Summary
Stabiele koolstof en zuurstof isotoop analyse van mens en dier tandglazuur carbonaat is gebruikt als een proxy voor afzonderlijke voeding en milieu wederopbouw. Hier, wij bieden een gedetailleerde beschrijving en visuele documentatie van bulk en sequentiële tooth glazuur bemonstering alsmede voorbehandeling van archeologisch en paleontologisch monsters.
Abstract
Stabiele koolstof en zuurstof isotoop analyse van mens en dier tandglazuur carbonaat is toegepast, in paleodietary, paleoecological, en paleomilieu onderzoek uit recente historische perioden terug naar meer dan 10 miljoen jaar geleden. Bulk benaderingen bieden een representatieve steekproef voor de periode van glazuur mineralisatie, terwijl opeenvolgende monsters binnen een tand dieet- en milieu wijzigingen tijdens deze periode bijhouden kunnen. Hoewel deze methodologieën zijn algemeen toegepast en beschreven in Archeologie, ecologie en paleontologie, zijn er geen expliciete richtlijnen om te helpen bij de keuze van apparatuur van het laboratorium nodig en grondig beschrijven gedetailleerde laboratorium bemonstering en protocollen. In dit artikel documenteren we tekstueel en visueel, het gehele proces van monsterneming door voorbehandeling en diagenetic screening de methodologie breder ter beschikking te stellen onderzoekers overwegen de toepassing in een verscheidenheid van laboratorium-instellingen.
Introduction
Stabiele koolstof en zuurstof isotoop analyses van tand email carbonaat is gebruikt om te studeren voorbij menselijke inname, spenen, mobiliteit, alsmede faunistische afhankelijkheid van de vegetatie, het verkeer van dieren en vee foddering. Deze toepassingen zijn uitvoerig besproken en geëvalueerd voor allerlei milieuomstandigheden, met vermelding van de gevolgen van lokale dorheid, temperatuur, waterbronnen en vegetatie composities1,2, 3,4,5,6. De verscheidenheid van mogelijke toepassingen in Archeologie en paleontologie, alsook het goede behoud van tand email carbonaat, heeft het een aantrekkelijk materiaal voor stabiele isotoop werk3gemaakt. Methoden van bemonstering, voorbehandeling, en diagenese screening worden kort beschreven in een aantal eerdere publicaties1,7. Grondige verbale en visueel demonstraties blijven echter grotendeels niet beschikbaar is, vooral voor mensen buiten Archeometrie laboratoria en tussen laboratorium groepen met beperkte financiële middelen waar de interesse in het gebruik van deze techniek groeit 5.
Tandglazuur is voornamelijk samengesteld uit hydroxyapatiet (bioapatite) kristalaggregaten8 groter dan die in het bot, waardoor het beter bestand tegen post mortem diagenetic Ionische vervangingen en besmetting3. Moderne studies hebben aangetoond dat stabiele koolstof-isotoop (δ13C) metingen van faunistische tand betrouwbaar record dierlijke voeding en gedrag9,10 geëmailleerde. De stabiele zuurstof isotoop (δ18van O) waarde van tandglazuur wordt bepaald door de zuurstof isotopische samenstelling van geconsumeerde water, waarin water in plant en dierlijk voedsel, drinkwater, ademhaling, evenals verschillende milieueffecten op het water die kunnen leiden tot verdere isotopische fractionering (bv., droogte, temperatuur, hoogte, regenval bedrag, continentale locatie)11. Dit is een populaire methode voor dieet- en milieu wederopbouw gemaakt in paleontologische, archeologisch en paleoecological onderzoek.
De periode van de vorming van de glazuur van de tand is relatief kort (jaar) en verschilt afhankelijk van de tand worden bemonsterd. Voor de mens, eerste molaire emaille mineralizes tussen geboorte en 3 jaar, premolars mineralize tussen de 1,5 en 7 jaar oud, tweede kiezen mineralize tussen 2,5 en 8 jaar oud en derde kiezen mineralize tijdens de adolescentie, tussen 7 en 16 jaar12 . Gegeven dat tandglazuur vormen stapsgewijs over haar periode van vorming, kan worden bemonsterd in bulk langs de gehele groei as of bemonsterd opeenvolgend te onderzoeken van de veranderingen in dieet en omgeving die hebben plaatsgevonden tijdens de periode van de formatie13 . Chronologisch bestelde dieet veranderingen binnen een bepaalde tand is waarneembaar voor de mens en andere dieren1,14, voorlichting over Inter jaarlijkse variatie van de seizoensgebonden en dieet.
Terwijl glazuur meestal resistent tegen diagenese is, isotopische wijzigingen als gevolg van de begrafenis milieu zijn mogelijk en15,16, waardoor experimentele controles en voorbehandeling keuzes nuttig zijn waargenomen. Hoewel het is niet de enige beschikbare methode, heeft Fourier transform infrarood spectroscopie (FTIR), met name in verzendmodus verzwakt, ontpopt als een snel, goedkoop, en relatief toegankelijk methode voor de beoordeling van de taphonomic wijziging van tandglazuur, met name in paleontologische contexten17,18,19,20. Gedetailleerde protocollen en opname normen blijven echter relatief ontoegankelijk voor veel mensen buiten het gebied van de geochemie of materiaal wetenschap.
