Summary
Her presenterer vi en protokoll for å isolere fucoxanthin klorofyll a/c bindende proteiner (FCP) fra kiselalger og innlemme dem i liposomer med naturlig lipid komposisjoner å studere eksitasjon energioverføring på ion justeringsendringer.
Abstract
Fotosynteseaktiviteten ytelsen til, alger og kiselalger avhenger sterkt på rask og effektiv regulering av lyset høsting og energi overføring prosesser i thylakoid membran av chloroplasts. Lyset høsting antenne av kiselalger, de såkalte fucoxanthin klorofyll a/c bindende proteinene (FCP), kreves for lys absorpsjon og effektiv overføring til fotosynteseaktiviteten reaksjonen sentre også for bilde-mot overdreven lys. Bytt mellom disse to funksjonene er en langvarig forskning. Mange av disse studiene har utført med FCP i vaskemiddel micelles. For samhandling studier, er vaskemidler fjernet, og som førte til en uspesifikke samling av FCP komplekser. I denne metoden er det vanskelig å forskjellsbehandle gjenstander og fysiologisk relevante data. Derfor kan mer verdifull informasjon om FCP og andre membran bundet lette høsting komplekser fås ved å studere protein-protein interaksjoner, energioverføring og andre spektroskopiske funksjoner hvis de er innebygd i deres opprinnelige lipid miljø. Hovedfordelen er at liposomer har en definert størrelse og en definert lipid/protein som omfanget av FCP klynging er kontrollert. Videre kan enkelt endringer i pH og ion sammensetningen som regulerer lys høsting i vivo simuleres. I forhold til thylakoid membranen er liposomer mer homogen og mindre komplisert, som gjør det enklere å få og forstå spektroskopiske data. Protokollen beskriver fremgangsmåten FCP isolasjon og rensing, liposome forberedelse og inkorporering av FCP liposomer naturlig lipid sammensetning. Resultater fra en typisk applikasjon er gitt og diskutert.
Introduction
Fotosynteseaktiviteten organismer som kiselalger må takle skiftende lysforhold og svare med sofistikert acclimation mekanismer som opprettholde høy fotosynteseaktiviteten effektivitet og beskytte mot Foto-oksidative skader forårsaket av overdreven lyset. En viktig lysbeskyttende prosess i fotosynteseaktiviteten eukaryoter kommer høy energi slukke (E) absorbert lys som forekommer som det viktigste bidraget til de ikke-fotokjemisk slukke (NPQ) under lette stress forhold1,2 ,3. Lette høsting antenne komplekser (LHC) er involvert i regulering av eksitasjon energi overføring trasé. Svar på høy lys indusert lav pH i chloroplast lumen, antenne system bryterne fra lyset høsting å slukke staten. Denne energien dissipative staten beskytter photosystems (PS) og andre komplekser i thylakoid membranen fra foto-oksidasjon. I fotosynteseaktiviteten eukaryoter, er qE vanligvis forårsaket av to faktorer1,2,3. En faktor som er spesialisert lyset høsting protein som svarer til den lave pH. PsbS protein induserer qE i høyere planter4. LhcSRs5, modulert av PsbS aktivitet, indusere qE i grønne alger6. Kiselalger har Lhcx-lignende proteiner som strukturelt relatert til LHCSRs7,8,9,10.
Den andre faktoren qE er den xanthophyll syklusen der karotenoider av antennen er konvertert til en foto-beskyttende de-epoxidation og erstattet av epoxidation. I planter og grønne alger konverteres violaxanthin til zeaxanthin. I kiselalger konverteres diadinoxanthin til diatoxanthin, som deretter korrelerer med omfanget av NPQ11. Slektene lyset høsting antenne besitter noen selv om det er evolusjonære anlegget og alger LHCs. Overgangen fra lys høsting Foto-beskyttelse er enormt rask og NPQ kapasitet er høyere sammenlignet med planter12. Dette kan være en grunn til hvorfor Kiselalger er svært vellykket i ulike økologiske nisjer slik at de er ansvarlige for opptil 45% av oceanic netto primærproduksjon13. Derfor slektene lys høstingen systemer er en interessant gjenstand for fotosyntesen forskning.
Kiselalger, som sentriske arten Cyclotella meneghiniana, har thylakoid innebygd lys høstingen systemer oppkalt etter pigmentene de bind - fucoxanthin, klorofyll (chl) a og c, derav FCP. lys høsting proteiner, som FCPs, er innebygd i thylakoid membran som består av flere membran lag. Kiselalger danne band av tre thylakoids. Dette komplekset situasjonen gjør det vanskelig å studere dem på molekylært nivå i thylakoid membranen. I tillegg bidrar mange komponenter til regulering av lys høsting (se ovenfor). Derfor i mange tilnærminger ble komplekser isolert fra membranen bruke milde vaskemidler, som n-Dodecyl-β-D-maltopyranoside (β-DDM), som solubilize membran, men beholder FCP komplekser. Mange spektroskopiske studier ble utført med solubilized FCP for å undersøke intramolekylære energi overføring14,15,16,17. Denne tidligere var imidlertid begrenset siden regulering av energioverføring trenger excitonic interaksjon med andre antenne komplekser eller photosystems. Dermed slike studier kan ikke utføres med solubilized komplekser fordi samspillet mellom komplekser er tapt.
En viktig funksjon i antenne regulering er "molekylær trengsel" antenne og photosystems i thylakoid membran18. Tidligere, en enkel tilnærming ble utført for å simulere denne effekten i vitro. Vaskemiddel ble fjernet, noe som fører til tilfeldig samling av antenne komplekser. Selv om noen rimelig data ble innhentet av denne tilnærmingen17,19, vaskemiddel fjerning reflekterer ikke situasjonen i vivo og har noen begrensninger siden komplekser ikke er samhandlende på deres vanlige tertiær struktur.
Bruk av liposomer overvinner flere av de tidligere begrensningene. Tertiær strukturen er fortsatt fullt intakt. Liposome membranen tilbyr en kvasi innfødt miljø for antenne komplekser. Membranen skiller innsiden av liposome fra det ytre miljøet. Med disse midler gir liposomer to reaksjon rom for studier av ion og pH forløpningene for transport prosesser. Videre kan parameterne for eksperimentell systemet styres lettere for studier i thylakoid membranen. Liposomer var allerede vist seg å være et utmerket verktøy for å studere fotosynteseaktiviteten komplekser. Fokus i fortiden var på anlegget LHC hvor effekten av endrede lipid komposisjon ble testet på LHC II20. I andre tilnærminger, protein-protein samspillet mellom ulike LHC II ble undersøkt21. Også ble noen studier i grønne alger utført som beskriver spontan klynging mellom LHC22. Vurderer betydningen av kiselalger for akvatiske økosystemer, relativt få studier som ble utført med antenne komplekser av kiselalger. To studier undersøkt antenne komplekser av sentriske Cyclotella meneghiniana, der klynging FCP antenne23 og responsen til FCP til elektrokjemiske graderinger24 ble vist. Dermed er liposomer et utmerket verktøy for å studere slektene antenner og samhandling og regulering i nesten innfødt forhold. Liposomer er allsidig siden mange forhold som lipid komposisjon, liposome størrelse, protein tetthet og den omkringliggende vandige fasen kan kontrolleres. Videre krever metoden lave mengder prøver. Eksperimentell systemet er robust og svært reproduserbare. Compartmentalization av liposomer kan studere pH og ion graderinger, som er viktige faktorer i regulering av antenne komplekser.
