Summary
Qui, un semplice, efficiente e conveniente metodo di clonazione sgRNA è descritta.
Abstract
Il protocollo descritto descrive metodi aerodinamici per la generazione efficiente e conveniente di RNA guida Cas9-collegata. Due strategie alternative per la guida RNA (gRNA) clonazione sono delineate basati sull'utilizzo dell'enzima di restrizione di tipo IIS BsmBI in combinazione con un insieme di vettori compatibili. All'esterno l'accesso ai servizi di sequenziamento Sanger per convalidare i vettori generati, attrezzature speciali o i reagenti non sono necessari oltre a quelli che sono standard per laboratori di biologia molecolare moderna. Il metodo descritto è principalmente destinato per la clonazione di una gRNA singolo o uno vettoriale che esprimono gRNA accoppiato alla volta. Questa procedura non si adatta bene per la generazione di librerie contenenti migliaia di gRNAs. A tali fini, fonti alternative di sintesi del oligonucleotide come sintesi di oligo-chip sono raccomandati. Infine, mentre questo protocollo si concentra su una serie di vettori dei mammiferi, la strategia generale è di plastica ed è applicabile a qualsiasi organismo se il vettore gRNA appropriato è disponibile.
Introduction
CRISPR-collegata della proteina 9 (Cas9) è un'endonucleasi di RNA-guidato che sono diretto verso un target genomico desiderato quando complessato con una piccola guida progettata specificatamente RNA (gRNA)1,2. gRNAs comprendono una sequenza di 20-nucleotide (il protospacer), che è complementare alla sequenza di destinazione genomica. Accanto al bersaglio genomic sequenza è un 3' protospacer-collegato motivo (PAM), che è obbligatorio per l'associazione Cas9. Nel caso di Streptococcus Pyogenes Cas9 (SpCas9), questo ha la sequenza NGG. All'associazione il DNA bersaglio, Cas9 cleaves entrambi i filamenti del DNA, stimolando in tal modo i meccanismi di riparazione che possono essere sfruttati per modificare il locus di interesse. L'attivazione del pathway (NHEJ) errori non-omologo entrare in fine può causare la rottura di un gene bersaglio. In alternativa, le riparazioni effettuate tramite una ricombinazione omologa può stimolare l'integrazione mirata di una sequenza di DNA desiderata se viene fornito un modello di donatore6. Nucleasi-morti Cas9 (dCas9) varianti possono anche essere generati3 modificando i residui all'interno Cas9 che sono essenziali per l'attività sia. dCas9 rimane competente per il grippaggio del DNA ma non taglia sua destinazione associata. Fusione di vari domini dell'effettore a dCas9 e dirigerla vicino sito di inizio trascrizionale di un gene, dCas9 può essere utilizzato per induzione genica selettivo o parziale silenziamento genico4,5.
Mentre incredibilmente potente, la capacità di utilizzare Cas9 per indirizzare una sequenza genomica di interesse richiede che un utente genera prima una gRNA univoche per i siti di destinazione. Una varietà di metodi per la costruzione di vettori di espressione gRNA precedentemente sono stati descritti, molte delle variabili di efficienza e costo6,7,8. Stand-alone ampliconi PCR possono essere utilizzato come gRNAs per lo screening rapido, andando dalla consegna del oligonucleotide di transfezione entro alcune ore; Tuttavia, questo richiede Ultramer (oltre 100 bp) sintesi di oligo, che è costoso9. È anche possibile acquistare gBlocks che sono più conveniente che Ultramers. Come Cas9 è rapidamente diventato una parte integrante di biologia molecolare moderna toolkit, un metodo semplice, economico e altamente efficiente per gRNA clonazione sarebbe una manna per il campo. Il metodo qui descritto è stato impiegato nel nostro gruppo e laboratori collabori per il passato parecchi anni per generare oltre 2.000 gRNAs unico4.
Il metodo descritto si concentra sulle tecniche per la clonazione di vettori lentivirali compatibili, contenente un singolo gRNA o al massimo due gRNAs. Per la generazione dei plasmidi che contengono più di due gRNAs, o per clonare una biblioteca di gRNAs, approcci alternativi sono raccomandati9,10,11,12.
