यहां, एक सरल, कुशल, और sgRNA क्लोनिंग की लागत प्रभावी तरीका रेखांकित किया है ।
रेखांकित प्रोटोकॉल कुशल और लागत प्रभावी Cas9-संबद्ध मार्गदर्शिका RNAs के उत्पादन के लिए सुव्यवस्थित विधियों का वर्णन करता है । गाइड आरएनए के लिए दो वैकल्पिक रणनीति (gRNA) क्लोनिंग संगत वैक्टर का एक सेट के साथ संयोजन में प्रकार आईआईएस प्रतिबंध एंजाइम BsmBI के उपयोग के आधार पर उल्लिखित हैं । सैंज अनुक्रमण सेवाओं के लिए उपयोग के बाहर उत्पन्न वैक्टर को मान्य करने के लिए, कोई विशेष उपकरण या एजेंट उन है कि आधुनिक आणविक जीव विज्ञान प्रयोगशालाओं के लिए मानक कर रहे हैं से अलग आवश्यक हैं. रेखांकित विधि मुख्य रूप से एक समय में एक एकल gRNA या एक युग्मित gRNA-व्यक्त वेक्टर क्लोनिंग के लिए करना है । यह प्रक्रिया gRNAs के हजारों युक्त पुस्तकालयों की पीढ़ी के लिए अच्छी तरह से पैमाने पर नहीं है । उन प्रयोजनों के लिए, इस तरह के oligo के रूप में oligonucleotide संश्लेषण के वैकल्पिक स्रोतों चिप संश्लेषण की सिफारिश कर रहे हैं. अंत में, जबकि इस प्रोटोकॉल स्तनधारी वैक्टर का एक सेट पर केंद्रित है, सामांय रणनीति प्लास्टिक है और किसी भी जीव के लिए लागू होता है अगर उचित gRNA वेक्टर उपलब्ध है ।
CRISPR-जुड़े प्रोटीन 9 (Cas9) एक शाही सेना निर्देशित endonuclease जो एक वांछित जीनोमिक लक्ष्य की दिशा में निर्देशित किया जाता है जब एक उचित रूप से डिजाइन छोटे गाइड आरएनए (gRNA)1,2के साथ जटिल है । gRNAs एक 20-न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम (protospacer) है, जो जीनोमिक लक्ष्य अनुक्रम के पूरक है शामिल हैं । जीनोमिक लक्ष्य अनुक्रम के बगल में एक ‘ 3 protospacer-जुड़े आकृति (पाम) है, जो Cas9 बंधन के लिए आवश्यक है । स्ट्रेप्टोकोकस Pyogenes Cas9 (SpCas9) के मामले में, यह क्रम NGG है । डीएनए लक्ष्य पर बाध्यकारी, Cas9 डीएनए के दोनों किस्में सट, जिससे मरंमत तंत्र उत्तेजक है कि ब्याज की लोकस को संशोधित शोषण किया जा सकता है । त्रुटि प्रवण गैर मुताबिक़ अंत में शामिल होने (NHEJ) मार्ग के सक्रियकरण एक लक्ष्य जीन के व्यवधान पैदा कर सकता है । वैकल्पिक रूप से, मरंमत एक मुताबिक़ पुनर्संयोजन के द्वारा बनाई गई एक वांछित डीएनए अनुक्रम के लक्षित एकीकरण को उत्तेजित अगर एक दाता टेंपलेट6प्रदान की जाती है सकते हैं । Nuclease-डेड Cas9 (dCas9) वेरिएंट को Cas9 के भीतर अवशेषों को रूपांतरित करके3 भी जेनरेट किया जा सकता है जो endonucleolytic गतिविधि के लिए आवश्यक हैं । dCas9 डीएनए बाध्यकारी के लिए सक्षम रहता है, लेकिन उसके बंधे लक्ष्य में कटौती नहीं करता है । dCas9 करने के लिए विभिंन प्रभाव डोमेन से इनकार कर रही है और यह एक जीन transcriptional शुरू साइट के पास निर्देशन करके, dCas9 चयनात्मक जीन प्रेरण या आंशिक जीन मुंह बंद करने4,5के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
