Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Behavior

Automatizada, a longo prazo ensaio comportamental para funções cognitivas em vários modelos genéticos da doença de Alzheimer, usando IntelliCage

doi: 10.3791/58009 Published: August 4, 2018

Summary

Este artigo descreve um protocolo para avaliação cognitiva para modelos genéticos da doença de Alzheimer usando o sistema de IntelliCage, que é um sistema de monitoramento comportamental alto throughput automatizado com condicionamento operante.

Abstract

Vários fatores — tais como envelhecimento e genes — estão frequentemente associados com o declínio cognitivo. Modelos de rato geneticamente modificado de declínio cognitivo, tais como a doença de Alzheimer (AD), tornaram-se uma ferramenta promissora para elucidar os mecanismos subjacentes e promover os avanços terapêuticos. Um passo importante é a validação e a caracterização de anormalidade comportamental esperada nos modelos, no caso de AD, declínio cognitivo. As investigações comportamentais a longo prazo dos animais de laboratório para estudar os efeitos do envelhecimento esforços substanciais de demanda de pesquisadores. O sistema IntelliCage é uma bateria de teste de alto rendimento e baixo custo para os ratos que elimina a necessidade de manipulação humana diária. Aqui, descrevemos como o sistema é utilizado na longo prazo fenotipagem de um modelo genético da doença de Alzheimer, especificamente enfocando as funções cognitivas. O experimento emprega repetida bateria de testes que avaliam a aprendizagem espacial e funções executivas. Este fenotipagem de idade-dependente econômica nos permite identificar os efeitos transitórios e/ou permanentes de genes em vários aspectos cognitivos.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

O desenvolvimento de modelos animais de doença neuronal na última década tem proporcionado uma compreensão mecanicista da sua base e a fim de promover os avanços terapêuticos1,2,3. Aplicação de uma bateria de teste comportamental de alto rendimento em modelos animais de genéticas é uma ferramenta de pesquisa heurística para investigar os mecanismos subjacentes das doenças humanas e identificação das terapias medicamentosas. As baterias de teste de investigação adaptaram para observação de longo prazo do envelhecimento e/ou modelos de demência tradicionalmente têm forçado a laboratórios de consumir grandes quantidades de mão de obra especializada e tempo. Um sistema de monitoramento de casa-gaiola seria uma estratégia econômica que reduziria o custo de observação comportamental por seres humanos. Algumas equipes de pesquisa desenvolveram ferramentas automatizadas de visão-baseada que ajudam a fenotipagem comportamental de um único indivíduo em uma gaiola pequena casa4,5,6. No entanto, tais métodos limitam a interação social, o tamanho dos ambientes de teste e a variedade de medidas comportamentais que incluem funções cognitivas. O IntelliCage é um sistema de monitoramento em casa-gaiola segunda geração projetado para executar várias tarefas cognitivas em uma gaiola casa social. Importante, esse método pode eliminar diariamente manipulação que permite-nos realizar monitoramento comportamentais a longo prazo com a avaliação das funções cognitivas, e pode eliminar os requisitos para a manipulação de prática especializada e habilitar altamente reprodutível aquisição de dados7. Aqui, descrevemos a longo prazo fenotipagem e validação em modelos de genética do rato da doença de Alzheimer (AD) que tem sido recentemente geraram8,9,10 usando o monitoramento automatizado de casa-gaiola sistema. Uma bateria de testes, que incluiu avaliações de aprendizagem espacial e funções executivas, realizou-se repetidamente em vários pontos da idade (9 – 12 e 14 – 17 meses de idade). Este fenotipagem dependente da idade nos permitiu identificar os efeitos transitórios e/ou permanentes de genes em vários aspectos cognitivos. Nós achamos que alguns modelos de AD mostraram fenótipos transitórios e permanentes de vários aspectos cognitivos, testados em análise a longo prazo usando o automatizado casa-gaiola monitoramento sistema10. Assim, o estudo automatizado usando o sistema de monitoramento de casa-gaiola é benéfico e cost-effective para fenotipagem comportamental a longo prazo e validação em vários modelos de disfunção cognitiva.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Todos os procedimentos foram aprovados pelo animal institucional conta e usam o Comité, e eles foram realizados de acordo com as diretrizes do Instituto RIKEN cérebro ciência a experimentação animal.

1. configuração aparelho

Nota: Uma visão geral do sistema de monitoramento automatizado do casa-gaiola é mostrada na Figura 1. Cada sistema (39 x 58 cm x 21 cm) contém um microprocessador e quatro câmaras de canto, cada qual com duas garrafas de água e uma antena de anel para a detecção de identificação por rádio-frequência de transponders de implantado em animais (figura 1A). Os números de identificação do microprocessador são definidos pelo seletor giratório (endereços de hardware) (figura 1B). Os números de identificação do microprocessador não devem se sobrepor. Duas portas em cada canto são controladas por computadores, que são utilizados para o condicionamento operante (Figura 1). Normalmente, cada gaiola pode avaliar até 12 ratos (consulte a Figura 2 , como exemplo de alojamento em grupo). Usar um maior número de ratos é aceitável. No entanto, um deve assegurar que os ratos não luta excessivamente e que eles não estão superlotados, quando eles executam tarefas fortemente competitivas.

  1. As gaiolas Conecte um computador serialmente através de cabos de lata.
  2. Conecte os cabos de bateria para os plugues no microprocessador (Power-on). Todos os LEDs devem então ser ligados por alguns segundos e devem mover todas as portas. Se os LEDs não desligue ou se as portas não se movem, desconectar e reconectar o cabo de alimentação (conexões elétricas maus podem levar a mau funcionamento).
  3. Garantir que estas portas abrir e fechar corretamente. Se as portas não se move corretamente, verifique se os ímãs pequenos preso ao braço preto. Se este problema ocorrer com frequência, considere colando o ímã para o braço.
  4. Continuam a verificar as condições das portas durante as experiências (pelo menos uma vez por dia).
  5. Ligue o PC.