Her beskriver vi isolering av FCP antenne komplekser fra C. meneghiniana og deres innlemmelse i liposomer med naturlig thylakoid lipid komposisjon. Også vi gi eksemplarisk data for spektroskopiske karakterisering av solubilized FCP og sammenligne dem med FCP i liposomer. Metoden oppsummerer kunnskap og standardiserte protokoller fra forbedringer av Gundermann og Büchel 201223og Natali et al. 201622Ahmad og Dietzel 201724.
Figur 1: skjematisk fremstilling av arbeidsflyten. (1) refererer til avsnitt 1 som beskriver cellevekst, avbrudd og thylakoid isolasjon med følgende FCP separasjon på sukrose tetthet forløpninger; C. m. -Cyclotella meneghiniana celler. (2) utarbeidelse av naturlige thylakoid lipid blanding (MGDG, DGDG og SQDG) beskrevet i avsnitt 2 og etableringen av lipid-rengjøringsmiddel micelles med octylglycoside (OG). En definert lipid-micelle størrelse oppnås ved ekstrudering bruker membraner med definerte pore diameter. FCP og lipid-micelles er samlet på en forhåndsdefinert lipid: protein forholdet og vaskemidler OG og β-DDM er fjernet via kontrollert dialyse danner FCP proteoliposomes. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Merk: Fotosynteseaktiviteten komplekser som FCPs er svært sårbare for lys og varme. Alltid arbeide på is og en svært dårlig lys.
1. isolering av FCP fra celler
-
Thylakoid isolasjon fra C. meneghiniana celler
- Vokse C. meneghiniana i fem 500 mL flasker har 300 mL av ASP-middels23,25 og 50 millioner celler. Koble flasker med en bomull stopper, og at cellene å vokse til den eksplosive vekst fasen i ca en uke på en shaker på 120 rpm med en 16 h lys og 8t mørke fase på 40 µmol photons/(m²s) hvitt lys og en temperatur mellom 15-18 ° C. Kontroller at celle nummer mellom 1.5-2 millioner celler/mL med en celle counter kammer.
- Sentrifuge cellene på 4000 x g i en forkjøles rotor med 500 mL sentrifuge ampuller (4 ° C) i 15 min i en høyhastighets sentrifuge. Nytt suspendere celle pellets i 12 mL homogenisering bufferen (HB, tabell 1) av pipettering.
- Overføre suspensjon til en enkelt 50 mL plastrør. Lagre prøvene ved-80 ° C eller fortsette til trinn 1.1.3.
- Pre-avkjøle den perle mill og utstyr. Fyll 50 mL begeret av møllen perle til 75% med et glass bead blandingen og legge celle suspensjon. Celle avbrudd, bruke 7 x 45 s pulser i full fart med 30 s avkjøling mellom hver puls. Ta 20 µL av forstyrret celler for kvalitetskontroller i trinn 1.1.6.
- Filtrere forstyrret cellene over et glass filter trakt og vask ved å helle HB over glassperler før de vises tydelig. Basseng vask brøken med filtratet. Holde det siste bindet lavere enn 150 mL.
- Sentrifuge prøven i 15 min 140 x g bruker tre 50 mL plast rør til pellets celle rusk. Nøye overføre nedbryting til 20 mL polykarbonat ultracentrifugation ampuller og kast pellet.
- Fylle hetteglass med HB equilibrate vekten og virvel i en egnet rotor 1t på 300.000 x g og 4 ° C pellets thylakoid membraner.
- Bruk sentrifugering tiden sjekke andelen forstyrret celler av mikroskopi på 400 X forstørrelse med 20 µL eksempeldiagrammene tatt i 1.1.3. Beregne forholdet mellom chloroplast gratis og chloroplast som inneholder frustules (silica skall).
Merk: Slektene cellevegger er laget av silisium, som vises som svært diffracting stoffet i mikroskopet. Chloroplasts forekommende grønne prikker skulle ha vært frigitt fra cellene hvis celle avbrudd arbeidet. - Nytt suspendere membran pellets med som liten vask buffer som mulig (0,5-1 mL) med en liten maler pensel. Fyll polykarbonat ultracentrifugation hetteglass med vaske bufferen (tabell 1), equilibrate deres vekt og sentrifuge for 20 min på 200 000 x g og 4 ° C.
- Nytt suspendere vasket membraner med en malers pensel. Legge vask buffer hvis nødvendig for å holde thylakoid konsentrasjonen så høy som mulig. Samle alle thylakoids i ett utvalg hetteglass (15 mL).
- Pre fortynne prøvene 10 µL av utvalget med 90 µL av 100% aceton. Sentrifuge det 12 000 x g for 5 min til pellets utfelt protein. Ta 10 µL av predilution og bland det med 990 µL av 90% aceton.
- Måle absorbansen (ABS) av klorofyll a og c på 664 nm og 630 nm i 90% aceton. Trekk ABS750nm fra begge verdiene. Bestemme total klorofyll innholdet ved hjelp av følgende formel:24
1)
2)
- Måle absorbansen (ABS) av klorofyll a og c på 664 nm og 630 nm i 90% aceton. Trekk ABS750nm fra begge verdiene. Bestemme total klorofyll innholdet ved hjelp av følgende formel:24
- Aliquot thylakoids i deler av 0,5 mg av totale klorofyll i en 1,5 mL reaksjon rør, fryse dem i flytende nitrogen og lagre dem på-80 ° C til fremme bruk.
-
Separasjon og konsentrasjonen av FCP komplekser
- Forberede en sukrose gradert løsning og fyll ultracentrifuge rør til toppen minus lasting volumet (300-500 µL). Fryse rør på 20 ° C før de er helt frosset. Tillate rør for å tine ved + 4 ° C, som tar 3-4 h for en 17 mL tube.
- Gjenta fryse-Tin syklusen to ganger for å finpusse graderingen for bedre oppløsning.
- Bruke prøver innhentet i 1.1.9 tilsvarer 0,5 mg av klorofyll og justere med buffer B1 (tabell 1) til et siste volum 2 ml. For solubilization, legge til n-Dodecyl-β-D-maltopyranoside (b-DDM) en siste konsentrasjon av 20 mM.