Protocol
Nota: Il seguente protocollo descrive come eseguire gRNA progettazione utilizzando gli strumenti online (punti 1.1-1.4), che sono comuni a tutti i metodi di costruzione del plasmide gRNA dettagliati in questo manoscritto. Una volta identificati i gRNAs desiderata, passi per ordinare i oligonucleotides necessari sono descritte con diversi metodi per introdurre gli oligonucleotidi in vettori di espressione (ad esempio, pSB700). 2 metodi di clonazione singoli vettori esprimenti Guida basati su entrambi la legatura in un vettore di espressione predigerita (passi 2-7,3) o Golden Gate clonazione (passaggi 8-8.4) sono presentati. Ulteriormente delineato è una strategia per clonazione vettori esprimenti guida accoppiati usando reazione a catena della polimerasi (PCR) seguita da Golden Gate clonazione (passaggi 11-16). Infine, i metodi comuni per l'esecuzione di una trasformazione chimica di e. coli (passaggi 9-9.6) e convalida di un'espressione vettoriale sequenza (passaggi 10 a 10.2.3) inoltre sono descritti.
- Progettare oligonucleotidi gRNA utilizzando gli strumenti online come segue.
- GRNAs di progettazione utilizzando strumenti online come il sgRNA Scorer 2.0 strumento online (https://crispr.med.harvard.edu/sgRNAScorerV2/)13 o alternative come lo strumento di progettazione di ampio sgRNA (http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/ sgRNA-progettazione)14 e parecchi altri15.
- Utilizzare il nome del gene, il simbolo o il crude sequenze bersaglio di DNA per generare potenziali gRNA sequenze.
Nota: Viene creato un file di foglio di calcolo (.csv/.xls) con tutti i potenziali gRNAs contro il gene o la sequenza fornita. La qualità della gRNAs potenziale verrà segnalata come Punteggio se viene utilizzato lo strumento online sgRNA Scorer 2.0, o come efficienza obiettivo % se viene utilizzato lo strumento di progettazione sgRNA ampio. Entrambe le misure sono derivate basato sull'attività di taglio sul bersaglio. - Considerare l' attività Off-target nella selezione gRNA quando classifica i gRNAs.
Nota: Guide ottimale sono quelli con la massima efficienza in target e l'attività di almeno fuori bersaglio. Per l'attivazione (CRISPRa), gRNAs sono progettati per raggiungere la regione da 1-200 bp a Monte del sito (TSS) inizio trascrizionale4,15. Per inibizione (CRISPRi), gRNAs sono progettati per raggiungere la regione da 50 bp a Monte del TSS fino a 300 bp a valle del TSS5. Per disattivare un gene usando il taglio del Cas9, gRNAs sono progettati per indirizzare il primo 10-50% della sequenza di codificazione a valle del codone (come gRNAs mirata all'estremità 3' del gene sono stati indicati per essere meno efficace) d'inizio13. - Garantire nessun siti BsmBI interni sono presenti se oligonucleotidi vengono utilizzati per la clonazione del Golden Gate, come questo si tradurrà nei oligonucleotides Ricotti essere digerito13.
- Selezionare le sequenze genomiche di destinazione e rimuovere il 3' NGG PAM (lasciando solo la sequenza di protospacer) per la modifica di gRNA singolo oligonucleotide sequenza (ad esempio, sequenza di avvio: CGCGTGCTCTCCCTCATCCATGG).
Nota: Se si utilizza un foglio di calcolo, la formula seguente rimuoverà 3' NGG: =LEFT(A2,LEN(A2)-3), dove A2 è la cella che contiene la sequenza di destinazione e il PAM.- Aggiungere CACCG all'estremità 5' dell'oligo.
Nota: Al momento di legatura per la spina dorsale pSB700, questa sequenza comprenderà estremità 3' del promotore U6 guida la trascrizione del gRNA. La sequenza "CACC" assicura che l'oligo è compatibile con gli strapiombi del vettore pSB700 BsmBI-digerito. La "G" è un requisito dei promotori della polimerasi III e assicura l'efficiente avvio della trascrizione del gRNA. Utilizzare la seguente formula in un foglio di calcolo per eseguire questa operazione: =CONCATENATE("CACCG",(B2)), dove B2 è la cella contenente la sequenza di protospacer [ad esempio, l'aggiunta di 5' CACCG di sequenza per il protospacer: CACCGCGCGTGCTCTCCCTCATCCA (questo è il finale oligo avanti che è stato ordinato)]. - Creare un complemento inverso (rc) della sequenza protospacer.
Nota: per esempio, il complemento inverso del protospacer di cui sopra è TGGATGAGGGAGAGCACGCG. - Aggiungere AAAC all'estremità 5' della protospacer rc. Accodare un do all'estremità 3' della protospacer rc (oligo inversa).