2. o software

Nota: Todos os três componentes de software ("Designer", "Controlador" e "Analisador") para o sistema de monitoramento automatizado casa-gaiola foram concebidos como interfaces gráficas do usuário (Figura 3). Os usuários podem facilmente controlar ou adicionar várias funções durante o experimento.

  1. Fazendo experiências de arquivos usando o "Designer"
    Nota: O "Designer" é usado para gerar e editar arquivos experimentais (programas do sistema) para executar vários protocolos experimentais e para testar o status do sistema (Figura 3A). Um arquivo experimental incorpora a lista de animais, configuração de hardware e vários protocolos experimentais. Usuários também podem obter protocolos de jornal publicado por entrar em contato com os autores.
    1. Criar a lista de animais
      1. Defina as condições. Construir o grande projeto experimental, que inclui os seguintes parâmetros: 1) o número de ratos de assunto, 2) o número de linhas genéticas (ou grupos de tratamento), 3) sexo (machos, fêmeas ou ambos) e 4) o número da gaiola deve ser usado.
      2. Selecione o tipo do identificador apropriado (DataMars ou Trovan) na barra de ferramenta central.
      3. Defina "Grupos". No painel de "Grupos", adicionar ou remover os grupos experimentais (i. e., genótipos ou tratamentos), pressionando o botão de "Cruz Vermelha (x)" na janela de "Grupos", ou "verde mais (+)", respectivamente.
      4. Defina "Clusters". Utilize a função de "Cluster" para operar subgrupos igualmente definindo os lados e cantos de corretos, incorretos e neutros.
        Nota: A visita, nosepoke e lamber eventos, os principais dados para qualquer tarefas comportamentais, são todos associados com a definição. Essa configuração é necessária para tarefas de aprendizado espacial. Os clusters definidos para cada animal permanecem os mesmos durante todo o experimento. Por exemplo, em um cluster para lugar preferência (PP) tarefa ou lugar preferência reversão (PPR), um canto é definido como correto (água acessível) e três cantos são definidos como incorreto (água-inacessível). Além disso, grupos podem ser vinculados para outro usando a função "Link".
      5. Atribua variáveis, incluindo o "Nome", "Tag" (identificação do microchip), "Sexo", "Grupo" e "Cluster".
      6. Salvar e cole as listas de animais, selecionando "Importação animais" e "Exportar os animais"...... na barra do menu "Arquivo" para replicar as listas de animais para outro experimento.
    2. Configure o hardware na guia "Configuração" conjunto todos os sistemas usando seus correspondentes números de identificação (endereço de hardware) na guia "Configuração" correspondem ao número de endereços na seção "designer" para o número real de endereços.
    3. Construir os protocolos experimentais na aba "IntelliCage"
      1. Construa os protocolos experimentais na aba "IntelliCage" usando o seguinte cabeça e guias inferiores (guias de "Módulo" e "Opção").
      2. Desenha as estruturas experimentais no espaço de"módulo", clicando na guia "Módulo" (Figura 3A). Para adicionar novos módulos, pressione "Adicionar" (green plus botão na guia "Módulo").
        Nota: Existem quatro tipos diferentes de componentes, ou seja "Tarefas", "Utils", "Repórteres" e "Eventos". Normalmente, um experimento começa com um evento de gatilho, ou seja "Visita", "Nosepoke" ou "Potável". Para selecionar o evento de gatilho, arraste a unidade correspondente da seção de eventos para definir o sinal de partida. Posteriormente, para definir a saída para determinados atuadores (tais como a abertura de porta), arraste as unidades da seção "Tarefas" (ex., "Porta", "Levou" e "Ar").
      3. Arraste as unidades, mostradas na parte de "Unidades", no espaço de"módulo".
        Nota: Novamente, os usuários podem obter protocolos publicados (como arquivos experimentais) dos autores e reutilizar os arquivos através da importação de nova lista de animais. Os usuários não precisam fazer todos os módulos.
      4. Para fazer um módulo de adaptação (NPA) de nosepoke (figura 6A), arraste a unidade de "Porta" da seção "Tarefas", unidades "Portão" e "Timer" da seção "Utils" e as unidades de "Visita" e "Nosepke" da seção "Eventos" no espaço do"módulo".
      5. "Qualquer um" link na linha de "ON" da unidade de Nosepoke para "No" na unidade portão. Link "Sair" para "Fechar" na unidade "Gate". Link "Out" na "Porta" para "Ativar" na unidade "Timer". Link "Out" no portão para abrir a unidade de "Porta". Link "Out" na unidade "Timer" para "Fechar" na unidade "Porta". Defina "Período" como 5.000 (ms), na seção de Timer.
        Nota: A unidade de "Gate" é usada para controlar a entrada e a saída da sequência. No estado "Aberto" (o estado padrão), será operada a sequência ligada à "Saída". Em contraste, no estado de "Fechar", a sequência ligada à saída será interrompida. A probabilidade da taxa de abertura pode ser especificado (figura 6A, Figura 8Ae 9A figura). O seletor"módulo" é usado para alterar os módulos aleatoriamente ou numa certa sequência durante o mesmo período experimental. A tarefa de série tempo de reação (SRT), por exemplo, os módulos (de comprimentos de atraso variável) aleatoriamente são comutados em cada extremidade da visita usando o seletor de módulo (modo de ajuste "RandomExcludeDefault"), vinculado à linha "Final" da unidade "Visita" (Figura 8A ). A unidade de "Divisor" será usada para direcionar um sinal de entrada para um lado especificado do canto. Isso é necessário para os módulos mais complicados tais como aqueles usados na tarefa SRT ou atraso descontando (DD), que exigem a operação de um lado específico. Por exemplo, a tarefa de DD, adoçado (apenas um lado) será aberto com um atraso (Figura 9A).
      6. Defina o estado inicial das portas em gaiolas na guia "Opções" especificar todas as portas a ser fechado na sessão não-bebendo como o status inicial típico para tarefas PP ou PPR.
      7. Defina os horários na aba "Opções". Os módulos são alterados em determinados pontos do tempo, e a ação definida na janela de ""Padrões dia"é realizada.
        Nota: A parte de "Padrões de dia" pode ser usada para definir a janela de tempo experimental. Normalmente, o tempo de noite, fase ativa dos ratos, é usado para avaliar o comportamento nas tarefas cognitivas. De notar que a duração da tarefa pode afetar a quantidade de ingestão de água. Se a duração é muito tempo em tarefas relativamente fácil, o desempenho no final da janela de tempo pode diminuir devido à satisfação. Assim, a janela de tempo é necessária para ser definido cuidadosamente.
  2. Executando o experimento usando o "controlador"
    1. Carregar o arquivo experimental, pressionando o "experimento" botão na seção "Configuração", o "controlador".
    2. Execute o experimento, pressionando o botão "Iniciar" do "Controlador" (parte direita do centro).
    3. Monitorar e visualizar o status atual do sistema e os ratos.
      Nota: Os eventos comportamentais são explicados como segue: visita, entrando para um canto (detectado pelo sensor térmico); nosepoke, colocando o nariz no buraco dentro do canto (detectado pelo feixe infravermelho e podem ser divididos em nosepoke esquerda e direita); lambe, lambe detectado pelo lickometer (contado como tempo de contato e de frequência).
    4. Verifique cuidadosamente o status do sistema, prestando atenção especialmente para os cuidados.
      Atenção: Erros devido a uma marca de animais incorreto (número do identificador) serão relatados no log de mesmo se o número da etiqueta real está correto (i. e., "Unregistered marca * * *", "Sinal de presença sem registro de antena", etc.). Isto pode ser devido ao uso de um transponder que está prestes a expirar. No entanto, esse erro não é um problema sério. Neste caso, um deve verificar que o animal identificado na mensagem pode ser detectado. Erros devido a longos períodos sem uma visita ou bebida serão exibidos como, por exemplo, "* * * (animal ID) não fez qualquer visitas durante os últimos minutos de 720" (Figura 3B). Verifique cuidadosamente as várias possibilidades que podem levar a tais erros. O caso mais grave é que o animal está morto. A possibilidade de segundo, mais grave é que há um problema com o sistema de detecção para o animal (o transponder não está funcionando, ou tem caído). A terceira possibilidade é que o animal não está ativo. Se o animal não faz qualquer visitas por um período de 24h inteira, o experimentador deve considerar retirar o animal da gaiola devido a sua condição de saúde. Um problema grave que não tem uma indicação de erro é a falha da porta para fechar (quase sempre devido os problemas com os ímãs na porta). Isso resulta na criação de um canto bebendo inadequada. Para verificar esse problema, as condições de todas as portas devem ser verificadas durante uma sessão não-beber pelo menos uma vez por dia. Os dados adquiridos quando este problema está presente não podem ser usados para a análise das tarefas PP, PPR, SRT ou DD.
    5. Saída de todos os eventos comportamentais com a tag para obter informações de animais e o tempo pressionando a tecla "Stop" no "Controlador" (Figura 3B).
  3. Manipulação de dados usando o "analisador"
    1. Usando o "analisador", analisar e visualizar os dados.
    2. Exporte os dados de tempo-guardados como ficheiros Excel (Figura 3). Os resultados gráficos mostrados na aba "Gráficos" podem facilitar a compreensão dos dados. Na aba "Dados", os dados são organizados em várias colunas e podem ser classificados em filtrado usando quaisquer parâmetros.

