Summary
这里概述了一种简单、高效、经济高效的 sgRNA 克隆方法。
Abstract
概述的协议描述了 Cas9-associated 导 rna 的高效和经济高效生成的简化方法。根据 IIS 限制酶 BsmBI 与一组兼容向量的结合使用, 概述了两种不同的导 RNA (gRNA) 克隆策略。除了使用桑格测序服务来验证生成的向量之外, 除那些标准的现代分子生物学实验室之外, 不需要任何特殊的设备或试剂。所概述的方法主要用于一次克隆一个单一的 gRNA 或一个配对的 gRNA 表达载体。对于包含数以千计 gRNAs 的库的生成, 此过程不会很好地扩展。为了这些目的, 建议采用寡核苷酸合成的替代来源, 例如寡聚芯片合成。最后, 虽然这个协议的重点是一套哺乳动物的载体, 一般的战略是塑料的, 并适用于任何有机体, 如果适当的 gRNA 向量可用。
Introduction
CRISPR 相关蛋白 9 (Cas9) 是一个 RNA 引导限制性, 这是针对一个理想的基因组目标时, 与适当设计的小指南 RNA (gRNA)1,2。gRNAs 包括一个20核苷酸序列 (protospacer), 这是互补的基因组目标序列。在基因组目标序列旁边是一个 3 ' protospacer 相关的主题 (PAM), 这是需要 Cas9 绑定。在化脓链球菌Cas9 (SpCas9) 的情况下, 这有序列 NGG。在结合 dna 靶点时, Cas9 会将两股 dna 都粘在一起, 从而刺激修复机制, 从而可以利用它来改变感兴趣的部位。激活易出错的非同源端连接 (NHEJ) 通路可能会导致目标基因的中断。另外, 如果提供6的捐助者模板,通过同源重组进行的修复可以刺激所需 DNA 序列的目标整合。核酸酶死 Cas9 (dCas9) 变种也可以产生3通过变异的残留在 Cas9, 是必不可少的 endonucleolytic 活动。dCas9 仍然有能力进行 DNA 结合, 但并没有削减其绑定目标。通过将各种效应域融合到 dCas9 并将其定向到基因转录起始点附近, dCas9 可用于选择性基因诱导或部分基因沉默4,5。
虽然非常强大, 但使用 Cas9 来针对基因组兴趣序列的能力要求用户首先生成一个 gRNA 唯一的目标站点。以前已经描述了各种建立 gRNA 表达载体的方法, 许多不同的效率和成本6,7,8。独立 PCR amplicons 可作为 gRNAs 快速筛选, 从寡核苷酸交付到转染在几个小时内;然而, 这需要 Ultramer (超过 100 bp) 寡聚合成, 这是昂贵的9。还可以购买比 Ultramers 更具成本效益的 gBlocks。随着 Cas9 迅速成为现代分子生物学工具包的一个组成部分, 一种简单、廉价、高效的 gRNA 克隆方法将对该领域大有裨益。这里描述的方法在我们的小组和合作实验室在过去几年被使用了创造2000个独特的 gRNAs4年。
所概述的方法侧重于克隆慢病毒载体兼容载体的技术, 该矢量包含单 gRNA 或最多两个 gRNAs。对于含有两个以上 gRNAs 的质粒的生成, 或者克隆 gRNAs 的库, 建议采用9、10、11、12的替代方法。
Protocol
注: 下面的协议概述了如何使用在线工具执行 gRNA 设计 (步骤 1.1-1.4), 这是 gRNA 质粒结构的所有方法的共同之处, 详述了本手稿。一旦确定了所需的 gRNAs, 就会描述订购必要寡核苷酸的步骤, 以及几种不同的方法, 将寡核苷酸引入表达载体 (如pSB700)。提出了2种方法克隆单导表达载体的基础上, 要么结扎成一个简化的表达载体 (步骤 2-7.3) 或金门克隆 (步骤 8-8.4)。进一步概述了克隆成对导表达载体的战略, 使用聚合酶链反应 (PCR) 后, 金门克隆 (步骤 11-16)。最后, 还概述了执行大肠杆菌化学转化的常用方法 (步骤 9-9.6) 和表达式向量序列验证 (步骤10到 10.2.3)。
- 设计 gRNA 寡核苷酸使用在线工具如下。
