to gRNAs. I generation af plasmider, der indeholder mere end to gRNAs, eller at klone et bibliotek med gRNAs, anbefales alternative tilgange9,10,11,12.
En række af tid – og omkostningsbesparende ændringer er foretaget gRNA udtryk vektor konstruktion. En enkelt-trins begrænsning og ligatur protokol er skitseret samt en metode til parret gRNA udtryk vektor byggeri. Parret gRNA udtryk er opnået gennem en PCR-amplifikation ved hjælp af oligonukleotider indeholdende både en forward gRNA target sekvens (n20) og den omvendte supplement af et andet mål (n20). Dette indfører derefter en sekundær RNA Pol III promotor (7SK) samt en sgRNA hale i konventionelt udtrykker enkelt gRNA udtryk plasmider.
En omhyggelig oligonukleotid design sikrer en vellykket PCR for parret gRNA byggeri samt en klæbrig-ende ligatur. Efter trinvis begrænsning og ligatur reaktion, tilføjelse af yderligere BsmBI vil sikre alle umodificeret udtryk vektorer i reaktionen er skåret. Dette vil reducere baggrund ved omdannelsen. Ved hjælp af NEB-stabil kompetente E. coli og en vækst på 30 ° C vil øge udbyttet af en vellykket transformation.
De fordele, denne teknik har over fælles praksis omfatter en forenkling af processen med oligonukleotid udglødning, en enkelt-trins begrænsning af gRNA udtryk vektor og ligatur af oligonukleotider og evnen til at udnytte konventionelle enkelt gRNA udtryk vektorer for udtryk for parret guider. Mens protokollen beskrevet her fokuserer på et sæt af pattedyr vektorer, den generelle strategi er plast og gælder for enhver organisme, forudsat at passende gRNA vektor er tilgængelige. Samlet set sparer protokollen beskrevet tid og omkostninger.
Dog skal det bemærkes, at den skitserede procedure for at købe enkelte oligonukleotider ikke skalerer godt for generation af biblioteker, der indeholder tusindvis af gRNAs. Til disse formål anbefales alternative kilder af oligonukleotid syntese som oligo chip syntese.
Det er gavnligt at medtage ingen Indsæt kontrolelement Når kloning gRNAs. Denne reaktion kan være nemt indstille parallelt med reaktioner af interesse og kan bruges til at bestemme, om en ufuldstændig fordøjelse af den begyndende vektor har bidraget til kolonierne observeret i slutningen af proceduren. Desuden, hvis en af de ovenstående kloning protokoller har mislykkedes på grund af et utilstrækkeligt fordøjet vektor rygraden eller dårlig ligatur effektivitet, vi foreslå at prøve alternativ kloning metode vi har skitseret.
Når du bruger Golden Gate kloning for at fordøje vektoren og ligate i de lille oligonukleotider inden for en enkelt reaktion samtidig, er det vigtigt at kontrollere, at den gRNA, der er ved at blive klonet i vektoren ikke har et BsmBI websted inde i det, da dette vil føre til t han gRNA skæres og fravær af kolonier ved transformation.
GRNA kloning strategi vi har skitseret giver mulighed for en hurtig og omkostningseffektiv generation af gRNAs på ~ 10 US dollars pr. guide, med hovedparten af udgifterne kommer fra oligonukleotid syntese og sekvens verifikation. Mens den skitserede metode er designet til at tillade brugere at generere gRNAs til brug med SpCas9, protokollen let kan tilpasses til brug med Cas9 orthologues eller andre RNA-styrede endonucleases såsom Cpf1 eller C2C2, med mindre ændringer til vector rygraden og den oligonukleotid overhæng sekvenser16,17.
Den protokol, der er skitseret ovenfor vil give sekvens-verificerede gRNA udtryk plasmider i 3 d (begyndende med korrekt designet oligonukleotider), hvilket er væsentligt hurtigere end nuværende metoder. Dette omfatter gRNA design 1 h (trin 1-2.3), fortynding og alikvot af oligonukleotider af 10 min (trin 3-5.1), fordøjelse og rensning af pSB700 gRNA udtryk vektor af 2 h (skridt 6-6.4), kloning af gRNA oligonukleotider i en predi omatisk pSB700 gRNA udtryk vektor natten over ved stuetemperatur (trin 7-7.3), trinvis BsmBI begrænsning ligatur af 3 timer og 40 min (trin 8-8.4), omdannelse af 16 h (trin 9-9.6) og validering af rækkefølgen af gRNA udtryk plasmid af 24 timer (med varighed afhængig af sanger sekventering tilgængelighed og hastighed efter indgivelse af den bakterielle koloni; trin 10). Parret gRNA design og sekvens ændring tager 1t (trin 11-13). Den parrede gRNA PCR tager 3,5 h (trin 14-14.4). Kloning af PCR fragment i en pSB700 vektor tager 3 timer og 40 min (trin 15-16).
De mest sandsynlige problemer, der kan blive konfronteret med denne protokol vedrører ineffektivitet i Golden Gate forsamling og transformation. Omfatte ingen Indsæt kontrolelement under Golden Gate forsamlingen til at visualisere effektiviteten af forsamlingen. Under omdannelsen, vil puc19 positive kontrol giver en transformation effektivitet kontrol. NEB-stabil E. coli bør anvendes til lentiviral kompatibel plasmider og ofte kræver op til > 16 h ved 30 ° C til at give synlige kolonier.
The authors have nothing to disclose.
Sathiji Nageshwaran er støttet af Friedreichs ataksi Research Alliance (07340305 – 01) og nationale ataksi Foundation stipendier (7355538-01). Alejandro Chavez blev finansieret af National Cancer Institute tildeling 5T32CA009216-34 og Burroughs Wellcome fond karriere Award for medicinske forskere. George M. Church er understøttet af den amerikanske National Institutes of Health (NIH) National Human Genome Research Institute grant RM1 HG008525 og Wyss Institut for biologisk inspirerede Engineering. James J. Collins anerkender støtte fra Defense trussel reduktion Agency grant HDTRA1-14-1-0006 og Paul G. Allen grænser gruppe. Alejandro Chavez udviklet metoden dual-guide kloning. Sathiji Nageshwaran, Alejandro Chavez og Nan Cher Yeo skrev manuskriptet med input fra alle forfattere.
BsmBI | New England Biolabs | R0580L | |
T4 DNA ligase | Enzymatic/New England Biolabs | L6030-LC-L/M0202S | |
Buffer 3.1 | New England Biolabs | B7203S | |
Adenosine 5'-Triphosphate (ATP) | New England Biolabs | P0756S | |
QIAprep spin miniprep kit | Qiagen | 27104 | |
Chemically competent E. coli | New England Biolabs | C3019l, C2987l, or C3040H | |
Standard microcentrifuge tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 0030 125.150 | |
Axygen 8-Strip PCR tubes | Fischer Scientific | 14-222-250 | |
Thermocycler with programmable temperature-stepping control | BioRad, | 1851148 | |
UV spectrophotometer (NanoDrop 2000c) | Thermo Scientific | ||
pSB700 plasmid | Addgene | #64046 | |
NEB Stable Competent E. coli (High Efficiency) | New England Biolabs | c3040 | |
Lysogeny broth (LB) | |||
Ampicillin | |||
TE buffer (1 mM EDTA, 10 mM Tris-Cl, pH 7.5) |