3. animal preparação

  1. Use animais de mais de 15 g (com 2 meses ou mais).
    Nota: Se os animais forem inferiores a 15 g, vários mouses podem visitar um canto simultaneamente, levando à falha na coleta de dados. Envelhecido animais devem ser cuidadosamente monitorizados para assegurar que eles são capazes de saltar para os cantos e escalar o alimentador. Alguns mais velhos ratos ou camundongos com mutações genéticas, exibindo motor deficiências podem morrer porque eles não podem acessar a água ou comida.
  2. Reduza o risco potencial de agressão.
    Nota: Mesmo quando usando ratos fêmeas, é melhor começar a habitação todos os ratos juntos em uma gaiola em uma idade jovem (ou seja, na idade de 1 mês) antes de iniciar o experimento. Um perfil da linha de rato, especialmente com relação a agressividade, deve ser obtido quando usando ratos masculinos na gaiola.
  3. Implante os transponders de identificação por radiofrequência (agulha esterilizada, incluído) por via subcutânea em ratos na região dorso-cervical sob anestesia por inalação de isoflurano (Figura 4).
    1. Posicione o mouse na câmara para a indução da anestesia.
    2. Ajuste o medidor de fluxo de oxigênio para 0,8 a 1,5 L/min e isoflurano vaporizador de 2.0 a 2.5%.
    3. Solte o mouse da câmara de indução depois que a taxa respiratória ficar lento (queda de 5% aproximadamente).
    4. Manter a anestesia com uma máscara facial.
    5. Aplica a pomada oftálmica de olhos para impedir a secagem do olho.
    6. Beliscar e levantar a pele ao redor da parte posterior das escápulas para criar um bolso.
    7. Mergulhe o local da injeção com etanol a 70% para minimizar a introdução de cabelo no espaço subcutâneo. Em seguida, inserir a agulha de injeção através da pele, paralelamente à coluna vertebral.
    8. Ejete o microchip por via subcutânea.
    9. Belisca o microchip através da pele para mantê-lo espaço inter escapular.
    10. Retire a agulha lentamente. Continue a apertar a área por alguns segundos fornecer a hemostasia.
    11. Use o alívio da dor pós-administração se a agulha é inserida incorretamente.
    12. Solte o mouse da anestesia.
    13. Coloque o mouse em uma gaiola de recuperação e monitorá-lo até que acordem e se mover. Evite deixar o mouse sem supervisão.
    14. Retorne o rato da gaiola em casa uma vez que tornou-se totalmente ambulatorial.
    15. Verifique o transponder implantado com um leitor de transponder pelo menos 1 semana.
      Atenção: A posição de transponders de implantado é absolutamente crítica para a identificação (ver Figura 2). Não insira o transponder verticalmente no pescoço; Isso pode causar, animais recebem grave lesão da medula espinhal do animal. Transponders, às vezes, cai depois de algumas horas ou dias. Verifique se o transmissor está funcionando usando um leitor de transponder. Em opcional, implante do identificador novamente se cai fora; no entanto, o re-implante de repetidas pode causar mudanças de comportamento artificiais. Verifique a data de validade. Transponders expirados frequentemente irão transmitir sinais incorretos que resulta na falta de dados.
  4. Introduzir os animais na gaiola e verificar os transponders implantados nos ratos usando os leitores de chave transponder. Remova os ratos se os transponders não são detectados.