जबकि अविश्वसनीय रूप से शक्तिशाली, Cas9 का उपयोग करने की क्षमता के लिए ब्याज की एक जीनोमिक अनुक्रम लक्ष्य की आवश्यकता है कि एक उपयोगकर्ता पहले एक gRNA लक्ष्य साइट (ओं) के लिए अद्वितीय उत्पंन करता है । gRNA अभिव्यक्ति वैक्टर के निर्माण के लिए तरीकों की एक किस्म पहले से वर्णित किया गया है, अलग दक्षता और लागत6,7,8के कई । स्टैंड-अलोन पीसीआर amplicons तेजी से स्क्रीनिंग के लिए gRNAs के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, oligonucleotide प्रसव से कई घंटे के भीतर अभिकर्मक के लिए जा रहा; हालांकि, इस Ultramer (पर १०० बीपी) oligo संश्लेषण, जो9महंगा है की आवश्यकता है । यह भी Ultramers से अधिक लागत प्रभावी रहे हैं कि gBlocks खरीद करने के लिए संभव है. के रूप में Cas9 तेजी से आधुनिक आणविक जीवविज्ञान toolkit, एक सरल, सस्ता है, और gRNA क्लोनिंग के लिए अत्यधिक कुशल तरीका क्षेत्र के लिए एक वरदान होगा की एक अभिंन घटक बन गया है । विधि यहां वर्णित हमारे समूह में कार्यरत है और पिछले कई वर्षों के लिए सहयोग प्रयोगशालाओं को २,००० से अधिक अद्वितीय gRNAs4उत्पंन किया गया है ।
उल्लिखित विधि lentiviral संगत वैक्टर की क्लोनिंग के लिए तकनीक पर केंद्रित है जिसमें एक एकल gRNA या अधिकतम दो gRNAs हैं । दो से अधिक gRNAs युक्त plasmids की पीढ़ी के लिए, या gRNAs की एक पुस्तकालय क्लोन करने के लिए, वैकल्पिक दृष्टिकोण9,10,11,12की सिफारिश कर रहे हैं ।
समय की एक संख्या और लागत बचत संशोधनों gRNA अभिव्यक्ति वेक्टर निर्माण करने के लिए किया गया है । एक एकल-चरण प्रतिबंध और बंधाव प्रोटोकॉल के रूप में अच्छी तरह के रूप में युग्मित gRNA अभिव्यक्ति वेक्टर निर्माण की एक विधि उल्लिखित है । युग्मित gRNA अभिव्यक्ति एक पीसीआर प्रवर्धन दोनों एक आगे gRNA लक्ष्य अनुक्रम (n20) और एक और लक्ष्य (n20) के रिवर्स पूरक युक्त oligonucleotides का उपयोग कर के माध्यम से हासिल की है । यह तो एक माध्यमिक आरएनए पोल III प्रमोटर (7SK) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से पारंपरिक एकल gRNA अभिव्यक्ति plasmids व्यक्त करने में एक sgRNA पूंछ परिचय ।
एक सावधान oligonucleotide डिजाइन युग्मित gRNA निर्माण के लिए एक सफल पीसीआर के साथ ही एक चिपचिपा अंत बंधाव सुनिश्चित करेगा । एकल कदम प्रतिबंध और बंधाव प्रतिक्रिया के बाद, आगे के BsmBI के अलावा सभी संशोधित प्रतिक्रिया में वैक्टर अभिव्यक्ति की कटौती सुनिश्चित करेगा । यह काफी परिवर्तन पर पृष्ठभूमि कम हो जाएगा । नेब-स्थिर सक्षम ई. कोलाई और 30 डिग्री सेल्सियस पर एक विकास का उपयोग एक सफल परिवर्तन की उपज में वृद्धि होगी ।
लाभ इस तकनीक पर आम प्रथाओं है oligonucleotide एनीलिंग, gRNA अभिव्यक्ति वेक्टर और oligonucleotides के बंधाव की एक एकल कदम प्रतिबंध की प्रक्रिया का सरलीकरण शामिल है, और पारंपरिक उपयोग करने की क्षमता एकल gRNA अभिव्यक्ति वैक्टर युग्मित गाइड की अभिव्यक्ति के लिए । जबकि प्रोटोकॉल यहां वर्णित स्तनधारी वैक्टर का एक सेट पर केंद्रित है, सामांय रणनीति प्लास्टिक की है और किसी भी जीव के लिए लागू है, बशर्ते उपयुक्त gRNA वेक्टर उपलब्ध है । कुल मिलाकर, प्रोटोकॉल का वर्णन समय और लागत बचाता है ।
तथापि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि व्यक्तिगत oligonucleotides क्रय की प्रक्रिया को अच्छी तरह से gRNAs के हजारों युक्त पुस्तकालयों की पीढ़ी के लिए पैमाने पर नहीं है । उन प्रयोजनों के लिए, इस तरह के oligo चिप संश्लेषण के रूप में oligonucleotide संश्लेषण के वैकल्पिक स्रोतों की सिफारिश कर रहे हैं.
