Summary
Vi presenterer en protokoll for å måle oksygenforbruk og ekstracellulære forsuring i Drosophila melanogaster larver og voksne hjerner. En metabolsk analysator benyttes med en tilpasset og optimert protokoll. Mikro-vev begrensninger ble er en kritisk komponent i denne protokollen utformet og laget spesielt for bruk i denne analysen.
Abstract
Denne protokollen beskriver en metode for å måle metabolismen i Drosophila melanogaster larver og voksne hjerner. Kvantifisere stoffskiftet i hele organer gir en vev-nivå forståelse av energi utnyttelse som ikke kan fanges når du analyserer primære celler og linjer. Denne analysen er ex vivo, det gir målenheten fra en rekke spesialiserte celler som arbeider sammen for å utføre en funksjon i en vev og modeller nærmere i vivo orgel. Metabolsk omprogrammering har blitt observert i mange nevrologiske sykdommer, inkludert neoplasi og nevrodegenerative sykdommer. Denne protokollen ble utviklet for å hjelpe D. melanogaster samfunnet undersøkelse av metabolismen i nevrologisk sykdom modeller med en kommersielt tilgjengelig metabolske analysator. Måle metabolismen av hele hjernen i metabolske analysatoren er utfordrende på grunn av geometrien i hjernen. Denne analyzer krever prøver å holde seg på bunnen av en 96-brønns plate. Cellen vareprøver og vev slag kan følge overflaten av cellen platen eller utnytte spheroid plater, henholdsvis. Imidlertid hindrer sfærisk, tredimensjonal form av D. melanogaster hjernen vev fra å platen. Denne protokollen krever en spesielt utformet og produsert mikro-vev selvbeherskelse som omgår dette problemet ved å hindre enhver bevegelse av hjernen samtidig gir metabolske målinger fra de analyserer to SSD sensor sonder. Oksygenforbruk og ekstracellulære forsuring priser er reproduserbare og følsom for behandling med metabolske hemmere. Med en mindre optimalisering, kan denne protokollen tilpasses for bruk med alle hele vev og/eller modellsystem, såfremt utvalgsstørrelsen ikke overstiger kammeret generert av tilbakeholdenhet. Mens basal metabolske målinger og en analyse etter en behandling med mitokondrie hemmere er beskrevet i denne protokollen, kunne utallige eksperimentelle forhold, som energi kilde preferanse og oppdrett miljø, bli avhørt.
Introduction
Metabolsk omprogrammering har blitt identifisert i mange nevrologiske sykdommer, inkludert glioblastom Multiforme (GBM), Huntingtons sykdom og store depressiv lidelse (MDD)1,2,3. Som metabolismen blir fokus for strategier, har verktøy for grunnleggende metabolske forskning avanserte. De fleste av disse metodene ble designet linjer og primære celler eller analysere større vev etter fiksering eller -frysing. Noen metoder har stolt på kits simplistically måle bestemt metabolitter, mens andre har benyttet mer kostbart og komplisert analyser utnytte Ture i kombinasjon med massespektrometri4 for samme mål. For å forstå større metabolske landskapet, metabolske profilering5,6 og metabolske flux analyse (UD)7 dukket opp for å utfylle de store proteomic og genomisk studier. Profilering gir en kvantitativ representasjon av metabolitter i en celle eller vev på et tidspunkt i tid, mens MFA utvider på dette ved at sporing av merket metabolitter over tid. Sistnevnte har vært nyttig å avsløre hvordan energikilder benyttes annerledes i en celle eller vev i sykdom staten8. Disse metodene inkluderer imidlertid ikke måling av samlet metabolske rate.
For å avhøre samlede metabolsk delstaten lite systemene, kan tradisjonelle metoder, som Clark elektrode9 og indirekte calorimetry10, brukes til å måle oksygenforbruk eller konfigurert for Stopp flyt respirometry, til måle oksygen og karbondioksid konsentrasjon, henholdsvis. Disse teknikkene, har mens nøyaktig gir innsikt i avlesning av metabolske omprogrammering på organismen nivå, begrensninger. Bruk av Clark elektroden kan være teknisk utfordrende og er ikke utformet for høy gjennomstrømming studier. Stopp flyt respirometer kan ikke fungere med følsomhet må analysen eller vev. Flere år siden, utviklet ny teknologi spesielt for disse mindre programmer11. Disse instrumentene var opprinnelig ment å måle oksygenforbruk og ekstracellulære forsuring av linjer og primære celler i 24 - eller 96-brønnen format. Enkelheten i oppsett og data output etablerte denne metoden som et alternativ til de tradisjonelle tilnærmingene. Denne metoden er et kraftig verktøy for celler nylige fremskritt har lov for måling av vev slag12,13,14. Metodene benyttet i disse analyser tillater imidlertid ikke for måling av hele organer fra små modellsystemer.
Metabolsk analyse av sykdom modeller innebærer ofte samspillet mellom cellene i spesialiserte funksjonen bosatt innenfor samme vev. For eksempel produsere gliacellene metabolitter benyttes av neurons. Disse metabolske interaksjoner kreves for neuronal overlevelse15. Lite systemer er fordelaktig for å undersøke spørsmål som disse. Studier for å måle metabolismen av et hele organ, som inneholder en rekke celletyper, legger til forståelsen av energi utnyttelse i vivo. Nylig, Becker et al. rapportert en metode for å måle oksygenforbruk i hele fly hoder16. Ved pooling flere hoder sammen i en brønn av en 24-vel celle plate, ble oksygen forbruk målinger innhentet ved hjelp av en metabolsk analysator. Mens dette fungerer godt for hoder, som er lett skilles fra kroppen, er det mye vanskeligere å bruke for organer som larver hjernen, fordi en stor mengde må være dissekert for denne metoden. Derfor ble metode bruker en 96-brønns celle plate, som øker følsomheten oksygenforbruk og ekstracellulære forsuring opplesninger, utviklet for å analysen en enkelt hele larver hjerne.