Nota: La sequenza di "AAAC" assicura che l'oligo è compatibile per la clonazione nel vettore pSB700 BsmBI-digerito. Ulteriori "C" all'estremità 3' è necessario per temprare la sequenza di avvio "G" aggiunto all'oligo avanti. Utilizzare la seguente formula in un foglio di calcolo per eseguire questo compito =CONCATENATE("AAAC",(C2),"C"), dove C2 è la cella contenente la sequenza inversa complemento [ad es., AAACTGGATGAGGGAGAGCACGCGC (questo è il finale oligo inversa che è ordinato)].
- Aggiungere CACCG all'estremità 5' dell'oligo.
- Ordinare gli oligonucleotidi, senza ulteriori modifiche sui oligonucleotides.
- Ordinare la quantità minima di oligo richiesto, solo piccole quantità sono necessari per le reazioni di clonazione.
- Diluire il primer liofilizzati a una concentrazione finale di 100 μM in 1x buffer di TE (10 mM Tris-Cl, pH 7.5 con 1 mM EDTA).
- Aliquotare 1:1 e inversione oligonucleotidi (ad esempio, 10 μL ciascuno) in provette per PCR striscia-cap.
Nota: Questo permetterà la rapida clonazione di molti gRNAs alla volta usando una pipetta multicanale.- Vortice e spin giù le miscele di oligo (100 x g per 15 s). Incubare la reazione a temperatura ambiente per 5 minuti prima di impostare la legatura.
Nota: Non è necessario riscaldare e raffreddare quindi le miscele di oligo per facilitare loro ricottura. Vale la pena notare che 3-4 coppie di oligonucleotidi gRNA possono essere riunite e ricotto in una singola reazione (ad es., mix 3 μL di forward e 3 μL di reverse oligonucleotidi insieme da fino a 4 coppie di oligo gRNA, dando un volume totale di 24 μL). Il volume di oligonucleotidi utilizzati per la ricottura può essere regolato per soddisfare le esigenze di un utente.
Nota: Passaggi 6-7.3 descrivono l'abbrevia di pSB700. Un metodo alternativo, vedere il passaggio 8, che descrive una legatura di restrizione BsmBI passo singolo.
- Vortice e spin giù le miscele di oligo (100 x g per 15 s). Incubare la reazione a temperatura ambiente per 5 minuti prima di impostare la legatura.
- Digerire μg 1-5 del vettore di espressione selezionata pSB700 guida con BsmBI (0,5 μL a 1 μg) per 1 h a 55 ° C15. Condurre la digestione del vettore pSB700 gRNA espressione in un volume totale di 40 μL (tabella 1).
- Eseguire i prodotti di digestione su gel di agarosio 1.5% (wt/vol) basso punto di fusione.
- Tagliare la banda di spina dorsale di vettore digerito che corrisponde a un frammento di ~ 9 kb di dimensione e posizionare la fetta di gel in una microcentrifuga da 1,5 mL (Figura 1).
- Utilizzare un kit di purificazione del gel commerciale per estrarre il DNA dal gel dell'agarosi secondo le istruzioni del produttore.
- Eluire il DNA in 10-15 μL di tampone di TE (10 mM Tris, pH 7.5; 10 mM Tris, pH 8.0) per ottenere un concentrato eluato.
- Legare i oligonucleotides ricotto gRNA dal passaggio 4 nel vettore di espressione di guida pSB700 BsmBI-digerito in una reazione di 20 μL (tabella 2) per la clonazione dei oligonucleotides gRNA nel vettore di espressione pSB700 pre-digeriti.
- In primo luogo, aggiungere acqua, buffer e DNA, poi vortice la miscela e aggiungere enzima, vortice finale 1 volta dopo aver aggiunto l'enzima e spin-down la soluzione (100 x g per 15 s). Incubare le reazioni a temperatura ambiente per una notte.
- Includere una reazione di controllo negativo no-inserto che dispone di un vettore BsmBI-digerita da sola, senza un inserto di oligo gRNA ricotto. 1 μL di acqua può essere utilizzato al posto di 1 μL di gRNA oligonucleotidi per il controllo negativo no-inserto.
- Procedere alla trasformazione (passo 9).
Nota: Passaggio 8 è un metodo alternativo per l'abbrevia di pSB700 come descritto nei passaggi 6-7.3.
- Introdurre gRNA oligonucleotidi (descritti nei passaggi 1-5.1) il vettore pSB700 attraverso l'uso di Golden Gate clonazione per la legatura di restrizione BsmBI passo singolo.
- Assemblare il mix master (1x) — se più gRNAs sono da clonare, preparare il mix master senza i oligonucleotides di inserto aggiunti (tabella 3). Aliquotare il master mix in provette per PCR e utilizzare una pipetta multicanale per aggiungere i oligonucleotides gRNA dalla fase 4.2. Includere un controllo no-inserto utilizzando 1 μL di acqua.
- Includendo l'enzima BsmBI e T4 DNA ligasi entro la stessa reazione, digestione di limitazione simultanea e la legatura vengono raggiunti (cioè, Golden Gate clonazione). Utilizzare il seguente protocollo semplice cancello per digerire il vettore e legare gli inserti in 1 reazione: mantenere la reazione a 37 ° C per 2 h, a 50 ° C per 10 min, a 65 ° C per 15 min a 80 ° C per 15 min e infine , tenerlo a 4 ° C.
- Della nota, verificare che gli oligonucleotidi non contengono BsmBI siti prima di utilizzare questo metodo. Se il gRNAs che sono da clonare contengono siti di restrizione BsmBI, essi verrà digeriti dopo l'aggiunta di BsmBI. Ciò impedirà all'utente di ottenere qualsiasi trasformanti.
- Dopo la reazione iniziale semplice cancello, aggiungere un ulteriore 0,5 μL di enzima BsmBI ad ogni reazione e metterli torna a 55 ° C per 1 h. Dopo la digestione, mantenere la reazione a 4 ° C o congelarlo fino al momento di trasformare. Questo secondo turno di restrizione enzimatica incubazione rimuove qualsiasi non digerito o religated pSB700 di selvaggio-tipo vettoriale spina dorsale dalla miscela di reazione affinché soli vettori che hanno ricevuto gli inserti di oligo rimangono intatti e produrranno trasformanti.
- Procedere alla trasformazione (passo 9).
- Trasformare 0,5 μL di miscela di reazione in 8 μL di competente Escherichia coli [ad es., NEB DH5a (1-3 x 109 cfu / µ g di DNA di pUC19) o NEB stabile 1 - 3 x 109 cfu / µ g di DNA di pUC19). Per plasmidi lentivirali, cellule stabili NEB fornirà più coerente plasmide rendimenti.
- Rimuovere e. coli da conservazione a-80 ° C e scongelare su ghiaccio per 5-10 min.
- Aggiungere 0,5 μL di miscela di reazione 8 μL di competente e. coli e mantenere la miscela sul ghiaccio per 30 min.
- La miscela a 42 ° C per 45 di scossa di calore s.
- Appoggiarla sul ghiaccio per 2 min.
- Recuperare la cultura su un agitatore rotante in 250 μL di media SOC per 1h a 37 ° C per NEB DH5a e a 30 ° C per stalle NEB.
- Piastra 80 μL della cultura su un'appropriata resistenza antibiotica piastra Lisogenesi brodo (LB) e incubare per una notte a 37 ° C per NEB DH5a e a 30 ° C per NEB scuderie [ad esempio, pSB700 è placcato su LB con piastre di ampicillina (100 μg/mL)] (Figura 3).
- Convalidare la sequenza del plasmide di espressione gRNA: verificare la sequenza di ogni colonia di Sanger sequenziamento utilizzando il primer 5'-GAGGGCCTATTTCCCATGATTCC-3' quali numeri primi al promotore U6 a Monte di oligo il gRNA inserire.
- Prendere 2-3 colonie per reazione di sequenziamento (tabella 4).
Nota: Diversi provider di sequenziamento ora offrire servizi che può eseguire Sanger sequenziamento direttamente dalle colonie batteriche, che riduce notevolmente i tempi e i costi, eliminando la necessità di purificare i plasmidi prima del sequenziamento. In alternativa, un kit di isolamento del plasmide può essere utilizzato per recuperare il DNA del plasmide da singoli cloni batterici. Plasmidi purificati quindi possono essere presentate per il sequenziamento. Se avviene una reazione di legatura in pool, è possibile utilizzare tabella 4 come guida per il numero di colonie che devono essere scelti e presentati per la sequenza. - Dopo la conferma di sequenza, isolare i plasmidi di espressione gRNA.
- Utilizzare una pipetta sterile per inoculare la Colonia desiderata in una cultura di 5 mL di mezzo LB contenente 100 μg/mL di ampicillina per vettori di espressione pSB700.
- Crescere le cellule in un incubatore rotativo a 100 giri/min a 37 ° C durante la notte (30 ° C se vengono utilizzate NEB stalle).
- Isolare il DNA del plasmide dalle culture utilizzando un kit di preparazione del plasmide, seguendo il protocollo del produttore.
Nota: Mentre i metodi di cui sopra consentono agli utenti di creare singoli vettori contenenti gRNA, questo protocollo consentirà agli utenti di creare vettori contenenti 2 gRNAs, ciascuno azionato dal proprio promotore di RNA polimerasi III.
