Her, er en enkel, effektiv og kostnadseffektiv metode for sgRNA kloning skissert.
Skissert protokollen beskriver strømlinjeformet metoder for effektiv og kostnadseffektiv generasjon av Cas9-assosiert guide RNAs. To alternative strategier for guide RNA (gRNA) kloning er beskrevet, basert på bruken av typen IIS begrensning enzymet BsmBI i kombinasjon med en kompatibel vektorer. Utenfor tilgang til Sanger sekvensering tjenester å validere genererte vektorer, er ingen spesielt utstyr eller reagenser nødvendig bortsett fra de som standard til moderne molekylærbiologi laboratorier. Metoden skissert er primært ment for kloning en enkelt gRNA eller en tilkoblet gRNA-uttrykke vektor samtidig. Denne fremgangsmåten gjør målestokken ikke bra for generering av biblioteker som inneholder tusenvis av gRNAs. For disse formål anbefales alternative kilder til oligonucleotide syntese som oligo-chip syntese. Til slutt, mens denne protokollen fokuserer på et sett av pattedyr vektorer, den generelle strategien er plast og gjelder alle organisme, hvis riktig gRNA vektoren er tilgjengelig.
CRISPR-assosiert protein 9 (Cas9) er en RNA-guidede endonuclease som er rettet mot et ønsket genomisk mål når kompleksbundet med en riktig utformet liten guide RNA (gRNA)1,2. gRNAs består av en sekvens med 20-nukleotid (protospacer), hvilke er supplerende å genomisk målet sekvensen. Genomic målet er sekvensen et 3 protospacer-assosiert motiv (PAM), som kreves for Cas9 binding. Når det gjelder Streptococcus Pyogenes Cas9 (SpCas9), har rekkefølgen NGG. Ved bindende DNA målet, kløyver Cas9 begge tråder av DNA, derved stimulere reparasjon mekanismer som kan utnyttes til å endre locus interesse. Aktivering av feilutsatte ikke-homologe slutten-begynte (NHEJ) veien kan forårsake avbrudd med et mål. Alternativt kan reparasjoner utført via en homologe rekombinasjon stimulere målrettet integrering av en ønsket DNA sekvens hvis en donor mal gis6. Nuclease-død Cas9 (dCas9) varianter kan også bli generert3 ved å mutere rester i Cas9 som er avgjørende for endonucleolytic aktivitet. dCas9 forblir kompetent for DNA bindingen men kutte ikke bundet målet. Fusing ulike effektor domener til dCas9 og beordrer nær et gen transcriptional startwebstedet, kan dCas9 brukes for selektiv genet induksjon eller delvis genet stanse4,5.
Mens det er utrolig kraftig, krever muligheten til å bruke Cas9 til å målrette en genomisk sekvens av interesse at en bruker først genererer en gRNA som er unike for målet (r). En rekke metoder for å bygge gRNA uttrykk vektorer har tidligere blitt beskrevet, mange av varierende effektivitet og koster6,7,8. Frittstående PCR-amplicons kan brukes som gRNAs for rask screening, kommer fra oligonucleotide levering til transfection i flere timer; Dette krever imidlertid Ultramer (over 100 bp) oligo syntese, som er dyre9. Det er også mulig å kjøpe gBlocks som er mer kostnadseffektive enn Ultramers. Som Cas9 har raskt blitt en integrert del av det moderne molekylærbiologi verktøyet, ville en enkel, rimelig og svært effektiv metode for gRNA kloning være en boon til feltet. Metoden beskrevet her har vært ansatt i vår gruppe og samarbeidende laboratorier for de siste flere år å generere over 2000 unike gRNAs4.
Metoden skissert fokuserer på teknikker for kloning av lentiviral kompatibel vektorer som inneholder en enkelt gRNA eller minst to gRNAs. For generering av plasmider som inneholder mer enn to gRNAs, eller å klone et bibliotek med gRNAs, anbefales alternative tilnærminger9,10,11,12.
En rekke tid – og kostnadsbesparende endringer er gjort til gRNA uttrykk vektor bygging. En enkeltsteg begrensning og ligatur protokoll er beskrevet og en metode for sammenkoblede gRNA uttrykk vektor bygg. Sammenkoblede gRNA uttrykket oppnås gjennom en PCR forsterkning med oligonucleotides som inneholder både en frem gRNA målet sekvens (n20) og omvendt komplement til et annet mål (n20). Dette introduserer så en sekundær RNA Pol III promoter (7SK) og en sgRNA hale i konvensjonelt uttrykke enkelt gRNA uttrykk plasmider.
Et forsiktig oligonucleotide design vil sikre en vellykket PCR sammenkoblede gRNA bygging samt en klissete slutt ligation. Følge enkeltsteg begrensning og ligatur reaksjon, tillegg av ytterligere BsmBI vil sikre alle uforandret uttrykk vektorer i reaksjonen er kuttet. Dette vil redusere bakgrunnen på transformasjon. Bruke NEB-stabil kompetent E. coli og en vekst på 30 ° C vil øke avkastningen av en vellykket transformasjon.
Fordelene denne teknikken har felles praksis er en forenkling av oligonucleotide annealing, enkeltsteg begrensningen gRNA uttrykk vektoren og ligatur av oligonucleotides og muligheten til å bruke konvensjonelle enkelt gRNA uttrykk vektorer for uttrykket av parede guider. Mens protokollen beskrevet her fokuserer på et sett av pattedyr vektorer, den generelle strategien er plast og gjelder alle organisme, forutsatt riktig gRNA vektoren er tilgjengelig. Samlet sparer protokollen beskrevet tid og kostnader.
Det bør imidlertid bemerkes at disponerte prosedyren for kjøpe individuelle oligonucleotides gjør ikke målestokken bra for generering av biblioteker som inneholder tusenvis av gRNAs. For disse formål anbefales alternative kilder til oligonucleotide syntese som oligo chip syntese.
Er det nyttig å inkludere en nei-sette kontroll når kloning gRNAs. Dette kan enkelt defineres parallelt med reaksjoner av interesse og kan brukes til å fastslå om en ufullstendig fordøyelsen av Start vektoren har bidratt til koloniene observert på slutten av prosedyren. Videre, hvis en av ovennevnte kloning protokoller har mislyktes på grunn av en ufullstendig fordøyd vektor ryggraden eller dårlig ligation effektivitet, foreslår vi prøver alternativet Klon metoden har vi skissert.
Når du bruker Golden Gate kloning samtidig fordøye vektoren og ligate i de lille oligonucleotides i en enkelt reaksjon, er det viktig å kontrollere at gRNA som blir samsvarer i vektoren ikke har et BsmBI område i det, da dette vil føre til t Han gRNA skjæring og fravær av kolonier på transformasjon.
GRNA Klon strategi har vi skissert gir en rask og kostnadseffektiv generasjon av gRNAs på ~ 10 amerikanske dollar per guide, med mesteparten av kostnadene kommer fra oligonucleotide syntese og sekvens bekreftelsen. Mens metoden beskrevet er utviklet for å tillate brukere å generere gRNAs for bruk med SpCas9, protokollen kan lett tilpasses for bruk med Cas9 orthologues eller andre RNA-guidede endonucleases som Cpf1 eller C2C2, med små endringer vektor ryggraden og oligonucleotide overheng sekvenser16,17.
Protokollen skissert ovenfor vil gi sekvens-verifiserte gRNA uttrykk plasmider i 3 d (starter med riktig utformet oligonucleotides), som er betydelig raskere enn dagens metoder. Dette inkluderer gRNA utformingen av 1t (trinn 1-2.3), fortynning og aliquot av oligonucleotides i 10 min (trinn 3-5.1), fordøyelse og rensing av pSB700 gRNA uttrykk vektoren for 2t (trinn 6-6.4), kloning av gRNA oligonucleotides i en predi gested pSB700 gRNA uttrykk vektor over natten i romtemperatur (trinn 7-7.3), enkeltsteg BsmBI begrensning ligation av 3 h og 40 min (trinn 8-8.4), transformasjonen av 16 h (trinn 9-9.6) og validering av en rekke gRNA uttrykk plasmider 24 h (med varighet avhengig av sanger sekvensering tilgjengeligheten og hastigheten etter innsending av bakteriell kolonien; trinn 10). Sammenkoblede gRNA design og sekvens endring tar 1 h (trinn 11-13). De sammenkoblede gRNA PCR tar 3,5 h (trinn 14-14.4). Kloning av PCR fragment til en pSB700 vektor tar 3h og 40 min (trinn 15-16).
Sannsynligvis problemene som kan bli møtt med denne protokollen gjelder ineffektivitet i Golden Gate montering og transformasjon. Inkluder en nei-sette kontroll da Golden Gate å visualisere effektiviteten av samlingen. Under transformasjon gir puc19 positive kontrollen en transformasjon effektivitet kontroll. NB-stabil E. coli skal brukes for lentiviral kompatibel plasmider og ofte krever opptil > 16 h på 30 ° C til synlig kolonier.
The authors have nothing to disclose.
Sathiji Nageshwaran støttes av Friedreichs ataksi forskning Alliance (07340305 – 01) og National ataksi Foundation stipend (7355538-01). Alejandro Chavez ble finansiert av National Cancer Institute grant 5T32CA009216-34 og Burroughs Wellcome fondet karriere Award for medisinske forskere. George M. Church er støttet av det amerikanske National Institutes of Health (NIH) National Human Genome Research Institute grant RM1 HG008525 og Wyss Institutt for biologisk inspirert Engineering. James J. Collins anerkjenner støtte fra Defense trussel reduksjon Agency stipendet HDTRA1-14-1-0006 og gruppen Paul G. Allen grenser. Alejandro Chavez utviklet metoden dobbel-guide kloning. Sathiji Nageshwaran, Alejandro Chavez og Nan Cher Yeo skrev manuskriptet med input fra alle forfattere.
BsmBI | New England Biolabs | R0580L | |
T4 DNA ligase | Enzymatic/New England Biolabs | L6030-LC-L/M0202S | |
Buffer 3.1 | New England Biolabs | B7203S | |
Adenosine 5'-Triphosphate (ATP) | New England Biolabs | P0756S | |
QIAprep spin miniprep kit | Qiagen | 27104 | |
Chemically competent E. coli | New England Biolabs | C3019l, C2987l, or C3040H | |
Standard microcentrifuge tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 0030 125.150 | |
Axygen 8-Strip PCR tubes | Fischer Scientific | 14-222-250 | |
Thermocycler with programmable temperature-stepping control | BioRad, | 1851148 | |
UV spectrophotometer (NanoDrop 2000c) | Thermo Scientific | ||
pSB700 plasmid | Addgene | #64046 | |
NEB Stable Competent E. coli (High Efficiency) | New England Biolabs | c3040 | |
Lysogeny broth (LB) | |||
Ampicillin | |||
TE buffer (1 mM EDTA, 10 mM Tris-Cl, pH 7.5) |