- Invertere røret 3 ganger og plasser den på is 20 min med mild risting for å unngå skum. Sentrifuger i 5 minutter, 12 000 x g i en pre-avkjølt bordplaten sentrifuge på 4 ° C.
- Last nedbryting på graderingen. Ikke Legg mer enn 125 µg av totale klorofyll per gradering hvis 17 mL ampuller brukes. Sentrifuger 22 h på 100.000 x g og 4 ° C.
- Gjenopprette ønsket brun FCP fraksjoner fra gradient bruker en sprøyte (figur 2A). Ta en 5 µL aliquot og fortynn den med 995 µL av B1a.
- Måle absorbansen (ABS) spekteret mellom 370-750 nm i et UV-VIS-spektrofotometer. Bruk semi mikro optisk glass cuvettes.
- Åpne programmet spectra manager, gå til spektrum modus og registrere en baseline fra 370 å 750 nm etterfulgt av prøven målinger. Bruk følgende innstillinger: skanning fart, 200 nm/min; data banen, 0,5 nm; svar, middels.
- Måle volumet av gjenopprettede prøven med brønnene. Vask FCP komplekser ved å legge til to ganger det gjenopprettede volumet med B1 buffer (tabell 1). Konsentrere seg i en membran konsentrator med en 30 kDa fristen på 1000 x g og 4 ° C til en ABS672nm minst 20.
Merk: B-DDM konsentrasjonen kan stige på grunn av micelle berikelse i eksempel skuffen. Dette kan føre til ytterligere solubilization av FCP komplekser! Unngå over solubilization ved å legge til vaskemiddel gratis buffer B1 hvis ytterligere vaske trinn kreves for å fjerne gjenværende sukrose. - Ta en 20 µL aliquot for kontroller. Sjokk fryse prøvene i flytende nitrogen og lagre dem på-80 ° C.
- Forberede en sukrose gradert løsning og fyll ultracentrifuge rør til toppen minus lasting volumet (300-500 µL). Fryse rør på 20 ° C før de er helt frosset. Tillate rør for å tine ved + 4 ° C, som tar 3-4 h for en 17 mL tube.
Figur 2: rensing av FCP, spektroskopiske kontroller og renheten sjekk. (A) typisk opptreden av en sukrose tetthet gradert etter overnatting sentrifugering. Alle brun band inneholde FCP bassenget bestående av FCPa og FCPb pigm. - ubundet pigmenter, PS - photosystems (B) Absorbance spektra av FCP før (blå linjen) og etter (oransje-stiplet linje) konsentrasjon bruke sentrifugal filter enheter med 30 kDa cutoff . Spesielt, er karotenoider utsatt for tap fra FCP, som vil resultere i lavere absorbansen i regionen mellom 500-550 nm. Grafer er normalisert til klorofyll Qy maksimum ved ~ 670 nm. (C) klorofyll a utslipp spectra med magnetisering av chl c (465 nm) for å teste funksjonelle eksitasjon energi-overføring. Hvis energien overføre chl c til chl en hemmes en ekstra fluorescens band på ~ 640 nm (chl c) skjer. Grafer er normalisert til utslipp maksimal. (D) eksitasjon spectra innspilt i 675 nm (chl en fluorescens maksimal) for å teste energioverføring til chl en fra alle pigmenter absorberende mellom 370 nm og 600 nm. Hvis energien overføre til chl en mindre effektiv, fluorescens avkastningen vil redusere spesielt mellom 465 og 550 nm. Grafene normalisert til maksimalt rundt 440 nm. Spectra med (B), (C) og (D) er nesten identiske hvis konsentrasjonen fungerte bra. (E) sjekk for renhet av de isolerte FCP bruker en Tris-tricine gel28. FCPa og FCPb har du underenheter mellom 18-19 kDa. Alle synlige sølv-farget proteiner større enn 20 kDa er forurensninger. Thyl. -Thylakoids Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
-
Spektroskopiske og gel-baserte
- Posten absorbans mellom 370-750 nm i 5 µL av FCP i 995 µL av B1a etter trinn 1.2.5. Sammenligne den med spekteret fikk i trinn 1.2.4. Bruk samme innstillinger som beskrevet i trinn 1.2.4 og instrumentering.
- Eksportere data som CSV og importere data til et regneark. Normalisere både spectra til maksimal chl en i Qy bandet rundt 672 nm avbildet i figur 2B.
- Beregne fortynningsfaktoren prøvene fra trinn 1.2.4 og 1.3.1 ved å dele den målte ABS672nm av den ønskede ABS672nm av 0,03. Fortynne prøvene tilsvarende med B1a og overføre dem til spesielle fluorescens cuvettes.
- Registrere chl en fluorescens utslipp spektrum med en spectrofluorometer å avsløre intakt lys energioverføring fra chl c til chl en (figur 2C).
- Bruke spectrometer programvare og gå til spektrum Målingsmodus med følgende innstillinger: modus, stråling; slit bredde eksitasjon og utslipp, 3 nm; følsomhet, middels; skannehastighet, 100 nm/min; data banen, 0,5 nm; eksitasjon bølgelengde, 465 nm; utslipp, 600-800 nm. Utføre autozero og mål.
- Registrere eksitasjon spectra med samme utvalg og utstyr å avsløre intakt energioverføring fra alle pigmenter til chl en (figur 2D). Endre innstillingene til: modus, eksitasjon; utslipp bølgelengde, 675 nm; eksitasjon, 370-600 nm. Registrere til spectra.
- Riktig med et rhodamine spekter i samme område for spektrale egenskapene til lampen- cf. instruksjonene i brukerhåndboken.
- Mix FCP prøver tilsvarer 1 µg av chl en med 10 µL SDS lasting bufferen. Inkuber i 10 min på 25 ° C. Sentrifuger i 5 min 12000 x g i en bordplaten sentrifuge.
- Last nedbryting på en Tris-tricine gel28. Skiller den 2 h på 150 V og sølv-flekk det etter separasjon40.
Merk: FCP underenheter skille i to fremtredende protein band mellom 18-19 kDa, som er bestanddeler av FCPa og FCPb29 (figur 2E).
- Last nedbryting på en Tris-tricine gel28. Skiller den 2 h på 150 V og sølv-flekk det etter separasjon40.
- Posten absorbans mellom 370-750 nm i 5 µL av FCP i 995 µL av B1a etter trinn 1.2.5. Sammenligne den med spekteret fikk i trinn 1.2.4. Bruk samme innstillinger som beskrevet i trinn 1.2.4 og instrumentering.