4. execução de experiências

Nota: Os ratos são alimentados ad libitum com chow de mouse padrão e mantidos com fundamento sintético que é alterado a cada 1 ou 2 semanas dependendo da programação da tarefa. Evite a mudança da cama durante a tarefa de aprendizagem espacial especialmente iniciais 1 a 2 dias. Luzes acesas entre 08:00 e 20:00. Os módulos experimentais são executados sequencialmente de acordo com as questões científicas. A programação experimental é ilustrada na Figura 5.

  1. Atividade geral
    Nota: Os ratos são sequencialmente adaptados ao meio ambiente na gaiola usando três condições experimentais: a adaptação livre, onde os animais sempre podem acessar livremente as garrafas de água nos cantos (um dia a 1 semana de habituação normalmente é considerado adequada); NPA, onde os ratos podem acessar as garrafas de água para 5 s após cada nosepoke nos orifícios na frente das portas nos cantos (3 dias a 1 semana habituação é normalmente considerada adequada); e a adaptação de sessão bebendo, onde os ratos podem acessar as garrafas de água em uma hora específica do dia.
    1. Prepare os arquivos de experimento para as tarefas de FA, NPA e DSA.
    2. Execute a tarefa de FA no "Controlador".
    3. Medir o número de visitas, nosepokes e/ou lamber episódios diários ou circadiano atividade periodicamente como um índice de atividade geral.
    4. Execute a tarefa NPA no "Controlador".
    5. Execute a tarefa DSA no "Controlador".
      Nota: Muitos paradigmas de aprendizagem necessitam de adaptação para os copos. Para definir o calendário para a DSA, use dois módulos experimentais diferentes: a sessão padrão (para privação de água) e copos. Os ratos não podem acessar as garrafas de água, porque nada acontece após um nosepoke no módulo padrão. A sessão bebendo é idêntica ao módulo NPA. O calendário definido na aba "Opções" no "Designer" Então pode deslocar para a sessão não beber, definida por outro módulo.
  2. Tarefas de memória e aprendizagem espacial
    Nota: A tarefa PP é usada para avaliar a aprendizagem espacial (geralmente 5-7 dias). A tarefa de PP, os ratos têm acesso limitado a água em três dos quatro cantos (um canto correto e três cantos incorretos). Assim, os animais teria que visitar um determinado canto para beber água durante as sessões de bebedeira. A tarefa PPR é usada para avaliar a flexibilidade ou compulsivity e a capacidade de alterar comportamento fluentemente (normalmente de 5-7 dias). A tarefa do PPR, os ratos só podem acessar água em cantos opostos, usado como canto correto na tarefa PP.
    1. Prepare os arquivos de experimento para as tarefas PP e PPR. Definir os cantos corretos para os ratos, definindo os "Clusters" (tipicamente 1-4 cantos cada) na aba "Animal" do "Designer" (ver figura 6A, inferior). Para evitar o tráfego pesado em um canto, aloca os quatro cantos para todos os mouses uniformemente.
    2. Execute a tarefa PP no controlador.
    3. Avalie o desempenho de aprendizagem espacial sobre o curso do tempo, os números e a porcentagem de nosepokes correto.
      Nota: A versão atual da tarefa PP enfoca mais espacial de aprendizagem ao invés de, memória espacial, como a tarefa não exige um intervalo de tempo entre os ensaios diferentes. Para focar mais na memória espacial, considere usando a tarefa de evasão (PA) do lugar ou uma nova versão indefinida da tarefa espacial que utiliza intervalos de tempo específico entre ensaios.
    4. Execute a tarefa PPR no "Controlador".
    5. Avalie a flexibilidade ou compulsivity baseado no curso do tempo, o número e a porcentagem do nosepokes correto.
      Nota: Interpretação dos dados PPR requer vários julgamentos de cuidado. Desempenho inicial da tarefa PPR é fortemente dependente do desempenho na tarefa PP. Isto é porque a tarefa PPR depende a interferência ou a necessidade de alterar o comportamento. Portanto, o desempenho do PPR pode ser especialmente pobre se o desempenho da tarefa PP está perto de 100% correto. Flexibilidade pode ser considerada uma das funções executivas11,12,13.
    6. Avaliar a memória espacial medo em PA.
      Nota: A tarefa de PA consiste em 4 sessões contínuas: habituação (dia 1); condicionado (sopro de ar é introduzido após nospoke em lados do canto predefinido [nosepoke incorreta], dia 2); intervalo de 24 h fora da gaiola de teste (os ratos são colocados volta para suas casa-gaiolas normais, Dia3); colocando ratos volta para a gaiola de teste sem ar-sopro (4-10 dias).
      1. Preparar os arquivos de experimento para PA
      2. Execute a habituação (dia 1).
      3. Execute condicionado (dia 2).
      4. Levar os ratos em gaiolas casa normais e manter por 24 h (Dia3).
      5. Leve os ratos de volta para a gaiola de teste e executar o protocolo de teste (dia 4-10).
      6. Avaliar o contrário aprendizagem espacial baseado na relação de nosepokes incorreta o condicionado (dia 2), memória espacial aversive baseado no dia do retorno para a gaiola de teste (dia 3), e aprendizado de extinção baseado nisso, nos dias 4 a 10.
  3. Avaliação da função executiva (impulsividade, atenção e Compulsivity)
    1. Tarefas SRT
      Nota: Este procedimento foi previamente descrito em mais detalhe10,14. Neste conjunto de tarefas, todos os quatro cantos são operados da mesma forma, 24h por dia. O SRT é composto por duas sessões de formação (SRT-treinamento 1 e 2) e duas sessões de testes (SRT-teste 1 e 2). Na primeira sessão de treinamento (SRT-treinamento 1), os animais são treinados para aprender que o diodo emissor de luz amarelo é um sinal de início para um nosepoke. As luzes de LED flash sempre imediatamente após o nosepoke inicial (atraso é definido como 0 s).