- 设计 gRNAs 使用在线工具, 如 sgRNA 记分2.0 在线工具 (https://crispr.med.harvard.edu/sgRNAScorerV2/)13或替代品, 如广泛的 sgRNA 设计工具 (http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-设计)14和另外几个15。
- 使用基因名称、符号或原始 DNA 目标序列生成潜在的 gRNA 序列。
注意: 创建一个电子表格 (. csv/. xls) 文件, 其所有潜在 gRNAs 针对该基因或提供的序列。如果使用的是 sgRNA 记分员2.0 在线工具, 或者如果采用了广泛的 sgRNA 设计工具, 则潜在 gRNAs 的质量将被报告为分数。这两种措施都是根据目标切割活动而得出的。 - 在分级 gRNAs 时, 请考虑 gRNA 选择中的非目标活动。
注: 最佳导则是那些具有最大的目标效率和最小非目标活动。为了激活 (CRISPRa), gRNAs 的目的是针对该地区从 1-200 bp 上游的转录起始点 (TSS)4,15。对于抑制 (CRISPRi), gRNAs 的设计目标是从 50 bp 上游的 tss, 直到 300 bp 下游的 tss5。为了禁用一个基因使用 Cas9 切割, gRNAs 设计目标的第一个 10-50% 的编码序列下游的起始密码子 (因为 gRNAs 目标的 3 ' 末端的基因已被证明是不太有效的)13。 - 如果将寡核苷酸用于金门克隆, 确保不存在内部 BsmBI 站点, 因为这将导致退火的寡核苷酸被消化13。
- 选择基因组目标序列, 并删除单 gRNA 寡核苷酸序列修改 (例如, 起始序列: CGCGTGCTCTCCCTCATCCATGG) 的 3 ' NGG PAM (只留下 protospacer 序列)。
注意: 如果使用电子表格, 下面的公式将删除 3 ' NGG: = 左 (A2, LEN (A2)-3), 其中 A2 是包含目标序列和 PAM 的单元格。- 将CACCG追加到寡聚 5 ' 末端。
注: 结扎后的 pSB700 骨干, 这一序列将包括 3 ' 结束的 U6 启动者驱动转录的 gRNA。"CACC" 序列确保寡核苷酸与 BsmBI 消化 pSB700 载体的悬垂性相容。"G" 是聚合酶 III. 促进剂的要求, 并确保有效地启动 gRNA 的转录。在电子表格中使用以下公式执行此任务: = 串联 ("CACCG" (B2)), 其中 B2 是包含 protospacer 序列的单元格 [例如, 将 5 ' CACCG 序列添加到 protospacer: CACCGCGCGTGCTCTCCCTCATCCA (此是所订购的最后向前寡聚)]。 - 创建 protospacer 序列的反向补全 (rc)。
注: 例如, 上述 protospacer 的反向补充是 TGGATGAGGGAGAGCACGCG。 - 将 AAAC 追加到 rc protospacer 的 5 ' 端。附加一个额外的 C 到 3 ' 端的 rc protospacer (反向寡核苷酸)。
注意: "AAAC" 序列确保寡核苷酸与克隆成 BsmBI 消化 pSB700 载体相容。额外的 "C" 在 3 ' 末端是需要的退火序列到开始的 "G" 添加到前寡核苷酸。使用电子表格中的以下公式执行此任务= 串联 ("AAAC"、(C2)、"C"), 其中 C2 是包含反向补序列的单元格 [例如, AAACTGGATGAGGGAGAGCACGCGC (这是最终的反向寡聚订购)]]。
- 将CACCG追加到寡聚 5 ' 末端。
- 点寡核苷酸, 不加修饰寡核苷酸。
- 要求最低数量的寡核苷酸, 因为只有非常小的数量是需要的克隆反应。
- 稀释冻干底漆到最终浓度为100微米的 1x TE 缓冲器 (10 毫米三氯, pH 7.5 与1毫米 EDTA)。
- 整除1:1 向前和反向寡核苷酸 (例如, 10 ul 每一个) 成 PCR 带帽管。
注意: 这将允许快速克隆许多 gRNAs 在一次使用多通道吸管。- 漩涡和自旋向下的寡聚混合物 (100 x g 十五年代)。在设置结扎前, 在室温下孵育5分钟的反应。
注意: 没有必要加热, 然后冷却的寡糖混合物, 以促进其退火。值得注意的是, 3-4 对 gRNA 寡核苷酸可能被汇集和退火在一个单一的反应 (例如, 混合 3 ul 前和 3 ul 的反向寡核苷酸一起从多达 4 gRNA 寡聚对, 给出了总容量 24 ul)。用于退火的寡核苷酸的体积可以调整以适应用户的需要。
注: 步骤 6-7.3 描述 pSB700 的简化。有关另一种方法, 请参见步骤 8, 其中描述了单步 BsmBI 限制结扎。
- 漩涡和自旋向下的寡聚混合物 (100 x g 十五年代)。在设置结扎前, 在室温下孵育5分钟的反应。
- 文摘 1-5 微克的选择 pSB700 指南表达载体与 BsmBI (0.5 ul 每1微克) 为 1 h 在55°c15。进行 pSB700 gRNA 表达载体的消化, 总容积为 40 ul (表 1)。
- 在 1.5% (重量/卷) 低熔点琼脂糖凝胶上运行消化产物。
- 切出的消化矢量骨干带, 这相当于一个片段的 9 kb 的大小, 并把凝胶切片在1.5 毫升离心管 (图 1)。
- 根据制造商的说明, 使用商业凝胶纯化试剂盒从琼脂糖凝胶中提取 DNA。
- 将 DNA 洗脱 10-15 ul 的 TE 缓冲器 (10 毫米三, ph 7.5; 10 毫米三, ph 8.0) 获得浓缩洗脱液。
- 在 20 ul 反应 (表 2) 中, 结扎从步骤4到 BsmBI 消化 pSB700 引导表达载体的退火 gRNA 寡核苷酸, 将 gRNA 寡核苷酸克隆到预消化的 pSB700 表达载体中。
- 首先, 添加水, 缓冲, 和 DNA, 然后涡的混合物和添加酶, 漩涡1最后的时间后加入酶和旋转的解决方案 (100 x g 为十五年代)。夜间在室温下孵化反应。
- 包括无插入阴性对照反应, 仅有 BsmBI 消化载体, 没有退火 gRNA 寡糖插入。1 ul 的水可以用来代替 1 ul 的 gRNA 寡核苷酸为无插入阴性控制。
- 继续进行转换 (步骤 9)。
注意: 步骤8是对 pSB700 的简化的一种替代方法, 如步 6-7.3 所述。
- 引入 gRNA 寡核苷酸 (在步骤 1-5.1 中概述) 进入 pSB700 载体, 通过使用金门克隆为单步 BsmBI 限制结扎。
- 装配主混合 (1 x)-如果正在克隆多个 gRNAs, 则在不添加加核苷酸的情况下准备主混合 (表 3)。整除将主组合成 PCR 管, 使用多通道吸管从步骤4.2 中添加 gRNA 寡核苷酸。包括使用 1 ul 水的无插入控制。
- 通过将 BsmBI 酶和 T4 DNA 连接酶在同一反应中, 实现同时进行限制消化和结扎 (即金门克隆)。使用以下简单的门协议来消化向量和结扎在1反应: 保持反应在37°c 为 2 h, 在50°c 为10分钟, 在65°c 为15分钟, 在80°c 为15分钟, 并且最后, 保持在摄氏4摄氏度。
- 注意, 在使用此方法之前, 请验证寡核苷酸不包含 BsmBI 站点。如果正在克隆的 gRNAs 包含 BsmBI 限制站点, 则在添加 BsmBI 时将对它们进行消化。这将阻止用户获取任何转化。
- 在最初简单的门反应以后, 增加另外 0.5 ul BsmBI 酵素到每个反应并且安置他们回到在55°c 为 1 h。消化后, 保持反应在4摄氏度或冻结它, 直到准备转变。这第二轮的限制酶孵化去除任何未消化或 religated 野生型 pSB700 向量主干从反应混合物, 以便只有接受了寡核苷酸插入的载体保持完好, 并将产生转化。
- 继续进行转换 (步骤 9)。
- 将反应混合物的 0.5 ul 转换成 8 ul 的合格大肠杆菌[例如, 纳布 DH5a (1-3 x 109 cfu/µg pUC19 DNA) 或纳布稳定 1-3 x 109 cfu/µg 的 pUC19 DNA)。对于慢病毒载体质粒, 纳布稳定细胞将提供更一致的粒产量。
- 将大肠杆菌从贮藏处取出-80 摄氏度, 在冰上解冻 5-10 分钟。
- 添加 0.5 ul 的反应混合到 8 ul 的合格大肠杆菌, 并保持在冰上的混合物30分钟。
- 热冲击混合物在42°c 四十五年代。
- 在冰上休息2分钟。
- 恢复在 250 ul 的 SOC 介质旋转振动筛上的文化为1小时的 DH5a 和30°c 的纳布马厩。
- 板材 80 ul 文化在适当的抗生素抵抗溶源性肉汤 (磅) 板材和孵化它隔夜在37°c 为纳布 DH5a 并且在30°c 为纳布马厩 [例如, pSB700 被镀在磅与氨苄西林 (100 微克/毫升) 板材] (图 3)。
- 验证 gRNA 表达质粒的序列: 用 5 '-GAGGGCCTATTTCCCATGATTCC-3 ' 在 gRNA 寡聚物上游 U6 启动子上的素数来验证每个菌落的序列。
- 选择 2-3 殖民地每反应为排序 (表 4)。
注意: 一些测序提供商现在提供的服务可以直接从细菌菌落进行, 这大大降低了时间和成本, 消除了在测序前净化质粒的需要。或者, 质粒分离试剂盒可用于从单个细菌克隆中回收质粒 DNA。然后, 可以提交纯化质粒进行测序。如果进行了联合结扎反应, 请使用表 4作为对应选择和提交用于排序的殖民地数目的指南。 - 在序列确认之后, 分离出 gRNA 表达质粒。
- 使用无菌吸管尖端接种所需的蚁群成5毫升培养基, 含有100微克/毫升氨苄西林的 pSB700 表达载体。
- 在 100 rpm 37 摄氏度的旋转孵化器中生长细胞 (如果使用纳布马厩, 30 摄氏度)。
- 按照制造商的协议, 用质粒准备试剂盒将质粒 DNA 从培养基中分离出来。
注意: 虽然上述方法使用户能够创建单一的 gRNA 矢量, 但此协议将允许用户创建包含 2 gRNAs 的向量, 每个矢量由它们自己的 RNA 聚合酶 III 启动子驱动。
- 选择 2-3 殖民地每反应为排序 (表 4)。
- 对于配对的 gRNA 设计, 请使用上面概述的 sgRNA 设计工具 (步骤 1.1-1.4) 中的输出文件, 然后选择2个感兴趣的参考线。
- 对于激活或压制, 请选择至少 30 nt 的参考线对。
- 对于用于切割的 gRNAs, 选择在该基因中针对2不同外显子的参考线。
- 在下面的说明中, 指定数组 gRNA 中的第一个 gRNA 和数组 gRNA B 中的第二个 gRNA, 以创建配对的 gRNA 寡核苷酸序列修改。
注: 用于创建 gRNA 的寡核苷酸将被称为 fA, 而用于引入 gRNA 的反向寡聚将被称为 rB。下面的克隆方法在每个 gRNAs 的 5 ' 端自动追加一个起始 G。- 按如下所示创建适当的 fA 寡核苷酸。
注:20 核苷酸组成的 gRNA 目标序列 gRNA-A 将构成初始 fA 序列后, 将建立以下步骤 (例如, protospacer-aggggctacaccactcattg)。- 将 TTTTCGTCTCTCACCG 追加到 fA 的 5 ' 末尾 (例如序列 TTTTCGTCTCTCACCGaggggctacaccactcattg)。
- 将GTTTTAGAGCTATGCTGAAAAGCA追加到 fA 的 3 ' 末尾 (例如, 序列 TTTTCGTCTCTCACCGaggggctacaccactcattgGTTTTAGAGCTATGCTGAAAAGCA)。这是最终版本的 fA 寡核苷酸将被订购。
- 创建必要的 rB 寡聚, 如下所示。
注: 由 gRNA B 组成的 gRNA 目标序列的20核苷酸将构成初始 rB 序列, 以下步骤将生成 (例如, 起始序列 gtcccctccaccccacagtg)。- 采取 rb = (revcom) rb (如cactgtggggtggaggggac) 的反向补充。
- 将 TTTTCGTCTCTAAAC 追加到 (revcom) rB (TTTTCGTCTCTAAACcactgtggggtggaggggac) 的 5"末尾"。
- 将CGGTGACCCAGGCGGCGCACAAG追加到 3 "(revcom) rB (如TTTTCGTCTCTAAACcactgtggggtggaggggacCGGTGACCCAGGCGGCGCACAAG) 的末尾。这是将被订购的 rB 寡核苷酸的最终版本。