2. forberedelse av liposomer og innlemmelse av FCP
-
Utarbeidelse av lipid blandingen og lipid vaskemiddel micelles
Merk: lipider er utsatt for varme temperaturer kombinert med oksidativt forhold. Prøv å holde lipider kjølt og under en N2 atmosfære.- Beregne ønsket thylakoid lipid prosenter for C. meneghiniana etter Vieler et al. 200730. Se eksempelet i Supplemental tabell 1. Forberede lipid lager løsninger anbefalt av produsenten i løsemiddel bevis beholder.
- Pipetter ønsket antall lipider i en 2 mL reaksjon rør og fordampe kloroform bruke en mild nitrogen flyt og prøver å spre lipider over hele området av rør base. La N2 flyte til alle løsemiddel er fordampet.
- Solubilize lipid blandingen i 29 µL av n-octyl β-D-glucopyranoside løsning (OG) på 4 ° C i 4 h. Incubate lipid blandingen for 10 min på 30 ° C. Inkuber lipider i et sonicator bad i 3 x 3 min ved 25 ° C avbrutt av 30 s på is.
- Legg 221 µL tricine bufferen og 250 µL 4 x dialyse bufferen.
- Bruk en extruder med 0,1 µm polykarbonat membraner for definerte liposome diameter 50-70 nm. Samle extruder med membran og filter støtte. Unngå luftbobler og stram forsamlingen grundig.
- Fyll en sprøyte med 4 x dialyse buffer og pre våt extruder før noen bobler kan sees i andre sprøyten.
- Lipid-vaskemiddel-micelles gjelder extruder og trykk løsningen fra en sprøyte den andre frem og tilbake. Gjenta dette trinnet 5 ganger til løsningen vises homogen.
Merk: Denne løsningen kan lagres på 4 ° C i flere dager. Må ikke fryses!
-
Innlemmelse av FCP komplekser og fjerning av vaskemidler og aggregat
Merk: I dette eksempelet bruker vi en lipid/chl forholdet 12:1, som tilsvarer lipid/protein forholdet omtrent 100: 1.- Legge til FCP lik 20 µg av chl en i et totalt volum på 500 µL B1a bufferen til 250 μL ekstrudert lipid-micelles og 250 µL av 4 x dialyse buffer. Inkuber prøvene i 3 x 3 min ved 25 ° C i en thermomixer på 1500-3000 rpm avbrutt av en 30 s pause på is.
- Kuttet lokket av fire 1,5 mL reaksjon rør under toppen gir en ring som fortsatt passer på lokket. Forberede 1,5 cm x 1,5 cm biter av dialyse membran og vaske dem i 20 mL 1 x dialyse buffer
- Fyll 250 µL av utvalget til lokket. Nøye, lå membranen på lokket slik at rommet er fylt med prøven og ingen luftbobler oppstår. Stram reaksjon tube ringen på forsamlingen for å få inn i lukkede rom.
- Dialyze eksemplene i 50 mL 1 x dialyse buffer natten (12-16 h) på isen på en tumbling shaker. Erstatte brukte dialyse bufferen med friske og legge 7 mg adsorbent perler fjerne de gjenværende vaskemidler minst 6 h.
- Erstatte dialyse bufferen igjen og dialyze for en annen 12 h. gjenopprette liposomer piercing dialyse membranen med 200 µL brønnene tips og Sug opp alle liposomer fra reaksjon tube lokket.
- Valgfritt trinn: Hvis høy renhetsgrad (> 95%) er nødvendig. Forberede en usammenhengende tetthet gradert i 17 mL ultracentrifugation ampuller med trinn med 6%, 10%, 15% og 20% sukrose epichlorhydrin copolymer dialyse buffer. Last liposomer på toppen og ultracentrifuge på 100.000 x g 4 h i en svingende bøtte rotor.
- Gjenopprette øvre brun band med en sprøyte, fortynne eksempel 1:5 med DP og fortsette til neste trinn.
- Sentrifuge FCP liposomer i minst 2 mL 1 x dialyse bufferen for 1,5 t til 100 000 x g og 4 ° C. Gjenopprette liposomer snu sentrifuge røret i en vinkel på 45°. At liposomer å flytte for 1 min (figur 3A).
- Gjenopprette FCP liposomer i et siste volum på 25-50 µL. unngå forstyrre utløse.
-
Kontroller 1: absorbansen, fluorescens spektroskopi
- Legge til en 3 µL aliquot av FCP-liposomer et 1 mL siste volum 1 x dialyse buffer og sentrifuge for 5 min på 12.000 x g.
- Posten absorbans mellom 370 og 750 nm i FCP-liposomer med det samme utstyret som beskrevet i 1.2.4. Normalisere spekteret til maksimalt i Qy regionen chl en (670-680 nm) og sammenligne den normaliserte spekteret av solubilized FCP (Figur 3 c).
- Forberede FCP-liposomer i 1 mL av DP med en absorbansen (ABS) = 0,03 med hensyn til maksimal mellom 670-680 nm. Justere solubilized FCP i vaskemiddel fra trinn 1.2.6 til samme ABS fortynne med B1a.
- Posten absorbans spektra av begge prøver som beskrevet i 1.2.4. Registrere chl en fluorescens utslipp spektrum av begge prøver som beskrevet i 1.3.3.
Merk: Fluorescens avkastningen er redusert i FCP-liposome utvalget (figur 3D og jf diskusjon.)
- Legge til en 3 µL aliquot av FCP-liposomer et 1 mL siste volum 1 x dialyse buffer og sentrifuge for 5 min på 12.000 x g.
Figur 3: isolering av FCP proteoliposomes etterfulgt av spektroskopiske kontroller og AC confocal bildebehandling. (A) utvinning av FCP liposomer etter sentrifugering. Slå sentrifugeringsrøret å 45° og vent ca 1 min - liposomer flyttes mens FCP samler som ikke er innarbeidet i liposomer pinne til røret veggen. (B) sammenligning av absorbansen spektra av solubilized FCP i vaskemiddel (blå) og FCP i liposomer (oransje) (C) til samme spectra som (B) normalisert til chl maksimalt i regionen rød (~ 670 nm - Qy peak); solubilized FCP i vaskemiddel (blå) og FCP i liposomer (oransje). Muligens kunne det pigment tap hovedsakelig av karotenoider synlig i regionen 500-550 nm. Klynging av FCP i liposomer kan føre til en topp utvidelse og en liten forskyvning av chl maksimalt (~ 670 nm) røde. (D) utslipp spektra av solubilized FCP i vaskemiddel og FCP i liposome. Klynging av FCP i liposome forbedrer energisk samspill av FCP komplekser som senker fluorescens avkastningen (oransje kurve) og Skift utslipp maxima litt til rødt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollen beskriver isolering av totale FCP brøkdel fra Cyclotella meneghiniana og innlemmelse i liposomer innfødt lipid sammensetning. Thylakoid isolasjon er svært reproduserbare, men thylakoid avkastningen kan endres. Resultatet er akseptabelt hvis mer enn 50% av alle pigmenter gjenopprettes i trinn 1.1.4. Mer enn 80% er optimal.
Solubilization av thylakoids er en avgjørende skritt. Godt solubilized membraner hentes hvis nedbryting etter trinn 1.2.2 inneholder de fleste av pigmentene. Separasjon av FCP fra photosystems er bra hvis en klar brun (FCP) og en grønn (PS) band skjelnes (figur 2A). En fremtredende gulaktig brøkdel på graderingen er en indikasjon for pigment tap på grunn av over solubilization. Pigment tap oppstår hver forberedelse. Det er akseptabelt til en viss grad som funksjonaliteten til energi overføre til chl en er ikke påvirket (figur 2C, 2D). Også kan FCP berikelse trinn (1.2.4) indusere ytterligere solubilization og pigment tap på grunn av samtidig vaskemiddel berikelse. Forskjeller i normalisert absorbansen spectra er en indikasjon for pigment tap (figur 2B), som ofte forekommer i spektral regionen mellom 500-550 nm der karotenoider absorbere. Pigment tap er akseptabelt hvis komplekser er fremdeles funksjonell. Dette betyr at ingen store forskjeller oppstår i utslipp spectra og eksitasjon spektra (figur 2C, 2D). For utslipp spectra, chl c er fortrinnsvis glade 465 nm og overfører alle eksitasjon energien til chl en, som avgir på ~ 675 nm. Hvis chl c til chl energioverføring er forstyrret, chl c avgir på ~ 640 nm. I eksitasjon spectra, overføre energien til chl en overvåkes ved å endre eksitasjon bølgelengden fra 370-600 nm. I spektral varierer fra 370-440 nm hovedsakelig chl en spent. Eksitasjon rundt 465 nm favoriserer chl c. I området > 500 nm karotenoider, hovedsakelig fucoxanthins, er begeistret. Energi-overføring er berørt, hvis chl c og karotenoider bidra mindre chl en fluorescens. Derfor synker fluorescens avkastningen i disse spectral regioner i forhold til chl en eksitasjon mellom 370-440 nm.
Ønsket renheten av prøven, avhenger av det tiltenkte formålet av studien. For eksempel er det viktig å skille photosystems fra FCP for spektroskopiske mål mens ikke-pigmented proteiner påvirke mindre med målingene. Her renhet av 95% er tilstrekkelig høy (figur 2E). For masse spectrometric tilnærminger utelukkende skal FCP underenheter vises på en sølv-farget gel.
Kvalitetskontroll av liposome preparat er vanskelig å overvåke og bare kan ses på slutten av protokollen (2.2.5, figur 3A). FCP komplekser er ødelagt hvis farge svinger fra brown til olivengrønn. Et godt resultat er hvis en brun liposome brøkdel samles. Andelen liposomer gjenopprettede vs aggregert pellets er optimalt > 70%. Inkorporering av FCP i liposomer kan igjen føre til mindre pigment tap. En sammenligning av normalisert absorbansen spectra før og etter innlemmelse sett hvis pigmenter gikk tapt (figur 3B, 3 C). Noen absorbansen toppene i FCP-liposomer vises bredere og absorpsjon i rød spectral regionen (~ 670 nm - såkalte Qy bandet) av chl en kan være litt rød-skiftet. Dette skyldes klynging av FCP i liposome. Chl en fluorescens avkastning som oppstår fra FCP i liposomer reduseres i stor grad på grunn av excitonic samhandling i FCP-klynger (figur 3D, cf. diskusjon).
En typisk eksperimentere med liposomer gjør bruk av liposome's to reaksjon rom atskilt med en lipid bilayer som gir pH eller elektrokjemiske graderinger. I et eksempel, virkningen av kalium ion gradering på FCP fluorescens avkastning ble testet (figur 4A). Fluorescens avkastningen ble målt i nærvær av standard buffer. Fluorescensen drops med 30% hvis KCl ble lagt til. K+ forløpningen ble utgitt av kalium bestemte ionophore valinomycin, som gjenoppretter FCP fluorescens til første nivå (figur 4B). Disse endringene i fluorescens bekrefte hypotesen at FCP komplekser svare på kalium ion konsentrasjon graderinger24 i vivo.
Figur 4: typisk eksperimentere med FCP liposomer viser endringen av FCP fluorescens svar til en elektrokjemisk gradient indusert KCl. (A) Eksperimentell ordningen: 1. FCP chl fluorescens dialyse buffer. 2. tillegg 20 mm KCl indusere en elektrokjemisk gradering. 3. avslapning på graderingen av K+ selektiv ionophore valinomycin (4 µM). (B) miste av FCP fluorescens (675 nm) som svar på en K+ gradient (blå) og restaurering av samme fluorescens avkastningen som før (oransje) av avslapning på graderingen (grå). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| buffere / blandinger | komposisjon | |
| celle vekst & | Kunstig sjøvann i henhold til | 86 mM NaCl |
| thylakoid forberedelse | Provasoli, 1957 (ASP)25 | 21 mM KCl |
| 4 mM Tris | ||
| 8.1 mM MgSO4 | ||
| 11.8 mM NaNO3 | ||
| 0.58 mM K3HPO4 | ||
| 0,16 mM H3BO3 | ||
| 2 mM silica | ||
| pH 7.7 (H2så4) | ||
| autoklav | ||
| legge til sterilt: 2,72 mM CaCl2 | ||
| legge til sterilt: 0.012 mM FeCl3 | ||
| legge til sterilt: 0.092 mM EDTA | ||
| legge til sterilt: 0.02 mM MnCl2 | ||
| legge til sterilt: 0.002 mM ZnCl2 | ||
| legge til sterilt: 50 pM CoCl2 | ||
| legge til sterilt: 25 pM Na2MoO4 | ||
| legge til sterilt: 22 5 pM CuCl2 | ||
| homogenisering buffer | 10 mM MES | |
| 2 mM KCl | ||
| 5 mM EDTA | ||
| 1 M sorbitol | ||
| pH 6,5 (KOH) | ||
| vaske bufferen | 10 mM MES | |
| 2 mM KCl | ||
| 5 mM EDTA | ||
| pH 6,5 (KOH) | ||
| glass bead blanding | 75% 1 mm perler | |
| 25% 0.4 mm perler | ||
| aceton | 90% (v/v) med H2O | |
| flytende nitrogen | ||
| FCP rensing | n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside | 10% (w/v) i H2O |
| buffer B1 | 25 mM Tris | |
| 2 mM KCl | ||
| pH 7.4 (HCl) | ||
| buffer B1a = B1 + b-DDM | 0,03% (w/v) siste | |
| sukrose gradert løsning | 19% sukrose (w/v) i B1a | |
| liposome forberedelse | lipider se tilleggstabellen 1 | |
| N2 gass | ||
| n-octyl β-D-glucopyranoside (OG) | 10% (w/v) i B1a | |
| tricine buffer | 20 mM pH 7.5 | |
| 4 x dialyse buffer (DB) | 80 mM tricine pH7.5 | |
| 20 mM MgCl2 | ||
| 0,04% (w/v) NaN3 |
Tabell 1: Liste over buffere, lager løsninger og blandinger for FCP forberedelse og innlemmelse i liposomer.