gRNAs क्लोनिंग करते समय कोई सम्मिलित नियंत्रण शामिल करना लाभकारी होता है. यह प्रतिक्रिया आसानी से समानांतर में ब्याज की प्रतिक्रियाओं के साथ स्थापित किया जा सकता है और यह निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि क्या एक अधूरा पाचन शुरू सदिश की प्रक्रिया के अंत में मनाया कालोनियों के लिए योगदान दिया है । इसके अलावा, यदि ऊपर क्लोनिंग प्रोटोकॉल में से एक एक पूरी तरह से पचा वेक्टर रीढ़ या गरीब बंधाव दक्षता के कारण विफल रहा है, हम सुझाव वैकल्पिक क्लोनिंग विधि हम रेखांकित किया है की कोशिश कर रहा ।
जब गोल्डन गेट क्लोनिंग के साथ साथ एक ही प्रतिक्रिया के भीतर छोटे oligonucleotides में वेक्टर और ligate पचाने के लिए, यह जांच करने के लिए महत्वपूर्ण है कि gRNA कि सदिश में क्लोन किया जा रहा है यह एक BsmBI साइट के अंदर नहीं है, के रूप में यह टी के लिए नेतृत्व करेंगे वह gRNA और परिवर्तन पर कालोनियों के एक अभाव जा रहा है ।
gRNA क्लोनिंग रणनीति हम रेखांकित किया है एक तेजी से और लागत प्रभावी gRNAs की पीढ़ी ~ गाइड प्रति 10 अमेरिकी डॉलर, oligonucleotide संश्लेषण और अनुक्रम सत्यापन से आ रही लागत के थोक के साथ । जबकि उल्लिखित विधि उपयोगकर्ताओं को SpCas9 के साथ प्रयोग के लिए gRNAs उत्पंन करने की अनुमति देने के लिए डिज़ाइन किया गया है, प्रोटोकॉल को आसानी से Cas9 orthologues या अंय आरएनए-निर्देशित endonucleases के साथ उपयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है जैसे Cpf1 या C2C2, वेक्टर रीढ़ में मामूली संशोधनों के साथ और oligonucleotide बदस्तूर जुगाड़16,17.