注: 以下公式可用于通用电子表格软件自动编辑寡聚序列: = 串联 ("TTTTCGTCTCTCACCG", (A2), "GTTTTAGAGCTATGCTGAAAAGCA"), 其中 A2 是包含 fA 序列的单元格, 而=串联 ("TTTTCGTCTCTAAAC", (B2), "CGGTGACCCAGGCGGCGCACAAG"), 其中 B2 是包含 (revcom) rB 序列的单元格。
- 按如下所示创建适当的 fA 寡核苷酸。
- 从选择的综合供应商处订购寡核苷酸。不需要进行其他修改。
- 利用制备的质粒 DNA 对 fA 和 rB 引物进行 PCR。这将附上向前和反向 gRNAs 从这个质粒产生的 PCR 片段, 并将允许每一个从它自己的启动子 (U6 和7SK 促进者-不同的发起人在这个设计中使用, 以防止病毒重组)。
- 使用 Phusion GC 特殊 PCR 协议创建所需的片段: 保持混合物在98°c 为1分钟 (1 周期), 在98°c 为十五年代, 在53°c 十五年代, 在65°c 为2分钟, 并且在72°c 为4分钟 (30 个周期), 然后按住它在4°c (表 5)。
- 在1% 琼脂糖凝胶上运行 PCR 产品, 并验证1波段是否见过 490 bp (图 2)。
- 使用凝胶萃取试剂盒切割和提取此 PCR 产品。将 DNA 洗脱为 15 ul 的 TE 缓冲器 (10 毫米三, ph 7.5; 10 毫米三, ph 8.0) 或蒸馏水。
- 用分光光度计测定提取产物与 pSB700 载体的浓度, 用于 DNA 浓度计算。将 PCR 产物和载体正常化为 40 femtomoles/ul 的浓度。
注: 有几个网站可帮助根据 dna 的长度和溶液浓度 (如完成公司有关: http://www.promega.com/a/apps/biomath/index.html？calc=ugpmols) 来计算给定 dna 溶液的浓度。计算器使用公式:
在这里, N 是核苷酸序列的长度。
- 使用步骤 8-8.4 中概述的协议建立同时限制消化和结扎反应, 将 PCR 片段克隆成 pSB700 向量。
- 而不是添加 1 ul 的底漆溶液的反应, 添加 1 ul 的 40 fmole/ul 的 PCR 产品。此外, 使用 1 ul 的 pSB700 向量集中 40 fmole/ul。
注: 等摩尔比率导致一致的结果, 虽然即使在不使用确切比率的情况下, 也可以获得菌落。
- 而不是添加 1 ul 的底漆溶液的反应, 添加 1 ul 的 40 fmole/ul 的 PCR 产品。此外, 使用 1 ul 的 pSB700 向量集中 40 fmole/ul。
- 在完成金门反应过程 (步骤 8-8.4), 进行转换和序列验证 (步骤 9-10.2.3)。
Representative Results
本协议中概述的方法是创建单个或配对的 gRNA 表达式向量。单 gRNA 表达载体可以通过简化向量主干 (图 1) 来创建, 然后在一系列短核苷酸中结扎它, 或者使用金门克隆同时消化矢量主干, 并将其结扎单反应中的短寡核苷酸系列。还提供了一种生成包含 2 gRNAs 的向量的方法, 每个载体由它自己的独立启动子驱动, 通过克隆一个自定义 PCR 片段 (图 2)。
成功的克隆任何概述的协议将导致显着更多的殖民地的转换与适当的插入 DNA 比无插入控制板 (图 3)。
图 1: pSB700 gRNA 表达载体的消化.1% 使用琼脂糖凝胶。1车道: 未切割的 pSB700。2车道: pSB700 与 BsmBI 切割。
图 2: 配对 gRNA PCR.1% 使用琼脂糖凝胶。1车道: 一个配对指南 PCR 片段的 ~ 490 bp。
图 3: gRNA 质粒的克隆和转化成功.左面板显示的 LB 和氨苄西林板块成功地转化为殖民地。右侧面板显示无插入控制板, 显示无菌落。请单击此处查看此图的较大版本.
| pSB700 导则表达式矢量 | 1-5 微克 |
| 纳布缓冲器3。1 | 4 ul |
| BsmBI | 1 ul |
| 蒸馏水 | 高达 40 ul |
| 总容积 | 40 ul |
表 1: pSB700 gRNA 表达载体与 BsmBI 的限制消化。
| 退火 gRNA 寡核苷酸 (单一或共用反应) | 1 ul |
| BsmBI 消化 pSB700 导表达载体 | 1 ul (~ 100-250 ng) |
| 10x T4 DNA 连接酶反应缓冲液 | 2 ul (1x 最后的集中) |
| T4 DNA 连接酶 | 1 ul (120 个单位) |
| 蒸馏水 | 15 ul |
| 总容积 | 20 ul |
表 2: gRNA 寡核苷酸结扎反应为简化的 pSB700 gRNA 表达载体。
| 试剂 | 容积 (1x) |
| H2O | 6 ul |
| T4 连接酶 | 0.5 ul |
| Atp | 1 ul |
| BsmBI | 0.5 ul |
| 纳布缓冲器3。1 | 1 ul |
| 矢量 (如pSB700) (40 fmol) | 1μlL |
| 双导 (40fmol) 的插入前和反向寡核苷酸或 PCR 片段 | 1 ul (0.5 ul 向前和 0.5 ul 反向) |
表 3: 单步 BsmBI 限制和 gRNA 结扎反应组合。
| 1指南 | 序列3殖民地 |
| 2指南 | 序列5-10 殖民地 |
| 3指南 | 序列10-15 殖民地 |
| 4指南 | 序列15-20 殖民地 |
表 4: 建议的菌落数序列为汇集 gRNA 克隆反应。
| PCR 成分 | 50µL 反应 |
| 10µM 前底漆 | 2.5 µL |
| 10µM 反向底漆 | 2.5 µL |
| 5x Phusion HF 或 GC 缓冲器 | 10µL |
| 10毫米 dNTPs | 1µL |
| 模板 DNA | 100吴 |
| Phusion DNA 聚合酶 | 0.5 µL |
| 核酸酶水 | 多达50µL |
表 5: 配对 gRNA PCR 混合物。
Discussion
对 gRNA 表达式矢量结构进行了大量的时间和成本节约修改。概述了单步约束和结扎协议, 以及配对 gRNA 表达载体构造的方法。配对的 gRNA 表达是通过 PCR 扩增, 使用含有前 gRNA 目标序列 (n20) 和另一目标 (n20) 的反向补充的寡核苷酸。然后引入一个二级 RNA sgRNA III 启动子 (7SK) 以及一个常规表达单 gRNA 表达质粒的尾端。
仔细的寡核苷酸设计将确保一个成功的 PCR 为配对的 gRNA 建设, 以及粘性端结扎。在单步限制和结扎反应后, 进一步 BsmBI 的添加将确保所有未修改的表达载体在反应中被切割。这将大大减少转型后的背景。利用纳布稳定的大肠杆菌和生长在30°c 将增加成功转化的收益率。
该技术在一般实践中的优势包括简化寡核苷酸退火过程, gRNA 表达载体的单步约束和寡核苷酸结扎, 以及利用常规配对参考线表达式的单 gRNA 表达式向量。虽然这里描述的协议集中在一组哺乳动物的载体, 一般的战略是塑料的, 适用于任何有机体, 只要适当的 gRNA 向量是可用的。总的来说, 该协议描述节省了时间和成本。
然而, 应该指出的是, 采购单个寡核苷酸的概述程序在生成包含数以千计 gRNAs 的库方面没有很好的扩展。为了这些目的, 建议采用寡核苷酸合成的替代来源, 如寡聚芯片合成。
在克隆 gRNAs 时包含无插入控件是有益的。这种反应可以很容易地建立在与兴趣的反应平行, 并可用于确定是否不完全消化的起始向量已作出贡献的殖民地观察到的过程结束。此外, 如果上述克隆协议之一由于未完全消化的载体骨干或结扎效率差而失败, 我们建议尝试我们概述的替代克隆方法。
当使用金门克隆同时消化在一个单一的反应中的小寡核苷酸的载体和结扎, 重要的是要检查的 gRNA 被克隆到向量中没有一个 BsmBI 的网站里面, 因为这将导致 t他 gRNA, 在改造过程中没有殖民地。
我们概述的 gRNA 克隆策略能够快速、经济高效地生成 gRNAs, 每本指南需要10美元, 其中大部分来自寡核苷酸合成和序列验证的成本。虽然概述的方法是为了允许用户生成 gRNAs 用于 SpCas9, 但该协议可以很容易地适应使用 Cas9 orthologues 或其他 RNA 引导内切酶, 如 Cpf1 或 C2C2, 对向量主干和寡核苷酸悬置序列16,17。