Ekstra tabell 1: eksempel lipid og chl en forholdet beregning. En lipid/chl forholdet 12 brukes i eksemplet i figur 1 og Figur 3. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
FCP liposomer med naturlig lipid komposisjon gir en praktisk, enkel og reproduserbar verktøyet for å undersøke spektroskopiske egenskaper i vitro. Lipid miljøet FCP liposomer ligner situasjonen innen thylakoid membran, gir opphav til eksperimentelle resultater som er naturlige forhold.
Det er flere fordeler med å bruke C. meneghiniana som et modellsystem for FCP antenne. Det vokser relativt fort og mer robust i forhold til andre slektene modell arter, eksempelvis Thalassiosira pseudonana. Cellene bryte relativt lett i perle mill, noe som gir en høy avkastning av intakt thylakoid komplekser. Det viktigste punktet for C. meneghiniana , er vell av biokjemiske og spektroskopiske data innhentet i de siste år16,17,23,27,29,31 ,32,33,34. Den eneste ulempen er at en annotert genomet ikke er tilgjengelig ennå selv om genetisk manipulasjon er mulig35.
FCPs var forberedt fra kulturer vokst optimale forhold. Derfor kan avkastning, delenhet sammensetning og pigmentering av FCP komplekser endres hvis de er forberedt fra stress vilkår, f.eks høy lys27 eller næringsstoffer begrensning. Celle avbrudd i perle mill (1.1.3) er avgjørende for FCP avkastningen og bør følges etter hver endring av vekst tilstand av et mikroskop. Plastids skulle ha vært frigitt fra cellene slik at Tom frustules (silica skjell) er rådende. Neste viktige trinn er thylakoid solubilization. Effektiviteten av membran solubilization påvirker mengden lagring lipider som samler under visse stress forhold36. Derfor bør mengden vaskemiddel justeres før behandling prøver innhentet under stress forhold å unngå over solubilization. Dette problemet vises som økt chl c fluorescens utslipp på ~ 640 nm. Videre energioverføring fra karotenoider (500-550 nm) til chl en reduseres. Dette kan sees i eksitasjon spektrum (figur 2C, 2D). Visse tilnærminger kan være nyttig å skille FCPa fra FCPb antenne komplekser av ionebytte kromatografi27.
Overføring av FCP i liposomer er neste viktige trinn. Overføre effektiviteten, liposome homogenitet og intactness, avhenger av flere parametere. Lipid-micelle-utarbeidelse og ekstrudering gir homogenously størrelse liposome prekursorer. I dette eksemplet (2.1.3-2.1.4) en polykarbonat membran av 100 nm porestørrelse ble brukt til å få en BG-liposome størrelse ~ 50 nm. Mengden FCP lagt til lipid-rengjøringsmiddel micelles definerer protein: lipid forholdet i liposome. Derfor oppnås et definert antall FCP per liposome. I en lignende tilnærming anlegg og grønne alger LHC komplekser klynge spontant. Dette ble avslørt av tid-løst fluorescens og enkelt-molekylet spektroskopi22 og gir en lyd base for ytterligere eksperimenter.
Den kontrollerte dialyse er også avgjørende for inkorporering av FCP i liposomer. Selv om innlemmelse av den hydrofobe FCP komplekse energisk foretrukket, kan the kinetics av innsetting konkurrere med the kinetics av aggregering. Dette faktum blir mer fremtredende i mer hydrofobe og større komplekser er. I dette eksemplet er mindre FCPa trimer innebygd raskere enn den større FCPb nonamer. Riktig FCP innlemmelse krever at lipid micelles er godt blandet med solubilized FCP komplekser før vaskemiddel flytting via dialyse. Her, kan blande tiden i 2.2.1 varieres. Det anbefales ikke å stige blande temperaturen fordi dette vil føre til FCP oppløsning. Videre "speed" av vaskemiddel fjerning er viktig og kan bli justert av mengden adsorbent (2.2.4). Den endelige størrelsen på liposomer kan variere. Dynamisk lysspredning, analytiske ultracentrifugation og elektronmikroskop er egnet metoder å avgjøre liposome størrelse utvalg37,38. For denne protokollen med naturlig thylakoid lipid sammensetning og lipid micelle ekstrudering forventer vi nevnte diameteren på 50-80 nm og en nesten kule som figuren avslørt av cryo-elektronmikroskop. Disse resultatene ble oppnådd med samme metoden omfatter grønne alger LHC22. Tilsatte utskilte fettstoffer slik liten diameter har en sterk overflate krumning av ~ 10° per 5 nm som kan bøye større antenne komplekser og tvinge dem til å monomerize. Denne situasjonen etterligner ryggsøylens naturlige i grana marginene av alger og planter22. Sammenlignet med grana marger, vises av thylakoid ganske flat. Derfor hvis større komplekser som photosystems skal bli studert anbefales det å bruke liposomer med større diameter. Et annet spørsmål som oppstår er: Hva er retningen av komplekser? Ved FCPa konkluderer vi fra målinger svar på lav pH24 at retningen er 50% høyre ut og 50% genseren. I fremtiden, må metoder tvinge komplekser i én retning. I andre studier med bacteriorhodopsin middelklasseinnbyggere pumpen, er nesten alle proteinene spontant orientert i den samme måten (høyre ut)39.
Det er spørsmålet om hva induserer fluorescens endringen når K+ legges til i liposomer. Flere svar er tenkelig. Hvis K+ konsentrasjonen alene er ansvarlig eksperiment i Figur 4 vil resultere i en ytterligere reduksjon av fluorescens hvis valinomycin legges til etter KCl. I en fersk studie gitt vi støtte for ideen om at K+ konsentrasjon gradient er ansvarlig for fluorescens endring av FCPa24. Andre faktorer kan påvirke fluorescens avkastningen også. Dette kan være osmotisk eller overflate ladning dynamics effekter24.
For å oppsummere, er fordelen å undersøke lette høsting antenne komplekser som FCP i liposomer at det gir et funksjonelt system nær i vivo forhold. Men antallet komponenter er fortsatt liten, noe som reduserer kompleksiteten i eksperimentelle resultatene. Det gir simuleringer av lette stress og induksjon av foto-beskyttende mekanismer. Videre kan rollen enkelte lipid arter funksjonen FCP komplekser studeres. Potensialet i denne metoden øker med de nylig laget går i cryo-elektronmikroskop, ett molekyl spektroskopi og andre løst spektroskopiske metoder. Dette vil aktivere forskere å forbedre studier av energioverføring i lys høstingen systemer. Kombinert med disse teknikkene, kan kunnskap om FCP solubilized og samlede tilstanden suppleres med informasjon om bidraget av lipid miljøet FCP-funksjonen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Rana Adeel Ahmad for hjelp i FCP rensing. Prof Claudia Büchel er anerkjent for nyttig diskusjoner og lese manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av tysk Research Foundation til LD (DI1956-1/1) og Humboldt grunnlaget for en Fjodor Lynen fellesskap til LD.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 500 ml centrifuge vials | |||
| high speed centrifuge | Heraeus | ||
| Bead Mill VI 2 | Edmund-Bühler (edmund-buehler.de) | newer version: Vibrogen-Zellmühle Vl 6 | |
| Silibeads S 400 µm | Sigmund-Lindner.com | 5223-7 | |
| Silibeads S 1,-1,3 mm | Sigmund-Lindner.com | 4504 | |
| VitraPOR filter funnel - por1 | ROBU GmbH | 21121 | |
| polycarbonate ultracentrifuagtion vials (30 mL) for T-865 | Beranek Laborgeräte (Laborgeraete-beranek.de) | 314348 | |
| Ultracentrifuge Discovery 90SE | Sorvall | n.a. | |
| rotor T 865 | ThermoFisher Scientific (thermofisher.com) | 51411 | |
| Neubauer Cell Counter Chamber (improved) | Carl Roth Laborbedarf (Carlroth.com) | T729.1 | |
| Zeiss Mikroskop Primostar (7) | Optik-Pro (optik-pro.de) | 51428 | |
| optical glass cuvettes (6040-OG) | Hellma Analytics (hellma-analytics.com) | "6040-10-10" | |
| V-630 UV-VIS Spectrophotometer (incl. software) | Jasco (jasco.de) | V-630 | |
| n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside | ANATRACE (anatrace.com) | D310LA | |
| Ultra-Clear tubes 17 ml for AH629 | Beranek Laborgeräte (Laborgeraete-beranek.de) | 344061 | |
| rotor AH629-17-mL | ThermoFisher Scientific (thermofisher.com) | 54285 | |
| Membrane concentrator_Centriprep 30 kDa cutoff | Millipore (merckmillipore.com) | 4307 | |
| Biometra Minigel-Twin | Analytik Jena AG (analytik-jena.de) | 846-010-100 | |
| Silver Stain Plus Kit | Bio-Rad (bio-rad.com) | 1610449 | |
| libre office spread sheet | The document foundation | https://de.libreoffice.org/download/libreoffice-still/ | |
| special glass cuvettes for fluorescence (101-0S) | Hellma Analytics (hellma-analytics.com) | 101-10-20 | |
| Spectrofluorometer FP-6500 (incl. Software) | Jasco (jasco.de) | FP-6500 | |
| SDS-loading buffer Roti-Load | ROTH (carlroth.com) | K929.1 | |
| n-octyl β-D-glucopyranoside | ANATRACE (anatrace.com) | O311 | |
| Monogalactosyl Diaclyglycerol (MGDG) | Larodan AB (larodan.com) | 59-1300 | make stock solution in chloroform |
| Digalactosyl Diacylglycerol (DGDG) | Larodan AB (larodan.com) | 59-1310 | make stock solution in chloroform |
| Sulphoquinovosyl Diacylglycerol (SQDG) | Larodan AB (larodan.com) | 59-1230 | make stock solution in chloroform |
| L-alpha-Phosphatidylglycerol (PG) | Larodan AB (larodan.com) | 37-0150 | make stock solution in chloroform |
| L-α-Phosphatidylcholine | Sigma-Aldrich (sigmaaldrich.com) | P3782 SIGMA | make stock solution in chloroform |
| sonicator bath S-50TH | Sonicor (getmedonline.com | SONICOR-S-50TH | |
| mini-Extruder | Avanti Polar Lipids (Avanti.com) | 610000 | |
| Nuleopore polycarbonate membrane | Avanti Polar Lipids (Avanti.com) | 610005 | |
| dialysis membrane Visking 14 kDa cutoff | ROTH (carlroth.com) | 0653.1 | boil in destilled water before use |
| Biobeads SM2 Adsorbent | Biorad (Bio-rad.com) | 152-3920 | |
| sucrose epichlorhydrin copolymer - Ficoll 400 | Sigma-Aldrich (sigmaaldrich.com) | F4375 | |
| Polycarbonate ultracentrifuagtion vials (2.7 mL) for TFT 80.4 | Beranek Laborgeräte (Laborgeraete-beranek.de) | 252150 | |
| rotor TFT 80.4 | Millipore (merckmillipore.com) | 54356 | |
| material listed in order of appearance | For specific safety instructions please refer to material safety sheets and repective manuals. Standard lab material and substances are not listed. |
References
- Eberhard, S., Finazzi, G., Wollman, F. A. The Dynamics of Photosynthesis. Annual Review of Genetics. 42, 463-515 (2008).
- Li, Z. R., Wakao, S., Fischer, B. B., Niyogi, K. K. Sensing and Responding to Excess Light. Annual Review of Plant Biology. 60, 239-260 (2009).
- Niyogi, K. K., Truong, T. B. Evolution of flexible non-photochemical quenching mechanisms that regulate light harvesting in oxygenic photosynthesis. Current Opinion in Plant Biology. 16 (3), 307-314 (2013).
- Li, X. -P., et al. A pigment-binding protein essential for regulation of photosynthetic light harvesting. Nature. 403 (6768), 391-395 (2000).
- Peers, G., et al. An ancient light-harvesting protein is critical for the regulation of algal photosynthesis. Nature. 462 (7272), 518-521 (2009).
- Correa-Galvis, V., et al. Photosystem II Subunit PsbS Is Involved in the Induction of LHCSR Protein-dependent Energy Dissipation in Chlamydomonas reinhardtii. The Journal of biological chemistry. 291 (33), 17478-17487 (2016).
- Bailleul, B., et al. An atypical member of the light-harvesting complex stress-related protein family modulates diatom responses to light. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (42), 18214-18219 (2010).
- Taddei, L., et al. Multisignal control of expression of the LHCX protein family in the marine diatom Phaeodactylum tricornutum. Journal of experimental botany. 67 (13), 3939-3951 (2016).
- Lepetit, B., et al. The diatom Phaeodactylum tricornutum adjusts nonphotochemical fluorescence quenching capacity in response to dynamic light via fine-tuned Lhcx and xanthophyll cycle pigment synthesis. New Phytologist. 214 (1), 205-218 (2017).