Metabolsk analysatoren brukt i denne studien krever prøven måles for å være nederst på av en 96-brønns celle plate. For celler og relativt flat vev er dette ikke en utfordring; men for D. melanogaster larver og voksne hjernen er det ikke mulig å bruke tradisjonelle plate belegg protokoller. Sfærisk tredimensjonal form av hjernen vil ikke pålitelig overholder tallerken overflaten, og de som gjør er ofte skadet under forsøk på å plassere dem riktig i brønnen. En viktig del av denne nye protokollen er design og utvikling av mikro-vev begrensninger17 som gir et lite kammer for hjernen å ligge i uten å forstyrre metabolske målinger. Kammeret generert er rundt 0.016 i høyde og gir nok plass holder mange D. melanogaster hjernen. Baksetet består av nylon maske festet til en inert polymer ring og vil bli diskutert nærmere i Representant resultater. Med disse begrensninger reduserer tiden det tar å forberede dissekert hjerner metabolske målingen. Optimalisere måling fremgangsmåten genererer jevn, reproduserbare oksygenforbruk og ekstracellulære forsuring priser etter seks målesykluser (av 25 min). Hjernen være metabolically aktiv under disse forholdene i minst 2 h, som gjør injeksjoner av therapeutics, hemmere, eller andre behandlinger via metabolske analyzer patron stoffet levering portene. Denne protokollen kan også være enkelt tilpasses til andre vev og lite systemer18.
Protokollen nedenfor beskriver hvordan du analysen oksygenforbruk i hele Drosophila larver hjernen når utfordret mitokondrie stress. Stress hjernen, legges oligomycin til hemme ATP syntase19. Nedgangen i oksygenforbruk fra basale målinger viser en måling av hvor mye ATP-avhengig av åndedrett i hjernen. Ytterligere nedgang i oksygen inntak etter behandlinger med rotenon20 og antimycin21, hemmere av elektronet transport kjeden komplekser I og III, henholdsvis angir mengden ikke-Mitokondrielt oksygenforbruk i den hjernen. Denne analysen er et eksempel på hvordan mitokondrie åndedrett i et fly hjernen kan sammenlignes og hvordan denne protokollen kan brukes til å sammenligne metabolismen i ulike genotyper. Men kan denne protokollen tilpasses for å måle bare basale oksygenforbruk og ekstracellulære forsuring priser, samt å utforme mer omfattende studier som undersøker spesifikke energi utnyttelse eller substrat utnyttelse hypoteser.
Protocol
1. analysen forberedelse (dag 1)
- Plass den metabolske analyzer (Tabell for materiale) i en inkubator eller et temperaturkontrollerte rom satt til 11 ° C.
Merk: Denne temperaturen er ideell for målinger tatt ved 25 ° C, som gjør det mulig for ~ 14 ° C temperatur svingningene som oppstår når du kjører analysen. Dette er forårsaket av varmen som genereres av apparatet under kjøringen. - Åpne riktig programvare på datamaskinen som er koblet til den metabolske analyzer. Klikk på numeriske temperaturen i nederst til venstre på skjermen. I det nye vinduet som åpnes, klikk på boksen ved siden av kommandoen "Ovnen på" og sikre du har merket. Justere temperaturen å 25 ° C og justere toleranseområdet 0,2 ° c bruke pilene.
Merk: Flere timer må oppnå stabil temperatur. - Åpne beholderen patron (Tabell for materiale) og ta tonerkassetten fra verktøyet platen uten å berøre sonder.
Merk: Verktøyet platen brukes under kalibrering av kassetten og brukes ikke mens metabolske analysen kjøres. - Legge til 200 μL av en calibrant løsning (Tabell for materiale) i verktøyet plate og plass kassetten tilbake over verktøyet platen rehydrate sensoren sonder på kassetten. Ikke berør sonder og beskytte dem mot lyset.
- Forsegle kassetten med parafin filmen.
- Inkuber kassetten overnatting på 25 ° C.
2. analysen Media forberedelse (dag 2)
- Legge til 10 mM glukose og 10 mM natrium pyruvate til analysen medium.
- Inkuber medium ved 25 ° C til væsken har equilibrated å denne temperaturen.
- Justere pH 7,4 bruker en pH-meter.
3. installasjon av programvare for metabolske analyse av Drosophila melanogaster hjernen (dag 2)
- Definere metabolske programvaren på metabolske analysatoren brukte i trinn 1.2.
- Velg "Mal" på programvare Hjem-skjermen.
- Dobbeltklikk på "Tomt" for å starte en ny analysen design.
- Klikk på knappen "Plate kart" i den øverste verktøylinjen vise utformingen av cellen analysen platen.
Merk: Cellen analysen platen inneholder hjernen prøvene og vil bli koblet sammen med kassetten før metabolske analysen kjøres. -
Klikk Legg til grupper knappen 3 x.
- Dobbeltklikk på "Gruppe 1" etiketten og endre navnet til "Experimental".
Merk: Denne gruppen inneholder en fly hjerne og en mikro-vev selvbeherskelse behandlet med narkotika. - Dobbeltklikk på "Group 2" etiketten og endre navnet til "Control".
Merk: Denne gruppen inneholder en fly hjerne og en mikro-vev selvbeherskelse med ingen behandling. - Dobbeltklikk på den "gruppe 3" merke og endre navnet til "tilbakeholdenhet bare".
Merk: Denne gruppen inneholder en mikro-vev selvbeherskelse uten hjerne eller behandling.
- Dobbeltklikk på "Gruppe 1" etiketten og endre navnet til "Experimental".
-
Tilordne brønnene hver gruppe basert på hvor prøver i cellen platen skal plasseres.
- Klikk på "Experimental" etiketten og deretter utheve brønner B2 - B8 på plate kartet.
- Klikk på "Kontroll" etiketten og deretter utheve brønner C2-C8 på plate kartet.
- Klikk på den "tilbakeholdenhet bare" etikett og høydepunkt brønner D2-D8 på plate kartet.
- Kontroller at alle fire hjørnene (A1, A12, H1 og H12) er angitt som bakgrunn.
Merk: Brønner langs perimeteren på platen brukes ikke til å redusere noen kanteffekter. Dette er en standardinnstilling i programvaren.
-
Klikk på knappen "Protocol" i den øverste verktøylinjen til å definere protokollen.
- Klikk på "Rediger måling detaljer" i boksen opprinnelig plan måling.
- Justere tiden at metabolsk analysatoren måler hjernen ved å endre basale tiltaket syklustiden "3:00" ved å klikke opp- og nedpilene.
- Juster tiden metabolske analysatoren vil vente mellom hjernen målinger ved å endre basale ventetiden syklustiden til "0:00" ved å klikke opp- og nedpilene.
- Juster tiden metabolske analysatoren vil blande media før måle hjernen ved å endre de basale blande syklustiden til "1:00" ved å klikke opp- og nedpilene.
- Juster det totale antallet basale sykluser, som inkluderer mål, vente og blande sykluser, til "7" ved å klikke opp- og nedpilene.
Merk: Stabil oksygen forbruksraten målene er oppnådd etter ~ 25 minutter fra starten av analysen. - Klikk på knappen "Legg til injeksjon", i øvre venstre verktøylinjen.
- Klikk på "injeksjon etiketten" og endre den til "Oligomycin".
- Justere injeksjon mål, vente og blanding ganger som passer for de basale.
- Juster det totale antallet injeksjon sykluser til "6" ved å klikke opp- og nedpilene.
- Gjenta 3.7.6 - 3.7.8 men endre etiketten til "Rot/AA" og justere antall injeksjon sykluser til 7 ved å klikke opp- og nedpilene.
- Klikk på knappen "Kjør analysen" i den øverste verktøylinjen.
- "Lagre" analysen og klargjør analysen kassetten (Tabell for materiale).
4. forberedelse av kassetten for kalibrering (dag 2)
-
Ta tonerkassetten settefiskanlegg 25 ° C og dekselet.
- Legge til 20 μL 100 μM oligomycin liten øvre venstre sirkulær injeksjon havnen, port A, i kassetten alle tilsvarende eksperimentelle brønner på cellen plate og legge til 20 μL analysen media port A i alle andre brønner, inkludert kontroll og bakgrunn brønnene.
Merk: Patronen inneholder 4 porter (AD) for hver av 96 tilsvarer celle platen hva inneholder prøvene. Dette trinnet er gjort før du legger prøvene. Legge til 20 μL 100 μM oligomycin resultater i en endelig oligomycin konsentrasjon på 10 μM i cellen platen vel når stoffet injiseres av metabolske analyseringen. Oligomycin er en inhibitor av ATP syntase. Oksygen forbruk resultatverdien vil gjenspeile ATP-tilknyttet åndedrett i hjernen. For å riktig injisere narkotika i angitte brønnene, må alle portene på samme bokstav fylles med samme volum flytende, selv om ikke i bruk. - Legge til 22 μL 50 μM rotenon/antimycin A i øvre høyre sirkulær havn, port B i kassetten alle tilsvarende eksperimentelle brønner på cellen plate og legge 22 μL analysen media port B alle andre brønner, inkludert kontroll og bakgrunn brønnene.
Merk: Dette resulterer i en siste rotenon/Antimycin en konsentrasjon på 5 μM i cellen platen vel når stoffet injiseres av metabolske analyseringen. Rotenon og antimycin A er hemmere av elektronet transport kjeden komplekser I og III, henholdsvis. Oksygen forbruk resultatverdien gjenspeiler ikke-Mitokondrielt åndedrett i hjernen. - Klikk "Start Kjør" plassere lastet kassetten med verktøyet platen i metabolske analysatoren med godt A1 plassert i øvre venstre hjørne når mot instrumentet, med plate loader fra høyre side av maskinen.
- Legge til 20 μL 100 μM oligomycin liten øvre venstre sirkulær injeksjon havnen, port A, i kassetten alle tilsvarende eksperimentelle brønner på cellen plate og legge til 20 μL analysen media port A i alle andre brønner, inkludert kontroll og bakgrunn brønnene.
- Velg "I 'm Ready" i programvaren å starte balanse og kalibrering av kassetten før analysen metabolske med cellen platen inneholder prøvene.
Merk: Programmet vil be om å lagre filen og deretter starte equilibrating og kalibrere. Denne fremgangsmåten kan ta opptil 1 h. trinn 5-8 er utført i løpet av balanse og kalibrering tiden.
5. forberedelse av mikro-vev begrensningene (dag 2)
- Velg 1 mikro-vev tilbakeholdenhet per hjernen som måles, pluss minst 3 for bruk som tilbakeholdenhet-bare kontroller, fra beholderen (inneholder 70% etanol).
- Skyll begrensninger med fersk 70% etanol og vaske dem med deionisert vann 3 x i 2 minutter hver, med en mesh kurv og 6-vel plate (Tabell for materiale). Legge til ekstra vann vasker hvis begrensninger likevel gi alkohol lukter.
- Vask mikro-vev begrensninger i analysen media og la dem i denne løsningen til de er klare til bruk.
6. Disseksjon av Drosophila melanogaster larver hjerner (dag 2)
- Velg slutten (vandrende) tredje skikkelsen Larvene ampuller av kultivert Oregon-R fluer med høy presisjon, stil 5 (0,10 x 0,06 mm2) pinsett.
- Plass Larven i av en ren dissecting spotplate (Tabell for materiale) som inneholder 500 μL 1 x PBS.
Merk: En spotplate er en glassplate med depresjoner, brukes til å analysere liten vev og organismer. - Vask Larven ved å riste den forsiktig i brønnen, ved hjelp av pinsett.
- Flytt Larven ren godt av en spotplate inneholder 500 μL 1 x PBS.
- Plass spotplate under dissecting mikroskop.
- Forstå Larven på sin midsection med ett par pinsett, mens fatte øyekroker med et par pinsett.
- Forsiktig og jevnt dra Larven i motsatt retning bruke de to settene med pinsett.
- Visualisere hjernen, som vanligvis opphold knyttet til øyekroker og vil vanligvis ha øye-antennal plater knyttet til den.
- Nøye fjerne ekstra vev fra hjernen, hjelp av øyet kroker for å holde hjernen på plass. Til slutt skille øyekroker fra hjernen.
- Bruke pinsett flytte dissekert hjernen til en ny brønn på en spotplate som inneholder 1 x PBS.
- Gjenta trinn 6.1-6.10 til 14 hjerner er dissekert.
Merk: Den totale tiden fra starten av dissection for analysen kjøring må ikke overstige 30 min.
7. tillegg av dissekert hjernen til 96-brønns metabolske analysen celle Plate (dag 2)
- Tilsett 50 μL av analysen media fordelt av 96-brønns metabolske analysen plate (Tabell for materiale) brukes i eksperimentet, inkludert den eksperimentelle, kontroll, tilbakeholdenhet-bare, og bakgrunnen brønner.
- Forsiktig plassere én hjerne i hver brønn fra A2-A8 og B2-B8 av cellen plate, bruke pinsett, en slikkepott eller en pipette.
Merk: Dette kan gjøres fra dissecting mikroskopet. - Under disseksjon mikroskopet, bruker du en bøyd nål mikro-sonden for å synke hjernen til bunnen av brønnen.
- Forsiktig plassere hjernen i tre hevet kulene ved hjelp av sonden.
8. tillegg av mikro-vev begrensningene til 96-brønns metabolske analysen celle Plate (dag 2)
- Ved hjelp av pinsett, plassere den mikro-vev tilbakeholdenhet i utkanten av analysen platen godt, og bruk mikroskopet undersøke at det er orientert med plast ringen ned og mesh på toppen.
- Fjern platen under mikroskopet og bruke pinsett for å forstå tilbakeholdenhet på begge sider, og slipp den forsiktig inn i brønnen.
- Bruk en bøyd nål mikro-sonden for å presse tilbakeholdenhet i brønnen.
- Under mikroskopet, kontroller at hjernen kan ses gjennom den vev tilbakeholdenhet og at det er sentrert i brønnen.
- Gjenta trinn 8.1-8.4 for alle brønnene som vil være i analysen, A2-A8, B2-B8 og C2-C8.
- Forsiktig legge til 130 μL av analysen media til hver av den eksperimentelle, kontroll og tilbakeholdenhet bare brønner.
- Kontroller at hjernen og mikro-vev baksetet ikke har flyttet mens media ved å visualisere dem under mikroskopet.
- Legg til 180 μL analysen media fire hjørne brønnene for bruk som bakgrunn.
9. tillegg av cellen platen til metabolske Analyzer og starten av analysen (dag 2)
- Kontroller at balanse og kalibrering er fullført ved å vente programvaren ber om cellen platen inneholder utvalget.
- Velg "Åpne brett" og vent for instrumentet å mate ut platen verktøyet.
- Fjerner verktøyet platen og legge celle platen, uten lokket, i samme retning.
- Velg "Last celle Plate" instrumentet til å ta i cellen platen og Lukk skuffen, og deretter starte analysen.
- Se målene i sanntid med feilfelt på dataskjermen kjører programvaren.
- Fjern utløst celle plate og patron når analysen er fullført.
Merk: Sammenkoblede kassetter og celle plater kan være re-anvendt 5 x.
10. etter måling analyse (dag 2)
- Bruk dissecting mikroskop for å verifisere at hjernen og mikro-vev begrensninger er fortsatt plassert riktig i brønnen når analysen er fullført. Utelukke noen brønner med avvik fra analysen.
- Eksportere oksygen forbruk Rate (OCR) og ekstracellulære forsuring Rate (ECAR) data for videre analyse.
Representative Results
Protokollen presenteres her krever bruk av mikro-vev begrensninger som oppfyller spesifikasjonene beskrevet nedenfor. Bruke andre metoder for å holde hjernen på plass nederst i 96-brønnen celle plate var mislykket (figur 2A og 2B). Først testet ulike agenter til å øke vev tilslutning til platen. Et kommersielt tilgjengelig vev lim (Tabell for materiale) anbefales for bruk av celler og organoids med cellen og formet plater, henholdsvis. I utgangspunktet syntes hjerner å følge godt overflaten; men oksygen forbruk (OCR) målingene var lav, og observere brønnene etter analysen avdekket at hjernen var ikke lenger knyttet til godt overflaten (figur 2A). De samme resultatene oppstod med superlim (figur 2A). Neste, produksjon små skjermer å holde hjernen i et lite kammer på bunnen av brønnen ble forsøkt (figur 2B).
Metall skjermer produsert høy OCR opplesninger alene, som metall skjermer med en polymer ring holder skjermen på plass (figur 2B). Plast mesh netting ble brukt med samme polymer ring. Denne enheten forårsaket en negativ OCR lesing innhentes. Til slutt, mikro-vev begrensninger ble utformet med en inert polymer for ringen måle en ytre diameter på 0.146 i en diameter på 0.1335 i tykkelse på 0.0125 i, og en høyde på 0.016 i (Tabell for materiale). Superlim (Tabell for materiale) ble brukt til å knytte ringen til en nylon maske med en bestemt porestørrelse av 0.0039 i diameter (Tabell for materiale). Porestørrelse er kritisk, som det tillater media og metabolitten utveksling uten dannelsen av luftbobler, men fortsatt fungerer som en barriere til hjernen. Disse begrensninger alene resultere i liten eller ingen OCR lesing, og når den brukes med hjernen, tillate reproduserbar målinger (figur 2A og 2B). Verifikasjon etter analysen viste at hjernen var fremdeles plassert riktig i brønnene. Disse vev begrensninger er ikke kommersielt tilgjengelige men kan produseres av etter spesifikasjonen ovenfor. Mens dette krever nøyaktig fremstilling, vil de fleste maskin butikker kunne reprodusere dette beherskelse av materialer referert ovenfor.
Protokollen ble ytterligere optimalisert kontoen for analysen media, tidsfristen før analysen kjører og temperaturen (Figur 3). I utgangspunktet ble analyser satt opp i Schneider medium å modellere larver i vivo miljøet. Men kan ikke mediene som brukes inneholde bufring agenter pH brukes til å måle ECAR. Dette derfor må være tilpasset laget, som er kostbart. For å optimalisere dette, ble et kommersielt tilgjengelig analysen media beregnet på metabolske analyse (Tabell for materiale) brukt i stedet for Schneider media. OCR nivåene var uendret, selv når øker blodsukkeret litt til modell analysen media forhold (figur 3A). Alle analyser fra dette punktet ble utført i analysen medium. Kosttilskudd til media var optimalisert ved å observere om oksygenforbruk og ekstracellulære forsuring priser viste et svar når behandlet med kjente mitokondrie hemmere. Deretter ble ventetiden mellom disseksjoner og analysen går analysert. En inkubasjonstiden for 3t falt betydelig OCR nivåer (figur 3B). Figur 3D viser forskjellen på det sjette punktet, som er når de OCR og ECAR nivåene stabilisere for både voksne og larver hjerner. Dermed angir protokollen for å starte analysen umiddelbart etter disseksjoner, med mindre eksperimentet krever en temperatur balanse, som foreslås saken en inkubasjonstiden for mindre enn 30 min. Metabolsk analysatoren lagres i en inkubator satt til 11 ° C for å tillate en 25 ° C temperatur i hele analysen. Hvis temperaturen er forhøyet omgivelsestemperaturen og instrument operasjonen, er reduserte OCR nivåer observert (Figur 3 c). Dette er hypotesen for å være vev død.
Når optimalisert forholdene er fulgt, analyser med larver og voksne hjerner resultatet i målinger av OCR litt over 150 pmol/min på den stabilisert sjette gang peker, ~ 25 min i analysen (figur 4B). Denne rate er opprettholdt for minst 30 min (figur 4A) og opptil 2 h (data ikke vist). ECAR er litt lavere i voksen hjernen enn i larver hjernen på det sjette tidspunktet (Figur 4 d) og opprettholdes i minst 30 min (figur 4C). Dette funnet tilsvarer en økning i Glykolysen under den larver stadier å støtte veksten. Injeksjon med en mitokondrie inhibitor, som oligomycin, senker OCR målingene å avsløre ATP-avhengige åndedrett, og videre behandling med rotenon og antimycin A senker OCR for å vise ikke-Mitokondrielt oksygenforbruk (figur 5A ). Dataene viser at disse hemmere kan trenge hjernevevet og kan brukes til å sammenligne mitokondrie åndedrett i hjernen av varierende genotyper. Denne analysen, mix, vent, og mål ganger var optimalisert ved å observere oksygen nivåer, ikke forbruksraten, og sikre det etter blanding, oksygennivået tilbake til nivået før måling.
Figur 1: en skjematisk av larver hjernen OCR og ECAR mål i metabolske analysatoren. Patronen er utarbeidet en dag før du kjører analysen. Neste dag, legges narkotika til injeksjon portene på kassetten. D. melanogaster larver hjerner er dissekert og mikro-vev begrensninger legges til sikre hjernen til bunnen av brønnen. Cellen platen med hjernen er assayed i metabolske analyzer og dataene er analysert. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Micro-vev begrensninger er ikke metabolically aktiv og holde hjernen i et kammer nederst på en plate godt. (A) The OCR Oregon-R D. melanogaster larver hjerner måles i brønner belagt med vev lim (Tabell for materiale), eller når hjernen er super festet til bunnen av brønnen. Resultatene er enn de av hjernen plassert på bunnen av brønnen med mikro-vev begrensninger. (B) The OCR måles i brønner som inneholder analysen media og metall, metall med en polymer ring, plast mesh netting og en polymer ring eller mikro-vev begrensninger. p-verdien < 0,05, ** p-verdien < 0,01, *** p-verdien < 0,001, *** p-verdien < 0,0001. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: optimalisering av media, inkubasjonstiden og temperatur. (A) The OCR er målt i Oregon-R D. melanogaster larver hjerner Schneider media (S2) med natrium pyruvate lagt, S2 med glukose og natrium pyruvate lagt analysen media med glukose og natrium pyruvate lagt til. (B) The OCR måles i larver hjernen etter 3 timer med inkubering før analysen, eller etter 30 min med inkubering før analysen. (C) The OCR måles i larver hjernen på analysen kjøre temperaturer på 33 ° C og 25 ° C. Sjette tidspunktet er grafisk. (D) The OCR måles i larver hjernen etter 3 timer med inkubering før analysen, eller etter 30 min med inkubering før analysen. Data rapporteres for sjette tidspunktet. p-verdien < 0,05, ** p-verdien < 0,01, *** p-verdien < 0,001, *** p-verdien < 0,0001. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: OCR og ECAR måles reproduserbar i voksne og larver D. melanogaster hjerner. (A) The OCR måles i Oregon-R D. melanogaster voksne og larver hjernen for 30 min. (B) The OCR data av sjette tidspunktet panelet A for grafisk fremstilling. Dette er tidspunktet for OCR målingene stabilisere. (C) The ECAR måles i D. melanogaster voksne og larver hjernen for 30 min. (D) det ECAR data av sjette tidspunktet panelet en grafisk fremstilling. Dette er tidspunktet da ECAR målingene stabilisere. p-verdien < 0,05, ** p-verdien < 0,01, *** p-verdien < 0,001, *** p-verdien < 0,0001. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Oligomycin senker D. melanogaster larver hjernen OCR nivåer å avsløre ATP-avhengige åndedrett og rotenon/antimycin ytterligere senker OCR å avsløre ikke-Mitokondrielt oksygenforbruk. (A) The OCR måles i Oregon-RD. melanogaster larver hjernen etter en behandling med 20 µM oligomycin og 5 µM rotenon/antimycin A blanding. Kontroll og tilbakeholdenhet bare brønner ble injisert med analysen media. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Her er en ny metode for metabolske analyse av D. melanogaster larver og voksne hjerner ex vivo beskrevet. Under basale forhold angi oksygenforbruk og ekstracellulære forsuring priser hvordan metabolically aktiv hjernen er og kan avgjøre om en vev blitt mer avhengig mitokondrie versus glycolytic åndedrett, henholdsvis11.
Behandle hjernen med hemmere eller terapeutisk medisiner kan gi ytterligere informasjon om metabolske av vev. Metabolsk underlag kan også legges til å angi avhengigheter på bestemte metabolitter, som glukose å teste for Warburg effekt22 eller glutamin undersøke glutaminolysis23-både vanlig i metabolske omprogrammering. For langsiktige studier, larver eller fluer kan også bli matet narkotika i stedet for injeksjon porter, og hjernen kan være assayed med mellomrom eller på slutten-punktet, avhengig av eksperimentell design. Denne metoden kan optimaliseres for mange programmer.
Denne metoden er optimalisert for hjernen, men kan brukes til å analysere andre larver18 og voksen vev. I tillegg kan andre lite-systemer bruke denne metoden til å måle hele organismer18 eller vev. Den eneste begrensningen eller optimalisere denne metoden for andre systemer er størrelsen av orgel, vev eller organisme. Kammeret skapt av den mikro-vev tilbakeholdenhet er størrelse barriere å kjøre analysen. Hvis metabolske produksjonen er for lav for hjernen eller vev blir testet, og utvalgsstørrelsen er ikke en betingelse, kan pooling prøver brukes å øke analysen målinger og følsomhet. Å endre denne protokollen for andre programmer bør bare krever mindre optimaliseringer, inkludert 1) å velge det aktuelle tiltaket og bland syklus tall og timing og 2) bestemme effektiv behandling konsentrasjoner for vevet. Mål og miksing ganger ble fastsatt av overvåking oksygen konsentrasjon målt av metabolske analyseringen under hver syklus. Dette kan sees ved å velge O2 knappen Y2 aksen i oversiktsvinduet etter fullført. I løpet av hver syklus, bør det være en drop-in oksygen konsentrasjon reflekterer vevets oksygenopptak ved den målte tiden, etterfulgt av en tilbake til den opprinnelige oksygen konsentrasjonen under miksing syklus. Mål og bland tidene bør testes før dette mønsteret er observert. Bruker denne metoden, har andre insekt hjerner blitt studert. Disse hjernen var større enn fly hjernen brukt her, men fortsatt passer innenfor kammeret generert av vev tilbakeholdenhet. OCR målinger fra disse hjernen var så høyt som 400 pmol/min (data ikke vist). Resultatene fra disse studiene, samt OCR priser som samsvarer med andre studier måle hele-fly oksygen forbruk18,24, tyder på at D. melanogaster hjernen ikke var oksygen-begrenset. For både D. melanogaster hjernen og vev fra andre organismer krever bruk denne metoden spesiell oppmerksomhet til fire avgjørende skritt.
For å kunne oppnå reproduserbare og biologisk relevante målinger, er det kritisk trinn av protokollen som må følges. Først, bruk av en mikro-vev selvbeherskelse er obligatorisk for denne metoden. Produksjon disse begrensninger med spesifikasjoner og materialer som er nevnt er viktig. Materialet ble valgt inert kjemiske sammensetningen og deres evne til å tillate riktig exchange under miksing trinnene uten å skape luftbobler. Andre er en betimelig disseksjon og plate forberedelse nødvendig å maksimere metabolske produksjonen av vev. Kort disseksjon ganger bør ikke betydelig svekke hjernen. Andre studier har vist at fly hjerner kan holdes i live timer til dager etter disseksjon Hvis riktig lagret i en kammer25. Men som vist i figur 3B og 3D, hvis hjerner er venstre sitter i analysen media over lengre tid før analysen, er oksygen forbruk prisene redusert. Under analysen gjennomgå prøver en blanding trinn i løpet av hver syklus. Dette blande ikke bare hjelpemidler med injeksjoner av kjemiske forbindelser, men også handlinger for å recirculate media og skaffe oksygen. Hjernen kan bli metabolically aktiv i lengre perioder disse mål-blanding syklusene enn de ville være incubating inne media øverst benk. Derfor skal dissection larver hjerner beherskes før du begynner å sette opp denne analysen. Når konfigurere denne analysen, analysere en rekke genotyper samtidig, minimere antallet Hjerner nødvendig og brønner utnyttet. Dette vil hindre forsinkelser mellom den dissekere og analysen målinger. Tredje, opprettholde en stabil temperatur er nødvendig å analysere de metabolske prisene i fysiologisk relevante forhold. Økt analysen temperaturer kan føre til vev død, observert av lavere oksygen forbruk priser (Figur 3 c). Hvis fluer er reared i en annen temperatur for eksperimentelle formål, skal målingene også utføres ved denne temperaturen. Mens disseksjoner sannsynligvis blir utført ved romtemperatur, hvis analysen vil bli utført ved en annen temperatur, bør belagt og behersket hjernen være ruges på ønsket temperatur i 15 min før du kjører analysen. Endelig, observere brønner etter analysen er avgjørende for å avgjøre om vev plasserer påvirket målinger. Noen ganger vil det være en avvikende godt som, etter å observere platen under dissecting mikroskopet, kan elimineres fra dataanalyse på grunn av enten tap av vev eller mispositioning, der hjernen har glidd ut av sentrum av brønnen og stakk under polymer ringen av tilbakeholdenhet. Vev kan gå tapt hvis tilbakeholdenhet ikke ble sikret skikkelig til brønnen og ble forstyrret under blande sykluser. Mens ingen av disse hendelsene skjer ofte, hvis de ikke er ekskludert fra analysen, vil de redusere verdiene vesentlig.
Måling av hele-vev metabolske fluks av overvåking oksygenforbruk og ekstracellulære forsuring inneholder en biologisk relevante metode for å forstå hvordan metabolisme er endret av genetisk landskapet eller andre eksperimentelle forhold. Denne metoden er følsom nok å oppdage metabolske forandringer i en enkelt D. melanogaster hjernen, som ikke er mulig å bruke stop-flow respirometry eller indirekte calorimetry. Det er også mindre teknisk utfordrende enn å bruke en Clark elektrode for å måle oksygenforbruk. En ekstra fordel av denne protokollen er muligheten til å analysere en hel hjernen per brønn. 96-brønns formatet tillater mer følsomme opplesninger, og dermed flere genotype kan være assayed samtidig på grunn av mindre antall prøver må etter analysen. Mens måle stoffskiftet i vev er fortsatt utfordrende og krever nøye oppdratt og synkronisert dyr, denne protokollen beskriver en metode for rask, relativt enkle, og har potensial til å analysere mange metabolske følsomhet i D. melanogaster larver og voksne hjerner.
Disclosures
M. Tipping har foreløpig patent mikro-vev begrensningene beskrevet i denne protokollen17.
Acknowledgments
Aksjer fra Bloomington Drosophila lager Center (NIH P40OD018637) ble brukt i denne studien. Forskning rapportert i denne publikasjonen ble støttet av institusjonelle Development Award (idé) nettverk for biomedisinsk forskning Excellence fra National Institute of General Medical Sciences av National Institutes of Health under bevilgning nummer P20GM103430, og av Rhode Island Foundation. Forfatterne takker J. vann og P. Snodgrass-beltet om deres støtte i utvikling av denne protokollen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Assay medium | Agilent | 102365-100 | |
| Calibrant solution | Agilent | 100840-000 | |
| Corning Cell-Tak Cell Tissue Adhesive | Sigma Aldrich | DLW354240 | |
| delrin | Grainger | 2XMK6 | |
| Drosophila Schneider Media | Thermo Fisher | 21720-024 | |
| Dumont High Precision Tweezers (style 5) | Ted Pella | 5622 | |
| Loctite 409 | Amazon | ||
| Mitostress kit | Agilent | 103015-100 | oligomycin, rotenone, and antimycin A included |
| Netwell inserts (6-well) | VWR | 29442-136 | |
| nylon mesh | Component Supply | U-CMN-64 | |
| Parafilm M wrapping film | Fisher Scientific | S37440 | |
| PYREX spot plate | Fisher Scientific | 13-748B | |
| Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent | ||
| Wave v2.4 XFe96 analyzer software | Agilent | https://www.agilent.com/en/products/cell-analysis/software-download-for-wave-desktop | free download to mac or windows |
| XFe96 catridge and cell plates | Agilent | 102416-100 |
References
- Cai, H., et al. Metabolic dysfunction in Alzheimer's disease and related neurodegenerative disorders. Current Alzheimer Research. 9 (1), 5-17 (2012).
- Zhao, S., et al. Glioma-derived mutations in IDH1 dominantly inhibit IDH1 catalytic activity and induce HIF-1alpha. Science. 324 (5924), New York, NY. 261-265 (2009).
- Brody, A. L., et al. Brain metabolic changes in major depressive disorder from pre- to post-treatment with paroxetine. Psychiatry Research. 91 (3), 127-139 (1999).
- Nagana Gowda, G. A., Djukovic, D. Overview of mass spectrometry-based metabolomics: Opportunities and challenges. Methods in Molecular Biology. 1198, 3-12 (2014).
- Dona, A. C., et al. A guide to the identification of metabolites in NMR-based metabonomics/metabolomics experiments. Computational and Structural Biotechnology Journal. 14, 135-153 (2016).
- Yuan, M., Breitkopf, S. B., Yang, X., Asara, J. M. A positive/negative ion-switching, targeted mass spectrometry-based metabolomics platform for bodily fluids, cells, and fresh and fixed tissue. Nature Protocols. 7 (5), 872-881 (2012).
- Zamboni, N., Fendt, S. -M., Rühl, M., Sauer, U. 13C-based metabolic flux analysis. Nature Protocols. 4 (6), 878-892 (2009).
- Duckwall, C. S., Murphy, T. A., Young, J. D. Mapping cancer cell metabolism with(13)C flux analysis: Recent progress and future challenges. Journal of Carcinogenesis. 12, 13 (2013).
- Clark, L. C., et al. Continuous recording of blood oxygen tensions by polarography. Journal of Applied Physiology. 6 (3), 189-193 (1953).
- Lighton, J. R. B. Measuring Metabolic Rates. Spatial Epidemiology: Methods and Applications. , 87-103 (2000).
- Ferrick, D. A., Neilson, A., Beeson, C. Advances in measuring cellular bioenergetics using extracellular flux. Drug Discovery Today. 13 (5-6), 268-274 (2008).
- Dunham-Snary, K. J., Sandel, M. W., Westbrook, D. G., Ballinger, S. W. A method for assessing mitochondrial bioenergetics in whole white adipose tissues. Redox Biology. 2 (1), 656-660 (2014).
- Fan, Y. -Y., Davidson, L. A., Callaway, E. S., Wright, G. A., Safe, S., Chapkin, R. S. A bioassay to measure energy metabolism in mouse colonic crypts, organoids, and sorted stem cells. American Journal of Physiology - Gastrointestinal and Liver Physiology. 309 (1), G1-G9 (2015).
- Lee, H., et al. Increased mitochondrial activity in renal proximal tubule cells from young spontaneously hypertensive rats. Kidney International. 85 (3), 561-569 (2014).
- Volkenhoff, A., et al. Glial glycolysis is essential for neuronal survival in drosophila. Cell Metabolism. 22 (3), 437-447 (2015).
- Becker, L., Nogueira, M. S., Klima, C., De Angelis, M. H., Peleg, S. Rapid and transient oxygen consumption increase following acute HDAC/KDAC inhibition in Drosophila tissue. Scientific Reports. 8 (1), (2018).
- Method and device for restraining contents of a cell plate. United States patent. Tipping, M., Waters, J. , 62/491,431 (2017).
- Neville, K. E., et al. A novel ex vivo method for measuring whole brain metabolism in model systems. Journal of Neuroscience Methods. 296, 32-43 (2018).
- Lardy, H. A., Johnson, D., McMurray, W. C. Antibiotics as tools for metabolic studies. I. A survey of toxic antibiotics in respiratory, phosphorylative and glycolytic systems. Archives of Biochemistry and Biophysics. 78 (2), 587-597 (1958).
- Turrens, J. F., Boveris, A. Generation of superoxide anion by the NADH dehydrogenase of bovine heart mitochondria. Biochemical Journal. 191, 421-427 (1980).
- Potter, V. R., Reif, A. E. Inhibition of an electron transport component by antimycin A. The Journal of Biological Chemistry. 194 (1), 287-297 (1952).
- Warburg, O. On the Origin of Cancer Cells. Science. 123 (3191), 309-314 (1956).
- Yang, L., Venneti, S., Nagrath, D. Glutaminolysis: A Hallmark of Cancer Metabolism. Annual Review of Biomedical Engineering. 19 (1), 163-194 (2017).
- Van Voorhies, W. A. Metabolic function in Drosophila melanogaster in response to hypoxia and pure oxygen. The Journal of Experimental Biology. 212 (19), 3132-3141 (2009).
- Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of developing and adult Drosophila brains and retinae for live imaging. Journal of Visualized Experiments. (37), e1936 (2010).