- Prendere 2-3 colonie per reazione di sequenziamento (tabella 4).
- Per un design di gRNA accoppiati, utilizzare il file di output dagli strumenti di progettazione di sgRNA cui sopra (punti 1.1-1.4) e selezionare 2 guide di interesse.
- Per un'attivazione o repressione, selezionare le coppie di guide che sono almeno 30 nt a pezzi.
- Per gRNAs usato per il taglio, selezionate guide destinate a 2 diversi esoni del gene.
- Per le istruzioni qui sotto, designare il primo gRNA nella matrice gRNA-A e la seconda gRNA nella matrice gRNA-B, per creare una modifica di sequenza del oligonucleotide gRNA accoppiati.
Nota: L'oligo utilizzato per creare gRNA-A si chiamerà fA, e l'oligo inverso utilizzato per introdurre gRNA-B deve essere indicato come rB. Il metodo di clonazione sotto aggiunge automaticamente un avvio G all'estremità 5' di ciascuno della gRNAs.- Creare l'oligo fA appropriato come segue.
Nota: I 20 nucleotidi che comprende il gRNA targeting sequenza per gRNA-A volontà costituiscono la sequenza iniziale fA su cui i passaggi seguenti costruirà (ad es., protospacer - aggggctacaccactcattg).- Aggiungere TTTTCGTCTCTCACCG all'estremità 5' del cespite (ad es., della sequenza TTTTCGTCTCTCACCGaggggctacaccactcattg).
- Aggiungere GTTTTAGAGCTATGCTGAAAAGCA all'estremità 3' del cespite (ad es., della sequenza TTTTCGTCTCTCACCGaggggctacaccactcattgGTTTTAGAGCTATGCTGAAAAGCA). Questa è la versione finale dell'oligo fA che sarà ordinato.
- Creare il necessario oligo rB come segue.
Nota: I 20 nucleotidi che comprende la sequenza targeting gRNA per gRNA-B costituirà la sequenza iniziale di rB su cui i passaggi seguenti costruirà (ad es., della gtcccctccaccccacagtg di sequenza iniziale).- Prendere il complemento inverso di rB = (revcom) rB (ad esempio, cactgtggggtggaggggac).
- Aggiungere TTTTCGTCTCTAAAC all'estremità 5' del (revcom) rB (ad es., TTTTCGTCTCTAAACcactgtggggtggaggggac).
- Aggiungere CGGTGACCCAGGCGGCGCACAAG all'estremità 3' del (revcom) rB (ad es., TTTTCGTCTCTAAACcactgtggggtggaggggacCGGTGACCCAGGCGGCGCACAAG). Questa è la versione finale dell'oligo di rB che sarà ordinato.
Nota: le seguenti formule possono essere utilizzate con software di foglio di calcolo comune per modificare automaticamente le sequenze di oligo: = CONCATENATE("TTTTCGTCTCTCACCG",(A2), "GTTTTAGAGCTATGCTGAAAAGCA"), dove A2 è la cella contenente la sequenza di fA e = CONCATENATE("TTTTCGTCTCTAAAC",(B2),"CGGTGACCCAGGCGGCGCACAAG"), dove B2 è la cella contenente la sequenza di rB (revcom).
- Creare l'oligo fA appropriato come segue.
- Ordinare gli oligonucleotidi da un fornitore di sintesi di scelta. Non aggiuntive sono necessarie modifiche.
- Utilizzare il DNA del plasmide preparato per eseguire PCR con primer sia fA e rB. Questo verrà collegato entrambi avanti e la gRNAs inversa al frammento di PCR generati da questo plasmide e volontà consentire a ciascuno di essere espresso da un promotore (U6 e 7SK promotori — differenti promotori sono utilizzati in questo disegno per prevenire ricombinazione virale).
- Utilizzare il protocollo di PCR Phusion speciale GC per creare il frammento necessario: mantenere la miscela a 98 ° C per 1 min (1 ciclo), a 98 ° C per 15 s, a 53 ° C per 15 s, a 65 ° C per 2 min e a 72 ° C per 4 min (30 cicli) e poi tenerlo a 4 ° C (tabella 5).
- Eseguire il prodotto PCR su un gel di agarosio all'1% e verificare quello 1 banda viene visualizzato a ~ 490 bp (Figura 2).
- Tagliare ed estrarre questo prodotto PCR utilizzando un kit di estrazione del gel di scelta. Eluire il DNA in 15 μL di tampone di TE (10 mM Tris, pH 7.5; 10 mM Tris, pH 8.0) o acqua distillata.
