Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Metabolisk analys av Drosophila melanogaster Larval och vuxna hjärnor

doi: 10.3791/58007 Published: August 7, 2018

Summary

Vi presenterar ett protokoll för att mäta syreförbrukning och extracellulära försurning i Drosophila melanogaster larver och vuxna hjärnor. En metabolisk analyzer används med en anpassad och optimerad protokollet. Micro-vävnad begränsningar var är en kritisk komponent i detta protokoll och designad och Skapad speciellt för deras användning i denna analys.

Abstract

Det här protokollet beskriver en metod för att mäta metabolismen i Drosophila melanogaster larver och vuxna hjärnor. Kvantifiera ämnesomsättningen i hela organ ger en vävnad-nivå förståelse för energiutnyttjande som inte kan registreras när analysera primära celler och cellinjer. Denna analys är ex vivo, det möjliggör mätning från ett antal specialiserade celler arbetar tillsammans för att utföra en funktion i en vävnad och modeller närmare i vivo orgeln. Metaboliska omprogrammering har observerats i många neurologiska sjukdomar, inklusive neoplasi och neurodegenerativa sjukdomar. Detta protokoll har utvecklats för att hjälpa D. melanogaster gemenskapens undersökning av metabolism i neurologiska sjukdomsmodeller använder en kommersiellt tillgänglig metabola analyzer. Mäta metabolismen av hela hjärnor i metabola analysatorn är utmanande på grund av geometri av hjärnan. Denna analysator kräver prov kvar på botten av en plattan med 96 brunnar. Cellprover och vävnad stämplingar kan följa ytan av cell plattan eller utnyttja sfäroid plattor, respektive. D. melanogaster hjärnor sfäriska, tredimensionell form hindrar dock vävnaden från klibba till plattan. Detta protokoll kräver ett speciellt konstruerade och tillverkade mikro-vävnad återhållsamhet som kringgår detta problem genom att förhindra någon rörelse i hjärnan samtidigt tillåta metabola mätningar från analysatorns två solid-state sensor sonder. Syreförbrukning och extracellulära försurning priser är reproducerbara och känslig behandling med metaboliska hämmare. Med en mindre optimering, kan detta protokoll anpassas för användning med alla hela vävnad och/eller modellsystem, förutsatt att stickprovets storlek inte överstiger kammaren genereras av fasthållningsanordningen. Medan basala metaboliska mätningar och analys efter en behandling med mitokondrie-hämmare beskrivs i detta protokoll, kunde otaliga experimentella förhållanden, såsom energi källa preferens och uppfödning miljö, förhöras.

Introduction

Metaboliska omprogrammering har upptäckts i många neurologiska sjukdomar, inklusive Glioblastoma Multiforme (GBM), Huntingtons sjukdom och stora depressiv störning (MDD)1,2,3. Som metabolismen blir fokus för terapeutiska strategier, avancerade verktyg för grundläggande metabolisk forskning. Emellertid var de flesta av dessa metoder för att studera cellinjer och primära celler eller för att analysera större vävnader efter fixering eller -frysning. Vissa metoder har förlitat sig på kit att förenklat mäta specifika metaboliter, medan andra har utnyttjas mer kostsamma och komplexa analyser utnyttja kromatografi i kombination med masspektrometri4 för samma mål. För att förstå det största metabola landskapet, metabolisk profilering5,6 och metabola flux analys (MFA)7 framkom för att komplettera storskaliga proteomiska och genomisk studier. Profilering ger en kvantitativ representation av metaboliter i en cell eller vävnad vid ett tillfälle i tid, medan MFA utökar detta genom att tillåta spårning av märkta metaboliter över tid. Den senare har varit användbar i avslöjar hur energikällor utnyttjas på olika sätt i en cell eller vävnad när i en sjukdom stat8. Dessa metoder omfattar dock inte mätning av den totala ämnesomsättningen.

För att förhöra totala metaboliska tillståndet för de små modellsystem, kan traditionella metoder, såsom Clark elektrod9 och indirekt kalorimetri10, användas för att mäta syreförbrukning eller konfigurerats för stoppa flödet respiration, till mäta syre och koldioxid koncentration, respektive. Dessa tekniker, har medan exakt ger inblick i avläsningen av metabola omprogrammering på organismnivå, begränsningar. Användning av Clark elektroden kan vara tekniskt utmanande och är inte avsedd för hög genomströmning studier. Respirometer med stopp i flödet fungera inte med den känslighet som krävs till assay celler eller vävnader. Flera år sedan, har ny teknik utvecklats speciellt för dessa mindre program11. Dessa instrument var ursprungligen tänkt att mäta syreförbrukning och extracellulära försurning av cellinjer och primära celler i en 24 - eller 96-bra format. Enkelheten i set-up och data utdata etablerat denna metod som ett alternativ till de traditionella metoderna. Denna metod är ett kraftfullt verktyg för celler och senaste framsteg har gjort för mätning av vävnad stämplingar12,13,14. De metoder som används i dessa analyser tillåter dock inte för mätning av hela organ från små modellsystem.