      Na segunda sessão de treinamento (SRT-formação 2), o atraso é definido como variar aleatoriamente entre 0.5, 1.0, 2.0 e 4.0 s. Durante este período, respostas prematuras não têm consequências (pré-formação). Qualquer nosepoke durante o período de atraso é considerado uma resposta prematura, enquanto o primeiro nosepoke quando a porta for aberta (5 s) é considerado uma resposta correta. Na primeira sessão de teste (SRT-teste 1, utilizada para avaliar a impulsividade), o primeiro nosepoke define o lado correto e inicia um período de atraso (0,5 – 4,0 s, dependendo da fase da tarefa), depois que LEDs amarelos são ativados para um período de tempo específico (duração do estímulo = 2.0 s, dependendo da fase da tarefa). Então abre a porta. O primeiro nosepoke após o período de atraso abre a porta (5 s) e é contado como uma nosepoke correta enquanto qualquer nosepoke durante o período de atraso é considerado prematuro nosepoke. Existem várias modificações na segunda sessão de teste (SRT-teste 2, usado para avaliar a atenção). Após o início de um estímulo (0,2 – 1,0 s, ligeiramente mais curto do que o primeiro teste), os ratos são fornecidos com um período de tempo durante o qual são permitidas nosepokes (limitada a segurar, normalmente 2 s). As portas abertas (5 s) somente após uma nosepoke correta, que é o primeiro nosepoke durante a preensão limitada. Nosepokes após a preensão limitada são considerados como omitido nosepoke e não conduzem a qualquer alteração no resultado. Os erros são divididos em três tipos: nosepoke prematura, nosepoke omitido e omissão (primeiro nosepoke somente). O teste de atenção requer capacidade de notar flash LED (definidos pela duração da duração do estímulo), bem como a resposta moderadamente rápida (definidos pela duração da preensão limitada). O curso do tempo do julgamento é ilustrado na Figura 7.
      1. Prepare os arquivos de experimento para tarefas SRT.
      2. Execute o SRT-treinamento 1 por 3 dias.
      3. Execute o SRT-formação 2 por 7 dias.
      4. Execute o SRT-teste 1 (impulsividade) por 7 dias. Calcule a impulsividade com base na seguinte fórmula:
        Equation 1
        onde P é o número de ensaios nosepoke prematura (ou o número de nosepoke incorreta), e T é o número de testes totais (o número de nosepoke primeiro).
      5. Execute o SRT-teste 2 (atenção) por 7 dias. Calcular a precisão (o que é considerada um indicador de desempenho para atenção) usando a seguinte fórmula:
        Equation 2
        onde C é o número de tentativas de nosepoke correto (número de nosepokes segundo correto), T é o número de testes totais (o número de nosepokes primeiro), O é o número de tentativas de omissão (número de julgamento faltando um segundo nosepoke) e P é o número de prematuros ensaios de nosepoke (ou o número de nosepoke incorreta segundo antes a preensão limitada).
    2. Tarefa DD
      Nota: Esta é uma tarefa de escolha simples, onde os animais escolhem esperar para beber água adoçada (SW, sacarina de 0,5% ou 10% de sacarose), com um atraso ou para beber água normal sem um atraso. Abre a porta do lado escolhido, enquanto a porta do lado oposto permanecem fechados. A água normal e SW são alocados em lados direito ou esquerdos de todos os cantos, identicamente. O agendamento de tarefas DD inclui as sessões de treinamento e teste. Na sessão de treinamento, os ratos podem acessar tanto SW e água sem um tempo de espera. Assim, os ratos desenvolverá sua preferência ao lado SW. Em sessões de teste, o tempo de espera aumenta diariamente (i. e., 0, 1, 2,..., 8 s). Os atrasos sequencialmente aumentam diariamente fazendo vários módulos exibindo comprimento diferente do atraso (0, 1, 2,..., 8 s) e definir o "Link" nas áreas de "Módulo" e "Opções" (padrões de dia). Nesta tarefa, todos os quatro cantos operam da mesma forma, 24h por dia.
      1. Prepare o arquivo experimental para a tarefa DD.
      2. Defina o lado da SW (lados direito ou esquerdos em todos os cantos).
      3. Substituir as garrafas de água de ambos os lados definidos com as garrafas contendo SW.
      4. Execute a sessão de treinamento para treinar os animais para beber SW de ambos os lados definidos sem demora para 5-7 dias.
      5. Calcule o índice de preferência, que é definido como a razão de lamber ou nosepoking ao lado de SW para o número total de lambe ou nosepokes. O índice de preferência para o lado que SW contendo, portanto, é calculada como:
        Equation 3
        ou
        Equation 4
        O índice antigo centra-se mais sobre os resultados da ação, enquanto o último concentra-se mais sobre o comportamento de escolha.
        Nota: Certifique-se que a maioria dos ratos preferencialmente escolher os lados com o SW (> 90% para o índice baseado no número de lamber, > 80% para o primeiro índice com base em nosepoke) no final do treinamento.
      6. Posteriormente, execute a sessão de testes da tarefa DD para 9 dias (atraso de 0 a 8 s).
      7. Avalie o curso do tempo da mudança na preferência em direção ao lado com SW para avaliar a compulsivity.
  4. Análise de dados
    1. Abra os arquivos usando o "analisador" e exportar todos os dados para arquivos do Excel. Se a quantidade de quantidade de dados é muito grande, é melhor filtrar os dados (i. e., extrair os copos para as tarefas espaciais e extrair o primeiro e segundo nosepokes para tarefas SRT).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Em nosso estudo anterior, os idade-dependente déficits cognitivos em modelos de AD foram detectados pelos experimentos usando o automatizado casa-gaiola monitoramento sistema10. Seu desempenho de modelos do AD em PP estava intacto em adultos jovens e indivíduos mais velhos; no entanto, o desempenho em PPR foi significativamente e progressivamente prejudicada (Figura 6). Também é importante observar o comportamento geral ou ansiedade na fase de adaptação, porque tais características podem afetar a cognição15. Os modelos do AD não mostrou qualquer anormalidade bruta na visita, nosepoke e lambendo os números nas sessões FA, NP e DSA. Assim, os modelos do AD podem ter baixa flexibilidade.

