Summary
Nós descrevemos um método para o isolamento de células endócrinas de pancreases embrionárias, Neonatais e pós-natal, seguidos por sequenciação do ARN de célula única. Esse método permite que as análises do desenvolvimento de linhagem endócrina do pâncreas, heterogeneidade e transcriptomic dinâmica de células.
Abstract
Células endócrinas no pâncreas, que são agrupadas em Ilhéus, regulam a estabilidade de glicose do sangue e metabolismo energético. Os tipos de células distintas em Ilhéus, incluindo células secretoras de insulina β, são diferenciados de progenitores endócrinas comuns durante a fase embrionária. Células endócrinas imaturas expandir através da proliferação celular e amadurecem durante um período de tempo pós-natal do desenvolvimento. No entanto, os mecanismos subjacentes a esses processos não estão claramente definidos. A sequenciação do ARN-célula única é uma abordagem promissora para a caracterização das populações de células distintas e vias de diferenciação de linhagem de célula rastreamento. Aqui, descrevemos um método para a célula única-a sequenciação do ARN de células β do pâncreas isolado de pancreases embrionárias, Neonatais e pós-natal.
Introduction
O pâncreas é um órgão vital metabólico em mamíferos. O pâncreas é composto por compartimentos endócrinos e exócrinas. Células endócrinas no pâncreas, incluindo células β produtoras de insulina e glucagon-produzindo células α, cluster juntos em ilhotas de Langerhans e coordenada regulam a homeostase de glicose sistémica. Disfunção das células endócrinas resulta em diabetes mellitus, que se tornou uma questão de saúde pública em todo o mundo.
Células endócrinas do pâncreas são derivadas de Ngn3+ progenitores durante a embriogênese1. Mais tarde, durante o período perinatal, as células endócrinas proliferaram para Ilhéus imaturo de formulário. Estas células imaturas continuam a desenvolver e tornar-se progressivamente ilhotas maduras, que se tornam ricamente vascularizadas regular homeostase de glicose do sangue em adultos2.
Embora foi identificado um grupo de fatores de transcrição que regulam a diferenciação de células β, o caminho exato de maturação das células β é ainda incerto. Além disso, o processo de maturação de células β envolve também o Regulamento da cela número expansão3,4 e a geração de heterogeneidade celular5,6. No entanto, os mecanismos de regulação desses processos não foram bem estudados.
A sequenciação do ARN-célula única é uma abordagem poderosa que pode perfil subpopulações de células e rastrear celular linhagem caminhos do desenvolvimento7. Aproveitando esta tecnologia, a chave de eventos que ocorrem durante o desenvolvimento de ilhotas pancreáticas podem ser decifrados a célula única nível8. Entre os protocolos de célula única-a sequenciação do ARN, Smart-seq2 permite a geração de cDNA completo com sensibilidade melhorada e precisão e a utilização de reagentes padrão no menor custo9. Inteligente-seq2 leva cerca de dois dias para construir uma biblioteca de cDNA para sequenciamento10.
Aqui, propomos um método para o isolamento de células β fluorescência-etiquetada dos pancreases de fetal adulto Ins1-RFP11ratos transgénicos, usando fluorescência-ativado da pilha (FACS) de classificação e o desempenho de transcriptomic analisa na nível de célula única, usando a tecnologia Smart-seq2 (Figura 1). Este protocolo pode ser estendido para analisar a transcriptomes de todos os tipos de célula endócrina do pâncreas em Estados normais, patológicos e envelhecimento.
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Protocol
Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê de uso (IACUC) da Universidade de Pequim e institucional Cuidado Animal.
1. pâncreas isolamento
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Embriões de E17.5 (dia embrionário 17,5):
- Estime dia embrionário 0.5 baseado no ponto de tempo, quando aparece o plug vaginal.
- Sacrifica os ratos grávidas pela administração de CO2 . Pulverize a pele abdominal com álcool a 70%.
- Faça uma incisão em forma de V com uma tesoura da área genital, estendendo para as costelas. Este processo será completamente aberto na cavidade abdominal.
- Dissecar o útero fora da cavidade abdominal e coloque-o em um prato de 10 cm contendo PBS frio.
- Disse os embriões do útero com pinça de ponta fina sob um estereomicroscópio, remoção de outros tecidos, tais como a placenta e cordão umbilical. Coloque todos os embriões em um prato de 10 cm contendo PBS frio.
- Abrir a cavidade abdominal dos embriões e desenterrar o tecido visceral com uma pinça de cotovelo. Transferi o tecido visceral para uma placa de fundo preto de 6 cm contendo PBS frio.
- O pâncreas situa-se na parte superior esquerda do abdômen e anexa o estômago, baço e duodeno (linha amarela pontilhada na Figura 2A)12. Desanexe os pancreases do tecido visceral usando fórceps e juntar o tecido pancreático dentro de um frasco de 20 mL contendo 5 mL da solução de colagenase frio de 0,5 mg/mL: colagenase de 0,5 mg/mL P no buffer de isolamento (HBSS contendo 10 mM HEPES, 1 mM MgCl2 5 mM de glicose, pH 7,4).
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Para os ratos P0-P15 (dia pós-natal 0-15):
- Sacrifício e corrigir o mouse aderindo os membros de um pedaço de protetor de bancada com fita. Pulverize a pele abdominal com álcool a 70%.
- Abra completamente a cavidade abdominal como descrito na etapa 1.1.3. Puxe o intestino para fora e para o lado esquerdo do mouse. Este procedimento irá expor os lóbulos esplênico, gástricos e duodenais do pâncreas. Cuidadosamente, dissecar todos os lóbulos do pâncreas (Figura 2B)12 e juntar o tecido pancreático dentro de um frasco de 20 mL contendo 5 mL da solução de colagenase frio de 0,5 mg/mL.
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Para os ratos P18-P60 (18-60 dias pós-parto):
- Prepare a solução de colagenase. Manter em gelo até que esteja pronto para uso.
- Sacrificar o mouse e abrir a cavidade abdominal, como mencionado acima (passo 1.1.2 e 1.1.3).
Nota: Não ferir o fígado, qualquer ferida no fígado irá reduzir a pressão de fluxo no ducto biliar e reduzir a eficiência de perfusão da etapa seguinte. - Remova o xifoide. Puxe o intestino para fora e para o lado direito do mouse e empurre os lóbulos medial direito e esquerdos do fígado para cada lado para expor a vesícula biliar (seta branca na Figura 2) e o ducto biliar comum.
- Prenda o duodeno com um par de pinças de pequeno vaso na posição superior e inferior, flanqueando o site onde o ducto biliar entra no duodeno (Figura 2D).
Nota: Não fixe os lóbulos gástricos ou esplênico do pâncreas. A solução de colagenase não fluirá para o lobo gástrico e esplênico do pâncreas na próxima etapa se pinçada. - Encher uma seringa com 5 mL de solução de colagenase frio de 0,5 mg/mL e inserir uma agulha 30G na vesícula biliar. Cuidadosamente e suavemente, manipule a agulha através do ducto biliar comum.
- Perfundir o pâncreas através da injeção de 1 a 5 mL de solução de colagenase frio de 0,5 mg/mL, dependendo do tamanho do mouse. A injeção deve ser lenta e constante para evitar que a agulha deslizando para fora do duto e impedir que o intestino estourando sob alta pressão de líquido. A injeção é completa quando o pâncreas é totalmente expandido.
- Disse o pâncreas (amarelo linha pontilhada na Figura 2D) fora da cavidade abdominal usando fórceps imediatamente após a perfusão. Coloque o tecido em um frasco de 20 mL contendo 5 mL da solução de colagenase frio de 0,5 mg/mL. Se manipular mais de um rato de cada vez, perfundir os ratos um por um e juntar os tecidos em solução fria de colagenase em um frasco de 20 mL até todos os mouses têm sido dissecados.
2. colagenase digestão e isolamento ilhéu
- Coloque o frasco de 20 mL contendo o tecido pancreático em banho maria a 37 ° C e incube por 3 min equilibrar a temperatura.
- Agite o tubo por outro 3 a 5 min. Se o tecido pancreático é totalmente inflado, gradualmente vou apartar em pedaços pequenos de tecido até que finalmente se dispersa uniformemente. O tempo de digestão varia dependendo do tamanho do pâncreas e a eficiência de perfusão.
- Filtre o produto digerido através de um filtro de nylon 0,25 mm para um novo tubo de centrifugação de 50 mL. Lave completamente o filtro usando uma seringa de 20 mL contendo PBS gelado.
- Para E17.5-P15 pancreases, pule para o passo 3.1.
- Para P18-P60 pancreases, centrifugar a 200 x g por 1 min e descartar o sobrenadante. Ressuspender o tecido com PBS frio.
- Despeje a 5 mL de suspensão de tecido em um prato fundo preto de 6 cm. As ilhotas pancreáticas são estruturas brancas pequenas, compactas, leitosas e tecido acinares é solto e translúcido branco. Escolha ilhotas com uma pipeta de 200 μL e transferi-los para um tubo de 1,5 mL contendo uma pequena quantidade de PBS frio.
3. tripsina digestão do tecido pancreático ou ilhotas
- Centrifugar o tubo contendo tecido pancreático ou ilhotas a 200 x g por 1 min a 4 ° C e descartar o sobrenadante sem perturbar o sedimento.
- Ressuspender o sedimento com 0,25% do trypsin-EDTA e incubar em banho maria a 37 ° C. Após 4 minutos de incubação, suavemente e, ocasionalmente, Aspire (pipeta) por 1 min usando 200 μL de dicas.
Nota: Para E17.5-P3 pancreases, adicione 1 mL do trypsin-EDTA. Para P4-P15 pancreases, adicione 3 mL do trypsin-EDTA. Para 100-300 ilhotas, adicione 1 mL do trypsin-EDTA. Ajuste o volume da tripsina-EDTA, de acordo com a quantidade de tecido. - Parar a digestão adicionando volume de 0,4 x de frio de soro fetal bovino (FBS) e misture por suave vórtice.
- Centrifugar a 250 x g por 3 min a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante sem perturbar o sedimento.
- Ressuspender as células com 200 μL frio FACS o buffer (HBSS contendo 1% FBS, pH 7,4). Transfira as células para um tubo de 5 mL FACS.
- Rapidamente gire o tubo de FACS para permitir a suspensão de células para passar através do filtro para remover os restos de tecido grande não digerido. A suspensão de célula única no tubo está agora pronta para classificação de FACS.
4. single-cell Lysis
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Prepare o tampão de lise celular.
Nota: Execute todas as experiências sob uma capa de UV-esterilizados com fluxo laminar. Todos os tubos, chapas e pontas de pipetas devem ser RNase- / livre de DNase. Descontaminar o capô e pipetas com solução fora de RNase antes do uso.- Descongele os reagentes no gelo: dNTP (10 mM), oligo-dT primeira demão (10 μM) e ERCC estoque solução (01:20).
- Diluir o ERCC a 1:5 x 105 com água livre de nuclease.
- Calcule o volume de tampão de lise celular necessária. Adicione 0,1 μL de inibidor de RNase (40 U/μL), 1.9 μL de 0,2% (vol/vol) Triton X-100, 1 μL de dNTP, 1 μL de primer oligo-dT e 0,05 μL do ERCC diluído até um volume final de 4,05 μL de cada célula.
- Alíquota da lise celular em 0,2 mL parede fina listra-8 PCR tubos ou placas de 96 poços. Centrifugar os tubos ou placas por 30 s a 4 ° C.
Nota: 0,2 mL parede fina listra-8 PCR tubos de centrifuga em 7500 x g e placas de 96 poços a 800 x g nas etapas a seguir.
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Célula única colheita e Lise.
- Escolha FACS classificados células únicas Ins1-RFP+ no buffer de FACS em 8-tira da polimerase usando uma pipeta capilar µm de 30 – 40, ou manualmente diretamente classificar células únicas Ins1-RFP+ em placas de 96 poços. O volume que contém uma única célula é considerado menos de 0.3 μL.
Nota: Uso frente dispersão altura (FSC-H) vs encaminhar área de dispersão (FSC-A) estratégia associada para a discriminação de gibão, FSC-H vs lado a área de dispersão (SSC-A) para resíduos e retenção de fluorescência para classificação de célula (Figura 3A-3C)+ Ins1-RFP. Para o método de colheita, classificar as células de destino em um tubo de 1,5 mL contendo 300 μL FACS buffer. A concentração final adequada é de 5 – 10 células/μL. Ajuste o volume de reserva de acordo. Para o método de coleta de placa, classificar uma única célula em cada poço de uma placa de 96 poços, seguindo o manual do instrumento. 7 , 13 - Vórtice de tubos ou placas para lisar as células e liberar o RNA. Centrifugar os tubos ou placas por 30 s a 4 ° C e imediatamente colocá-los no gelo.
Nota: As células podem ser armazenadas a-80 ° C durante uma semana.
- Escolha FACS classificados células únicas Ins1-RFP+ no buffer de FACS em 8-tira da polimerase usando uma pipeta capilar µm de 30 – 40, ou manualmente diretamente classificar células únicas Ins1-RFP+ em placas de 96 poços. O volume que contém uma única célula é considerado menos de 0.3 μL.
5. célula única cDNA amplificação
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Transcrição reversa (RT).
- Descongele os reagentes RT (tabela 1) no gelo.
- Incubar as amostras a 72 ° C por 3 min e colocar imediatamente os tubos ou placas no gelo pelo menos 1 min. brevemente centrifugar os tubos ou placas por 30 s a 4 ° C.
Nota: Use um termociclador com uma tampa de 105 ° C aquecida para incubação do todo. - Prepare a mistura de RT para todas as reações, conforme descrito na tabela 1.
- Dispense a 5.7 μL de mistura de RT para cada amostra para trazer o volume para um total de 10 μL. Delicadamente a mistura de vórtice e centrifugar por 30 s a 4 ° C.
- Colocar as amostras em um termociclador e iniciar o programa de RT da seguinte forma: 42 ° C por 90 min, 10 ciclos (50 ° C por 2 min, 42 ° C por 2 min), 70 ° C durante 15 min e espera a 4 ° C.
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Pré-amplificação por PCR.
- Descongele os reagentes PCR (tabela 2) no gelo.
- Prepare a mistura PCR para todas as reações, conforme descrito na tabela 2.
- Dispense 15 μL de mistura PCR para cada amostra, que contém as reações da primeira vertente. Delicadamente a mistura de vórtice e centrifugar por 30 s a 4 ° C.
- Colocar as amostras em um termociclador e iniciar o seguinte programa de PCR: 98 ° C por 3 min, 18 ciclos (98 ° C por 20 s, 67 ° C por 15 s, 72 ° C por 6 min), 72 ° C por 5 min e espera a 4 ° C.
Nota: O produto do PCR pode ser armazenado a 4 ° C para menos de uma semana ou a-20 ° C /-80 ° C por até 6 meses.
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Purificação do PCR.
- Adicione 25 μL de grânulos de purificação de DNA re-suspensos (1x) para cada amostra do passo anterior e mistura bem pelo vórtice. Em seguida, rapidamente gire o tubo ou placas à temperatura ambiente para coletar o líquido, mas evitar a liquidação de contas.
Nota: Equilibrar grânulos de purificação de DNA à temperatura ambiente por 15 min e vórtice cuidadosamente antes de usar. - Incube durante 5 min à temperatura ambiente.
- Lugar do tubo ou placa magnética em um apropriado ficar até que a solução é clara, em seguida, Retire cuidadosamente e descartar o sobrenadante.
- Adicionar 200 μL de etanol a 80% recentemente preparada para lavar os grânulos enquanto no suporte magnético, incube durante 30 s, então cuidadosamente remova e descarte a solução de etanol.
Nota: A solução de etanol 80% (vol/vol) deve ser preparada de cada vez. - Repita a etapa 5.3.4 para um total de duas lavagens.
- Cuidadosamente remova e descarte o restante da solução de etanol e ar seco as contas enquanto o tubo ou placa é o suporte magnético.
Nota: Evite ressecamento as contas para assegurar a eficiência máxima de eluição. - Adicione 11 μL de água nuclease livre para Eluir o alvo do DNA da missanga e misture bem por vórtice. Em seguida, rapidamente girar o tubo ou a placa e colocá-lo num suporte magnético até que a solução é clara. Transferi 10 μL da amostra para um tubo novo de PCR.
Nota: Se dímeros existirem após uma única rodada de purificação, baseada na deteção de distribuição do tamanho de cDNA, purifica novamente para remover os dímeros completamente. Os dímeros podem influenciar o cálculo de rendimento de cDNA, se permitido permanecer na amostra.
- Adicione 25 μL de grânulos de purificação de DNA re-suspensos (1x) para cada amostra do passo anterior e mistura bem pelo vórtice. Em seguida, rapidamente gire o tubo ou placas à temperatura ambiente para coletar o líquido, mas evitar a liquidação de contas.
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Verificação da qualidade do cDNA.
- Escolha aleatoriamente amostras para detectar o rendimento total do cDNA usando um dados.
- Avalie os níveis de expressão de gene marcador por PCR em tempo real (qPCR) (Figura 4E). Remova 1 μL da amostra para diluir 40 vezes e executar qPCR usando uma placa de 384. Prepare a mistura de qPCR conforme descrito na tabela 3. Condições de ciclismo: 95 ° C por 10 min, 45 ciclos (95 ° C, durante 10 s, 60 ° C durante 15 s, 72 ° C por 15 s).
- Escolha aleatoriamente amostras para detectar a distribuição de tamanho usando um instrumento paralelo eletroforese capilar.
6. construção de biblioteca de cDNA
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Reação de Tagmentation pelo transposase Tn5.
- Detecta o rendimento total do cDNA de qPCR-selecionado células da etapa 5.4.2 usando um dados. Uso 2 ng de cDNA como matérias-primas.
- Descongele os reagentes da reação tagmentation (tabela 4) no gelo.
- Preparar a reação de tagmentation em um tubo PCR 0,2 mL parede fina listra-8, conforme descrito na tabela 4e misturar cuidadosamente pelo vórtice. Em seguida, rapidamente spin para baixo a solução à temperatura ambiente.
- Incubar as amostras a 55 ° C por 10 min e manter a 4 ° C.
- Imediatamente adicione 2 μL de 5 x TS para cada amostra contendo o tagmented DNA para parar a reação. Misturar cuidadosamente pelo vórtice e então rapidamente spin para baixo a solução à temperatura ambiente.
- Incube a mistura durante 5 min à temperatura ambiente. O DNA deve ser processado imediatamente para o enriquecimento final do PCR.
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Amplificação de fragmentos de adaptador-ligados.
- Descongele os reagentes PCR (tabela 5), no gelo.
- Prepare a mistura PCR de enriquecimento, como descrito na tabela 5e misturar cuidadosamente pelo vórtice. Em seguida, rapidamente spin para baixo a solução à temperatura ambiente.
- Realizar o PCR usando o seguinte programa: 72 ° C por 10 min, 98 ° C por 30 s, 8 ciclos (98 ° C por 15 s, 60 ° C por 30 s, 72 ° C por 3 min), 72 ° C por 5 min e espera a 4 ° C.
Nota: O número de ciclos depende da quantidade de DNA de biblioteca esperado.
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Purificação de PCR com seleção de tamanho.
- Adicione 14 μL de grânulos de purificação de DNA re-suspensos (0,7 x) para cada amostra da etapa anterior e mistura bem pelo vórtice. Em seguida, rapidamente gire o tubo à temperatura ambiente para coletar o líquido, mas evitar a liquidação de contas.
Nota: Equilibrar grânulos de purificação de DNA à temperatura ambiente por 15 min e vórtice cuidadosamente antes de usar. - Incube durante 5 min à temperatura ambiente.
- Colocar o tubo em um carrinho magnético apropriado até que a solução é clara, cuidadosamente transferir o sobrenadante para uma nova tira do tubo e descartar a listra de tubo anterior.
- Adicionar 3 μL de grânulos de purificação de DNA re-suspensos (0,15 x) para cada amostra na listra do tubo e misture bem por vórtice. Em seguida, rapidamente gire o tubo à temperatura ambiente.
- Incube durante 5 min à temperatura ambiente.
- Lugar do tubo ou placa magnética em um apropriado ficar até que a solução é clara, em seguida, Retire cuidadosamente e descartar o sobrenadante.
- Adicionar 200 μL de etanol a 80% recentemente preparada para lavar os grânulos enquanto no suporte magnético, incube durante 30 s, então cuidadosamente remova e descarte a solução de etanol.
Nota: A solução de etanol 80% (vol/vol) deve ser preparada de cada vez. - Repita a etapa 6.3.7 para um total de duas lavagens.
- Cuidadosamente remova e descarte o restante da solução de etanol e ar seco as contas enquanto o tubo ou placa é o suporte magnético.
Nota: Evite ressecamento as contas para assegurar a eficiência máxima de eluição. - Adicione 11 μL de água nuclease livre para Eluir o alvo do DNA da missanga e misture bem por vórtice. Em seguida, rapidamente girar o tubo ou a placa e colocá-lo num suporte magnético até que a solução é clara. Transferi 10 μL da amostra para uma nova faixa de tubo.
- Adicione 14 μL de grânulos de purificação de DNA re-suspensos (0,7 x) para cada amostra da etapa anterior e mistura bem pelo vórtice. Em seguida, rapidamente gire o tubo à temperatura ambiente para coletar o líquido, mas evitar a liquidação de contas.
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Verificação da qualidade da biblioteca de cDNA final.
- Medir a concentração de cada biblioteca usando um dados e verificar a distribuição de tamanho usando um instrumento paralelo eletroforese capilar.
Nota: O rendimento do ADN é normalmente entre 15-25 ng para cada biblioteca. Os fragmentos que variam de 250 bp para 450 bp será observado. Se dímeros permanecem após a purificação, como confirmado pela verificação de distribuição de tamanho, purifica com 1 x grânulos de purificação de DNA, mais uma vez.
- Medir a concentração de cada biblioteca usando um dados e verificar a distribuição de tamanho usando um instrumento paralelo eletroforese capilar.
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Pool de biblioteca
- Baseado no tamanho aproximado de fragmento, quantidades iguais de pool de DNA de cada amostra, garantindo que nenhum deles contêm as mesmas combinações de adaptadores N6XX e N8XX.
7. sequenciamento de DNA
- Bibliotecas de código de barras assunto para sequenciamento de único-extremidade 51 bp usando um sistema de sequenciamento de alto rendimento. Realize o sequenciamento seguindo o protocolo do fabricante. A profundidade de sequenciamento de cada célula é de aproximadamente 1 milhão lê em média8, pelo menos 0,5 milhões lê por célula14.
8. análises de bioinformática
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Avaliação da qualidade de sequenciamento e alinhamento.
- Avaliar a qualidade das leituras sequenciais usando FastQC (v0.11.3)15 , com os seguintes parâmetros: "fastqc - extrato -o output_dir input_fastq".
- Mesclar o genoma do rato com as ERCC sequências usando o comando "cat mm10.fa ERCC.fa > mm10_ERCC.fa".
- Construir bowtie2 índice de16 (v2.2.5) com os seguintes parâmetros: "bowtie2-compilação mm10_ERCC.fa mm10_ERCC".
- Alinhar as leituras usando tophat2 (2.1.0)17 com os seguintes parâmetros: "tophat2 -o output_dir -G gene.gtf - transcriptoma-índice trans_index mm10_ERCC input_fastq".
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Quantificar os níveis de expressão do gene.
- Contagem mapeada lê para cada gene usando HTSeq (v 0.6.0)18 com os seguintes parâmetros: ' htseq-contagem - f bam - r pos -s não - um 30 gene.gtf accepted_hits.bam > read_count.txt '.
- Normalize os níveis de expressão do gene para transcrições por milhão (TPM)19.
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Controle de qualidade das células.
- Excluir células com menos de 0,5 milhões de leituras mapeadas ou menos de 4.000 genes (TPM > 1).
Nota: o critério de exclusão depende os tipos de células e profundidade de sequência. - Manter células expressando marcadores endócrinos (por exemplo, Ins1 para as células β, Gcg para células α) e excluir células expressando marcadores não-endócrina (por exemplo, Spi1 para leucócitos).
- Excluir células com menos de 0,5 milhões de leituras mapeadas ou menos de 4.000 genes (TPM > 1).
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Análise de componentes principais (PCA)
- Identifica genes altamente variáveis de acordo com o ERCC espiga-ins, como descrito anteriormente,20.
- Executar o PCA usando a função "PCA" no R pacote FactoMineR (v1.31.4)21, com log2(TPM + 0.1) de genes altamente variáveis.
- Visualizar os resultados da PCA com ggplot2 (v 2.0.0)22.
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Hierárquica de clustering.
- Identifica os genes com as mais alta cargas de componente principal (PC) usando a função "dimdesc" FactoMineR (v1.31.4)21.
- Executar a clusterização hierárquica usando a função "heatmap.2" no R pacote gplots (v 3.0.1)23, com log2 (TPM + 1) valores relativos do PC alta carga de genes.
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Representative Results
Pancreases foram dissecados de ratos embrionários, Neonatais e pós-natal (Figura 2A e 2B). Para os ratos mais velhos que pós-Natal dia 18, o efeito digestivo depende do grau de perfusão; Portanto, a injeção é o passo mais importante para isolamento ilhéu (Figura 2-2E e tabela 6). Tanto colagenase foi injetado como era possível preencher o pâncreas durante esta etapa. O pâncreas totalmente inflado é mostrado na Figura 2D. Se a perfusão não é bem sucedida (Figura 2E), mas a amostra é preciosa, o pâncreas pode ser rasgado em pedaços pequenos para digestão suficiente mais tarde.
Após a perfusão, o tecido pancreático foi digerido em pedaços pequenos para liberar ilhotas (Figura 2F). Para encurtar o tempo de classificação FACS, nós enriquecido as células endócrinas escolhendo as ilhotas com antecedência. O tamanho dos ilhéus pode variar dependendo da idade do rato e a intensidade de digestão. Ocasionalmente, os ilhéus não são redondos em forma. Ilhéus devem ser selecionados de acordo com a cor e estado compacto (Figura 2 e tabela 6). Se a tensão de rato transgênico tem um gene repórter, como GFP ou RFP para células endócrinas, os ilhéus também poderiam ser escolhidos sob um microscópio de fluorescência.
Células Ins1-RFP+ foram purificadas por FACS classificação (Figura 3A-3-C), e então células únicas foram escolhidas usando uma pipeta capilar para a célula única RNA-seq (Figura 3D). CDNA amplificado com sucesso deve ter um comprimento total acima de 500 bp e ser enriquecido de 1,5 kb a 2 kb. Além disso, normalmente há um enriquecimento de bp de 500-600 do cDNA observado nas células Ins1-RFP+ , que podem representar as transcrições de insulina (Figura 4A). No entanto, tem havido algumas situações anormais observados10 (quadro 6). Por exemplo, os fragmentos de cDNA perto de 100 bp são dímeros de cartilha (Figura 4B), que são geralmente causados por primers excessivos, que devem ser removidos, repetindo a etapa de purificação de DNA. A existência de dímeros de primeira demão pode influenciar os cálculos de cDNA total rendimentos, que são usados para a construção de biblioteca a seguir. Os fragmentos de cDNA entre 100 bp e 500 bp geralmente representam degradado cDNA (Figura 4), que é causado por problemas status ou reagente celular ruim, como a contaminação de RNase. Sob esta condição, devemos identificar a causa da degradação do DNA e excluir o distúrbio. Por exemplo, para garantir o status de boa célula, tecidos devem ser digeridos e células devem ser enviadas rapidamente e suavemente, e operações devem ser realizadas com cautela para evitar qualquer tipo de poluentes.
Após a purificação das bibliotecas de cDNA para sequenciamento, obtivemos fragmentos de cDNA de tamanhos diferentes, seguindo as instruções para a adição de diferentes proporções de grânulos de purificação de DNA para a amostra. Por exemplo, podemos obter o cDNA que variam de 250 bp para 450 bp por adicionando x 0,7 e 0,15 x grânulos de purificação de DNA para a primeira e segunda rodadas da purificação, respectivamente (Figura 4). Esta etapa tem uma elevada taxa de sucesso. No entanto, se existem fragmentos de aproximadamente 100 bp, sugere-se para purificar as bibliotecas novamente com 1 x grânulos de purificação de DNA para remover os dímeros (quadro 6). Os dímeros distorção a quantificação de DNA e influenciarão a amostra pooling de resultados, que resulta na aquisição irregular de dados de cada amostra.
Foram analisados os dados de sequenciamento com abordagens de Bioinformática (Figura 5A). Os escores de qualidade de sequenciamento devem ser maiores que 30 durante o sequenciamento de avaliação de qualidade (Figura 5B). Após o alinhamento, 80-90% de leituras são esperados para ser mapeado para o genoma de referência. Para obter células de alta qualidade para análises a jusante, podemos excluir células com menos de 0,5 milhões de leituras mapeadas ou com menos de 4.000 detectados genes (Figura 5 e 5 D). Depois de PCA e clustering hierárquico, nós caracterizado de diferentes grupos de células e identificados os genes que forma heterogénea foram expressos em diferentes grupos de8.
Figura 1: visão geral esquemática para célula única RNA-seq de células endócrinas no pâncreas de rato. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: pâncreas dissecação, perfusão e Ilhéu picking. (A) dissecação de tecido pancreático embrionário (inferior) de um embrião E17.5 (superior). A linha pontilhada amarela demarca o tecido pancreático. Barra de escala = 1.000 µm. (B) dissecção de tecidos pancreáticos pós-natal (à direita) de um rato de P10 (à esquerda). Barra de escala = 1.000 µm. (C-D), o tecido pancreático do mouse P60 antes (C) e depois (D) da perfusão. A linha pontilhada amarela demarca o tecido pancreático. Seta branca indica a vesícula biliar. (E) o tecido pancreático parcialmente perfundido de rato P60. Seta vermelha indica a área bem perfundida do pâncreas. Setas azuis indica as áreas mal perfundidas do pâncreas. Tecido (F) o pâncreas antes (superior) e depois da digestão de colagenase (inferior). (G) setas apontam para os ilhéus que foram lançados a partir de tecido pancreático colagenase digerido. Barra de escala = 200 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: escolher manualmente as células com 30-40 µm pipeta capilar sob um microscópio. (A-C) Passo a passo FACS gating para classificação de células Ins1-RFP+ . (D) o brilhante círculos indicam as células e o tubo é uma pipeta capilar. Escolher as células com melhor morfologia (seta) e ignorar as células em cluster (seta). Barra de escala = 200 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Deteção de qualidade da distribuição de tamanho de cDNA e biblioteca de células Ins1-RFP+ por um instrumento de eletroforese capilar paralela. Resultado de (A), o representante do cDNA com sucesso pre-amplificado. Normalmente, o perfil de cDNA deve estar acima de 500 bp com um pico de kb ~1.5–2. (B) o resultado representativo do cDNA pre-amplificado com um pico de dímero da primeira demão. O pico de dímero da primeira demão é de aproximadamente 100 BP (C) o perfil do cDNA pre-amplificado com fragmentos entre 100 bp e 500 bp indica a possibilidade de degradação do cDNA. (D) a distribuição de tamanho de cDNA biblioteca variando entre 250 bp e 450 seguinte de bp, as etapas de purificação mencionadas no presente protocolo. (E) a expressão níveis de Ins2 nas bibliotecas de cDNA por qPCR (à esquerda) e parente dados de sequenciamento (à direita). Os x-axes representam distintas 8 amostras de célula única. O eixo y (à esquerda) representa ΔCt normalizado em relação a Gapdh (CtGapdh- CtIns2 + 6) e o eixo y (direita) representa o nível de expressão normalizada de Ins2 relativo Gapdh (log2(TPM Ins2 / TPMGapdh)). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: análises de Bioinformática de dados de célula única transcriptome. Pipeline de (A) de análises de Bioinformática. (B) sequenciamento escores de qualidade em todas as bases de leituras. (C) distribuição de contagem leitura mapeada. (D) distribuição de contagem de gene detectado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Componente de | Volume (µ l) |
| Transcriptase reversa (200 U / µ l) | 0,5 |
| Inibidor de RNase | 0.25 |
| Primeiro-costa amortecedor (5x) | 2 |
| TDT (100 mM) | 0,5 |
| Betaína (5m) | 2 |
| MgCl2 (1 M) | 0,06 |
| TSO (100 ΜM) | 0.1 |
| Água livre de nuclease | 0,29 |
| Total | 5.7 |
Tabela 1: Reagente RT misturar componentes numa reação 5,7 µ l de cada amostra.
| Componente de | Volume (µ l) |
| Reação de primeiro-costa | 10 |
| DNA polimerase (2x ReadyMix) | 12.5 |
| É iniciadores de PCR (10 µM) | 0.25 |
| Água livre de nuclease | 2.25 |
| Total | 25 |
Tabela 2: Reagente de Pre-amplificação do PCR mix componentes numa reação 25 µ l de cada amostra
| Componente de | Volume (µ l) |
| SYBR Green Master Mix | 5 |
| Cartilhas (5 µM) | 0,5 |
| Água livre de nuclease | 2.5 |
| cDNA | 2 |
| Total | 10 |
Tabela 3: reagente qPCR misturar componentes numa reação 10 µ l utilizando uma placa padrão de 384.
| Componente de | Volume (µ l) |
| 5 x TTBL | 1.6 |
| 2 ng cDNA | Variável |
| ddH2O | Variável |
| TTE Mix V5 | 2 |
| Total | 8 |
Tabela 4: Reagente Tagmentation misturar componentes em uma reação de µ l 8 para cada amostra.
| Componente de | Volume (µ l) |
| ddH2O | 1.6 |
| Produto da etapa anterior | 10 |
| 5 x guia | 4 |
| N6XX | 2 |
| N8XX | 2 |
| TAE | 0.4 |
| Total | 20 |
Tabela 5: Enriquecimento do PCR componentes de mistura de reagentes em uma reação de 20 µ l de cada amostra.
| Passo | Problema | Possibilidade | Solução |
| 1.3.4 | Deslizamento das braçadeiras | A superfície exterior do intestino é molhada causado pela existência da pequena quantidade de intersticial fluido e collegenase leakness | Delicadamente, trocar a parede do duodeno e outras paredes do órgão na cavidade abdominal com cotonetes |
| 1.3.6 | Ruptura de intestino | Pressão do líquido é elevada no intestino | Diminuir a velocidade de injeção |
| 2.6 | Ilhéus manter tecido exócrino quando escolher Ilhéus | Digestão de insuficiente | Prolongar a duração da digestão e força a tremer |
| 5.3 | O rendimento de cDNA é baixo após amplificação por PCR | As células estão em mau estado | Manter as células fresco e em boas condições |
| 5.4 ou 6.4 | Dímeros de primeira demão podem ser vistos | Primeiras demão excessivas | Purificar o cDNA mais uma vez com grânulos de purificação de DNA (0.8:1 ou proporção 1:1) |
| 5.4 | CDNA degradado após amplificação por PCR | Má qualidade de células ou reagentes contaminados | Manter as células em boas condições ou alterar os reagentes |
| 6.3 | A quantidade de DNA é baixa após a construção da biblioteca | Muito poucos ciclos PCR ou a qualidade do cDNA não é bom | Aumentar o número de ciclos ou garantir a qualidade do cDNA antes da construção da biblioteca |
Tabela 6: solução de problemas.
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Discussion
Neste protocolo, temos demonstrado um método eficaz e fácil de usar para estudar os perfis de expressão de célula única das células β do pâncreas. Esse método pode ser usado para isolar células endócrinas de pancreases embrionárias, Neonatais e pós-natal e realizar análises de transcriptomic de célula única.
O passo mais crítico é o isolamento das células β único em boas condições. Totalmente perfundidos pancreases respondem melhor à digestão subsequente. Insuficiente perfusão, que normalmente ocorre no pâncreas dorsal, resultará em um rendimento de ilhéu de baixo. Após a perfusão, o tempo de digestão e tremendo intensidade requerem atenção especial. Digestão excesso, resultante dos tempos de incubação longa e vigorosa agitação, pode quebrar as ilhotas em pedaços. Insuficiente digestão não vai separar completamente os ilhéus dos tecidos adjacentes. Após a digestão do pâncreas, os ilhéus foram purificados por colheita de mão em vez de centrifugação gradiente de densidade. Apesar de centrifugação gradiente de densidade pode enriquecer ilhotas, muitas pequenas ilhotas ou ilhotas conectadas com tecido acinares equivocadamente são descartadas. Tente evitar escolher tecido acinares, que pode causar a digestão do trypsin ineficiente e reduzir a pureza das células β.
Réplicas biológicas independentes são necessárias para distinguir efeitos biológicos de variabilidade e lote. Se dois biológico Replica tem um padrão semelhante no PCA e incluem subgrupos semelhantes em resultados de clustering, estas amostras podem revelar confiança variabilidade biológica. Caso contrário, réplicas biológicas adicionais são necessários para confirmar os resultados. Para um órgão metabólico como o pâncreas, pode representar o estado de célula associado com o relógio circadiano24 diferenças de lote. Para resolver este problema, recomendamos que todas as amostras em coleta na mesma hora do dia.
A limitação dessa abordagem é a baixa taxa de transferência porque nós temos que construir uma biblioteca para cada célula. Devido à excessivos primers na reação, o cDNA antes e depois da construção da biblioteca geralmente deve ser purificado duas vezes para remover completamente o dímero da primeira demão. Estes processos são demorados. Recentemente, um protocolo modificado25 foi relatado que poderia resolver este problema em certa medida. Neste protocolo, código de barras de célula específica rótulos fragmentos de cDNA durante a etapa de transcrição reversa. Portanto, o cDNA de cada célula podem ser agrupado e então ser purificado, seguido pela construção da biblioteca. Esta modificação aumenta significativamente a taxa de transferência de construção da biblioteca. No entanto, este método modificado é menos sensível e detecta menos genes por célula. Além disso, esse método é um 3' contando o método com a reduzida cobertura de leitura. Portanto, o Smart-seq2 ainda é o método mais adequado para o desenvolvimento do pâncreas.
A preparação do pâncreas de outras espécies pode ser diferente. Para o pâncreas humana, os ilhéus podem ser isolados anteriores protocolos26,27a seguir. Em seguida, as ilhotas isoladas podem ser dissociadas em células únicas28 e realizar análises de célula única usando esse método. Esse método pode ser amplamente aplicado à pesquisa de desenvolvimento do pâncreas de mamíferos, doenças e regeneração.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Agradecemos o centro nacional para Ciências da proteína, Beijing (Peking University) e do centro de Pequim-Tsinghua para a plataforma de computação de Ciências da vida. Este trabalho foi financiado pelo Ministério da ciência e tecnologia da China (2015CB942800), Nacional Natural Science Foundation da China (31521004, 31471358 e 31522036) e financiamento de Pequim-Tsinghua centro para Ciências da vida para R.X.-C.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase P | Roche | 11213873001 | |
| Trypsin-EDTA (0.25 %), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200114 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30071.03 | |
| Dumont #4 Forceps | Roboz | RS-4904 | |
| Dumont #5 Forceps | Roboz | RS-5058 | |
| 30 G BD Needle 1/2" Length | BD | 305106 | |
| Stereo Microscope | Zeiss | Stemi DV4 | |
| Stereo Fluorescence microscope | Zeiss | Stereo Lumar V12 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap | BD-Falcon | 352235 | |
| 96-Well PCR Microplate | Axygen | PCR-96-C | |
| Silicone Sealing Mat | Axygen | AM-96-PCR-RD | |
| Thin Well PCR Tube | Extragene | P-02X8-CF | |
| Cell sorter | BD Biosciences | BD FACSAria | |
| Capillary pipette | Sutter | B100-58-10 | |
| RNaseZap | Ambion | AM9780 | |
| ERCC RNA Spike-In Mix | Life Technologies | 4456740 | |
| Distilled water | Gibco | 10977 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| dNTP mix | New England Biolabs | N0447 | |
| Recombinant RNase Inhibitor | Takara | 2313 | |
| Superscript II reverse transcriptase | Invitrogen | 18064-014 | |
| First-strand buffer (5x) | Invitrogen | 18064-014 | |
| DTT | Invitrogen | 18064-014 | |
| Betaine | Sigma-Aldrich | 107-43-7 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 7786-30-3 | |
| Nuclease-free water | Invitrogen | AM9932 | |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2x) | KAPA Biosystems | KK2601 | |
| VAHTS DNA Clean Beads XP beads | Vazyme | N411-03 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32854 | |
| AceQ qPCR SYBR Green Master Mix | Vazyme | Q121-02 | |
| TruePrep DNA Library Prep Kit V2 for Illumina | Vazyme | TD502 | Include 5x TTBL, 5x TTE, 5x TS, 5x TAB, TAE |
| TruePrep Index Kit V3 for Illumina | Vazyme | TD203 | Include 16 N6XX and 24 N8XX |
| High Sensitivity NGS Fragment Analysis Kit | Advanced Analytical Technologies | DNF-474 | |
| 1x HBSS without Ca2+ and Mg2+ | 138 mM NaCl; 5.34 mM KCl 4.17 mM NaHCO3; 0.34 mM Na2HPO4 0.44 mM KH2PO4 |
||
| Isolation buffer | 1 × HBSS containing 10 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 5 mM Glucose, pH 7.4 | ||
| FACS buffer | 1 × HBSS containing 15 mM HEPES, 5.6 mM Glucose, 1% FBS, pH 7.4 | ||
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S5136 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Oligo-dT30VN primer | 5'-AAGCAGTGGTATCAA CGCAGAGTACT30VN-3' |
||
| TSO | 5'-AAGCAGTGGTATCAAC GCAGAGTACATrGrG+G-3' |
||
| ISPCR primers | 5'-AAGCAGTGGTAT CAACGCAGAGT-3' |
||
| Gapdh Forward primer | 5'-ATGGTGAAGGTC GGTGTGAAC-3' |
||
| Gapdh Reverse primer | 5'-GCCTTGACT GTGCCGTTGAAT-3' |
||
| Ins2 Forward primer | 5'-TGGCTTCTTC TACACACCCA-3' |
||
| Ins2 Reverse primer | 5'-TCTAGTTGCA GTAGTTCTCCA-3' |
References
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