Metabolisk analys av sjukdomsmodeller innebär ofta samverkan mellan celler specialiserade funktion som är bosatta inom samma vävnaden. Exempelvis producera gliaceller metaboliter som utnyttjas av nervceller. Dessa metaboliska interaktioner krävs för neuronal överlevnad15. Liten modellsystem är fördelaktiga för att utreda frågor som dessa. Studier för att mäta metabolismen av en hel orgel, som innehåller en mängd olika celltyper, kommer att lägga till förståelsen av energi utnyttjande i vivo. Becker et al. rapporterade nyligen, en metod att mäta syreförbrukningen i hela flyga huvuden16. Genom att samla ett antal huvuden tillsammans i en väl 24-väl cell platta, erhölls syre förbrukning avläsningar använder en metabolisk analyzer. Även detta fungerar bra för huvuden, som skiljs lätt från kroppen, är det mycket svårare att använda för organ såsom larver hjärnor, eftersom en stor mängd behöver vara dissekeras för denna metod. Därför utvecklades en metod som utnyttjar en cell plattan med 96 brunnar, vilket ökar känsligheten av syreförbrukning och extracellulära försurning avläsningar, för att assay en enda hela larval hjärna.

Den metabola analyzer används i denna studie kräver provet mäts för att ligga kvar på botten av brunnen av en plattan med 96 brunnar i cellen. För celler och relativt platt vävnader är detta inte en utmaning; dock för D. melanogaster larver och vuxna hjärnor är det inte möjligt med traditionella platta beläggning protokoll. Det sfäriska tredimensionella formen av hjärnor kommer inte tillförlitligt följer den platta ytan, och de som gör skadas ofta vid försök att placera dem ordentligt i brunnen. En viktig del av detta nya protokoll är design och utveckling av mikro-vävnad begränsningar17 som ger en liten kammare för hjärnan att vistas i utan att störa de metabola mätningarna. Kammaren genereras är ungefärligt 0,016 i höjd och ger tillräckligt utrymme för att enkelt hålla många D. melanogaster hjärnor. Begränsningarna som består av nylon mesh bifogas en inert polymer ring och kommer att diskuteras ytterligare i Representativa resultat. Med dessa begränsningar minimerar tiden det tar att förbereda dissekerade hjärnor för metabola mätning. Optimera mäta förfarandet genererar stadig, reproducerbara syreförbrukning och extracellulära försurning priser efter sex mätning cykler (25 min). Hjärnor fortfarande metaboliskt aktiva under dessa förhållanden i minst 2 h, vilket gör injektioner av therapeutics, -hämmare eller andra behandlingar via metabola analyzer patron drogen leverans hamnarna. Detta protokoll kan också enkelt anpassas för andra vävnader och liten modell system18.

Protokollet beskrivs nedan beskriver hur till assay syreförbrukningen i en hela Drosophila larval hjärnan när utmanas med mitokondriell stress. Stress hjärnan, läggs oligomycin till hämma ATP synthase19. Minskningen i syreförbrukning från basal avläsningar visar en mätning av mängden ATP-beroende andning i hjärnan. Ytterligare sänkningar av syreförbrukningen efter behandlingar med rotenon20 och antimycin A21, hämmare av elektrontransport kedja komplex I och III, respektive, ange mängden icke-mitokondriell syreförbrukning i den hjärnan. Denna analys är ett exempel på hur mitokondriernas andning i en flyga hjärna kan jämföras och hur detta protokoll kan användas för att jämföra metabolismen i olika genotyper. Detta protokoll kan dock anpassas för att mäta bara basala syreförbrukning och extracellulära försurning priser, samt att utforma noggrannare studier som undersöker särskilda energiutnyttjande eller substrat utnyttjande hypoteser.

Protocol

1. Test förberedelse (dag 1)

  1. Placera den metabola analyzer (Tabell för material) i en inkubator eller en temperatur-kontrollerad rummet till 11 ° C.
    Obs: Denna temperatur är idealisk för mätningar vid 25 ° C, eftersom det ger ~ 14 ° C temperatur fluktuationer som uppstår när du kör analysen. Detta orsakas av värmen som alstras av instrumentet under körning.
  2. Öppna lämplig programvara på den dator som är ansluten till metabola analyzer. Klicka på numeriska temperaturen i längst ned till vänster på skärmen. I det nya fönstret som öppnas, klicka på rutan bredvid kommandot ”värmaren på” och säkerställa en bockmarkering visas. Justera temperaturen till 25 ° C och justera toleransområdet till 0.2 ° C med hjälp av pilarna.
    Obs: Flera timmar krävs för att uppnå stabila temperaturer.
  3. Öppna behållaren patron (Tabell av material) och ta bort patronen från verktyget plattan utan att vidröra sonderna.
    Obs: Verktyget plattan används under kalibreringen av patronen och används inte när den metaboliska test körs.
  4. Tillsätt 200 μL av en standard lösning (Tabell för material) med verktyget tallrik och placera kassetten tillbaka på toppen av verktyget plattan att rehydrera sensorn sonder på kassetten. Inte röra sonderna och skydda dem från ljus.
  5. Försegla patronen med paraffin filma.
  6. Inkubera patronen övernattning på 25 ° C.

2. analys Media förberedelse (dag 2)

  1. Lägga till 10 mM glukos och 10 mM natrium pyruvat analyssubstratet.
  2. Inkubera mediet vid 25 ° C tills vätskan har jämviktas till denna temperatur.
  3. Justera pH till 7,4 med hjälp av en pH-mätare.

3. installationen av programvaran för metabolisk analys av Drosophila melanogaster hjärnor (dag 2)

  1. Ställa in metabola programvaran på den metabola analyzer används i steg 1.2.
  2. Välj ”mall” på startsidan programvara.
  3. Dubbelklicka på ”tomt” för att starta en ny analys-design.
  4. Klicka på ”plattan” kartknappen i det övre verktygsfältet Visa utformningen av cell assay plattan.
    Obs: Cell assay plattan innehåller hjärnan proverna och kommer att paras med kassetten innan du börjar den metaboliska test köra.
  5. Klicka på Lägg till grupper knappen 3 x.
    1. Dubbelklicka på skivbolaget ”grupp 1” och döp om den till ”experimentell”.
      Obs: Denna grupp kommer att innehålla en flyga hjärna och en mikro-vävnad återhållsamhet behandlas med läkemedel.
    2. Dubbelklicka på skivbolaget ”grupp 2” och döp om den till ”kontroll”.
      Obs: Denna grupp kommer att innehålla en flyga hjärna och en mikro-vävnad återhållsamhet med ingen läkemedelsbehandling.
    3. Dubbelklicka på den ”grupp 3” etikett och döp om den till ”återhållsamhet endast”.
      Obs: Denna grupp kommer att innehålla en mikro-vävnad återhållsamhet utan hjärna eller läkemedelsbehandling.
  6. Tilldela varje grupp baserat på där prover i cell plattan är avsedda att placeras brunnarna.
    1. Klicka på ”experimentell” etiketten och sedan markera brunnar B2 - B8 på plattan kartan.
    2. Klicka på ”Control” etiketten och sedan markera brunnar C2-C8 på plattan kartan.
    3. Klicka på den ”återhållsamhet enda'' etikett och sedan markera wells D2-D8 på plattan kartan.
    4. Kontrollera att alla fyra hörnen (A1, A12, H1 och H12) designeras som bakgrund.
      Obs: Brunnar längs omkretsen av plattan inte används för att minska eventuella kanteffekter. Detta är en standardinställning i programvaran.
  7. Klicka på knappen ”protokoll” i det övre verktygsfältet att ställa in protokollet.
    1. Klicka på ”Redigera mätning detaljer” i rutan för baseline-mätningen.
    2. Justera tiden att metabola analysatorn mäter hjärnan genom att ändra den basala åtgärden cykeltid till ”3:00” genom att klicka på uppåt- och nedåtpilarna.
    3. Justera tiden som metabola analysatorn ska vänta mellan hjärnan mätningar genom att ändra den basala väntan cykeltid till ”0:00” genom att klicka på uppåt- och nedåtpilarna.
    4. Justera den tid som den metaboliska analyzer kommer att blanda media före mätning hjärnan genom att ändra den basala blanda cykeltid till ”1:00” genom att klicka på uppåt- och nedåtpilarna.
    5. Justera det totala antalet basala cykler, som innehåller åtgärden, vänta och blandning cykler, till ”7” genom att klicka på uppåt- och nedåtpilarna.
      Obs: Stabil syre materialåtgången mätningar erhålls efter ~ 25 min från början av analysen.
    6. Klicka på knappen ”Lägg till injektion”, beläget i övre vänstra verktygsfältet.
    7. Klicka på skivbolaget ”injektion” och ändra det till ”Oligomycin”.
    8. Justera injektion åtgärd, vänta och mix gånger att matcha de för den basala.
    9. Justera det totala antalet injektion cykler till ”6” genom att klicka på uppåt- och nedåtpilarna.
    10. Upprepa steg 3.7.6 - 3.7.8 men ändra etiketten till ”röta/AA” och justera det totala antalet injektion cykler till 7 genom att klicka på uppåt- och nedåtpilarna.
    11. Klicka på ”Run test” knappen i det övre verktygsfältet.
    12. ”Spara” analysen och börjar ställa upp assay patronen (Tabell för material).

4. beredning av kassetten för kalibrering (dag 2)

  1. Ta ut patronen ur ruvmaskinen 25 ° C och ta av locket.
    1. Tillsätt 20 μL av 100 μM oligomycin små övre vänstra cirkulär injektion hamnen, port A, i ampullen för alla motsvarande experimentella brunnar på cell plattan och tillsätt 20 μL av assay media till port A i alla andra brunnar, inklusive kontroll och bakgrunden brunnarna.
      Obs: Patronen innehåller 4 portar (A-D) för varje 96 brunnarna motsvarande cell plattan vad kommer att innehålla proverna. Detta steg är klar innan du lägger till proven. Att lägga 20 μL av 100 μM oligomycin resultat i en slutlig oligomycin koncentration av 10 μM i cell plattan väl när läkemedlet injiceras i metabola Analyzer. Oligomycin är en hämmare av ATP-syntas. Resultatvärdet syre förbrukning kommer att återspegla mängden ATP-kopplad andning i hjärnan. För att korrekt injicera droger i angivna brunnar, måste alla hamnar i samma skrivelse fyllas med samma volym av vätska, även om inte används.
    2. Tillsätt 22 μL av 50 μM Rotenon/antimycin A till den lilla övre höger cirkulär hamnen, port B, i ampullen för alla motsvarande experimentella brunnar på cell plattan och tillsätt 22 μL av assay media till port B i alla andra brunnar, inklusive kontroll och bakgrunden brunnarna.
      Obs: Detta resulterar i en slutlig Rotenon/Antimycin en koncentration av 5 μM i cell plattan väl när läkemedlet injiceras i metabola Analyzer. Rotenon och antimycin A är hämmare av elektrontransport kedja komplex I och III, respektive. Resultatvärdet syre förbrukning kommer att återspegla icke-mitokondriell andning i hjärnan.
    3. Klicka på ”Start Kör” att placera laddade patronen med verktyget plattan i metabola analyzer med väl A1 placerad i det övre vänstra hörnet när inför instrumentet, med platta lastaren sträcker sig från höger sida av maskinen.
  2. Välj ”Jag är redo” i mjukvaran för att börja Jämviktstiden och kalibrering av patronen innan du påbörjar den metaboliska test med cell plattan som innehåller proverna.
    Obs: Programmet kommer att be att spara filen och sedan börja equilibrating och kalibrera. Dessa steg kan ta upp till 1 h. steg 5 – 8 genomförs under tiden Jämviktstiden och kalibrering.

5. beredning av mikro-vävnad begränsningar (dag 2)

  1. Välj 1 mikro-vävnad återhållsamhet per hjärnan som mäts, plus minst 3 för användning som endast återhållsamhet-kontroller, från förvaringsbehållaren (innehåller 70% etanol).
  2. Skölj begränsningarna med färsk 70% etanol och tvätta dem med avjoniserat vatten 3 x 2 min varje, med en mesh korg och 6-well plate (Tabell för material). Tillsätt ytterligare vatten tvättar om begränsningar fortfarande avger en alkohol lukt.
  3. Tvätta de mikro-vävnad begränsningarna i analysen media och lämna dem i denna lösning tills de är redo för användning.

6. dissekering av den Drosophila melanogaster Larval hjärnor (dag 2)

  1. Välj sen (vandrande) tredje instar larver från en injektionsflaska av odlade Oregon-R flugor med hög precision, stil 5 (0,10 x 0,06 mm2) pincett.
  2. Placera larven i brunnen av en ren dissekera spot tallrik (Tabell för material) som innehåller 500 μL 1 x PBS.
    Obs: En plats plattan är en glasplatta med fördjupningar, brukade dissekera små vävnader och organismer.
  3. Tvätta larven genom att försiktigt skaka den i brunnen, med hjälp av pincett.
  4. Flytta larven till ren väl av en spot tallrik innehållande 500 μL 1 x PBS.
  5. Placera spot plattan under mikroskopet dissekera.
  6. Förstå larven på sin midsection med en pincett, medan gripa ögat krokar med en andra pincett.
  7. Skonsamt och smidigt dra larven i motsatta riktningar med hjälp av de två uppsättningarna av pincett.
  8. Visualisera hjärnan, som vanligtvis vistelser ansluten till ögat krokar och kommer vanligen har eye-antennal skivor fäst vid den.
  9. Ta försiktigt bort ytterligare vävnader från hjärnan, med ögat krokar för att hålla hjärnan på plats. Slutligen, separera ögat krokar från hjärnan.
  10. Använd pincett för att flytta dissekerade hjärnan till en ny brunn på en plats tallrik innehållande 1 x PBS.
  11. Upprepa steg 6.1 – 6.10 tills 14 hjärnor är dissekeras.
    Obs: Den totala tiden från början av dissektionen till assay körningen bör inte överstiga 30 min.

7. tillägg av dissekerade hjärnor till 96 brunnar metabola test Cell plattan (dag 2)

  1. Tillsätt 50 μL av assay media till brunnarna Skyltens 96 brunnar metabola test (Tabell för material) används i experiment, inklusive de experimentella, kontroll, återhållsamhet-bara, och bakgrunden brunnar.
  2. Placera försiktigt en hjärna i varje brunn från A2-A8 och B2-B8 av cell plattan, med pincett, en spatel eller en pipett.
    Obs: Detta kan göras från mikroskopet dissekera.
  3. Under mikroskopet dissektion, använda en böjd nål mikro-probe sjunka hjärnor till botten av brunnen.
  4. Försiktigt placera hjärnan i mitten av de tre upphöjda sfärer med sonden.

8. tillägg av mikro-vävnad begränsningar till 96 brunnar metabola test Cell plattan (dag 2)

  1. Pincett, placera fasthållningsanordningen för mikro-vävnad i utkanten av assay plattan väl, och använder lupp för att inspektera att det är orienterad med plast ringen nedåt och mesh på toppen.
  2. Avlägsna plattan från under mikroskopet och använda pincett för att förstå återhållsamhet på båda sidor och försiktigt släppa den i brunnen.
  3. Använda en böjd nål mikro-probe för att driva fasthållningsanordningen i brunnen.
  4. Under mikroskopet, kontrollera att hjärnan kan ses genom den vävnad återhållsamhet och att den är centrerad i brunnen.
  5. Upprepa steg 8,1 – 8,4 för alla de brunnar som ska ingå i analysen — A2-A8, B2-B8 och C2-C8.
  6. Tillsätt försiktigt 130 μL av assay media till var och en av de experimentella, kontroll och endast återhållsamhet-brunnar.
  7. Verifiera att hjärnorna och mikro-vävnad begränsningar inte har flyttat när du lägger till media genom att visualisera dem under mikroskopet.
  8. Tillsätt 180 μL av assay media till fyra hörn brunnarna för användning som bakgrund kontroll.

9. tillägg av Cell plattan metabola analysatorn och i början av analysen (dag 2)

  1. Verifiera att Jämviktstiden och kalibrering är komplett genom att vänta för programvaran att fråga efter cell plattan som innehåller provet.
  2. Välj ”Öppna fack” och vänta på instrumentet för att mata ut verktyget plattan.
  3. Avlägsna verktyget plattan och lägga till cell plattan, utan locket, i samma riktning.
  4. Välj ”Load Cell platta” för instrumentet att ta i cell plåten och stäng facket och sedan påbörja analysen.
  5. Visa mätningarna i realtid med felstaplar på datorskärmen köra programvaran.
  6. Ta bort den utmatade cell plattan och patron när analysen är klar.
    Obs: Parade patroner och cell plattorna kan återanvändas 5 x.

10. efter mätning Analysis (dag 2)

  1. Använda en dissekera Mikroskop för att kontrollera att hjärnorna och de mikro-vävnad begränsningarna fortfarande sitter rätt i brunnen när analysen har slutförts. Utesluta eventuella brunnar med avvikelser från analysen.
  2. Exportera den syre förbrukning hastighet (OCR) och extracellulära försurning Rate (ECAR) data för vidare analys.