Para avaliar as funções executivas, o desempenho comportamental em SRT e DD foi gravado. Modelos mais antigos de AD (NL-G-F) carecia de precisão na última fase da SRT (SRT-teste 2) (Figura 8). Compulsivity facilitado foi observada em adultos jovens e temas antigos dos ratos NL-G-F (Figura 9B, topo). Curiosamente, embora tenha havido um aumento da compulsivity dos ratos NL-F que eram adultos jovens, em idade avançada, se tornou comparável dos ratos selvagem-tipo (Figura 9B, inferior). Este é um exemplo do fenótipo transitório da mutação NL-F.

Figure 1
Figura 1: componentes do sistema de monitoramento automatizado do casa-gaiola. (A) visão geral do sistema. (B) a localização dos conectores. (C) canto de câmara com porta operante. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: exemplo da caixa de grupo para o estudo. Normalmente, 12 ratos por gaiola são usados. No caso de utilizar quatro grupos (três modelos genéticos e um selvagem-tipo), três ratos por grupo por IntelliCage são considerados adequados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Software para o sistema. (A), o "Designer" é usado para criar arquivos experimentais. Esquerda: A parte Animal lista inclui as informações das definições de animais e de grupo. Direito: O espaço do módulo é usado para definir operações experimentais. (B), o "controlador" pode ser usado para executar, monitor e experimentos de registro. Esquerda: O status de um da gaiola trabalhando com a exibição de visita dos animais, nosepoke e lambendo nos quatro cantos. Direita: Janelas de alarme serão exibida se acontecem alguns problemas. (C) o analisador pode ser usado para manipular e exportar dados adquiridos pelo controlador. Esquerda: Todos os dados são marcados com informações do animal, ambiente dentro da gaiola e o tempo. Filtragem ajudará ainda mais análise no Excel ou outro software analítico. Direita: A linha do tempo das visitas (também nosepoke ou lambidas) podem ser mostradas individualmente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: implantação de Transponder. (A) Microchip do transponder (DataMars). Lado (B) Ver os da implantação do identificador (transpondering). Evite causar ferimentos na medula espinhal. (C) vista superior do transponder. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: linha do tempo dos experimentos de avaliação cognitiva com o sistema de monitoramento automatizado casa-gaiola. Uma bateria de testes para avaliação cognitiva foi realizada duas vezes (1º jogo, 9 – 12 meses velhos; e 2 jogos, 14 – 17 meses de idade) seguido de experimentos para avaliar a atividade geral no final (3º conjunto [18 meses de idade]). Esta bateria foi designada para avaliar vários domínios cognitivos (indicadas por cores — vermelho: atividade geral; Azul: aprendizagem espacial e memória; Verde: função executiva), que tem vantagens em validação e caracterização dos défices cognitivos esperados. FA: Adaptação livre; NPA: Nosepoke adaptação; DSA: Beber adaptação de sessão; PP: Preferência de lugar; PPR: Inversão de preferência de lugar; SRT: Tempo de reação Serial (para impulsividade e atenção); PA: Evasão de lugar; DD: Atraso de desconto. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: desenho Experimental e resultados representativos das tarefas PP e PPR. Parte superior (A), um projeto de módulo de exemplo para PP ou PPR. No fundo, correto configuração de canto é alterada para o lado oposto em PPR. (B) os défices em inversão espacial de aprendizagem em um modelo de AD (NL-G-F) suscitou em idade mais avançada. Dados são expressos como média ± erro padrão da média (SEM). ∗p < 0,05; ∗∗p < 0,01. As cores indicam grupos de comparação: azul: NL vs WT; Vermelho: NL-F vs WT; Verde: NL-G-F vs WT. Esta figura foi modificada de referência10. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7: fluxo de julgamento das tarefas SRT. Esquerda: o fluxo experimental de posto de gasolina (imp). O primeiro nosepoke define o lado correto e inicia um período de atraso (0.5-4.0 s), depois que os LEDs amarelos estão ativados. Então abre a porta. Direita: o fluxo experimental de posto de gasolina (att). O primeiro nosepoke define o lado correto e inicia um período de atraso (2.0 s), depois que LEDs amarelos estiverem ativados no tempo mais curto (0,2 – 1,0 s). Os ratos são fornecidos com um período de tempo durante o qual são permitidas nosepokes (segure o limitada, 2 s). As portas abertas (5 s) somente após uma nosepoke correta, que é o primeiro nosepoke durante a preensão limitada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 8
Figura 8: delineamento Experimental e resultados representativos das tarefas SRT. (A) um projeto de módulo de exemplo para SRT. (B) atenção declinar em um modelo de anúncio específico para a idade mais avançada. Dados são expressos como média ± SEM. ∗p < 0,05; ∗∗p < 0,01. As cores indicam grupos de comparação: azul: NL vs WT; Vermelho: NL-F vs WT; Verde: NL-G-F vs WT. Esta figura foi modificada desde a referência10. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 9
Figura 9: desenho Experimental e resultados representativos da tarefa DD. (A) um exemplo do módulo para a tarefa DD. (B) facilitou compulsivity no modelo AD (NL-G-F) em ambos os jovens e velhos tempos. Este é um exemplo de fenótipo. Por outro lado, compulsivity transitoriamente foi aumentado em um outro modelo de AD (NL-F). Dados são expressos como média ± SEM. ∗p < 0,05; ∗∗p < 0,01. As cores indicam grupos de comparação: azul: NL vs WT; Vermelho: NL-F vs WT; Verde: NL-G-F vs WT. Esta figura foi modificada do anterior trabalho10. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Este artigo descreve o método usando o sistema de monitoramento de casa-gaiola automatizado para ensaios de cognitivos e comportamentais a longo prazo em modelos de AD geneticamente modificados. O passo mais crítico é a implantação do transponder na posição apropriada. Antes de realizar a implantação, certifique-se de que a data de expiração do transponder não passou. O segundo ponto importante é verificar o funcionamento do sistema diariamente, especialmente como um problema menor pode tornar-se posteriormente um mais grave durante o estudo (i. e., um empilhado de porta chave transponder caído-para fora, más ligações eléctricas, etc .). Em terceiro lugar, é essencial para poder atirar problemas porque muitos problemas podem ocorrer em toda a programação experimental.