- Misurare la concentrazione del prodotto estratto insieme a quella del vettore pSB700 con uno spettrofotometro per il calcolo di molarità di DNA. Normalizzare sia il prodotto PCR che il vettore a una concentrazione di 40 femtomoles/μL.
Nota: Diversi siti Web sono disponibili per assistere con il calcolo della molarità di una specifica soluzione di DNA basata sulla lunghezza del DNA e la sua concentrazione in soluzione (ad esempio, di Promega: http://www.promega.com/a/apps/biomath/index.html?calc=ugpmols). Il calcolatore utilizza la formula:
Qui, N è la lunghezza della sequenza del nucleotide.
- Impostare una reazione di digestione e legatura simultanea restrizione utilizzando il protocollo descritto nei passaggi 8-8.4 per clonare il frammento della PCR in un vettore di pSB700.
- Invece di aggiungere 1 μL di soluzione di primer alla reazione, aggiungere 1 μL di 40 femtomole/μL del prodotto della PCR. Inoltre, è possibile utilizzare 1 μL del vettore pSB700 ad una concentrazione di 40 femtomole/μL.
Nota: Rapporti molari uguali conducono ai risultati coerenti, sebbene anche nei casi in cui non vengono utilizzati i rapporti esatti, colonie possono essere ottenuti.
- Invece di aggiungere 1 μL di soluzione di primer alla reazione, aggiungere 1 μL di 40 femtomole/μL del prodotto della PCR. Inoltre, è possibile utilizzare 1 μL del vettore pSB700 ad una concentrazione di 40 femtomole/μL.
- Dopo aver completato il processo di reazione del Golden Gate (passaggi 8-8,4), procedere alla verifica di sequenza e trasformazione (passaggi 9 - 10.2.3).
Representative Results
I metodi descritti in questo protocollo sono per la creazione di vettori di espressione sia gRNA singoli o accoppiati. Singola gRNA esprimendo vettori possa essere creato da entrambi predigesting la spina dorsale di vettore (Figura 1) seguita da esso legando una serie di corti oligonucleotidi o usando Golden Gate clonazione per digerire simultaneamente la spina dorsale di vettore e legare in un serie di corti oligonucleotidi in una singola reazione. È previsto anche un metodo di produzione di vettori contenenti 2 gRNAs, ciascuno guidato da un promotore indipendente, mediante la clonazione di un frammento PCR personalizzato (Figura 2).
Una clonazione riuscita per i protocolli delineato si tradurrà nella comparsa di significativamente più colonie per le trasformazioni con il DNA di inserimento appropriato rispetto sul piatto di no-Inserisci controllo (Figura 3).
Figura 1: la digestione di un vettore di espressione gRNA pSB700. gel di agarosio 1% viene utilizzato. Lane 1: pSB700 uncut. Corsia 2: pSB700 tagliato con BsmBI.
Figura 2: accoppiato gRNA PCR. gel di agarosio 1% viene utilizzato. Lane 1: un guida accoppiati frammento di PCR di ~ 490 bp.
Figura 3: la clonazione riuscita e la trasformazione di un plasmide gRNA. Il pannello di sinistra mostra un LB e piastra di ampicillina con trasformata con successo colonie. Il pannello di destra mostra una piastra di controllo no-inserto non risultati colonie. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| vettore di espressione pSB700 Guida | 1-5 μg |
| NEB Buffer 3.1 | 4 ΜL |
| BsmBI | 1 ΜL |
| Acqua distillata | fino a 40 μL |
| Volume totale | 40 ΜL |
Tabella 1: La digestione di limitazione di un vettore di espressione gRNA pSB700 con BsmBI.
| Ricotto gRNA oligos (reazione singola o aggregata) | 1 ΜL |
| Vettore di espressione di BsmBI-digerito pSB700 Guida | 1 μL (~ 100-250 ng) |
| 10 x T4 DNA ligasi tampone di reazione | 2 μL (1 x concentrazione finale) |
| T4 Ligasi del DNA | 1 μL (120 unità) |
| Acqua distillata | 15 ΜL |
| Volume totale | 20 μl |
Tabella 2: Una reazione di legatura di gRNA oligonucleotidi in un vettore di espressione gRNA pSB700 predigerita.
| Reagente | Volume (1x) |
| H2O | 6 ΜL |
| Ligasi T4 | 0,5 ΜL |
| ATP | 1 ΜL |
| BsmBI | 0,5 ΜL |
| NEB Buffer 3.1 | 1 ΜL |
| Vettore (ad esempio, pSB700) (40 fmol) | 1 μlL |
| Inserire - avanti e indietro i oligos o frammento di PCR per la doppia guida (40fmol) | 1 μL (0,5 μL avanti e 0,5 μL inversa) |
Tabella 3: Un passo singolo BsmBI restrizione e gRNA legatura mix di reazione.
| Per 1 Guida | colonie di sequenza 3 |
| Per le 2 guide | sequenza 5-10 colonie |
| Per 3 guide | sequenza di colonie di 10-15 |
| Per 4 guide | sequenza di colonie di 15-20 |
Tabella 4: Il numero consigliato di colonie di sequenza per pool gRNA clonazione reazioni.
| Componente PCR | Reazione di 50 µ l |
| Primer in avanti di 10 µM | 2,5 Μ l |
| 10 µM reverse Primer | 2,5 Μ l |
| 5 x Phusion HF o Buffer GC | 10 Μ l |
| dNTPs da 10 millimetri | 1 Μ l |
| Modello del DNA | 100 ng |
| Phusion DNA polimerasi | 0,5 Μ l |
| Acqua priva di nucleasi | Fino a 50 µ l |
Tabella 5: Una miscela PCR gRNA accoppiati.
Discussion
Un numero di costo-risparmio di tempo e le modifiche è stato apportato alla costruzione di vettore di espressione gRNA. Un protocollo di restrizione e legatura passo singolo è descritto così come un metodo di costruzione di gRNA accoppiati espressione vettoriale. L'espressione di gRNA accoppiati è ottenuta attraverso un'amplificazione di PCR utilizzando oligonucleotidi che contiene una sequenza di destinazione gRNA avanti (n20) sia il complemento inverso di un altro target (n20). Questo introduce quindi un promotore di RNA Pol III secondario (7SK) così come una coda di sgRNA nel convenzionalmente esprimendo singolo gRNA plasmidi di espressione.
Una progettazione attenta del oligonucleotide garantirà una riuscita PCR per la costruzione di gRNA accoppiati nonché una legatura di appiccicoso-fine. Seguendo il passo singolo restrizione e la reazione di legatura, l'aggiunta di ulteriori BsmBI garantirà a tutti i vettori di espressione non modificato nella reazione sono tagliati. Ciò consentirà di ridurre significativamente lo sfondo al momento della trasformazione. Utilizzando NEB-stabile competente e. coli e una crescita a 30 ° C aumenta il rendimento di una trasformazione di successo.
I vantaggi di che questa tecnica ha sopra pratiche comuni includono una semplificazione del processo di ricottura, una restrizione di singolo-passaggio del vettore di espressione gRNA e la legatura di oligonucleotidi e la capacità di utilizzare convenzionale del oligonucleotide gRNA singoli vettori di espressione per l'espressione delle guide accoppiate. Mentre il protocollo qui descritto si concentra su una serie di vettori dei mammiferi, la strategia generale è di plastica ed è applicabile a qualsiasi organismo, se il vettore gRNA appropriato è disponibile. Nel complesso, il protocollo descritto consente di risparmiare tempo e costi.
Tuttavia, dovrebbe essere notato che la procedura delineata di acquisto individuale oligonucleotidi non scala bene per la generazione di librerie contenenti migliaia di gRNAs. A tali fini, fonti alternative di sintesi del oligonucleotide come sintesi di oligo chip sono raccomandati.
È utile includere un controllo no-inserto quando clonazione gRNAs. Questa reazione può essere facilmente impostata in parallelo con le reazioni di interesse e può essere utilizzata per determinare se una digestione incompleta del vettore iniziale ha contribuito alle colonie osservate alla fine della procedura. Inoltre, se uno dei protocolli sopra clonazione non è riuscita a causa di una spina dorsale in modo incompleto digerite vettoriale o legatura poveri efficienza, ti suggeriamo di provare l'alternativa clonazione metodo che abbiamo descritto.
Quando si utilizza il Golden Gate clonazione per digerire il vettore e legare nei oligonucleotides piccoli all'interno di una singola reazione contemporaneamente, è importante controllare che il gRNA che sono essere clonato nel vettore non dispone di un sito BsmBI all'interno di esso, come questo porterà a t gRNA ha tagliato e un'assenza di colonie al momento di trasformazione.
Il gRNA clonazione strategia che abbiamo descritto consente una generazione rapida ed economica di gRNAs a ~ 10 dollari ogni guida, con la maggior parte dei costi provenienti dalla sintesi del oligonucleotide e la verifica di sequenza. Mentre il metodo descritto è stato progettato per consentire agli utenti di generare gRNAs per l'uso con SpCas9, il protocollo può essere facilmente adattato per l'uso con Cas9 ortologhi o altri endonucleasi RNA-guida come Cpf1 o C2C2, con lievi modifiche per la spina dorsale di vettore e la sporgenza del oligonucleotide sequenze16,17.
Il protocollo di cui sopra fornirà sequenza-verificato gRNA plasmidi di espressione in 3 d (a partire con oligonucleotidi opportunamente dimensionati), che è significativamente più veloce rispetto ai metodi attuali. Questo comprende la progettazione di gRNA di 1h (passi 1-2.3), la diluizione e aliquota di oligonucleotidi di 10 min (punti 3-5.1), la digestione e la purificazione del vettore pSB700 gRNA espressione di 2 h (passaggi 6-6.4), la clonazione dei oligonucleotides gRNA in un predi vettore di espressione gRNA pSB700 ingerito durante la notte a temperatura ambiente (passaggi 7-7,3), la legatura di restrizione BsmBI passo singolo di 3 h e 40 min (punti 8-8,4), la trasformazione di 16 h (passaggi 9-9.6) e la convalida della sequenza del plasmide di espressione gRNA di 24 h (con la durata a seconda della disponibilità di sequenziamento sanger e la velocità a seguito della presentazione della colonia batterica; fase 10). Il design di gRNA accoppiati e la modifica di sequenza dura 1h (passaggi da 11-13). Il gRNA accoppiato PCR prende 3,5 h (passaggi 14-14,4). La clonazione del frammento PCR in un vettore di pSB700 prende 3h e 40 min (passo 15-16).
I problemi più probabili che possono essere affrontati con questo protocollo riguardano inefficienza nell'Assemblea del Golden Gate e trasformazione. Includere un controllo no-inserto durante l'Assemblea di Golden Gate per visualizzare l'efficienza dell'Assemblea. Durante la trasformazione, il controllo positivo puc19 fornirà un controllo di efficienza di trasformazione. NEB-stabile e. coli da utilizzarsi per lentivirali plasmidi compatibili e frequentemente richiedono fino a > 16 h a 30 ° C per produrre colonie visibili.
Disclosures
George M. Church ha equità Editas e Caribou Biosciences, che intendono commercializzare genoma CRISPR-Cas9 tecnologia di editing (per una lista completa divulgazione, vedere http://arep.med.harvard.edu/gmc/tech.html).
Acknowledgments
Sathiji Nageshwaran è supportato da atassia Research Alliance di Friedreich (07340305 - 01) e nazionale atassia Fondazione borse di studio (7355538-01). Alejandro Chavez è stato finanziato dal National Cancer Institute grant 5T32CA009216-34 e il premio alla carriera di Burroughs Wellcome fondo per gli scienziati medici. George M. Church è supportato da US National Institutes of Health (NIH) grant National Human Genome Research Institute HG008525 RM1 e l'Istituto Wyss biologicamente ispirato Engineering. James J. Collins riconosce sostegno dall'agenzia di riduzione di minaccia difesa grant HDTRA1-14-1-0006 e il gruppo di frontiere di Paul G. Allen. Alejandro Chavez ha sviluppato il metodo di clonazione dual-guida. Sathiji Nageshwaran, Alejandro Chavez e Nan Cher Yeo ha scritto il manoscritto con ingresso da tutti gli autori.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BsmBI | New England Biolabs | R0580L | |
| T4 DNA ligase | Enzymatic/New England Biolabs | L6030-LC-L/M0202S | |
| Buffer 3.1 | New England Biolabs | B7203S | |
| Adenosine 5'-Triphosphate (ATP) | New England Biolabs | P0756S | |
| QIAprep spin miniprep kit | Qiagen | 27104 | |
| Chemically competent E. coli | New England Biolabs | C3019l, C2987l, or C3040H | |
| Standard microcentrifuge tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 0030 125.150 | |
| Axygen 8-Strip PCR tubes | Fischer Scientific | 14-222-250 | |
| Thermocycler with programmable temperature-stepping control | BioRad, | 1851148 | |
| UV spectrophotometer (NanoDrop 2000c) | Thermo Scientific | ||
| pSB700 plasmid | Addgene | #64046 | |
| NEB Stable Competent E. coli (High Efficiency) | New England Biolabs | c3040 | |
| Lysogeny broth (LB) | |||
| Ampicillin | |||
| TE buffer (1 mM EDTA, 10 mM Tris-Cl, pH 7.5) | |||
| pSN007 plasmid | Addgene | 102440 |
References
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