Representative Results

Det protokoll som presenteras här kräver användning av mikro-vävnad begränsningar som uppfyller de specifikationer som beskrivs nedan. Använda andra metoder för att hålla hjärnor på plats längst ned på plattan med 96 brunnar i cellen var misslyckade (figur 2A och 2B). Först testades olika agenter för att öka vävnad adherencen till plattan. Ett kommersiellt tillgängliga vävnad lim (Tabell för material) rekommenderas för användning av celler och organoids med cell plattor och sfäroid plattor, respektive. Inledningsvis, tycktes hjärnor följa väl ytan; dock syre förbrukning (OCR) avläsningarna var låga, och observerar brunnarna efter analysen avslöjade att hjärnan inte längre fästes vid väl ytan (figur 2A). Samma resultat inträffade med superlim (figur 2A). Nästa, tillverka små skärmar för att hålla hjärnan i en liten kammare på botten av brunnen försökte (figur 2B).

Metall skärmar producerade hög OCR avläsningar ensam, som metall skärmar med en polymer ring håller skärmen på plats (figur 2B). Plast mesh nät användes med samma polymer ring. Denna enhet orsakade en negativ OCR-läsning ska erhållas. Slutligen, mikro-vävnad begränsningar utformades med hjälp av en inert polymer för ringen mäter en yttre diameter av 0.146 i, en inre diameter av 0.1335 i, en tjocklek av 0.0125 i och en höjd av 0,016 i (Tabell för material). Superlim (Tabell för material) användes för att fästa ringen till en nylon mesh med en viss porstorlek på 0.0039 i diameter (Tabell för material). Porstorlek är kritisk, eftersom den tillåter media och metaboliten utbyte utan bildandet av luftbubblor, men ändå fortfarande fungerar som en barriär mot hjärnor. Dessa begränsningar enbart resultera i lite att inga OCR läsning, och när den används med hjärnor, ger reproducerbara mätvärden (figur 2A och 2B). Kontrollen efter analysen visade att hjärnan var fortfarande rätt placerade i brunnarna. Dessa vävnad begränsningar för närvarande inte är kommersiellt tillgängliga men kan tillverkas genom att följa ovanstående specifikation. Detta kräver exakt tillverkning, kommer de flesta verkstäder kunna reproducera denna återhållsamhet med de material som refereras till ovan.

Protokollet var ytterligare optimerad till konto för assay media, tidsfristen innan analysen kör och temperaturen (figur 3). Inledningsvis sattes analyser upp Schneider medium att modellera larver i vivo miljön. Men får inte media som används innehålla buffert agenter eftersom pH används för att mäta ECAR. Detta media, således måste vara anpassade gjort, vilket är kostsamt. För att optimera detta, var ett kommersiellt tillgängliga test media utformad för metabolisk analys (Tabell för material) används i stället för Schneider media. OCR nivåerna var oförändrad, även när öka glukosnivåerna något till modell assay media villkor (figur 3A). Alla analyser från denna punkt på genomfördes i analysmediet. Tillägg till media var optimerad genom att observera om syreförbrukningen och de extracellulära försurning priserna visade ett svar när de behandlades med kända mitokondrie-hämmare. Därefter analyserades väntetiden mellan dissektionerna och test körs. En inkubation av 3 h sjunkit betydligt OCR nivåerna (figur 3B). Figur 3D visar skillnaden vid den sjätte tidpunkt, vilket är när OCR och ECAR nivåerna stabilisera för både vuxna och larver hjärnor. Protokollet anger således för att påbörja analysen omedelbart efter dissektionerna, såvida inte experimentet kräver en temperatur Jämviktstiden, i vilket fall en inkubation för mindre än 30 min föreslås. Den metabola analyzer lagras i en inkubator inställd på 11 ° C för att möjliggöra en 25 ° C temperatur genom hela analysen. Om temperaturerna är förhöjda på grund av den omgivande temperaturen och hur instrumentet, observeras reducerade OCR nivåer (figur 3 c). Detta är en hypotes om för att bero på vävnadsdöd.

När de optimera villkor följs, analyserna med larver och vuxna hjärnor resultatet i avläsningar av OCR något överstiger 150 pmol/min vid den stabiliserade sjätte gången peka, ~ 25 min till analysen (figur 4B). Denna hastighet bibehålls i minst 30 min (figur 4A) och upp till 2 h (inga data anges). ECAR är något lägre i vuxna hjärnor än i larval hjärnor vid den sjätte tidpunkten (figur 4 d) och underhålls för minst 30 min (figur 4 c). Detta motsvarar en ökning av glykolys under larval stadier att stödja tillväxt. En injektion med en hämmare av mitokondrie, såsom oligomycin, sänker de OCR avläsningarna till avslöja den ATP-beroende respirationen, och ytterligare behandling med rotenon och antimycin A sänker OCR för att avslöja icke-mitokondriell syreförbrukning (figur 5A ). Dessa data visar att dessa hämmare är kunna penetrera hjärnvävnaden och kan användas för att jämföra mitokondriell respiration i hjärnor av varierande genotyper. För denna analys, mix, vänta, och åtgärden gånger var optimerad genom att observera syrehalten, inte materialåtgången, och att säkerställa att efter blandning, syrenivån tillbaka till nivån innan mätningen.