Este papel introduziu um pacote básico de tarefas para avaliação cognitiva. Essas tarefas foram produzidas pela referindo-se a testes comportamentais convencionais, mas não imitam perfeitamente os testes convencionais. Por exemplo, tarefas SRT não defina modo de escolha. 5 escolha escolha serial tarefa (5CSRTT), um modelo de tarefas SRT, normalmente é realizado em uma câmara com 9, 5 ou 3 furos para o nosepoke medir a precisão de16,17. Nossa equipe anteriormente tentou implementar uma versão de escolha do SRT, mas os ratos não aprendeu a regra dentro de tempo relativamente longo (2 semanas ou mais). O usuário deste sistema deve estar ciente da diferença e discutir os dados com cuidado.

Outra questão é sobre as limitações para a medição repetida. Como mencionado em anterior estudo18, a primeira é que as experiências repetidas simplesmente não podem comparar o efeito da idade. Observamos que os dados a partir do segundo teste de PA não conseguiram replicar a perda de memória em modelos de AD10. O desempenho do genótipo de todos foi muito pior do que o primeiro teste de PA. Esta diferença pode vir de diferença de idade ou habituação ao estímulo contrário (experiência de tarefa PA anterior). Os experimentadores devem importa-o efeito de repetição e considerar a ordem das tarefas. Para superar a habituação de estímulo contrário do segundo teste de PA, é melhor usar o mais forte estímulo de sopro de ar ou adicionar algum romance estímulo ambiental tais como diferentes tipos de roupa de cama ou som19.

Vários pesquisadores têm vindo a desenvolver novos métodos e protocolos para o monitoramento de casa-gaiola automatizado estuda20,21,22,23,24,25, 26e software de suporte usando a biblioteca de código-fonte aberto27. Portanto, a possibilidade do sistema foi ampliada. Finalmente, o sistema fornece automatizada elevado-throughput triagem comportamental para ensaios a longo prazo que são usados para estudar uma vasta gama de funções cognitivas, que é benéfico em fenotipagem e Validando modelos de doença.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Não há conflitos de interesse declarados.