上面概述的协议将提供序列验证的 gRNA 表达质粒在 3 d (开始与适当设计的寡核苷酸), 这比目前的方法明显快。这包括 gRNA 设计 1 h (步骤 1-2.3), 寡核苷酸的稀释和整除10分钟 (步骤 3-5.1), 消化和纯化的 pSB700 gRNA 表达载体 2 h (步骤 6-6.4), 克隆 gRNA 寡核苷酸成 predigested pSB700 gRNA 表达载体夜间室温 (步骤 7-7.3), 单步 BsmBI 限制结扎3小时和40分钟 (步骤 8-8.4), 转换 16 h (步骤 9-9.6), 并验证 gRNA 表达质粒的序列24 h (随着时间的推移取决于桑格测序的可用性和在细菌菌落提交后的速度; 步骤 10)。配对的 gRNA 设计和序列修改需要 1 h (步骤 11-13)。配对的 gRNA PCR 需要 3.5 h (步骤 14-14.4)。将 PCR 片段克隆成 pSB700 向量需要3h 和40分钟 (步骤 15-16)。
本议定书可能面临的最可能问题涉及金门大会和改造的效率低下。在金门组件中包括无插入控制, 以可视化组件的效率。在变换过程中, puc19 正控制将提供一个转换效率控制。纳布-稳定大肠杆菌应用于慢病毒载体相容质粒, 并经常要求高达 > 16 小时在30°c, 以产生可见的殖民地。
Disclosures
乔治 m. 教会在 Editas 和驯鹿生物科学方面拥有公平性, 目的是将 CRISPR-Cas9 基因组编辑技术商业化 (对于一个完整的披露列表, 请参见 http://arep.med.harvard.edu/gmc/tech.html)。
Acknowledgments
Sathiji Nageshwaran 由 Friedreich 的共济失调研究联盟 (07340305-01) 和全国共济失调基金会奖学金 (7355538-01) 支持。查韦斯是由国家癌症研究所赠款5T32CA009216-34 和斯勒维斯威康基金会的医学科学家职业奖资助的。乔治 m. 教会得到美国国立卫生研究院 (NIH) 国家人类基因组研究所赠款 RM1 HG008525 和 Wyss 生物启发工程研究所的支持。詹姆斯 j. 柯林斯承认防御威胁减少机构赠款 HDTRA1-14-1-0006 和保罗. 艾伦边境集团的支持。查韦斯开发了双制导克隆方法。Sathiji Nageshwaran, 查韦斯和南雪儿写的手稿与所有作者的输入。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BsmBI | New England Biolabs | R0580L | |
| T4 DNA ligase | Enzymatic/New England Biolabs | L6030-LC-L/M0202S | |
| Buffer 3.1 | New England Biolabs | B7203S | |
| Adenosine 5'-Triphosphate (ATP) | New England Biolabs | P0756S | |
| QIAprep spin miniprep kit | Qiagen | 27104 | |
| Chemically competent E. coli | New England Biolabs | C3019l, C2987l, or C3040H | |
| Standard microcentrifuge tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 0030 125.150 | |
| Axygen 8-Strip PCR tubes | Fischer Scientific | 14-222-250 | |
| Thermocycler with programmable temperature-stepping control | BioRad, | 1851148 | |
| UV spectrophotometer (NanoDrop 2000c) | Thermo Scientific | ||
| pSB700 plasmid | Addgene | #64046 | |
| NEB Stable Competent E. coli (High Efficiency) | New England Biolabs | c3040 | |
| Lysogeny broth (LB) | |||
| Ampicillin | |||
| TE buffer (1 mM EDTA, 10 mM Tris-Cl, pH 7.5) | |||
| pSN007 plasmid | Addgene | 102440 |
References
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