Figure 1
Figur 1: en schematisk av larval hjärnan OCR och ECAR mätningar i metabola analysatorn. Patronen är beredd en dag innan du kör analysen. Nästa dag, läggs droger till injektion hamnar i patronen. D. melanogaster larval hjärnor är dissekeras och mikro-vävnad begränsningar läggs till säkra hjärnan till botten av brunnen. Cell plattan med hjärnor har analyserats i den metaboliska analyzer och data analyseras. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Micro-vävnad begränsningar inte är metaboliskt aktiva och håller hjärnan i en kammare längst ned på en tallrik bra. (A) The OCR av Oregon-R D. melanogaster larval hjärnor mäts i brunnar belagd med vävnad tejp (Tabell för material) eller när hjärnorna limmas super till botten av brunnen. Resultaten jämförs med hjärnor placerad längst ned i brunnen med hjälp av mikro-vävnad begränsningar. (B) The OCR mäts i brunnar som innehåller assay media och metall, metall med en polymer ring, plast mesh nät och en polymer ring eller mikro-vävnad begränsningar. p-värdet < 0,05, ** p-värdet < 0,01, *** p-värdet < 0,001, *** p-värdet < 0,0001. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: optimering av media, inkubationstiden och temperatur. (A) The OCR mätt i Oregon-R D. melanogaster larval hjärnor med Schneider media (S2) med natrium pyruvat läggs, S2 med glukos och natrium pyruvat läggs till och assay media med glukos och natrium pyruvat lagt till. (B) The OCR mäts i larval hjärnor efter 3 timmars inkubering före analysen, eller efter 30 min inkubering före analysen. (C) The OCR mäts i larval brains på assay kör temperaturer på 33 ° C och 25 ° C. Den sjätte tidpunkten är diagram. (D) The OCR mäts i larval hjärnor efter 3 timmars inkubering före analysen, eller efter 30 min inkubering före analysen. Data redovisas för sjätte gången punkten. p-värdet < 0,05, ** p-värdet < 0,01, *** p-värdet < 0,001, *** p-värdet < 0,0001. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: De OCR och ECAR mäts reproducibly i vuxen och larver D. melanogaster brains. (A) The OCR mäts i Oregon-R D. melanogaster vuxna och larver hjärnor för 30 min. (B) The OCR data av den sjätte tidpunkten från panel A är ett diagram. Detta är den tidpunkt vid vilken OCR avläsningarna stabilisera. (C) The ECAR mäts i D. melanogaster vuxna och larver hjärnor för 30 min. (D) The ECAR data av den sjätte tidpunkten från panelen en är ett diagram. Detta är den tidpunkt vid vilken de ECAR avläsningarna stabilisera. p-värdet < 0,05, ** p-värdet < 0,01, *** p-värdet < 0,001, *** p-värdet < 0,0001. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: Oligomycin sänker D. melanogaster larval hjärnan OCR nivåerna att avslöja ATP-beroende respiration och Rotenon/antimycin ytterligare sänker OCR att avslöja icke-mitokondriell syreförbrukning. (A) The OCR mäts i Oregon-RD. melanogaster larval hjärnor efter en behandling med en 20 µM oligomycin och 5 µM Rotenon/antimycin A blandning. Kontroll och återhållsamhet-bara brunnar injicerades med assay media. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Här beskrivs en ny metod för metabolisk analys av D. melanogaster larver och vuxna hjärnor ex vivo . Under basala förhållanden anger syreförbrukning och extracellulära försurning priser hur metaboliskt aktiva hjärnan är och kan avgöra om en vävnad har blivit mer beroende av mitokondriell kontra glycolytic respiration, respektive11.

Behandling av hjärnor med hämmare eller terapeutiska läkemedel kan ge ytterligare information om metabolisk status av vävnad. Metaboliska substrat kan också läggas för att avgöra beroenden på specifika metaboliter, såsom glukos att testa för Warburg effekt22 eller glutamin att undersöka glutaminolysis23— båda common i metabola omprogrammering. För långsiktiga studier, larver eller flugor kan också matas droger istället för att använda injektion hamnar, och hjärnor kunde analyseras vid intervaller eller vid slutpunkten, beroende på experimentell design. Denna metod kan optimeras för många applikationer.

Denna metod har optimerats för hjärnor men kan användas för att analysera andra larver18 och vuxna vävnader. Dessutom kan andra små modellsystem använda denna metod för att mäta hela organismer18 eller vävnader. Den enda begränsningen att optimera denna metod för andra system är storleken av organ, vävnad eller organism. Kammaren skapad av mikro-vävnad fasthållningsanordningen är storlek barriären att köra analysen. Om metabola utdata är för låg för hjärnan eller vävnad som testas, och urvalets storlek är inte en begränsning, kan samla prover användas för att öka assay mätningar och känslighet. Ändra detta protokoll för andra program bör endast kräva mindre optimeringar, inklusive (1) att välja en lämplig åtgärd och blanda cykel nummer och timing, och 2) att fastställa effektiva behandlingen koncentrationer för vävnaden. Åtgärden och blandande gånger bestämdes genom övervakning syrekoncentrationen mätt i metabola Analyzer under varje cykel. Detta kan ses genom att välja O2 i Y2 axeln knappen i översiktsfönstret när körningen är klar. Under varje cykel, bör det finnas en drop-in syrekoncentration återspeglar den Tissues syreförbrukning under den uppmätta tiden, följt av en återgång till den ursprungliga syrekoncentrationen under skakningen. De mån och mix tiderna bör testas tills detta mönster har observerats. Med den här metoden, har andra insekt hjärnor studerats. Dessa hjärnor var större än flyga hjärnor används här men fortfarande passar i kammaren genereras av vävnad fasthållningsanordningen. OCR avläsningarna från dessa hjärnor var så hög som 400 pmol/min (inga data anges). Resultaten från dessa studier, samt OCR-priser som är i linje med andra studier som mäter hela-fly syre förbrukning18,24, tyder på att D. melanogaster hjärnor inte syre-begränsad. För både D. melanogaster hjärnor och vävnader från andra organismer kräver tillämpa denna metod särskild uppmärksamhet åt fyra kritiska steg.

För att framgångsrikt uppnå reproducerbara och biologiskt relevanta mätningar, finns det kritiska steg i protokollet som måste följas. Första krävs användningen av en fasthållningsanordning för mikro-vävnad för denna metod. Tillverkning av dessa begränsningar med hjälp av specifikationer och material är viktigt. Material valdes på grund av sin inert kemiska sammansättning och deras förmåga att tillåta korrekt media exchange under blandning stegen utan skapandet av luftbubblor. Andra, en läglig dissektion och plattan förberedelse krävs att maximera metabola utdata av vävnad. Kort dissektion gånger bör inte avsevärt försämrar hjärnan. Andra studier har visat att flyga hjärnor kan hållas vid liv i timmar till dagar efter dissektion om korrekt lagras i en perfusion kammare25. Som kan ses i figur 3B och 3D, om hjärnor är kvar sitter i assay media under lång tid före analysen, minskade dock de syre förbrukning. Under analysen genomgå prov en blandande steg under varje cykel. Denna blandning inte bara aids med injektioner av kemiska föreningar men också verkar för att återcirkulera media och ger syre. Hjärnan kan bo metaboliskt aktiva under längre perioder under dessa mått-blandning cykler än de skulle inkubation i media bänk längst upp. Därför bör dissektion av larval hjärnor bemästras innan du börjar ställa in denna analys. När inställningen upp denna analys, analysera ett litet antal genotyper samtidigt, för att minimera antalet hjärnor behövs och brunnar utnyttjas. Detta kommer att förhindra fördröjningar mellan den dissekera och assay mätningarna. För det tredje, att upprätthålla en stabil temperatur krävs att analysera de metabola priserna i fysiologiskt relevanta villkor. Ökad assay temperaturer kan orsaka vävnadsdöd, observeras av lägre syre förbrukning (figur 3 c). Om flugor föds vid annan temperatur i experimentsyfte, bör mätningarna också utföras vid denna temperatur. Medan dissektioner kommer sannolikt utföras vid rumstemperatur, om analysen kommer att genomföras vid annan temperatur, bör guldpläterade och återhållsam hjärnor inkuberas vid önskad temperatur för 15 min innan du kör analysen. Slutligen, Observera brunnar efter analysen är avgörande för att fastställa om vävnad positionering påverkat mätningarna. Ibland blir det en avvikare väl som, efter att observera plattan under dissekera mikroskopet, kan elimineras från dataanalysen på antingen förlust av vävnad eller mispositioning, där hjärnan har halkat ur centrum av brunnen och fastnar under polymer ringen av fasthållningsanordningen. Vävnaden kan förloras om fasthållningsanordningen säkrades inte korrekt till brunnen och stördes under blandning cyklerna. Medan ingen av dessa händelser händer ofta, om de inte är undantagna från analysen, kommer de lägre ränta värdena väsentligt.

Mätning av hela-vävnad metabola flux av övervakning syreförbrukning och extracellulära försurning ger en biologiskt relevanta metod för att förstå hur ämnesomsättningen påverkas av genetiska landskapet eller andra experimentella villkor. Denna metod är tillräckligt känslig för att upptäcka metaboliska förändringar i en enda D. melanogaster hjärnan, vilket inte är möjligt med stop-flow respiration eller indirekt kalorimetri. Det är också mindre tekniskt utmanande än att använda en Clark elektrod mäta syreförbrukning. Ytterligare en fördel med detta protokoll är förmågan att analysera en hela hjärnan per brunn. 96-väl formatet tillåter känsligare avläsningar, och således mer än en genotyp kan analyseras i taget på grund av det mindre antalet prover krävs per analys. Även mäta metabolismen i vävnad är fortfarande utmanande och kräver noggrant uppfödda och synkroniserade djur, detta protokoll beskriver en snabb, relativt förenklad metod, och har potential att analysera många metaboliska känslighet i D. melanogaster larver och vuxna hjärnor.