Acknowledgments

Agradecemos a ajuda em fotografar materiais Reiko Ando. Esta pesquisa foi apoiada pelo subsídio para pesquisa exploratória (número de concessão de KAKENHI JSPS 16K 15196).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
IntelliCage TSE Systems - Parchased in 2011 or later
PC Dell Inspiron 580s -
Display Dell SI75T-WL -
ALPHA-dri Shepherd Specialty Papers - Standard bedding
Aron Alpha (Krasy Glue) 2 g Toagosei (Krasy Glue) #04612 Cyanoacrylates for gluing magnet and blak arm
Handheld Transponder Reader BTS-ID R-560 Transponder reader, which reads both Trovan and DataMars
Transponder DataMars T-VA, T-VAS, or another series Basic package of transponders and implanters
Diamond Grip Plus Ansel Microflex DGP-INT-M Experimental glove
Isoflurane Pfizer 1119701G1092 -
Vaporizer for small animals DS Pharma Biomedical SF-B01 Facemask included
Neo-Medrol Pfizer 006472-001 Eye ointment
Ethanol (70%) - - -
Excel Microsoft 00202-51382-15524-AA928 For data analysis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bryan, K. J., Lee, H., Perry, G., Smith, M. A., Casadesus, G. Transgenic Mouse Models of Alzheimer's Disease: Behavioral Testing and Considerations. Methods of Behavior Analysis in Neuroscience. CRC Press/Taylor & Francis. (2009).
  2. Nestler, E. J., Hyman, S. E. Animal models of neuropsychiatric disorders. Nature Neuroscience. 13, (10), 1161-1169 (2010).
  3. Crawley, J. N. Behavioral Phenotyping Strategies for Mutant Mice. Neuron. 57, (6), 809-818 (2008).
  4. Zarringhalam, K., Ka, M., et al. An open system for automatic home-cage behavioral analysis and its application to male and female mouse models of Huntington's disease. Behavioural Brain Research. 229, (1), 216-225 (2012).
  5. Prusiner, S. B., Jackson, W. S., King, O. D., Lindquist, S. The power of automated high-resolution behavior analysis revealed by its application to mouse models of Huntington's and prion diseases. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, (23), 13363-13383 (1998).
  6. Jhuang, H., Garrote, E., et al. Automated home-cage behavioural phenotyping of mice. Nature Communications. 1, (6), 1-9 (2010).
  7. Krackow, S., Vannoni, E., et al. Consistent behavioral phenotype differences between inbred mouse strains in the IntelliCage. Genes, brain, and behavior. 9, (7), 722-731 (2010).
  8. Nilsson, P., Saito, T., Saido, T. C. New mouse model of Alzheimer's. ACS chemical. 5, (7), 499-502 (2014).
  9. Saito, T., Matsuba, Y., et al. Single App knock-in mouse models of Alzheimer's disease. Nat Neurosci. 17, (5), 661-663 (2014).
  10. Masuda, A., Kobayashi, Y., Kogo, N., Saito, T., Saido, T. C., Itohara, S. Cognitive deficits in single App knock-in mouse models. Neurobiology of Learning and Memory. (2016).
  11. Chan, R. C. K., Shum, D., Toulopoulou, T., Chen, E. Y. H. Assessment of executive functions: Review of instruments and identification of critical issues. Archives of Clinical Neuropsychology. 23, (2), 201-216 (2008).
  12. Jurado, M. B., Rosselli, M. The Elusive Nature of Executive Functions: A Review of our Current Understanding. Neuropsychology Review. 17, (3), 213-233 (2007).
  13. Diamond, A. Executive Functions. Annual Review of Psychology. 64, (1), 135-168 (2013).
  14. Kobayashi, Y., Sano, Y., et al. Genetic dissection of medial habenula-interpeduncular nucleus pathway function in mice. Frontiers in behavioral neuroscience. 7, 17 (2013).
  15. Robinson, O. J., Vytal, K., Cornwell, B. R., Grillon, C. The impact of anxiety upon cognition: perspectives from human threat of shock studies. Frontiers in human neuroscience. 7, 203 (2013).
  16. Robbins, T. The 5-choice serial reaction time task: behavioural pharmacology and functional neurochemistry. Psychopharmacology. (3-4), 362-380 (2002).
  17. Asinof, S. K., Paine, T. A. The 5-Choice Serial Reaction Time Task: A Task of Attention and Impulse Control for Rodents. Journal of Visualized Experiments. (90), e51574 (2014).
  18. Codita, A., Gumucio, A., et al. Impaired behavior of female tg-ArcSwe APP mice in the IntelliCage: A longitudinal study. Behavioural brain research. 215, (1), 83-94 (2010).
  19. Blumstein, D. T. Habituation and sensitization: new thoughts about old ideas. Animal Behaviour. 120, 255-262 (2016).
  20. Endo, T., Maekawa, F., et al. Automated test of behavioral flexibility in mice using a behavioral sequencing task in IntelliCage. Behavioural brain research. 221, (1), 172-181 (2011).
  21. Voikar, V., Colacicco, G., Gruber, O., Vannoni, E., Lipp, H. -P., Wolfer, D. P. Conditioned response suppression in the IntelliCage: assessment of mouse strain differences and effects of hippocampal and striatal lesions on acquisition and retention of memory. Behavioural brain research. 213, (2), 304-312 (2010).
  22. Puścian, A., Łęski, S., Górkiewicz, T., Meyza, K., Lipp, H. -P., Knapska, E. A novel automated behavioral test battery assessing cognitive rigidity in two genetic mouse models of autism. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8, 140 (2014).
  23. Voikar, V., Colacicco, G., Gruber, O., Vannoni, E., Lipp, H. -P., Wolfer, D. P. Conditioned response suppression in the IntelliCage: assessment of mouse strain differences and effects of hippocampal and striatal lesions on acquisition and retention of memory. Behavioural brain research. 213, (2), 304-312 (2010).
  24. Harda, Z., Dzik, J. M., et al. Autophosphorylation of αCaMKII affects social interactions in mice. Genes, Brain and Behavior. e12457 (2018).
  25. Aarts, E., Maroteaux, G., et al. The light spot test: Measuring anxiety in mice in an automated home-cage environment. Behavioural Brain Research. 294, 123-130 (2015).
  26. Safi, K., Neuhäusser-Wespy, F., et al. Mouse anxiety models and an example of an experimental setup using unconditioned avoidance in an automated system -IntelliCage. Cognition Brain & Behavior. 10, (4), 475-488 (2006).
  27. Dzik, J. M., Puścian, A., Mijakowska, Z., Radwanska, K., Łęski, S. PyMICE: APython library for analysis of IntelliCage data. Behavior Research Methods. 50, (2), 804-815 (2018).
Automatizada, a longo prazo ensaio comportamental para funções cognitivas em vários modelos genéticos da doença de Alzheimer, usando IntelliCage
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Masuda, A., Kobayashi, Y., Itohara, S. Automated, Long-term Behavioral Assay for Cognitive Functions in Multiple Genetic Models of Alzheimer's Disease, Using IntelliCage. J. Vis. Exp. (138), e58009, doi:10.3791/58009 (2018).More

Masuda, A., Kobayashi, Y., Itohara, S. Automated, Long-term Behavioral Assay for Cognitive Functions in Multiple Genetic Models of Alzheimer's Disease, Using IntelliCage. J. Vis. Exp. (138), e58009, doi:10.3791/58009 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter