Summary
Beschrijven we een methode voor de isolatie van de endocriene cellen uit embryonale, Neonatale en postnatale pancreases gevolgd door eencellige RNA sequencing. Met deze methode kunt analyses van de ontwikkeling van de alvleesklier endocriene bloedlijn, cel heterogeniteit en transcriptomic dynamiek.
Abstract
Alvleesklier endocriene cellen, die zijn geclusterd in eilandjes, reguleren bloed glucose stabiliteit en stofwisseling. De verschillende celtypen in eilandjes, met inbegrip van de β-cellen insuline-afscheidende, worden onderscheiden van gemeenschappelijke endocriene progenitoren tijdens de embryonale fase. Onrijpe endocriene cellen breiden via celproliferatie en volwassen gedurende een periode van lang postnatale ontwikkelingsstoornissen. Nochtans, de mechanismen die ten grondslag liggen aan deze processen niet duidelijk zijn gedefinieerd. Eencellige RNA-rangschikken is een veelbelovende aanpak voor de karakterisering van verschillende cel populaties en tracering cel lineage differentiatie trajecten. Hier beschrijven we een methode voor de eencellige RNA-sequencing van geïsoleerde alvleesklier β-cellen uit embryonale, Neonatale en postnatale pancreases.
Introduction
De alvleesklier is een vitaal metabole orgaan in zoogdieren. De alvleesklier bestaat uit endocriene en exocrine compartimenten. Alvleesklier endocriene cellen, met inbegrip van de β-cellen insuline-producerende en glucagon-producerende α cellen, cluster samen in de eilandjes van Langerhans en betekenisdragers regelen systemische glucose homeostase. Dysfunctie van de resultaten van de endocriene cellen in diabetes mellitus, die uitgegroeid een belangrijke volksgezondheidskwestie wereldwijd tot is.
Alvleesklier endocriene cellen zijn afgeleid van Ngn3+ progenitoren tijdens de embryogenese1. Later, tijdens de perinatale periode vermenigvuldigen de endocriene cellen tot formulier onvolwassen eilandjes. Deze onvolwassen cellen blijven ontwikkelen en langzamerhand volwassen eilandjes, die worden rijkelijk gevacuoliseerd voor het regelen van bloed glucose homeostase in volwassenen2.
Hoewel een groep van transcriptionele factoren is geconstateerd dat het reguleren van de celdifferentiatie β, is het traject van de precieze rijping van β-cellen nog onduidelijk. Bovendien impliceert het rijpingsproces van β cel ook de regulering van de cel nummer expansie3,4 en de generatie van cellulaire heterogeniteit5,6. Echter zijn de regulerende mechanismen van deze processen niet goed bestudeerd.
Eencellige RNA-rangschikken is een krachtige aanpak die kan profile cel subpopulaties en traceren van cel lineage ontwikkelings trajecten7. Voordeel van deze technologie, de gebeurtenissen die zich tijdens de ontwikkeling van de alvleesklier islet voordoen kunnen worden ontcijferd in het eencellige niveau8sleutel nemen. Onder de eencellige RNA-sequencing protocollen kunt Smart-seq2 de generatie van full-length cDNA met verbeterde gevoeligheid en nauwkeurigheid, en het gebruik van standaard reagentia bij lagere kosten9. Smart-seq2 duurt ongeveer twee dagen voor de bouw van een cDNA Bibliotheek voor sequencing10.
Hier stellen wij een methode voor de isolatie van fluorescentie-geëtiketteerden β-cellen uit de pancreases van foetale naar volwassen Ins1-RFP transgene muizen11, met behulp van fluorescentie-activated cell sorting (FACS), en de prestaties van transcriptomic analyseert op de eencellige niveau, met behulp van Smart-seq2 technologie (Figuur 1). Dit protocol kan worden uitgebreid tot het analyseren van de transcriptomes van alle soorten van de alvleesklier endocriene cellen in normale, veroudering en pathologische staten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van de Universiteit van Peking.
1. de alvleesklier isolatie
-
Voor E17.5 (embryonale dag 17,5) embryo's:
- Schatten van embryonale dag 0,5, gebaseerd op het punt van de tijd wanneer de vaginale stekker verschijnt.
- De zwangere muizen door CO2 administratie opofferen. Spray de abdominale vacht met 70% alcohol.
- Maak een V-vormige insnijding met een schaar van het genitale gebied uit te breiden tot de ribben. Dit proces zal volledig open voor de buikholte.
- Ontleden van de baarmoeder uit de buikholte en plaats deze in een 10 cm schotel met koude PBS.
- Het ontleden van de embryo's uit de baarmoeder met een dun-tipped Tang onder een stereomicroscoop, andere weefsels, zoals de placenta en de navelstreng verwijderen. Plaats alle embryo's in een 10 cm schotel met koude PBS.
- Scheur open de embryo's buikholte en graven uit het viscerale weefsel met een elleboog pincet. Breng het viscerale weefsel in een 6 cm zwart-onderkant schotel met koude PBS.
- De alvleesklier ligt in het bovenste deel van de buik links en hecht aan de milt, maag en twaalfvingerige darm (gele stippellijn in de figuur 2A)12. Loskoppelen van de pancreases van de viscerale weefsel met behulp van de verlostang en de alvleesklier weefsel samen te bundelen in een flesje van 20 mL met 5 mL 0, 5 mg/mL koude collagenase oplossing: 0,5 mg/mL collagenase P in isolatie buffer (HBSS met 10 mM HEPES, 1 mM MgCl2 5 mM Glucose, pH 7.4).
-
Voor muizen P0-P15 (postnatale dag 0-15):
- Offeren en monteren van de muis door de ledematen aan een stuk van benchtop beschermer met tape vast te houden. Spray de abdominale vacht met 70% alcohol.
- Volledig open de buikholte zoals beschreven in stap 1.1.3. Trek de darm en aan de linkerkant van de muis. Deze procedure zal blootstellen de duodenale, maag en milt lobben van de alvleesklier. Zorgvuldig alle lobben van de alvleesklier (figuur 2B)12 ontleden en de alvleesklier weefsel samen te bundelen in een flesje van 20 mL met 5 mL 0, 5 mg/mL koude collagenase oplossing.
-
Voor muizen P18-P60 (postnatale dag 18-60):
- Bereid de oplossing collagenase. Houd op ijs tot klaar voor gebruik.
- De muis offeren en open de buikholte zoals hierboven beschreven (stap 1.1.2 en 1.1.3).
Opmerking: Niet de lever doen pijn, elke wond aan de lever zal verminderen de waterdruk in de koker van gal en de efficiëntie van de perfusie van de volgende stap. - Verwijder de xiphoid. Trek de darm en aan de rechterkant van de muis, en duw de links en rechts mediale lobben van de lever naar iedere kant bloot de galblaas (witte pijl in figuur 2C) en de Galgang.
- Klem de twaalfvingerige darm met een paar kleine schip klemmen op de bovenste en onderste positie, de site waar de gal duct de twaalfvingerige darm (figuur 2D betreedt) flankerende.
Opmerking: Niet klem van de maag of milt lobben van de alvleesklier. De collagenase oplossing zal niet stromen in de maag en milt kwab van de alvleesklier in de volgende stap als geklemd. - Vul een spuit met 5 mL 0, 5 mg/mL koude collagenase oplossing en invoegen van een naald 30 G in de galblaas. Zorgvuldig en soepel, manipuleren de naald door de Galgang.
- Perfuse de alvleesklier door het injecteren van 1-5 mL 0, 5 mg/mL koude collagenase oplossing, afhankelijk van de grootte van de muis. De injectie moet traag en constant om te voorkomen dat de naald glipt uit de koker en om te voorkomen dat de darm barsten onder hoge druk van de vloeistof. De injectie is voltooid wanneer de alvleesklier volledig is uitgevouwen.
- Het ontleden van de alvleesklier (de gele stippellijn in de figuur 2D) uit de buikholte met behulp van de verlostang onmiddellijk na perfusie. Plaats het weefsel in een flesje van 20 mL met 5 mL 0, 5 mg/mL koude collagenase oplossing. Als meer dan één muis tegelijk manipuleren, de muizen door één perfuse en bundelen van de weefsels in koude collagenase oplossing in een flesje van 20 mL, totdat alle muizen hebben is ontleed.
2. collagenase spijsvertering en Islet isolatie
- Plaats de 20 mL flacon met de alvleesklier weefsel in een waterbad 37 ° C en incubeer gedurende 3 minuten aan equilibreer van de temperatuur.
- Voorzichtig schudden de buis voor een andere 3 tot en met 5 min. Als de alvleesklier weefsel volledig opgeblazen is, zal het geleidelijk distantiëren in kleine weefsel stukjes totdat het is ten slotte gelijkmatig verspreid. De spijsvertering tijd varieert afhankelijk van de grootte van de alvleesklier en de efficiëntie van de perfusie.
- Filtreer het verteerd product door een zeef van 0,25 mm nylon in een nieuwe centrifuge-tube van 50 mL. Grondig wassen de zeef met behulp van een spuit van 20 mL met ijskoude PBS.
- Voor E17.5-P15 pancreases, gaat u naar stap 3.1.
- P18-P60 pancreases, centrifugeer bij 200 x g voor 1 min en verwijder het supernatant. Resuspendeer de weefsel met koude PBS.
- Giet 5 mL van de ophanging van het weefsel in een 6 cm zwart-onderkant schotel. De alvleesklier eilandjes zijn kleine, compacte, melkachtig witte structuren en acinaire weefsel is los en doorschijnend wit. Kies eilandjes met een 200 μL pipet en ze vervolgens overbrengen naar een 1,5 mL-buis met een kleine hoeveelheid koud PBS.
3. trypsine vertering van alvleesklier weefsel of eilandjes
- Centrifugeer de buis met alvleesklier weefsel of eilandjes bij 200 x g gedurende 1 minuut bij 4 ° C en verwijder het supernatant zonder de pellet te verstoren.
- Resuspendeer de pellet met 0,25% trypsine-EDTA en in een waterbad 37 ° C incuberen. Na 4 min. van incubatie, zachtjes en soms gecombineerd (Pipet) voor 1 min met behulp van 200 μl tips.
Opmerking: Voor E17.5-P3 pancreases, voeg 1 mL trypsine-EDTA. Toevoegen voor P4-P15 pancreases, 3 mL trypsine-EDTA. Voor 100-300 eilandjes, voeg 1 mL trypsine-EDTA. Regel het volume van de trypsine-EDTA volgens de hoeveelheid weefsel. - Stoppen van de spijsvertering door toevoegen van 0,4 x volume van koude foetale runderserum (FBS) en meng door zachte vortex.
- Centrifugeer bij 250 x g gedurende 3 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant zonder de pellet te verstoren.
- Resuspendeer de cellen met 200 μl koude FACS buffer (HBSS met 1% FBS, pH 7.4). Cellen overbrengen in een tube van 5 mL FACS.
- Snel draai de buis FACS zodat de celsuspensie geschiedde door het filter te verwijderen van onverteerd grote weefsel puin. De schorsing van één cel in de buis is nu klaar voor het sorteren van FACS.
4. eencellige Lysis
-
Lysis van de cel buffer voor te bereiden.
Opmerking: Onder een UV-gesteriliseerde kap met laminaire flow alle experimenten uitvoeren Alle buizen, platen en Pipetteer tips moeten worden RNase- / DNase-gratis. Ontsmetten van de kap en de pipetten met RNase weg oplossing vóór gebruik.- De reagentia op ijs ontdooien: dNTP (10 mM), oligo-dT primer (10 μM) en ERCC stockoplossing (1:20).
- Verdun het ERCC tot 1:5 x 105 met nuclease-gratis water.
- Bereken het volume van lysis van de cel buffer nodig. Voeg 0,1 l RNase remmer (40 U/μl), 1.9 μL van 0,2% (vol/vol) Triton X-100, 1 μL van dNTP, 1 μL van oligo-dT primer en 0,05 μL van verdunde ERCC tot een eindvolume van 4.05 μL voor elke cel.
- Aliquot de lysis van de cel buffer in 0,2 mL dun-muur 8-stripe PCR buizen of 96-wells-platen. Centrifugeer de buizen of platen voor 30 s bij 4 ° C.
Opmerking: Centrifugeer 0,2 mL dun-muur 8-stripe PCR buizen bij 7500 x g en 96-wells-platen bij 800 x g in de volgende stappen.
-
Eencellige picking en lysis.
- Handmatig pick FACS gesorteerd op de afzonderlijke cellen Ins1-RFP+ in FACS buffer in 8-strip PCR buizen met behulp van een capillaire precisiepipet van 30 – 40 µm, of direct sorteren Ins1-RFP+ afzonderlijke cellen in 96-wells-platen. Het volume met een enkele cel wordt beschouwd als minder dan 0,3 μl.
Opmerking: Gebruik voorwaartse scatter hoogte (FSC-H) vs toekomen scatter gebied (FSC-A) gating strategie voor doublet discriminatie, FSC-H vs kant scatter gebied (WS-A) voor puin en fluorescentie gating voor het sorteren van de cel (figuur 3A3 c) van de Ins1-RFP+ . Voor de methode van het plukken, sorteren de doelcellen in een tube van 1,5 mL met 300 μL FACS buffer. De juiste eindconcentratie is 5-10 cellen/μL. Het buffervolume dienovereenkomstig aanpassen. Sorteren voor de methode van de collectie plaat, een eencellige in ieder putje van een 96-wells-plaat na de handleiding van het instrument. 7 , 13 - Vortex de buizen of platen te lyse de cellen en de vrijgave van het RNA. Centrifugeer de buizen of platen voor 30 s bij 4 ° C en onmiddellijk plaats ze op het ijs.
Opmerking: De cellen kunnen worden opgeslagen bij-80 ° C gedurende één week.
- Handmatig pick FACS gesorteerd op de afzonderlijke cellen Ins1-RFP+ in FACS buffer in 8-strip PCR buizen met behulp van een capillaire precisiepipet van 30 – 40 µm, of direct sorteren Ins1-RFP+ afzonderlijke cellen in 96-wells-platen. Het volume met een enkele cel wordt beschouwd als minder dan 0,3 μl.
5. eencellige cDNA versterking
-
Omgekeerde transcriptie (RT).
- Ontdooi de RT reagentia (tabel 1) op het ijs.
- Incubeer de monsters bij 72 ° C gedurende 3 minuten en onmiddellijk de buizen of platen op ijs voor ten minste 1 min. kort centrifugeren de buizen of platen voor 30 s bij 4 ° C.
Opmerking: Gebruik een thermische cycler met een 105 ° C verwarmd deksel voor alle incubations. - Voorbereiden op de RT-mix alle reacties, zoals beschreven in tabel 1.
- 5.7 μL van RT mix aan elk monster om het volume tot een totaal van 10 μL afzien. Zachtjes vortex de mix en centrifuge voor 30 s bij 4 ° C.
- Plaats de monsters in een thermische cycler en start het programma RT als volgt: 42 ° C gedurende 90 min, 10 cycli (50 ° C gedurende 2 minuten, 42 ° C gedurende 2 minuten), 70 ° C gedurende 15 minuten en houd bij 4 ° C.
-
Pre PCR versterking.
- Ontdooi de PCR reagentia (tabel 2) op het ijs.
- De PCR-mix voor te bereiden voor alle reacties, zoals beschreven in tabel 2.
- Afzien 15 μL van de PCR-mix aan elk monster, waarin de eerste fronten reacties. Zachtjes vortex de mix en centrifuge voor 30 s bij 4 ° C.
- Leg de monsters in een thermische cycler en start het volgende programma van de PCR: 98 ° C gedurende 3 minuten, 18 cycli (98 ° C gedurende 20 s, 67 ° C gedurende 15 s, 72 ° C gedurende 6 minuten), 72 ° C gedurende 5 minuten en houd bij 4 ° C.
Opmerking: Het PCR-product kan worden opgeslagen bij 4 ° C voor minder dan een week of bij-20 ° C /-80 ° C voor maximaal 6 maanden.
-
PCR de zuivering.
- Voeg 25 μL van opnieuw gesuspendeerde DNA zuivering kralen (1 x) aan elke monster uit de vorige stap en meng goed door de vortex. Snel draai vervolgens, aan de buis of platen bij kamertemperatuur te verzamelen van de vloeistof, maar te voorkomen dat de afwikkeling van de kralen.
Opmerking: Equilibreer DNA zuivering kralen tot kamertemperatuur voor 15 min en vortex grondig vóór gebruik. - Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Plaats de buis of plaat op een passende magnetische staan totdat de oplossing is duidelijk, en vervolgens zorgvuldig verwijderen en verwijder het supernatant.
- Voeg 200 l versbereide 80% ethanol te wassen de kralen in de magnetische stand, Incubeer gedurende 30 s, vervolgens zorgvuldig verwijderen en negeren de ethanol-oplossing.
Opmerking: De 80% (vol/vol) ethanol oplossing moet vers worden bereid elke keer. - Herhaal stap 5.3.4 voor een totaal van twee wasbeurten.
- Verwijder voorzichtig en negeren de resterende ethanol oplossing en lucht drogen de kralen terwijl de buis of plaat is op de magnetische stand.
Opmerking: Vermijd overdreven drogen de parels om te zorgen voor de maximale elutie-efficiëntie. - 11 μL van de nuclease-vrije elueer de DNA-doelstelling van de kralen en meng goed door vortex water toevoegen. Daarna snel draai de buis of de plaat en plaats het op een magnetische staan totdat de oplossing helder is. 10 μL van het monster overbrengen in een nieuwe PCR-buis.
Opmerking: Als Dimeren na een ronde van de zuivering bestaat, gebaseerd op de detectie van cDNA grootte distributie, zuiveren opnieuw de Dimeren om volledig te verwijderen. De Dimeren kunnen beïnvloeden de cDNA rendement berekening als toegestaan te blijven in de steekproef.
- Voeg 25 μL van opnieuw gesuspendeerde DNA zuivering kralen (1 x) aan elke monster uit de vorige stap en meng goed door de vortex. Snel draai vervolgens, aan de buis of platen bij kamertemperatuur te verzamelen van de vloeistof, maar te voorkomen dat de afwikkeling van de kralen.
-
Kwaliteitscontrole van cDNA.
- Willekeurig kiezen te detecteren het totale rendement van cDNA met behulp van een Fluorimeter monsters.
- Evalueren van de marker-gen expressie niveaus door PCR in real time (qPCR) (4E van de figuur). 1 μL van het monster, tot 40 keer verdunnen en het uitvoeren van qPCR met een 384-well plaat te verwijderen. Bereiden de mix van qPCR zoals beschreven in tabel 3. Fietsen voorwaarden: 95 ° C gedurende 10 min, 45 cycles (95 ° C gedurende 10 s, 60 ° C gedurende 15 s, 72 ° C gedurende 15 s).
- Kies willekeurig monsters te detecteren de grootteverdeling met behulp van een parallelle capillaire elektroforese instrument.
6. cDNA Bibliotheek bouw
-
De reactie van de Tagmentation door de Tn5 transposase.
- De totale opbrengst van cDNA van qPCR geselecteerde cellen uit stap 5.4.2 met behulp van een Fluorimeter detecteren. Gebruik 2 ng van cDNA als het uitgangsmateriaal.
- Ontdooi de tagmentation reactie reagentia (tabel 4) op het ijs.
- De reactie van de tagmentation in een 0,2 mL dun-muur 8-stripe PCR buis, zoals beschreven in tabel 4, voor te bereiden en meng zorgvuldig door vortex. Draai vervolgens aan, snel naar beneden de oplossing op kamertemperatuur.
- Incubeer de monsters bij 55 ° C gedurende 10 minuten en houd bij 4 ° C.
- Onmiddellijk 2 μL van 5 x TS aan elk monster met de tagmented van DNA om te stoppen met de reactie toevoegen. Meng zorgvuldig door vortex, en draai vervolgens snel naar beneden de oplossing op kamertemperatuur.
- Laat het mengsel gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur inwerken. Het DNA moet direct worden verwerkt voor de definitieve verrijking PCR.
-
Versterking van de adapter-afgebonden fragmenten.
- Ontdooi de PCR reagentia (tabel 5) op het ijs.
- De PCR-mix van verrijking, zoals beschreven in tabel 5, bereiden en meng zorgvuldig door vortex. Draai vervolgens aan, snel naar beneden de oplossing op kamertemperatuur.
- De PCR uitvoeren met behulp van het volgende programma: 72 ° C gedurende 10 min, 98 ° C gedurende 30 s, 8 cycli (98 ° C gedurende 15 s, 60 ° C gedurende 30 s, 72 ° C gedurende 3 minuten), 72 ° C gedurende 5 minuten en houd bij 4 ° C.
Opmerking: Het aantal cycli hangt het bedrag verwachte bibliotheek DNA.
-
PCR zuiveren met maat keuze.
- 14 μL van opnieuw gesuspendeerde DNA zuivering kralen (0.7 x) aan elk monster uit de vorige stap en meng goed door vortex toevoegen. Snel draai vervolgens, aan de buis bij kamertemperatuur te verzamelen van de vloeistof, maar te voorkomen dat de afwikkeling van de kralen.
Opmerking: Equilibreer DNA zuivering kralen tot kamertemperatuur voor 15 min en vortex grondig vóór gebruik. - Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Plaats de buis op een passende magnetische stand totdat de oplossing helder is, zorgvuldig het supernatant overbrengen met een nieuwe strip van de buis en negeren de vorige buis streep.
- Voeg 3 l opnieuw gesuspendeerde DNA zuivering kralen (0,15 x) aan elk monster in de buis streep en meng goed door de vortex. Snel draai vervolgens, aan de buis bij kamertemperatuur.
- Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Plaats de buis of plaat op een passende magnetische staan totdat de oplossing is duidelijk, en vervolgens zorgvuldig verwijderen en verwijder het supernatant.
- Voeg 200 l versbereide 80% ethanol te wassen de kralen in de magnetische stand, Incubeer gedurende 30 s, vervolgens zorgvuldig verwijderen en negeren de ethanol-oplossing.
Opmerking: De 80% (vol/vol) ethanol oplossing moet vers worden bereid elke keer. - Herhaal stap 6.3.7 voor een totaal van twee wasbeurten.
- Verwijder voorzichtig en negeren de resterende ethanol oplossing en lucht drogen de kralen terwijl de buis of plaat is op de magnetische stand.
Opmerking: Vermijd overdreven drogen de parels om te zorgen voor de maximale elutie-efficiëntie. - 11 μL van de nuclease-vrije elueer de DNA-doelstelling van de kralen en meng goed door vortex water toevoegen. Daarna snel draai de buis of de plaat en plaats het op een magnetische staan totdat de oplossing helder is. 10 μL van het monster overbrengen in een nieuwe buis streep.
- 14 μL van opnieuw gesuspendeerde DNA zuivering kralen (0.7 x) aan elk monster uit de vorige stap en meng goed door vortex toevoegen. Snel draai vervolgens, aan de buis bij kamertemperatuur te verzamelen van de vloeistof, maar te voorkomen dat de afwikkeling van de kralen.
-
Kwaliteitscontrole van definitieve cDNA Bibliotheek.
- Meten van de concentratie van elke bibliotheek met behulp van een Fluorimeter en controleer de grootteverdeling met behulp van een parallelle capillaire elektroforese instrument.
Opmerking: De DNA-opbrengst is meestal tussen 15-25 ng voor elke bibliotheek. De fragmenten, variërend van 250 bp tot 450 bp zal worden waargenomen. Als Dimeren na zuivering, blijven zoals bevestigd door het selectievakje grootte distributie, zuiveren met 1 x DNA zuivering kralen één meer tijd.
- Meten van de concentratie van elke bibliotheek met behulp van een Fluorimeter en controleer de grootteverdeling met behulp van een parallelle capillaire elektroforese instrument.
-
Bundeling van de bibliotheek
- Gebaseerd op de geschatte fragment grootte, zwembad gelijke hoeveelheden van DNA van elk monster, ervoor te zorgen dat geen van hen de dezelfde combinaties van N6XX en N8XX adapters bevatten.
7. DNA Sequencing
- Onderwerp barcoded bibliotheken 51 bp single-end sequencing met behulp van een high-throughput rangschikkend systeem. De volgorde volgens de fabrikant protocol uit te voeren. De diepte van de sequencing van elke cel is ongeveer 1 miljoen leest gemiddeld8, ten minste 0,5 miljoen leest per cel14.
8. Bioinformatics Analyses
-
De evaluatie van de kwaliteit van het rangschikken en uitlijning.
- Evalueren van de kwaliteit van gesequenceerd leest met behulp van FastQC (v0.11.3)15 met de volgende parameters: "fastqc--extract -o output_dir input_fastq".
- Het genoom van de muis met het ERCC sequenties met de opdracht samenvoegen "kat mm10.fa ERCC.fa > mm10_ERCC.fa".
- Bouwen van bowtie2 (v2.2.5)16 index met de volgende parameters: "bowtie2-build mm10_ERCC.fa mm10_ERCC".
- Uitlijnen met behulp van tophat2 leest (v2.1.0)17 met de volgende parameters: "tophat2 -o output_dir -G gene.gtf--transcriptome-index trans_index mm10_ERCC input_fastq".
-
Gen expressie niveaus te kwantificeren.
- Graaf toegewezen leest voor elk gen HTSeq (v 0.6.0)18 met de volgende parameters: '' htseq-graaf - f pos -s - r bam geen - een 30 accepted_hits.bam gene.gtf > read_count.txt''.
- Normaliseren van de gen-expressie niveaus uitgeschreven per miljoen (TPM)19.
-
Kwaliteitscontrole van cellen.
- Uitsluiten van cellen met minder dan 0,5 miljoen toegewezen leest of minder dan 4.000 genen (TPM > 1).
Opmerking: het criterium van de uitsluiting hangt af van de celtypes en de diepte van de reeks. - Behouden van cellen uiten van endocriene markeringen (bijvoorbeeld Ins1 voor β-cellen, Gcg voor α-cellen), en uitsluiten van cellen uiten van niet-endocrinologische markeringen (bijvoorbeeld Spi1 voor leukocyten).
- Uitsluiten van cellen met minder dan 0,5 miljoen toegewezen leest of minder dan 4.000 genen (TPM > 1).
-
Belangrijkste componenten analyse (PCA)
- Zeer variabel genen volgens ERCC spike-ins, als eerder beschreven20identificeren.
- Uitvoeren van de partnerschaps-en samenwerkingsovereenkomst met de functie "PSO" in de R FactoMineR (v1.31.4)21, met pakket log2(TPM + 0.1) van zeer variabel genen.
- Visualiseren van de resultaten van de partnerschaps-en samenwerkingsovereenkomst met ggplot2 (v2.0.0)22.
-
Hiërarchisch clustering.
- Identificatie van genen met de hoogste belastingen van de belangrijkste component (PC) met behulp van de "dimdesc"-functie FactoMineR (v1.31.4)21.
- Uitvoeren van hiërarchische clustering met behulp van de functie "heatmap.2" in de R pakket gplots (v3.0.1)23, met log2 (TPM + 1) relatieve waarden van hoge PC laden van genen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Pancreases werden ontleed van embryonale, Neonatale en postnatale muizen (figuur 2A en 2B). Voor ouder dan postnatale dag 18 muizen, het spijsverteringsstelsel effect is afhankelijk van de mate van perfusie; de injectie is daarom de belangrijkste stap voor islet isolatie (figuur 2C-2E en tabel 6). Zoveel collagenase werd geïnjecteerd aangezien mogelijk te vullen de alvleesklier tijdens deze stap was. De volledig opgeblazen alvleesklier is afgebeeld in figuur 2D. Als de perfusie niet succesvol (figuur 2E is), maar het monster kostbaar is, kan de alvleesklier in kleine stukjes voor voldoende spijsvertering later worden gescheurd.
Na perfusie, was de alvleesklier weefsel verteerd in kleine stukjes om eilandjes (figuur 2F) vrij te geven. Als u wilt verkorten FACS sorteren, verrijkt we de endocriene cellen door het plukken van de eilandjes van tevoren. De grootte van de eilandjes kan variëren afhankelijk van de leeftijd van de muis en de intensiteit van de spijsvertering. De eilandjes zijn soms niet rond van vorm. Eilandjes moeten worden geselecteerd volgens kleur en compacte staat (Figuur 2 g en tabel 6). Als de transgene muis stam een verslaggever-gen, zoals GFP of RFP voor endocriene cellen heeft, zou kunnen de eilandjes ook worden geplukt onder een fluorescentie Microscoop.
Ins1-RFP+ cellen werden gezuiverd door FACS sorteren (figuur 3A-3 C), en vervolgens afzonderlijke cellen werden opgehaald met behulp van een capillaire precisiepipet voor eencellige RNA-seq (figuur 3D). Succesvol versterkte cDNA moeten een volledige lengte boven 500 bp en tot 2 kb van 1,5 kb worden verrijkt. Bovendien is er meestal een 500-600 bp verrijking van cDNA waargenomen in de Ins1-RFP+ cellen, die de insuline transcripten (figuur 4A vertegenwoordigen kunnen). Nochtans, zijn er sommige abnormale situaties waargenomen10 (tabel 6). Bijvoorbeeld, de cDNA fragmenten in de buurt van 100 bp zijn inleidingsdimeer (figuur 4B), die worden meestal veroorzaakt door de buitensporige primers, dat moeten worden verwijderd door de DNA zuivering stap te herhalen. Het bestaan van inleidingsdimeer invloed kan hebben op de berekening van de totale cDNA opbrengsten, die worden gebruikt voor de volgende bibliotheek bouw. De fragmenten van de cDNA tussen 100 bp en 500 bp meestal vertegenwoordigen gedegradeerd cDNA (figuur 4C), die wordt veroorzaakt door foute cel status of reagens problemen, zoals RNase verontreiniging. Onder deze voorwaarde, moet we identificeren van de oorzaak van DNA afbraak en uitsluiten van de verstoring. Bijvoorbeeld, om te zorgen voor goede cel status, moeten de weefsels worden verteerd cellen moeten worden gesorteerd, snel en zachtjes en bewerkingen moeten voorzichtig worden uitgevoerd om te voorkomen dat elk type van verontreinigende stoffen.
Na de zuivering van de cDNA bibliotheken voor het rangschikken verkregen we cDNA fragmenten van verschillende grootte door het volgen van de instructies voor het toevoegen van verschillende verhoudingen van DNA zuivering parels aan de steekproef. Bijvoorbeeld, kunnen we het krijgen van cDNA variërend van 250 bp 450 bp door toe te voegen 0.7 x en 0,15 x DNA zuivering kralen naar de eerste en tweede rondes van zuivering, respectievelijk (Figuur 4 d). Deze stap heeft een hoog slagingspercentage. Echter als er fragmenten van ongeveer 100 bp, wordt voorgesteld om het zuiveren van de bibliotheken weer met 1 x kralen van DNA zuivering verwijderen Dimeren (tabel 6). Unremoved Dimeren zal vertekenen het DNA kwantificering en zal invloed hebben op het monster bundeling van resultaten, wat in de ongelijke data-acquisitie van elk monster resulteert.
We analyseren de gegevens rangschikken met bioinformatics benaderingen (figuur 5A). De volgorde kwaliteitsscores moeten groter zijn dan 30 tijdens de sequencing van kwaliteitsevaluatie (figuur 5B). Na uitlijning, 80-90% van leest verwacht worden toegewezen aan het genoom van de referentie. Voor het verkrijgen van hoge kwaliteit cellen voor downstream analyses, wij uitgesloten van cellen met minder dan 0,5 miljoen toegewezen leest of met minder dan 4.000 gedetecteerd genen (figuur 5C en 5 D). Na de partnerschaps-en samenwerkingsovereenkomst en hiërarchische clustering, we gekenmerkt verschillende groepen van cellen en de genen die ongelijkmatig werden uitgedrukt in verschillende groepen8geïdentificeerd.
Figuur 1: Schematisch overzicht voor eencellige RNA-seq van muis alvleesklier endocriene cellen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: alvleesklier dissectie, perfusie en islet picking. (A) dissectie van embryonale alvleesklier weefsel (lagere) uit een E17.5 embryo (bovenste). De gele stippellijn kadert de alvleesklier weefsel. Schaal bar = 1.000 µm. (B) dissectie van postnatale alvleesklier weefsel (rechts) van een P10 muis (links). Schaal bar = 1.000 µm. (C-D) de alvleesklier weefsel van een muis P60 vóór (C) en na (D) perfusie. De gele stippellijn kadert de alvleesklier weefsel. Witte pijl geeft aan galblaas. (E) het gedeeltelijk perfused alvleesklier weefsel van een P60 muis. Rode pijl geeft het goed perfused gebied van de alvleesklier. Blauwe pijlen geeft de slecht perfused gebieden van de alvleesklier. (F) de alvleesklier weefsel vóór (boven) en na (lagere) collagenase spijsvertering. (G) pijlen wijzen naar de eilandjes die zijn uitgebracht van de alvleesklier weefsel collagenase verteerd. Schaal bar = 200 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: handmatig plukken van cellen met een 30 – 40 µm capillaire pipet onder een microscoop. (A-C) Stapsgewijs FACS gating Ins1-RFP+ cellen moeten worden gesorteerd. (D) de heldere cirkels geven aan cellen en de buis is een capillaire pipet. Kies de cellen met een betere morfologie (pijl) en negeren de geclusterde cellen (pijlpunt). Schaal bar = 200 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: Kwaliteit opsporing van cDNA en bibliotheek grootteverdeling van Ins1-RFP+ cellen door een parallelle capillaire elektroforese instrument. (A) de vertegenwoordiger resultaat van succesvol vooraf versterkte cDNA. Normaal gesproken moet de cDNA profiel boven 500 bp met een piek van de kb ~1.5–2. (B) de vertegenwoordiger resultaat van vooraf versterkte cDNA met een primer dimeer piek. De primer dimeer piek is ongeveer 100 bp. (C) het profiel van vooraf versterkte cDNA met fragmenten tussen 100 bp en 500 bp geeft de mogelijkheid van cDNA afbraak. (D) de grootteverdeling van cDNA Bibliotheek variërend tussen 250 bp en 450 bp na de zuivering stappen vermeld in dit protocol. (E) de expressie niveaus van Ins2 in cDNA bibliotheken door qPCR (links) en de relatieve volgorde gegevens (rechts). De x-axes vertegenwoordigen verschillende 8 eencellige monsters. De y-as (links) vertegenwoordigt genormaliseerde ΔCt ten opzichte van de Gapdh (CtGapdh- CtIns2 + 6) en de y-as (rechts) genormaliseerd expressie niveau van Ins2 ten opzichte van de Gapdh (log2(TPM Ins2 / TPMGapdh)). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: Bioinformatics analyses van eencellige transcriptome gegevens. (A) pijpleiding van bioinformatica analyses. (B) Sequencing kwaliteitsscores over alle basissen van luidt als volgt. (C) distributie van toegewezen Lees graaf. (D) distributie van gedetecteerde gene graaf. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Component | Volume (µL) |
| Reverse-transcriptase (200 U/µL) | 0,5 |
| RNase remmer | 0,25 |
| Eerste-onderdeel buffer (5 x) | 2 |
| DTT (100 mM) | 0,5 |
| Betaïne (5 M) | 2 |
| MgCl2 (1 M) | 0,06 |
| TSO (100 ΜM) | 0.1 |
| Nuclease-gratis water | 0,29 |
| Totaal | 5.7 |
Tabel 1: RT reagens mengen van de componenten in een 5.7 µL reactie voor elk monster.
| Component | Volume (µL) |
| Eerste-strand reactie | 10 |
| DNA-Polymerase (2 x ReadyMix) | 12,5 |
| PCR de inleidingen (10 µM) IS | 0,25 |
| Nuclease-gratis water | 2,25 |
| Totaal | 25 |
Tabel 2: PCR versterking van de pre-reagens mengen van componenten in een 25 µL reactie voor elk monster
| Component | Volume (µL) |
| SYBR groene Master Mix | 5 |
| Inleidingen (5 µM) | 0,5 |
| Nuclease-gratis water | 2.5 |
| cDNA | 2 |
| Totaal | 10 |
Tabel 3: qPCR-reagens mengen van de componenten in een 10 µL reactie met behulp van een standaard 384-well-plate.
| Component | Volume (µL) |
| 5 x TTBL | 1.6 |
| 2 ng cDNA | Variabele |
| ddH2O | Variabele |
| TTE Mix V5 | 2 |
| Totaal | 8 |
Tabel 4: Tagmentation-reagens mengen van de componenten in een 8 µL reactie voor elk monster.
| Component | Volume (µL) |
| ddH2O | 1.6 |
| Product van de vorige stap | 10 |
| 5 x tabblad | 4 |
| N6XX | 2 |
| N8XX | 2 |
| TAE | 0.4 |
| Totaal | 20 |
Tabel 5: Verrijking PCR reagens mix componenten in een 20 µL reactie voor elk monster.
| Stap | Probleem | Mogelijkheid | Oplossing |
| 1.3.4 | Uitglijden van de klemmen | Het buitenoppervlak van de darm is nat veroorzaakt door het bestaan van de kleine hoeveelheid interstitiële vloeistof en collegenase leakness | Zachtjes swap de twaalfvingerige darm wand en de muren van andere orgel in de buikholte met katoenen wissers |
| 1.3.6 | Darm burst | Vloeibare druk is te hoog in de darm | Vertragen van de snelheid van de injectie |
| 2.6 | Eilandjes vasthouden aan exocrine weefsel bij het afhalen van de eilandjes | Onvoldoende vertering | Verlengen van de duur van de spijsvertering en schudden van kracht |
| 5.3 | De opbrengst van cDNA slinkt na PCR versterking | De cellen zijn in slechte conditie | Cellen houden vers en in goede conditie |
| 5.4 of 6.4 | Inleidingsdimeer kunnen worden gezien | Buitensporige inleidingen | Zuiveren van cDNA één meer tijd met DNA zuivering kralen (0.8:1 of 1:1 verhouding) |
| 5.4 | Aangetaste cDNA na PCR versterking | Slechte kwaliteit van cellen of verontreinigde reagentia | Cellen in goede conditie houden of wijzigen van reagentia |
| 6.3 | De hoeveelheid DNA slinkt na de bouw van de bibliotheek | Te weinig cycli van PCR of de kwaliteit van cDNA is niet goed | Verhoog het aantal cycli c.q. cDNA kwaliteit vóór bibliotheek bouw |
Tabel 6: oplossen van problemen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit protocol, wij blijk gegeven van een effectieve en eenvoudig-en-klare methode voor het bestuderen van de eencellige expressieprofielen alvleesklier β-cellen. Deze methode kan worden gebruikt om te isoleren van de endocriene cellen uit embryonale, Neonatale en postnatale pancreases en eencellige transcriptomic-analyses uitvoeren.
De meest kritische stap is het isolement van één β-cellen in goede conditie. Volledig geperfundeerd pancreases reageren beter op daaropvolgende spijsvertering. Onvoldoende perfusie, die meestal in de dorsale alvleesklier optreedt, zal resulteren in een lage islet rendement. Na perfusie, de tijd van de spijsvertering en schudden van de intensiteit die bijzondere aandacht behoeven. Overmatige spijsvertering, als gevolg van lange incubatie tijden en krachtig kan schudden, de eilandjes in stukjes breken. Onvoldoende vertering zal niet volledig scheiden de eilandjes van aangrenzende weefsels. Na vertering van de alvleesklier, werden de eilandjes gezuiverd door de hand plukken in plaats van dichtheid kleurovergang centrifugeren. Hoewel dichtheid kleurovergang centrifugeren eilandjes verrijken kan, worden vele kleine eilandjes of eilandjes, verbonden met weefsel van het acinaire per ongeluk verwijderd. Probeer te vermijden plukken acinaire weefsel, dat kan leiden tot inefficiënte trypsine spijsvertering en verminderen de zuiverheid van de β-cellen.
Onafhankelijke biologische replicatieonderzoeken zijn nodig voor het onderscheiden van de biologische effecten van de variabiliteit en batch. Als twee biologische repliceert hebben een vergelijkbaar patroon in de partnerschaps-en samenwerkingsovereenkomst en soortgelijke subgroepen in clusters resultaten opnemen, deze monsters kunnen onthullen betrouwbare biologische variabiliteit. Anders, extra biologische replicatieonderzoeken zijn vereist om de resultaten te bevestigen. Voor een metabole orgel zoals de alvleesklier goed de staat van de cel die is gekoppeld aan de circadiane klok24 zijn voor de partij verschillen. U kunt dit probleem oplossen, is het raadzaam de verzamelen van alle monsters op hetzelfde moment van de dag.
De beperking van deze aanpak is een lage doorvoersnelheid omdat we bouwen een bibliotheek voor elke cel. Als gevolg van de buitensporige inleidingen in de reactie, cDNA vóór en na de bouw van de bibliotheek in het algemeen moet worden gezuiverd tweemaal om de inleidingsdimeer volledig te verwijderen. Deze processen zijn tijdrovend. Onlangs, een gewijzigde protocol25 werd gemeld dat dit probleem tot op zekere hoogte kunnen oplossen. In dit protocol etiketten de cel-specifieke barcode cDNA fragmenten tijdens de stap van omgekeerde transcriptie. Daarom, cDNA van elke cel kunnen samen worden gebundeld en vervolgens worden gezuiverd, gevolgd door de bouw van de bibliotheek. Deze wijziging aanzienlijk verhoogt de doorvoer van de bouw van de bibliotheek. Echter deze gewijzigde methode is minder gevoelig en minder genen per cel detecteert. Bovendien, is deze methode een 3' methode met verminderde Lees dekking tellen. Daarom, Smart-seq2 is nog steeds de meest geschikte methode voor alvleesklier ontwikkeling.
De alvleesklier bereiding op basis van andere soorten kan afwijken. Voor menselijke alvleesklier, kunnen de eilandjes worden geïsoleerd na eerdere protocollen26,27. Vervolgens de geïsoleerde eilandjes los kunnen worden gezien in afzonderlijke cellen28 en eencellige analyses met behulp van deze methode kunnen uitvoeren. Deze methode kan algemeen worden toegepast op het onderzoek van zoogdieren alvleesklier ontwikkeling, ziekten en regeneratie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken het nationale centrum voor eiwit wetenschappen, Beijing (Peking University) en de Peking-Tsinghua Center voor de Life Science Computing-Platform. Dit werk werd gesteund door het ministerie van wetenschap en technologie van China (2015CB942800), de nationale Natural Science Foundation van China (31521004, 31471358 en 31522036) en financiering van Peking-Tsinghua centrum voor Life Sciences C.-R.X.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase P | Roche | 11213873001 | |
| Trypsin-EDTA (0.25 %), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200114 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30071.03 | |
| Dumont #4 Forceps | Roboz | RS-4904 | |
| Dumont #5 Forceps | Roboz | RS-5058 | |
| 30 G BD Needle 1/2" Length | BD | 305106 | |
| Stereo Microscope | Zeiss | Stemi DV4 | |
| Stereo Fluorescence microscope | Zeiss | Stereo Lumar V12 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap | BD-Falcon | 352235 | |
| 96-Well PCR Microplate | Axygen | PCR-96-C | |
| Silicone Sealing Mat | Axygen | AM-96-PCR-RD | |
| Thin Well PCR Tube | Extragene | P-02X8-CF | |
| Cell sorter | BD Biosciences | BD FACSAria | |
| Capillary pipette | Sutter | B100-58-10 | |
| RNaseZap | Ambion | AM9780 | |
| ERCC RNA Spike-In Mix | Life Technologies | 4456740 | |
| Distilled water | Gibco | 10977 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| dNTP mix | New England Biolabs | N0447 | |
| Recombinant RNase Inhibitor | Takara | 2313 | |
| Superscript II reverse transcriptase | Invitrogen | 18064-014 | |
| First-strand buffer (5x) | Invitrogen | 18064-014 | |
| DTT | Invitrogen | 18064-014 | |
| Betaine | Sigma-Aldrich | 107-43-7 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 7786-30-3 | |
| Nuclease-free water | Invitrogen | AM9932 | |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2x) | KAPA Biosystems | KK2601 | |
| VAHTS DNA Clean Beads XP beads | Vazyme | N411-03 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32854 | |
| AceQ qPCR SYBR Green Master Mix | Vazyme | Q121-02 | |
| TruePrep DNA Library Prep Kit V2 for Illumina | Vazyme | TD502 | Include 5x TTBL, 5x TTE, 5x TS, 5x TAB, TAE |
| TruePrep Index Kit V3 for Illumina | Vazyme | TD203 | Include 16 N6XX and 24 N8XX |
| High Sensitivity NGS Fragment Analysis Kit | Advanced Analytical Technologies | DNF-474 | |
| 1x HBSS without Ca2+ and Mg2+ | 138 mM NaCl; 5.34 mM KCl 4.17 mM NaHCO3; 0.34 mM Na2HPO4 0.44 mM KH2PO4 |
||
| Isolation buffer | 1 × HBSS containing 10 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 5 mM Glucose, pH 7.4 | ||
| FACS buffer | 1 × HBSS containing 15 mM HEPES, 5.6 mM Glucose, 1% FBS, pH 7.4 | ||
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S5136 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Oligo-dT30VN primer | 5'-AAGCAGTGGTATCAA CGCAGAGTACT30VN-3' |
||
| TSO | 5'-AAGCAGTGGTATCAAC GCAGAGTACATrGrG+G-3' |
||
| ISPCR primers | 5'-AAGCAGTGGTAT CAACGCAGAGT-3' |
||
| Gapdh Forward primer | 5'-ATGGTGAAGGTC GGTGTGAAC-3' |
||
| Gapdh Reverse primer | 5'-GCCTTGACT GTGCCGTTGAAT-3' |
||
| Ins2 Forward primer | 5'-TGGCTTCTTC TACACACCCA-3' |
||
| Ins2 Reverse primer | 5'-TCTAGTTGCA GTAGTTCTCCA-3' |
References
- Gu, G., Dubauskaite, J., Melton, D. A. Direct evidence for the pancreatic lineage: NGN3+ cells are islet progenitors and are distinct from duct progenitors. Development. 129 (10), 2447-2457 (2002).
- Oliver-Krasinski, J. M., Stoffers, D. A.
- Dor, Y., Brown, J., Martinez, O. I., Melton, D. A. Adult pancreatic beta-cells are formed by self-duplication rather than stem-cell differentiation. Nature. 429 (6987), 41-46 (2004).
- Smukler, S. R., et al. The adult mouse and human pancreas contain rare multipotent stem cells that express insulin. Cell Stem Cell. 8 (3), 281-293 (2011).
- Dorrell, C., et al. Human islets contain four distinct subtypes of beta cells. Nature Communications. 7, 11756 (2016).
- Bader, E., et al. Identification of proliferative and mature beta-cells in the islets of Langerhans. Nature. 535 (7612), 430-434 (2016).
- Saliba, A. E., Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. Single-cell RNA-seq: Advances and future challenges. Nucleic Acids Research. 42 (14), 8845-8860 (2014).
- Qiu, W. L., et al. Deciphering pancreatic islet beta cell and alpha cell maturation pathways and characteristic features at the single-cell level. Cell Metabolism. 25 (5), 1194-1205 (2017).
- Picelli, S., et al. Smart-seq2 for sensitive full-length transcriptome profiling in single cells. Nature Methods. 10 (11), 1096-1098 (2013).
- Picelli, S., et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).
- Piccand, J., et al. Pak3 promotes cell cycle exit and differentiation of beta-cells in the embryonic pancreas and is necessary to maintain glucose homeostasis in adult mice. Diabetes. 63 (1), 203-215 (2014).
- Veite-Schmahl, M. J., Regan, D. P., Rivers, A. C., Nowatzke, J. F., Kennedy, M. A. Dissection of the mouse pancreas for histological analysis and metabolic profiling. Journal of Visualized Experiments. (126), (2017).
- Hu, P., Zhang, W., Xin, H., Deng, G. Single cell isolation and analysis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 116 (2016).
- Haque, A., Engel, J., Teichmann, S. A., Lonnberg, T. A practical guide to single-cell RNA-sequencing for biomedical research and clinical applications. Genome Medicine. 9 (1), 75 (2017).
- Andrews, S. FastQC: A quality control tool for high throughput sequence data. , Available from: https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2010).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
- Kim, D., et al. TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biology. 14 (4), (2013).
- Anders, S., Pyl, P. T., Huber, W. HTSeq--a Python framework to work with high-throughput sequencing data. Bioinformatics. 31 (2), Oxford, England. 166-169 (2015).
- Wagner, G. P., Kin, K., Lynch, V. J. Measurement of mRNA abundance using RNA-seq data: RPKM measure is inconsistent among samples. Theory in Biosciences. 131 (4), 281-285 (2012).
- Brennecke, P., et al. Accounting for technical noise in single-cell RNA-seq experiments. Nature Methods. 10 (11), 1093-1095 (2013).
- Le, S., Josse, J., Husson, F. FactoMineR: An R package for multivariate analysis. Journal of Statistical Software. 25 (1), (2008).
- Hadley, W. ggplot2: Elegant graphics for data analysis. , Springer Science & Business Media. (2009).
- Warnes, G., Bolker, B., Bonebakker, L., Gentleman, R., Huber, W., Liaw, A., Lumley, T., Mächler, M., Magnusson, A., Möller, S. gplots: Various R Programming Tools for Plotting Data. , Available from: https://cran.r-project.org/package=gplots (2016).
- Marcheva, B., et al. Disruption of the clock components CLOCK and BMAL1 leads to hypoinsulinaemia and diabetes. Nature. 466 (7306), 627-631 (2010).
- Li, L., et al. Single-cell RNA-seq analysis maps development of human germline cells and gonadal niche interactions. Cell Stem Cell. , (2017).
- Qi, M., et al. Human pancreatic islet isolation: Part I: Digestion and collection of pancreatic tissue. Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).
- Qi, M., et al. Human pancreatic islet isolation: Part II: Purification and culture of human islets. Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).
- Teo, A. K. K., et al. Single-cell analyses of human islet cells reveal de-differentiation signatures. Cell Death Discovery. 4 (14), (2018).