Reactietijden en de chemische stoffen in de voorbehandeling van tandglazuur door onderzoekers in dienst ook verschillen in de literatuur, vaak met beperkte aandacht over de vraag wat deze variabiliteit om stabiele koolstof en zuurstof isotoop waarden van het monster21 doen kan ,22. Wij rapporteren hier, een aanpak dat gebruik verdund azijnzuur (0.1 M) voor de voorbehandeling van glazuur poeder monsters. Echter, gezien het feit dat de verschillen in isotopische metingen, als gevolg van de voorbehandeling relatief kleine voor tandglazuur zijn, is het best voor de onderzoekers te volgen van de protocollen voor datasets waarmee ze willen hun gegevens vergelijken met11. Bovendien, waar kleine opeenvolgende monsters zijn genomen, met name op de monsters van het Holoceen, geen voorbehandeling kan worden gekozen (na diagenetic proeftoetsen) monster verspilling.
Hoewel de methoden we hier rapporteren niet nieuw, om onze kennis absoluut, is dit de eerste keer dat een grondige geschreven en visuele documentatie van bulk en sequentiële bemonstering, voorbehandeling keuzes en diagenetic selectievakje methoden (in de vorm van FTIR) om tand geëmailleerde zijn wijd beschikbaar gesteld aan een gevarieerd publiek van academische. Terwijl wij hopen dat onze inspanningen zal deze aanpak gemakkelijker toegankelijk maken voor een groter aantal personen en laboratoria, onderzoekers die wilt toepassen en publiceren deze techniek moet rekening houden met minimale rapporteringstandaarden, diagenetic overwegingen, en presentatie eisen overviewed elders20, alsmede potentiële interpretatieve complexiteiten die uniek zijn voor de regio van hun studie, taxa geanalyseerd, en tijd periode5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het volgende protocol volgt de richtsnoeren van het licht isotoop massaspectrometrie laboratorium aan het Max Planck Instituut voor de wetenschap van de menselijke geschiedenis. Passende ethiek machtigingen van nationale en internationale commissies moeten worden gezocht voor analyses waarbij bedreigde modern of historisch faunistische exemplaren, en voor het gebruik van archeologische en faunistische materiaal van belang zijn voor de hedendaagse belanghebbenden . In deze paper waren de gebruikte monsters archeologische en fossiele exemplaren. Geen levende mensen werden gebruikt in deze studie en volledige ethische, institutionele en gouvernementele machtigingen voor elke destructieve analyse zijn opgedaan.
1. bemonstering bulk
Opmerking: Voor mens en dier, de basismethode van bulk tooth glazuur bemonstering is de toepassing van een boor op de buccale rand van de tand.
- Reinig de buitenkant van de tand (~0.1 mm) met behulp van een aluminium shot blaster of door zachte schuren met behulp van de boor set-up. Gebruik een hand-held boor met een schone diamant-tipped boor beetje (zie hieronder), zelfs vorm, verbonden via een chuck de boor set-up. Zorgen dat zachte en zelfs schuren wordt uitgevoerd als een groove evenwijdig aan de aslijn van de gehele groei (Figuur 1 en Figuur 2).
- Probeer, indien mogelijk, aan de methode toepassen op de hetzelfde gedeelte van de tand voor elke mens of dier bemonsterd.
Opmerking: In menselijke paleodietary onderzoek, derde kiezen zijn over het algemeen favoriet als vertegenwoordiger van een te late juveniele/volwassene dieet terwijl eerste kiezen worden vermeden vanwege het spenen effecten23. De voorkeur tand voor elke taxon, en de periode van het leven vertegenwoordigd, verschilt naargelang de beschikbare monsters en vraag bestudeerde. - Boren in een goed geventileerde ruimte terwijl het dragen van een masker om te voorkomen dat de inhalatie van tand email poeder. Draag bril ter bescherming van de ogen. Wees ervan bewust dat de hoeveelheid monster poeder geboord afhankelijk van de uitrusting voor analyse, voorbehandeling protocol en grootte van de tand variëren zal. Boor met lage snelheid om te voorkomen dat de verwarming van het monster.
Opmerking: Ongeveer 4-8 mg monster poeder is een passende doelstelling voor meerdere analyses met behulp van een online gas-systeem voor voorbereiding en invoering voor isotoopverhouding massaspectrometrie en diagenetic testen. Wees ervan bewust dat de gekozen boor snelheid van de kwetsbaarheid van het monster afhangen zal en een zekere mate van trial and error vergt. In het algemeen, zijn twee van de vijf bars van kracht op een hand-held boor, voldoende. Boren van de tand poeder over een stuk van schoon aluminiumfolie of met een gewicht van papier. - Verzamel de resulterende glazuur poeder en breng dit in een 1,5 mL micro-centrifuge buis die zijn getarreerde heeft op een naar behoren nauwkeurige balans vóór het boren. Label elke buis met de aanduiding van de steekproef (Figuur 3). Het monster nummers en glazuur gewicht opnemen in een laboratorium-notebook, alsmede een elektronische databank.
- Vóór het boren van elke nieuwe tand, reinig de gebruikte boor bits eerst met behulp van 0.5 M HCl op een robuust weefsel. Daarna wassen de boor met een organische oplosmiddelen (zoals aceton, methanol of ethanol) met behulp van een robuust weefsel.
- Na een boren zittend, schoon de werkruimte grondig met behulp van een speciale stofzuiger, of een stoffer en blik borstel. Veeg de bemonstering ruimte met methanol. Vacuüm of licht spray de boor met gecomprimeerde lucht te verwijderen van stof en monster poeder tussen de monsters.
2. opeenvolgende monsternemingen
Opmerking: Sequentiële steekproeven kan worden benaderd in een verscheidenheid van vormen en zal afhangen van de taxon wordt bemonsterd, de grootte van de tand, evenals de gewenste temporele resolutie.
- Reinigen van het oppervlak van de tand worden bemonsterd door het verwijderen van een zeer dunne laag (~0.1 mm) buitenste tandglazuur.
- Boor de monsters langs de buccale oppervlak loodrecht op de as van de groei van de tand, loopt van de kruising van de wortel glazuur naar de top van de kroon. Boren van horizontale banden loodrecht op de as van de groei, met elk monster resulterend in een 1-2 mm brede groef over de glazuurlaag (Figuur 1 en Figuur 4). Zorg om te voorkomen dat boren door het glazuur in het dentine zoals het het monster en de resulterende meting vervuilen zou.
Opmerking: Het aantal genomen monsters zal variëren afhankelijk van de gewenste resolutie maar c. 10 vertegenwoordigt een passende doelstelling te bestuderen van de seizoensgebonden veranderingen in δ13C en δ18O waarden voor een hypsodont de grootte van gedomesticeerde runderen. - Kies de juiste boor voor elk monster, zoals de breedte van de bemonsteringsleiding wordt bepaald door de diameter van de boor.
- Gebruik een tuig set-up voor gevoelige tanden vereisen een groter aantal basismonsters (Figuur 2) (bv., menselijke tanden), evenals voor stabielere boren. Instellen van het tuig staan die in het bezit van de boor veilig, met de boor naar beneden wijzen.
Opmerking: Terwijl vier monsters kunnen gemakkelijk worden verkregen uit een permanente menselijke molar met behulp van een hand-held aanpak24, meer verfijnde bemonstering vereist een tuig of CO2 laser ablatie aanpak die niet zal hier14besproken. Een andere gemeenschappelijke benadering is het gebruik van een semi-automatische microsampling-25. - Houd de tand of hechten aan een klem. Druk op het tandglazuur tegen de boor en druk uitoefenen. Monsters worden geboord stapsgewijs langs de buccale oppervlak van de apex (occlusaal oppervlak) aan de basis van de kroon op de locatie van het glazuur de root-knooppunt (ERJ). Repliceren hetzelfde monster strategie meerdere keren boren elke opeenvolgende lijn parallel aan de vorige voorbeeldlijn boren. Gebruik een kleine cilindrische diamant boor voor gevoelige tanden, zoals schapen kiezen, met een diameter van 1 mm (Figuur 1 c).
- Meet de afstand van elke regel van de bemonstering van de ERJ met behulp van de remklauwen en noteer deze afstand voor een vergelijking.
- Volg stappen 1.3-1.6 hierboven.
Opmerking: Als kleine, gevoelige tanden worden geanalyseerd en voorbehandeling en diagenetic controle methoden worden niet toegepast, monsters zo klein als 1-4 mg levert betrouwbare resultaten op een on-line gas voorbereiding en invoering set-up voor carbonaat analyse. Gemodificeerde geautomatiseerd-perifere systemen kunnen vergemakkelijken het gebruik van nog lagere gewichten van de steekproef, maar onvermijdelijk worden beperkt door de hoeveelheid carbonaat in de bestudeerde glazuur (4 tot en met 5 wt %)26,27. Onderzoekers moeten raadplegen met het laboratorium waar monsters zijn gonna worden gemeten om te bepalen van de hoeveelheid monster nodig.
3. Fourier Transform infrarood spectrometrie/Attenuated totale reflectantie methode
- Stellen voor de totale reflectantie verzwakt-methode, een monster kamer achtergrond, ofwel vacuüm of onder normale weersomstandigheden.
- Plaats ongeveer 1 mg van tandglazuur boven het kristal van de diamant in de monsterkamer met behulp van een spatel. Lagere en beveiligen van de monster post totdat er een stevige verbinding tussen de post, het monster en de traanplaat. Sluit de monsterkamer, met of zonder een vacuüm tot stand wordt gebracht, afhankelijk van de set-up of beschikbaarheid.
- Meet de FTIR spectra van het monster 64 keer voor het golfgetal variërend tussen 400 en 4.000 cm-1. Het gewenste aantal replicatieonderzoeken zal afhankelijk van de doelstellingen van de studie, hoewel de analyse van drie replicaten, liefst met verschillende aliquots wordt genomen en keerde daarna terug naar de huisvesting van het monster, microcentrifuge-buis voor robuuste resultaten zorgt.
- Reinig de spatel met methanol tussen elk aliquot en tussen elk monster.
- Het uitvoeren van een correctie van de basislijn met behulp van de beschikbare software. De software wordt automatisch afgetrokken van de monster kamer achtergrond uit de resulterende FTIR-profiel. Om te zorgen voor betere reproduceerbaarheid, moeten rekening worden gehouden met alleen glazuur spectra met een minimale absorptie van 0.06 voor de hoogste fosfaat band op ~1035 cm-1 .
- De aanwezigheid van de gemeenschappelijke secundaire verontreinigingen carbonaat calciet in alle monsters controleren door te controleren voor een piek in 711 cm-1.
- Na de analyse, zorgvuldig de monsters terug te keren naar hun microcentrifuge buizen met behulp van een spatel of zuig-apparaat en nemen op de volgende fase van de voorbehandeling of analyse.
- De ruwe golflengte en intensiteit gegevens exporteren als een CSV-bestand (of soortgelijke) en gebruiken voor het berekenen van de indices van belang (gebruikte indices zijn A-site fosfaat Index, B-site fosfaat Index, fosfaat kristalliniteit Index, Water-Amide op Index fosfaat, en CO3/PO4 index17,18,19) (tabel 1).
- Vergelijk de FTIR uit de fossiele of archeologisch monsters voortvloeit op de groeiende datasets van moderne faunistische tandglazuur nu beschikbaar in de literatuur19,20 te bepalen van de aard en de omvang van de diagenetic wijziging van de emaille bemonsterd.
4. eenvoudige azijnzuur (0.1 M) voorbehandeling
- Weeg het glazuur poeder voor elk monster in een buis van de microcentrifuge met behulp van een evenwicht zo nodig. Label de buis dienovereenkomstig. Emaille poeder moet grond in dezelfde mate, met deeltjes van een gelijkaardige grootte.
Opmerking: Veel onderzoekers gebruiken een oxiderende agent zoals verdund bleekwater (NaClO) of 30% waterstofperoxide (H2O2) te verwijderen van organische stoffen uit een monster en dit op dit punt moet worden toegevoegd. Niet alleen kan deze reagentia veranderen de stabiele koolstof en zuurstof isotoop waarden van een monster, maar spectra van bot collageen monsters in een on-line gassysteem voorbereiding en invoering aantonen dat het 100% fosforzuur in carbonaat gebruikt meting reageert niet met biologische monsters (Figuur 5), wat suggereert dat deze stap niet nodig is. - 0,1 mL 0,1 M azijnzuur (per 1 mg glazuur) aan elk monster met behulp van een precisiepipet toevoegen. Raak de monsters met de pipet. Als het monster en Pipetteer in contact komen, gebruik een nieuwe pipet voor het volgende monster te voorkomen van kruisbesmetting.
- Doorroeren, hetzij door schudden of een elektronische roerder (Figuur 3) en vervolgens laat de monsters te zitten voor 10 min. glazuur poeder mag niet worden overgelaten in azijnzuur gedurende langere tijd (> 4 h).
- Leg de monsters in een microcentrifuge voor 2 min bij 13.700 x g.
Opmerking: Een goedkoop alternatief is het gebruik van een mini centrifuge voor 4 min op 3.500 x g, die houdt van minder monsters maar is minder tijdrovend bij het omgaan met grote steekproef sets. - Wanneer het microcentrifuge-programma reageert, vervangt u het azijnzuur met 2 mL ultrazuiver water met behulp van een schone precisiepipet, dan microcentrifuge de monsters gedurende 2 minuten bij 13.700 x g.
- Wijzig het ultrazuiver water twee meer tijden, als voorheen, en testen voor neutraliteit. Verwijder de resterende vloeistof met behulp van een precisiepipet (zonder verstoring van de bovendrijvende substantie).
Opmerking: Een totaal van drie wast met ultrazuiver water is de standaard procedure om naar neutraliteit. Het monster moet worden gewassen tot neutraliteit is bereikt. - Gesneden vellen Parafilm (1 cm × 1 cm) en plaats op elke microcentrifuge buis. Maak een klein gaatje in het midden met een scherp voorwerp, zodat het monster op passende wijze droogt.
- Plaats de buizen in een bevriezing van de droger te verwijderen van alle resterende vloeistof.
Opmerking: Als een bevriezing van de droger niet beschikbaar, zachte oven is drogen (40 ° C) is ook een mogelijkheid en hoeft niet elke aantasting van de stabiele koolstof en zuurstof isotoop gegevens. - Eenmaal droog, de Parafilm verwijderen en sluit de deksels van de microcentrifuge. Zorg ervoor dat de buis labeling klopt en indien nodig opnieuw te schrijven.
Opmerking: Dit is de laatste fase vóór de opslag voor het wegen uit, die in laboratoria met beperkte middelen de laatste fase vóór de verdeling van de monsters voor analyse elders kunnen zijn.
5. wegen en meten van de monsters en standaarden
- Met behulp van een spatel, weeg ongeveer 2 mg glazuur poeder op een tin schijf op een evenwicht gevoelig voor 0,001 mg (Figuur 6). Breng zorgvuldig het monster in een flesje van fosforzuur-resistente borosilicaat glas. Deze hoeveelheid glazuur is vereist voor betrouwbare resultaten als gevolg van de relatief kleine hoeveelheid carbonaat in tandglazuur.
- Schoon de spatel tussen de monsters met behulp van methanol en een frisse, schone schijf gebruiken of met een gewicht van vaartuig voor elk monster.
- Weeg op 0,2 mg van een internationale norm zoals IAEA NBS18, IAEA 603, IAEA CO8 of Merck CaCO3. Een in-house standaard vervaardigd uit het gehomogeniseerde glazuur van een grote tand kan worden gebruikt als goed20. Voor een volledige looppas van 76 monsters en standaarden, gebruik 61 monsters en 15 normen, die moeten worden gelijkmatig verspreid over de hele run. Verschillende studies hebben passende nummers van normen en details in Archeologisch onderzoek20,28gemeld.
Opmerking: De herhaalde voorbehandeling en analyse van een glazuur in huis norm, over een aantal punten van archeologische monsters, dreigt ook te zorgen voor een passende maatregel is van nauwkeurigheid voor de monsters die worden onderzocht20. - Draai de speciaal ontworpen deksels, toegankelijk voor de naald totdat het septum strak maar niet in de flacon meegezogen is. Niet over scherpen de deksel als de druk op het septum te sterk krijgt en uiteindelijk in een gebroken naald tijdens de analyse resulteren kan. Plaats de flesjes in een beursgenoteerde volgorde binnen een blok van de verwarming bij 70 ° C. De volgorde en de gewichten van de monsters moeten op betrouwbare wijze worden geregistreerd voor toegang tot de computersoftware.
- Meten van de monsters door drie stappen te volgen: 1) flush vullen de monsters met zuivere Helium, 2) toevoegen van fosforzuur, 3) het meten van het monster.
- Spoel de monsters met zuivere helium (grade 5.0) met een stroom van 100 mL/min gedurende 5 minuten te spoelen van de lucht.
- Voeg 4-5 druppels van fosforzuur (99%, dichtheid 1.85 g/mL) aan het carbonaat-bevattende monster. Reactie tussen het monster en de H3PO4 begint. Tijdens de reactie, is CO2 uitgebracht die de isotopische waarde van het carbonaat-ion CO32 - van het monster draagt.
- 1 h per monster wachten totdat de equilibratietijd voor CO2 is bereikt. Na 1 h, moeten de monsters worden gemeten om betrouwbare resultaten te verkrijgen. Tijdens het verwerven, een mengsel van gasmonster en hij gaat naar het apparaat. Een droogrek fase verwijdert water uit het monster gasmengsel.
- Het meten van het monster door te starten met drie toppen van CO2 referentie gas met een bekende isotopensamenstelling. Piek intensiteit moet 4000 mV overeenkomt met de intensiteit van de pieken van de steekproef (tussen 4000 tot 8000 mV). De drie referentie gas pieken moet 20 s lang en 30 s uit elkaar. Volg bij het definiëren van het interval van de meting van het monster. Meten van het monster 10 keer voor 5 s elke en 55 s uit elkaar. Zorg ervoor dat de piekhoogte afneemt na verloop van tijd die aangeeft goede transport van het monster/helium mengsel (Figuur 5).
Opmerking: Tijdens de meting, de software berekent de isotopensamenstelling van het monster door het vergelijken van de bekende isotopische waarde, de piekhoogte, en het gebied van de piek van het gas van de referentie met de piekhoogte en het gebied van de pieken van de monsters. De ruwe 13C /12C en 18O /16O samenstelling van het monster wordt berekend.
- Normaliseren de monsters na meting.
Opmerking: Dit is belangrijk omdat de verwijzing gas geen ondergaan dezelfde chemische en fysische weg als het gasmonster wanneer de massaspectrometer binnengebracht. Daarom is het essentieel dat de monsters zijn bovendien gekalibreerd naar internationale standaarden (stap 5.3) die ondergaan dezelfde fysische en chemische behandeling binnen een run als het monster zelf20. Deze internationale carbonaat normen kunnen de twee-punts kalibratie van monsters op de internationale delta metingsschaal en de beoordeling van de nauwkeurigheid en herhaalbaarheid gedurende een gegeven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met behulp van de hierboven weergegeven monstertrekkingsprocedure, werden incrementele emaille bioapatite monsters voorbereid. De analyse van bioapatite in glazuur is afhankelijk van de nauwkeurigheid van de bemonstering, bulk of incrementele. In dit geval hebben we gekozen voor het presenteren van de resultaten van archeologische monsters (twee schapen) van verschillende klimaatzones. Basismonsters werden geanalyseerd uit schapen tweede kiezen en geëtiketteerd basisgewicht van de ERJ (Figuur 4). Basismonster locaties werden geteld, en elke locatie werd gemeten als de afstand in mm van de ERJ (Figuur 7).
Divers koolstof en zuurstof stabiele isotoop resultaten van de twee schapen bevestigen dat ze in verschillende omgevingen, in dit leefden geval een tropisch grasland (A) en een gematigd grasland voor droge-steppe (B), respectievelijk. Incrementele δ18O waarden voor schapen een show een smalle bandbreedte tussen de 3.3 tot en met 5.1‰, suggereren de inname van waterbronnen met gelijkaardige isotopische waarden en een gebrek aan sterke seizoensgebonden veranderingen in neerslag (Figuur 8). Daarentegen, hebben δ18O waarden voor schapen B een hoge amplitude van variatie, variërend van ─5.2 tot ─13.1‰, met vermelding van sterke seizoensgebonden verschillen in neerslag. Stabiele koolstof-isotoop waarden stellen voor sterke verschillen in geconsumeerde vegetatie tussen monsters, met schapen, een met een voeding bestaat voornamelijk uit C4 planten, terwijl de schapen B ingeslikt voornamelijk C3 vegetatie. Deze schapen waren specifiek gekozen om aan te tonen van milieu variatie duidelijk in incrementele zuurstof en koolstof stabiele isotoop resultaten.
Menselijke tanden zijn ook van de ERJ bemonsterd aan de kroon langs de as van de groei. Incrementele δ18O en δ13C-waarden voor een menselijke tand van een regenwoud-omgeving zijn zeer beperkt, binnen een bereik van 2‰. Dit suggereert een gebrek aan variatie in foerageren strategieën in de periode van glazuur mineralisatie (Figuur 9).
Figuur 1: boren van een tand. (A) foto van een tand worden geboord op een tuig instellen. (B) foto van glazuur poeder wordt verzameld in aluminiumfolie en geplaatst in een 1,5 mL micro-centrifuge buis (met juiste etiket). (C) foto van verschillende boor bits beschikbaar voor incrementele bemonstering. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: Rig instellen omhoog Foto van tuig instellen met de boor op zijn plaats. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: Sample voorbereiding. Proef wordt geplaatst in een micro-centrifuge buis en geschud op een draaikolk nadat chemicaliën zijn toegevoegd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: incrementeel bemonsterd schapen tanden. Schapen tanden (A en B) die stapsgewijs werden bemonsterd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: Chromatogram van gasbench uitgevoerd. Foto van een chromatogram van één monster intensiteit van referentie gas pieken en monster pieken na verloop van tijd weer te geven. Gedetecteerde massa's zijn 44, 45 en 46. De eerste drie toppen zijn CO2 referentie gas toppen met een bekende isotopensamenstelling. Tien pieken die volgen zijn voorbeeld pieken in intensiteit afnemen. Pieken moeten altijd worden gescheiden door enkele seconden om een strikte discriminatie tussen de toppen en dus een schone piek-integratie. Getallen op de top van elke staat de tijd (s) van de piek van peak detectie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6: monster met een gewicht van carbonaat. Foto van het monster worden gewogen in glazen flesjes met behulp van een spatel. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 7: basismonsters op een schapen-tand. Basismonsters langs de as van de groei van de tand van de ERJ naar de top van de kroon uitgezet naast koolstof en zuurstof stabiele isotoop waarden. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 8: schapen glazuur carbonaat isotoop resultaten. Stabiele zuurstof en koolstof-isotoop waarden voor twee incrementeel bemonsterde schapen tanden. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 9: menselijke glazuur carbonaat isotoop resultaten. Stabiele zuurstof en koolstof-isotoop waarden voor een stapsgewijs bemonsterde menselijke tand. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| PCI (fosfaat kristalliniteit Index) |  |
Sponheimer en Lee-Thorp, 1999 |
| andere namen: | ||
| CIIR (kristalliniteit Index infrarood) | Shemesh, 1990 | |
| IRSF (infrarood splitsen Factor) | Weiner en Bar-Yosef, 1990 | |
| BPI (B-carbonaat op fosfaat Index) |  |
LeGeros, 1991 |
| API (A-carbonaat op fosfaat Index) |  |
Sponheimer en Lee-Thorp, 1999 |
| BAI (relatieve hoeveelheid B - tot A-site carbonaat) |  |
Sponheimer, 1999; Sponheimer en Lee-Thorp, 1999 |
| WAMPI (Water-Amide op fosfaat Index) |  |
Roche et al., 2010 |
Tabel 1: empirische indexen die kenmerkend zijn voor de crystal-chemische eigenschappen van emaille bioapatite. Wij raden de empirische indices uit Sponheimer (1999), Sponheimer en Lee-Thorp (1999) en Roche e.a. (2010) te karakteriseren van de crystal-chemische eigenschappen van emaille bioapatite.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De uitdagingen van de succesvolle bemonstering (bulk en incrementele) van gebit is afhankelijk van de toegang tot kennis met betrekking tot boren technieken en proef van de voorbereiding, naast de investering in relatief goedkope apparatuur. Deze uitdagingen zijn gemakkelijk niet onoverkomelijk als duidelijke instructies zijn beschikbaar over bemonstering en voorbehandeling benaderingen. In dit artikel willen wij dit op een duidelijke, beknopte wijze voor onderzoekers nieuw voor deze methoden hebben verspreid. Geleerden deze methoden toe te passen voor de eerste keer moeten de praktijk over toegankelijk moderne fauna voorafgaand aan de analyse en monsterneming van waardevolle archeologische en paleontologische monsters.
De bemonstering van mens en dier tandglazuur carbonaat voor stabiele isotoop analyse is een eenvoudige procedure die op meerdere laboratoria tot stand is gebracht. Er is echter een tendens voor de technieken en de technologie die is gekoppeld aan het boren van gebit verschillen per laboratorium te worden opgenomen in een bredere groep van technische voorkennis die niet openlijk worden gedeeld. Incrementele bemonstering heeft grote voordelen, de identificatie van gedetailleerde intra individuele variatie in inname via de voeding en de inname van water. Dit wordt geïllustreerd door het dwingende de verschillen gevonden tussen personen uit verschillende regio's als voeding en milieu-informatie is bewaard gebleven in de tand email bioapatite. In onze representatieve gegevens blijkt significante isotopische variatie tussen de schapen uit tropische graslanden in vergelijking met de schapen van gematigde graslanden van de droog-steppe (Figuur 8).
Kritische stappen in het protocol zijn gerelateerd aan de nauwkeurigheid in het boren, behoud van tandglazuur en voorbehandeling technieken. Kleine onnauwkeurigheden in het boren, bijvoorbeeld door middel van het glazuur in het dentine tand, kunnen leiden tot enorm variabele isotoop metingen29. Het behoud van het tandglazuur kan worden gecontroleerd via een verscheidenheid van methoden, inclusief het aandeel van de geschatte carbonaat van een monster gemeten, evenals de set-up van de FTIR hier besproken. Onderzoekers moeten ook informeren de laboratoria van het grafmonument milieu, specifiek of water-logged in zure gronden, die kunnen invloed hebben op de structurele behoud van fossiele tandglazuur. De hardheid van tandglazuur moet worden beschouwd als een eerste indicatie van verduurzaming, die alleen duidelijk tijdens het boren geworden kan. Glazuur dat is zacht en gemakkelijk geboord suggereert dat het kristalrooster bioapatite kunnen hebben aangetast en moeten worden gecontroleerd met FTIR of anderszins gemeld in de literatuur30. De variatie in monster voorbehandeling lijkt te leiden tot beperkte isotopische variatie in21,22van de glazuur van de tand. Daarom stellen we voor het gebruik van eenvoudige protocollen (bv., 0,1 M azijnzuur voor minder dan 4 uur gevolgd door wassen met gedestilleerd water).
Er zijn verschillende beperkingen aan de techniek, gekoppeld aan het ontwerp van de bemonstering en de interpretatie. Opeenvolgende monsters boren is een vaardigheid die enige tijd om te overmeesteren duurt. Een duidelijk begrip van de taxa en tand te worden geanalyseerd is essentieel bij het formuleren van een bemonstering ontwerp2,25. Verder, boren van monsters kan een aanzienlijke hoeveelheid tijd in beslag nemen. Echter toestaan de resulterende koolstof en zuurstof stabiele isotoop waarden voor opeenvolgend bemonsterde gebit de onderzoekers dieet- en milieu wijzigingen bijhouden. Als deze wijzigingen betrekking hebben op natuurlijke seizoensgebonden variaties, vaak in oude tijden, zijn doordachte interpretaties die zijn contextualized binnen een goed begrip van de variatie in isotopische referentie sets integraal onderdeel van dit onderzoek-6.
In het artikel, we hebben aangetoond dat incrementele bemonstering en bulk bemonstering van zowel mens als schapen gebit. Verder, instrueren we de onderzoekers op voorbehandelingsplatformen methoden voor beide reeksen monster. Incrementele methode kan worden toegepast op oude en moderne fauna met soortgelijke glazuur groei en mineralisatie (bv., vee en paarden). Voorbehandeling van emaille bioapatite zoals in het artikel kan worden gebruikt op de monsters van een dwarsdoorsnede van de oude overblijfselen. De belangrijkste les uit onze weergegeven monstertrekkingsprocedure is bulk en incrementele monsterneming van gebit, dat is niet gemakkelijk uitgelegd in een document. Verdere demonstraties zou democratiseren andere archeologische isotoop monstername en voorbehandeling benaderingen (bv., bone collageen extracties uit te voeren of de bemonstering van archeologische aardewerk voor stabiele isotoop metingen van vetzuren) verbetering van de verspreiding van kennis en technologie op dit gebied. Dergelijke democratisering moet echter niet, worden gezien als een complete vervanging voor overleg met de deskundigen, of de beschikbare literatuur, de normen voor meet- en interpretatie in een bepaalde context20,28vast te stellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenconflict.
Acknowledgments
We zouden graag bedanken het Max-Planck-Gesellschaft voor de financiering van dit onderzoek, alsmede de recente instelling van van een stabiele isotoop laboratorium aan het departement Archeologie, Max Planck Instituut voor de wetenschap van de menselijke geschiedenis.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dremel Micro | Dremel | https://www.dremel.com/en_US/products/-/show-product/tools/8050-micro | |
| Diamond-tipped drill bit | Dremel | https://www.dremel.com/en_US/products/-/show-product/accessories/7122-diamond-wheel-point | |
| 1.5 mL micro-centrifuge tube | Sigma Aldrich | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t2422?lang=de®ion=DE&gclid=EAIaIQ obChMI7pHRpauW2QIV77ftCh1p1 wjhEAAYASAAEgKzkvD_BwE |
|
| Methanol | Linear Formula: CH3OH | ||
| Acetic Acid | Linear Formula: CH3CO2H | ||
| Dremel rig set-up (workstation) | Dremel | https://www.dremel.com/en_US/products/-/show-product/tools/220-01-workstation | |
| Microcentrifuge | Thermo Scientific | http://www.thermofisher.com/order/catalog/product/75002401 | |
| Mini-centrifuge | Sprout | http://www.heathrowscientific.com/sprout-mini-centrifuge-4 | |
| Freeze drier | Zirbus Technology | http://www.zirbus.com |
References
- Balasse, M. Reconstructing dietary and environmental history from enamel isotopic analysis: time resolution of intra-tooth sequential sampling. International Journal of Osteoarchaeology. 12 (3), 155-165 (2002).
- Balasse, M. Potential biases in sampling design and interpretation of intra-tooth isotope analysis. International Journal of Osteoarchaeology. 13 (1-2), 3-10 (2003).
- Lee-Thorp, J. A. On isotopes and old bones. Archaeometry. 50 (6), 925-950 (2008).
- Clementz, M. T. New insight from old bones: stable isotope analysis of fossil mammals. Journal of Mammalogy. 93 (2), 368-380 (2012).
- Loftus, E., Roberts, P., Lee-Thorp, J. A. An isotopic generation: four decades of stable isotope analysis in African archaeology. Azania: Archaeological Research in Africa. 51 (1), 88-114 (2016).
- Ventresca Miller, A. R., Makarewicz, C. Isotopic approaches to pastoralism in prehistory: Diet, mobility, and isotopic reference sets. Isotopic Investigations of Pastoralism in Prehistory. , 1-14 (2018).
- Hollund, H. I., Ariese, F., Fernandes, R., Jans, M. M. E., Kars, H. Testing an alternative high-throughput tool for investigating bone diagenesis: FTIR in attenuated total reflection (ATR) mode. Archaeometry. 55 (3), 507-532 (2013).
- LeGeros, R. Z. Calcium phosphates in oral biology and medicine. Monographs in oral sciences. 15, 109-111 (1991).
- Lee-Thorp, J. L., Van Der Merwe, N. J. Carbon isotope analysis of fossil bone apatite. South African Journal of Science. 83 (11), 712-715 (1987).
- Cerling, T. E., Harris, J. M. Carbon isotope fractionation between diet and bioapatite in ungulate mammals and implications for ecological and paleoecological studies. Oecologia. 120 (3), 347-363 (1999).
- Koch, P. L. Isotopic study of the biology of modern and fossil vertebrates. Stable Isotopes in Ecology and Environmental Science. , 99-154 (2007).
- Nelson, S. J. Wheeler's Dental Anatomy, Physiology and Occlusion-E-Book. , Elsevier Health Sciences. (2014).
- Tsutaya, T., et al. From cradle to grave: multi-isotopic investigations on the life history of a higher-status female from Edo-period Japan. Anthropological Science. 124 (3), 185-197 (2016).
- Sponheimer, M., Passey, B. H., De Ruiter, D. J., Guatelli-Steinberg, D., Cerling, T. E., Lee-Thorp, J. A. Isotopic evidence for dietary variability in the early hominin Paranthropus robustus. Science. 314 (5801), 980-982 (2006).
- Lee-Thorp, J., Sponheimer, M. Three case studies used to reassess the reliability of fossil bone and enamel isotope signals for paleodietary studies. Journal of Anthropological Archaeology. 22 (3), 208-216 (2003).
- Zazzo, A. Bone and enamel carbonate diagenesis: a radiocarbon prospective. Palaeogeography, Palaeoclimatology, Palaeoecology. 416, 168-178 (2014).
- Sponheimer, M. Isotopic paleoecology of the Makapansgat Limeworks fauna (Australopithecus africanus, South Africa). , (1999).
- Sponheimer, M., Lee-Thorp, J. A. Alteration of enamel carbonate environments during fossilization. Journal of Archaeological Science. 26 (2), 143-150 (1999).
- Roche, D., Ségalen, L., Balan, E., Delattre, S. Preservation assessment of Miocene-Pliocene tooth enamel from Tugen Hills (Kenyan Rift Valley) through FTIR, chemical and stable-isotope analyses. Journal of Archaeological Science. 37 (7), 1690-1699 (2010).
- Roberts, P., et al. Calling all archaeologists: guidelines for terminology, methodology, data handling, and reporting when undertaking and reviewing stable isotope applications in archaeology. Rapid Communications in Mass Spectrometry. , (2018).
- Snoeck, C., Pellegrini, M. Comparing bioapatite carbonate pre-treatments for isotopic measurements: Part 1-Impact on structure and chemical composition. Chemical Geology. 417, 394-403 (2015).
- Pellegrini, M., Snoeck, C. Comparing bioapatite carbonate pre-treatments for isotopic measurements: Part 2-Impact on carbon and oxygen isotope compositions. Chemical Geology. 420, 88-96 (2016).
- Wright, L. E., Schwarcz, H. P. Stable carbon and oxygen isotopes in human tooth enamel: identifying breastfeeding and weaning in prehistory. American Journal of physical anthropology. 106 (1), 1-18 (1998).
- Roberts, P., et al. Fruits of the forest: Human stable isotope ecology and rainforest adaptations in Late Pleistocene and Holocene (∼ 36 to 3 ka) Sri Lanka. Journal of human evolution. 106, 102-118 (2017).
- Zazzo, A., Balasse, M., Patterson, W. P. High-resolution δ13C intratooth profiles in bovine enamel: Implications for mineralization pattern and isotopic attenuation. Geochimica et Cosmochimica Acta. 69 (14), 3631-3642 (2005).
- Sydney-Zax, M., Mayer, I., Deutsch, D. Carbonate content in developing human and bovine enamel. Journal of dental research. 70 (5), 913-916 (1991).
- Rink, W. J., Schwarcz, H. P. Tests for diagenesis in tooth enamel: ESR dating signals and carbonate contents. Journal of Archaeological Science. 22 (2), 251-255 (1995).
- Szpak, P., Metcalfe, J. Z., Macdonald, R. A. Best practices for calibrating and reporting stable isotope measurements in archaeology. Journal of Archaeological Science: Reports. 13, 609-616 (2017).
- Wright, L. E., Schwarcz, H. P. Correspondence between stable carbon, oxygen and nitrogen isotopes in human tooth enamel and dentine: infant diets at Kaminaljuyu. Journal of Archaeological Science. 26 (9), 1159-1170 (1999).
- Schoeninger, M. J., Hallin, K., Reeser, H., Valley, J. W., Fournelle, J. Isotopic alteration of mammalian tooth enamel. International Journal of Osteoarchaeology. 13 (1-2), 11-19 (2003).