ऊपर उल्लिखित प्रोटोकॉल अनुक्रम-सत्यापित gRNA व्यंजक plasmids को 3 d (उचित रूप से डिज़ाइन किए गए oligonucleotides के साथ प्रारंभ करना) में प्रदान करेगा, जो वर्तमान विधियों की तुलना में काफी तेज़ है. इसमें 1 ज का gRNA डिज़ाइन (स्टेप्स 1-२.३) शामिल है, कमजोर पड़ने और aliquot के oligonucleotides के 10 मिनट (चरण 3-५.१), पाचन और शुद्धि के pSB700 gRNA अभिव्यक्ति वेक्टर के 2 ज (कदम 6-६.४), क्लोनिंग के gRNA oligonucleotides में एक predi gested pSB700 gRNA अभिव्यक्ति वेक्टर कमरे के तापमान पर रातोंरात (चरण 7-७.३), एकल-चरण BsmBI प्रतिबंध बंधाव की 3 ज और ४० मिनट (चरण 8-८.४), 16 के परिवर्तन ज (चरण 9-९.६), और gRNA अभिव्यक्ति के अनुक्रम की मांयता प्लाज्मिड 24 ज (के साथ की अवधि के आधार पर सैंज अनुक्रमण उपलब्धता और गति बैक्टीरियल कॉलोनी के सबमिशन के बाद; चरण 10) । युग्मित gRNA डिजाइन और अनुक्रम संशोधन 1 ज लेता है (कदम 11-13) । युग्मित gRNA पीसीआर लेता है ३.५ ज (कदम 14-१४.४) । एक pSB700 वेक्टर में पीसीआर टुकड़ा की क्लोनिंग 3h और ४० मिनट (15-16 कदम) लेता है ।
इस प्रोटोकॉल के साथ सामना किया जा सकता है कि सबसे अधिक संभावना मुद्दों गोल्डन गेट विधानसभा और परिवर्तन में अक्षमता से संबंधित हैं । असेंबली की कार्यकुशलता को विज़ुअलाइज़ करने के लिए गोल्डन गेट असेंबली के दौरान कोई सं-मिलित नियंत्रण शामिल करें । रूपांतरण के दौरान, puc19 सकारात्मक नियंत्रण एक परिवर्तन दक्षता नियंत्रण प्रदान करेगा । नेब-स्थिर ई. कोलाई lentiviral संगत plasmids के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए और अक्सर करने के लिए की आवश्यकता होती है > 16 एच सी पर ज दिखाई कालोनियों उपज के लिए 30 डिग्री सेल्सियस ।
The authors have nothing to disclose.
साथीजी Nageshwaran को Friedreich के गतिभंग रिसर्च अलायंस (07340305-01) और नेशनल गतिभंग फाउंडेशन फैलोशिप (7355538-01) ने सपोर्ट किया है । ऐलेजैंड्रो Chavez राष्ट्रीय कैंसर संस्थान अनुदान 5T32CA009216-34 और चिकित्सा वैज्ञानिकों के लिए बरोज वेलकम फंड कैरियर पुरस्कार द्वारा वित्त पोषित किया गया । जॉर्ज एम चर्च स्वास्थ्य के अमेरिका के राष्ट्रीय संस्थान (NIH) राष्ट्रीय मानव जीनोम अनुसंधान संस्थान अनुदान RM1 HG008525 और जैविक रूप से प्रेरित इंजीनियरिंग के लिए Wyss संस्थान द्वारा समर्थित है । जेंस जे कोलिंस रक्षा खतरा कमी एजेंसी अनुदान HDTRA1-14-1-0006 और पॉल जी एलन फ्रंटियर्स समूह से समर्थन स्वीकार करता है । ऐलेजैंड्रो Chavez दोहरे गाइड क्लोनिंग विधि विकसित की है । साथीजी Nageshwaran, ऐलेजैंड्रो Chavez, और नण चर येओ ने सभी लेखकों से इनपुट के साथ पांडुलिपि लिखी ।
BsmBI | New England Biolabs | R0580L | |
T4 DNA ligase | Enzymatic/New England Biolabs | L6030-LC-L/M0202S | |
Buffer 3.1 | New England Biolabs | B7203S | |
Adenosine 5'-Triphosphate (ATP) | New England Biolabs | P0756S | |
QIAprep spin miniprep kit | Qiagen | 27104 | |
Chemically competent E. coli | New England Biolabs | C3019l, C2987l, or C3040H | |
Standard microcentrifuge tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 0030 125.150 | |
Axygen 8-Strip PCR tubes | Fischer Scientific | 14-222-250 | |
Thermocycler with programmable temperature-stepping control | BioRad, | 1851148 | |
UV spectrophotometer (NanoDrop 2000c) | Thermo Scientific | ||
pSB700 plasmid | Addgene | #64046 | |
NEB Stable Competent E. coli (High Efficiency) | New England Biolabs | c3040 | |
Lysogeny broth (LB) | |||
Ampicillin | |||
TE buffer (1 mM EDTA, 10 mM Tris-Cl, pH 7.5) |