Disclosures

M. Tipping innehar provisoriska patent på de micro-vävnad begränsningar beskrivs i detta protokoll17.

Acknowledgments

Aktier som erhållits från Bloomington Drosophila lager Center (NIH P40OD018637) användes i denna studie. Den forskning som redovisas i denna publikation stöddes av institutionella Development Award (IDeA) nätverket för biomedicinsk forskning Excellence från National Institute of General Medical Sciences av National Institutes of Health under licensnummer P20GM103430, och av stiftelsen Rhode Island. Författarna tackar J. vatten och P. Snodgrass-bälte för deras stöd i utvecklingen av detta protokoll.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Assay medium Agilent 102365-100
Calibrant solution Agilent 100840-000
Corning Cell-Tak Cell Tissue Adhesive Sigma Aldrich DLW354240
delrin Grainger 2XMK6
Drosophila Schneider Media Thermo Fisher 21720-024
Dumont High Precision Tweezers (style 5) Ted Pella 5622
Loctite 409 Amazon
Mitostress kit  Agilent 103015-100 oligomycin, rotenone, and antimycin A included
Netwell inserts (6-well) VWR 29442-136
nylon mesh Component Supply U-CMN-64
Parafilm M wrapping film Fisher Scientific S37440
PYREX spot plate Fisher Scientific 13-748B
Seahorse XFe96 Analyzer Agilent
Wave v2.4 XFe96 analyzer software Agilent https://www.agilent.com/en/products/cell-analysis/software-download-for-wave-desktop free download to mac or windows
XFe96 catridge and cell plates Agilent 102416-100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cai, H., et al. Metabolic dysfunction in Alzheimer's disease and related neurodegenerative disorders. Current Alzheimer Research. 9, (1), 5-17 (2012).
  2. Zhao, S., et al. Glioma-derived mutations in IDH1 dominantly inhibit IDH1 catalytic activity and induce HIF-1alpha. Science. 324, (5924), New York, NY. 261-265 (2009).
  3. Brody, A. L., et al. Brain metabolic changes in major depressive disorder from pre- to post-treatment with paroxetine. Psychiatry Research. 91, (3), 127-139 (1999).
  4. Nagana Gowda, G. A., Djukovic, D. Overview of mass spectrometry-based metabolomics: Opportunities and challenges. Methods in Molecular Biology. 1198, 3-12 (2014).
  5. Dona, A. C., et al. A guide to the identification of metabolites in NMR-based metabonomics/metabolomics experiments. Computational and Structural Biotechnology Journal. 14, 135-153 (2016).
  6. Yuan, M., Breitkopf, S. B., Yang, X., Asara, J. M. A positive/negative ion-switching, targeted mass spectrometry-based metabolomics platform for bodily fluids, cells, and fresh and fixed tissue. Nature Protocols. 7, (5), 872-881 (2012).
  7. Zamboni, N., Fendt, S. -M., Rühl, M., Sauer, U. 13C-based metabolic flux analysis. Nature Protocols. 4, (6), 878-892 (2009).
  8. Duckwall, C. S., Murphy, T. A., Young, J. D. Mapping cancer cell metabolism with(13)C flux analysis: Recent progress and future challenges. Journal of Carcinogenesis. 12, 13 (2013).
  9. Clark, L. C., et al. Continuous recording of blood oxygen tensions by polarography. Journal of Applied Physiology. 6, (3), 189-193 (1953).
  10. Lighton, J. R. B. Measuring Metabolic Rates. Spatial Epidemiology: Methods and Applications. 87-103 (2000).
  11. Ferrick, D. A., Neilson, A., Beeson, C. Advances in measuring cellular bioenergetics using extracellular flux. Drug Discovery Today. 13, (5-6), 268-274 (2008).
  12. Dunham-Snary, K. J., Sandel, M. W., Westbrook, D. G., Ballinger, S. W. A method for assessing mitochondrial bioenergetics in whole white adipose tissues. Redox Biology. 2, (1), 656-660 (2014).
  13. Fan, Y. -Y., Davidson, L. A., Callaway, E. S., Wright, G. A., Safe, S., Chapkin, R. S. A bioassay to measure energy metabolism in mouse colonic crypts, organoids, and sorted stem cells. American Journal of Physiology - Gastrointestinal and Liver Physiology. 309, (1), G1-G9 (2015).
  14. Lee, H., et al. Increased mitochondrial activity in renal proximal tubule cells from young spontaneously hypertensive rats. Kidney International. 85, (3), 561-569 (2014).
  15. Volkenhoff, A., et al. Glial glycolysis is essential for neuronal survival in drosophila. Cell Metabolism. 22, (3), 437-447 (2015).
  16. Becker, L., Nogueira, M. S., Klima, C., De Angelis, M. H., Peleg, S. Rapid and transient oxygen consumption increase following acute HDAC/KDAC inhibition in Drosophila tissue. Scientific Reports. 8, (1), (2018).
  17. Method and device for restraining contents of a cell plate. United States patent. Tipping, M., Waters, J. 62/491,431 (2017).
  18. Neville, K. E., et al. A novel ex vivo method for measuring whole brain metabolism in model systems. Journal of Neuroscience Methods. 296, 32-43 (2018).
  19. Lardy, H. A., Johnson, D., McMurray, W. C. Antibiotics as tools for metabolic studies. I. A survey of toxic antibiotics in respiratory, phosphorylative and glycolytic systems. Archives of Biochemistry and Biophysics. 78, (2), 587-597 (1958).
  20. Turrens, J. F., Boveris, A. Generation of superoxide anion by the NADH dehydrogenase of bovine heart mitochondria. Biochemical Journal. 191, 421-427 (1980).
  21. Potter, V. R., Reif, A. E. Inhibition of an electron transport component by antimycin A. The Journal of Biological Chemistry. 194, (1), 287-297 (1952).
  22. Warburg, O. On the Origin of Cancer Cells. Science. 123, (3191), 309-314 (1956).
  23. Yang, L., Venneti, S., Nagrath, D. Glutaminolysis: A Hallmark of Cancer Metabolism. Annual Review of Biomedical Engineering. 19, (1), 163-194 (2017).
  24. Van Voorhies, W. A. Metabolic function in Drosophila melanogaster in response to hypoxia and pure oxygen. The Journal of Experimental Biology. 212, (19), 3132-3141 (2009).
  25. Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of developing and adult Drosophila brains and retinae for live imaging. Journal of Visualized Experiments. (37), e1936 (2010).
Metabolisk analys av <em>Drosophila melanogaster</em> Larval och vuxna hjärnor
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Neville, K. E., Bosse, T. L., Klekos, M., Mills, J. F., Tipping, M. Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains. J. Vis. Exp. (138), e58007, doi:10.3791/58007 (2018).More

Neville, K. E., Bosse, T. L., Klekos, M., Mills, J. F., Tipping, M. Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains. J. Vis. Exp. (138), e58007, doi:10.3791/58007 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter