Här beskrivs en enkel, effektiv och kostnadseffektiv metod för sgRNA kloning.
Protokollet beskrivs beskriver strömlinjeformad metoder för effektiv och kostnadseffektiv produktion av Cas9-associerade guide RNAs. Två alternativa strategier för guide RNA (gärna) kloning beskrivs baserat på användning av typ IIS begränsning enzymet BsmBI i kombination med en uppsättning kompatibel vektorer. Förutom tillgång till Sanger sekvensering tjänster att validera de genererade vektorerna, krävs ingen speciell utrustning eller reagenser bortsett från de som är standard till moderna molekylärbiologiska laboratorier. Metoden beskrivs är främst avsett för kloning en enda gärna eller en parkopplad gärna-uttryckande vektor i taget. Detta förfarande skalas inte väl för generering av bibliotek som innehåller tusentals gRNAs. För dessa ändamål rekommenderas alternativa energikällor oligonukleotiden syntes såsom oligo-chip syntes. Slutligen, medan detta protokoll fokuserar på en uppsättning av däggdjur vektorer, den allmänna strategin är plast och är tillämplig på någon organism om lämpliga gärna vektorn är tillgängliga.
CRISPR-associerade protein 9 (Cas9) är ett RNA-guidad Amiiiiin som riktas mot en önskad genomisk mål när komplex med en lämpligt utformad liten guide RNA (gärna)1,2. gRNAs består av en 20-nukleotidsekvensen (protospacer), som kompletterar sekvensen genomisk mål. Bredvid målet genomiska är sekvensen ett 3′ protospacer-associerade motiv (PAM), som krävs för Cas9 bindande. När det gäller Streptococcus Pyogenes Cas9 (SpCas9), detta har sekvensen NGG. Vid bindande målet DNA, klyver Cas9 båda delarna av DNA, därmed stimulera reparationsmekanismer som kan utnyttjas för att ändra locus av intresse. Aktivering av felbenägna icke-homolog slutet-anslutning (NHEJ) vägen kan orsaka störningar av en målgenen. Alternativt, reparationer görs via en homolog rekombination kan stimulera riktade integrationen av en önskad DNA-sekvens om en givare mall ges6. Nuclease-döda Cas9 (dCas9) varianter kan också vara genererade3 genom muterar de restsubstanser inom Cas9 som är väsentliga för endonucleolytic verksamhet. dCas9 förblir behöriga för DNA bindande men klipper inte sitt bundna mål. Fusing olika effektor domäner till dCas9 och styra det nära en genens transkriptionell startwebbplats, kan dCas9 användas för selektiv gen induktion eller partiell nedtystning4,5.
Otroligt kraftfull, kräver förmågan att använda Cas9 för att rikta en genomiska sekvensen av intresse att en användare först genererar en gärna unika för målet industriområden. En mängd metoder för att bygga gärna uttryck vektorer har tidigare beskrivits, många av varierande effektivitet och kostnad6,7,8. Fristående PCR-amplikoner kan användas som gRNAs för snabb screening, kommer från oligonukleotiden leverans till transfection inom flera timmar; Detta kräver dock Ultramer (över 100 bp) oligo-syntes, vilket är dyra9. Det är också möjligt att köpa gBlocks som är mer kostnadseffektiv än Ultramers. Cas9 har snabbt blivit en integrerad del av modern molekylärbiologi toolkit, skulle en enkel, billig och mycket effektiv metod för gärna kloning vara en välsignelse för fältet. Den metod som beskrivs här har varit anställd i vår grupp och samverkande laboratorier för de senaste åren för att generera över 2.000 unika gRNAs4.
Metoden beskrivs fokuserar på tekniker för kloning av lentiviral kompatibel vektorer som innehåller en enda gärna eller högst två gRNAs. För generering av plasmider som innehåller fler än två gRNAs, eller att klona ett bibliotek av gRNAs, rekommenderas alternativa metoder9,10,11,12.
Ett antal tid – och kostnadsbesparande ändringar har gjorts till gärna uttryck vektor byggandet. Ett enda steg begränsning och ligatur protokoll beskrivs liksom en metod för Parade gärna uttryck vektorn konstruktion. Parade gärna uttrycket uppnås genom en PCR-amplifiering med oligonukleotider som innehåller både en framåt gärna mål sekvens (n20) och ett omvänd komplement till ett annat mål (n20). Detta sedan införs en sekundär RNA Pol III promotor (7SK) samt en sgRNA svans konventionellt uttrycker enda gärna uttryck plasmider.
En försiktig oligonukleotiden design kommer att säkerställa en framgångsrik PCR för Parade gärna byggandet samt en klibbig-end ligering. Efter steg begränsning och ligatur reaktion, tillägg av ytterligare BsmBI kommer att garantera alla omodifierade uttryck vektorer i reaktionen skärs. Detta kommer att avsevärt minska bakgrunden vid omvandlingen. Använda NEB-stabil behöriga E. coli och en tillväxt på 30 ° C kommer att öka avkastningen av en framgångsrik omvandling.
De fördelar som denna teknik har över gemensam praxis inkluderar en förenkling av processen för oligonukleotiden glödgning, singel-steg begränsa gärna uttryck vektorn och ligering av oligonukleotider och förmågan att utnyttja konventionell enda gärna uttryck vektorer för uttrycket av Parade guider. Medan protokollet beskrivs här fokuserar på en uppsättning däggdjur vektorer, den allmänna strategin är plast och är tillämplig på någon organism, förutsatt att lämpliga gärna vektorn är tillgängliga. Sammantaget sparar protokollet beskrivs tid och kostnader.
Det bör dock noteras att inte skalas beskrivs förfarandet för att köpa enskilda oligonukleotider väl för generering av bibliotek som innehåller tusentals gRNAs. För dessa ändamål rekommenderas alternativa energikällor oligonukleotiden syntes såsom oligo chip syntes.
Det är fördelaktigt att inkludera en no-infoga kontroll när kloning gRNAs. Denna reaktion kan vara enkelt ställa in parallellt med reaktionerna av intresse och kan användas för att avgöra huruvida en ofullständig matsmältning av start vektor har bidragit till kolonierna observerades vid slutet av förfarandet. Om något av ovanstående kloning protokoll har misslyckats på grund av ett ofullständigt smält vektor ryggraden eller dålig ligering effektivitet, föreslår vi dessutom försöker alternativet kloning metod som vi har beskrivit.
När du använder Golden Gate kloning för att samtidigt smälta vektorn och ligera i de små oligonukleotider inom en enda reaktion, är det viktigt att kontrollera att den gärna som är att vara klonade in vektorn inte har en BsmBI plats inne i den, eftersom detta kommer att leda till t han gärna skärs och frånvaro av kolonier vid omvandling.
Den gärna kloning vi har strategin gör det möjligt för en snabb och kostnadseffektiv generation av gRNAs på ~ 10 US-dollar per guide, med huvuddelen av de kostnader som kommer från oligonukleotiden syntesen och sekvens kontrollen. Metoden beskrivs är utformat för att tillåta användare att generera gRNAs för användning med SpCas9, protokollet kan enkelt anpassas för användning med Cas9 orthologues eller andra RNA-guidad endonucleases såsom Cpf1 eller C2C2, med smärre ändringar till vektor stamnätet och den oligonukleotid överhäng sekvenser16,17.
Protokollet som beskrivs ovan ger sekvens-verifierade gärna uttryck plasmider i 3 d (start med syftet lämpligt utformad oligonukleotider), som är betydligt snabbare än nuvarande metoder. Detta inkluderar gärna utformningen av 1 h (steg 1-2.3), utspädning och alikvot av oligonukleotider 10 min (steg 3-5.1), matsmältning och rening av pSB700 gärna uttryck vektor 2 h (steg 6-6,4), kloning av de gärna oligonukleotider till en predi föresla pSB700 gärna uttryck vektor över natten i rumstemperatur (steg 7-7,3), den enda steg BsmBI begränsning ligering av 3 h och 40 min (steg 8-8,4), omvandlingen av 16 h (steg 9-9,6) och validering av sekvensen av gärna uttryck plasmiden 24 h (med varaktigheten beroende på sanger sekvensering tillgången och hastigheten efter inlämnande av bakteriell kolonin; steg 10). Parade gärna design och sekvens ändring tar 1 h (steg 11-13). Den Parade gärna PCR tar 3,5 h (steg 14-14,4). Kloning av PCR-fragment i en pSB700 vektor tar 3h och 40 min (steg 15-16).
De mest sannolika frågor som kan ställas inför detta protokoll avser ineffektivitet i Golden Gate församlingen och transformation. Inkludera en no-infoga kontroll under Golden Gate församling att visualisera effektiviteten i församlingen. Under omformningen ger puc19 positiv kontroll en förvandling effektivitet kontroll. NEB-stabil E. coli ska användas för lentiviral kompatibel plasmider och ofta kräver upp till > 16 h 30 ° c att ge synliga kolonier.
The authors have nothing to disclose.
Sathiji Nageshwaran stöds av Friedreichs ataxi forskningsallians (07340305 – 01) och National Ataxia Foundation stipendier (7355538-01). Alejandro Chavez finansierades av National Cancer Institute grant 5T32CA009216-34 och Burroughs Wellcome fonden karriär Award för medicinska forskare. George M. Church stöds av den amerikanska National Institutes of Health (NIH) National Human Genome Research Institute grant RM1 HG008525 och Wyss Institutet för biologiskt inspirerade Engineering. James J. Collins medger stöd från Defense Threat minskning Agency bidraget HDTRA1-14-1-0006 och gruppen Paul G. Allen gränser. Alejandro Chavez utvecklat metoden dual-guide kloning. Sathiji Nageshwaran, Alejandro Chavez och Nan Cher Yeo skrev manuskriptet med input från alla författare.
BsmBI | New England Biolabs | R0580L | |
T4 DNA ligase | Enzymatic/New England Biolabs | L6030-LC-L/M0202S | |
Buffer 3.1 | New England Biolabs | B7203S | |
Adenosine 5'-Triphosphate (ATP) | New England Biolabs | P0756S | |
QIAprep spin miniprep kit | Qiagen | 27104 | |
Chemically competent E. coli | New England Biolabs | C3019l, C2987l, or C3040H | |
Standard microcentrifuge tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 0030 125.150 | |
Axygen 8-Strip PCR tubes | Fischer Scientific | 14-222-250 | |
Thermocycler with programmable temperature-stepping control | BioRad, | 1851148 | |
UV spectrophotometer (NanoDrop 2000c) | Thermo Scientific | ||
pSB700 plasmid | Addgene | #64046 | |
NEB Stable Competent E. coli (High Efficiency) | New England Biolabs | c3040 | |
Lysogeny broth (LB) | |||
Ampicillin | |||
TE buffer (1 mM EDTA, 10 mM Tris-Cl, pH 7.5) |