- Büchel, C. Evolution and function of light harvesting proteins. Journal of Plant Physiology. 172, 62-75 (2015).
- Lavaud, J., Rousseau, B., van Gorkom, H. J., Etienne, A. -L. Influence of the Diadinoxanthin Pool Size on Photoprotection in the Marine Planktonic Diatom Phaeodactylum tricornutum. Plant Physiology. 129 (3), 1398-1406 (2002).
- Ruban, A., et al. The super-excess energy dissipation in diatom algae: comparative analysis with higher plants. Photosynthesis Research. 82 (2), 165-175 (2004).
- Mann, D. G. The species concept in diatoms. Phycologia. 38 (6), 437-495 (1999).
- Papagiannakis, E., van Stokkum, I. H. M., Fey, H., Büchel, C., van Grondelle, R. Spectroscopic Characterization of the Excitation Energy Transfer in the Fucoxanthin-Chlorophyll Protein of Diatoms. Photosynthesis Research. 86 (1-2), 241-250 (2005).
- Premvardhan, L., Robert, B., Beer, A., Büchel, C. Pigment organization in fucoxanthin chlorophyll a/c2 proteins (FCP) based on resonance Raman spectroscgopy and sequence analysis. Biochimica et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1797 (9), 1647-1656 (2010).
- Gildenhoff, N., Herz, J., Gundermann, K., Büchel, C., Wachtveitl, J. The excitation energy transfer in the trimeric fucoxanthin-chlorophyll protein from Cyclotella meneghiniana analyzed by polarized transient absorption spectroscopy. Chemical Physics. 373 (1), 104-109 (2010).
- Ramanan, C., et al. Exploring the mechanism(s) of energy dissipation in the light harvesting complex of the photosynthetic algae Cyclotella meneghiniana. Biochimica et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1837 (9), 1507-1513 (2014).
- Haferkamp, S., Kirchhoff, H. Significance of molecular crowding in grana membranes of higher plants for light harvesting by photosystem II. Photosynthesis Research. 95 (2-3), 129-134 (2008).
- Wahadoszamen, M., et al. Stark fluorescence spectroscopy reveals two emitting sites in the dissipative state of FCP antennas. Biochimica et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1837 (1), 193-200 (2014).
- Zhou, F., et al. Effect of monogalactosyldiacylglycerol on the interaction between photosystem II core complex and its antenna complexes in liposomes of thylakoid lipids. Photosynthesis Research. 99 (3), 185-193 (2009).
- Moya, I., Silvestri, M., Vallon, O., Cinque, G., Bassi, R. Time-resolved fluorescence analysis of the photosystem II antenna proteins in detergent micelles and liposomes. Biochemistry. 40 (42), 12552-12561 (2001).
- Natali, A., et al. Light-harvesting Complexes (LHCs) Cluster Spontaneously in Membrane Environment Leading to Shortening of Their Excited State Lifetimes. Journal of Biological Chemistry. 291 (32), 16730-16739 (2016).
- Gundermann, K., Büchel, C. Factors determining the fluorescence yield of fucoxanthin-chlorophyll complexes (FCP) involved in non-photochemical quenching in diatoms. Biochimica et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1817 (7), 1044-1052 (2012).
- Ahmad, R. A., Dietzel, L. Relaxation of cellular K+ gradients by valinomycin induces diatoxanthin accumulation in Cyclotella meneghiniana cells and alters FCPa fluorescence yield in vitro. Physiologia Plantarum. , 171-180 (2017).
- Provasoli, L., McLaughlin, J. J. A., Droop, M. R. The development of artificial media for marine algae. Archiv für Mikrobiologie. 25 (4), 392-428 (1957).
- Jeffrey, S., Humphrey, G. New spectrophotometry equations for determining chlorophyll a, chlorophyll b, chlorophyll c-1 and chlorophyll c-2 in higher plants, algae and natural phytoplankton. Biochemie und Physiologie der Pflanzen. 167, 191-194 (1975).
- Beer, A., Gundermann, K., Beckmann, J., Büchel, C. Subunit Composition and Pigmentation of Fucoxanthin−Chlorophyll Proteins in Diatoms: Evidence for a Subunit Involved in Diadinoxanthin and Diatoxanthin Binding. Biochemistry. 45 (43), 13046-13053 (2006).
- Schägger, H., von Jagow, G. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. Analytical Biochemistry. 166 (2), 368-379 (1987).
- Büchel, C. Fucoxanthin-Chlorophyll Proteins in Diatoms: 18 and 19 kDa Subunits Assemble into Different Oligomeric States. Biochemistry. 42 (44), 13027-13034 (2003).
- Vieler, A., Wilhelm, C., Goss, R., Süß, R., Schiller, J. The lipid composition of the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii and the diatom Cyclotella meneghiniana investigated by MALDI-TOF MS and TLC. Chemistry and Physics of Lipids. 150 (2), 143-155 (2007).
- Gundermann, K., Büchel, C. The fluorescence yield of the trimeric fucoxanthin-chlorophyll-protein FCPa in the diatom Cyclotella meneghiniana is dependent on the amount of bound diatoxanthin. Photosynthesis Research. 95 (2-3), 229-235 (2008).
- Miloslavina, Y., et al. Ultrafast fluorescence study on the location and mechanism of non-photochemical quenching in diatoms. Biochimica et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1787 (10), 1189-1197 (2009).
- Grouneva, I., Jakob, T., Wilhelm, C., Goss, R. The regulation of xanthophyll cycle activity and of non-photochemical fluorescence quenching by two alternative electron flows in the diatoms Phaeodactylum tricornutum and Cyclotella meneghiniana. Biochimica et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1787 (7), 929-938 (2009).
- Chukhutsina, V. U., Büchel, C., van Amerongen, H. Disentangling two non-photochemical quenching processes in Cyclotella meneghiniana by spectrally-resolved picosecond fluorescence at 77 K. Biochimica et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1837 (6), 899-907 (2014).
- Ghazaryan, A., Akhtar, P., Garab, G., Lambrev, P. H., Büchel, C. Involvement of the Lhcx protein Fcp6 of the diatom Cyclotella meneghiniana in the macro-organisation and structural flexibility of thylakoid membranes. Biochimica Et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1857 (9), 1373-1379 (2016).
- Darley, W. M. Biochemical composition. The biology of diatoms. 13, 198-223 (1977).
- Milsman, M. H. W., Schwendner, R. A., Weder, H. G. Preparation of large single bilayer liposomes by a fast and controlled dialysis. Biochimica Et Biophysica Acta. 512 (1), 147-155 (1978).
- Zumbuehl, O., Weder, H. G. Liposomes of controllable size in the range of 40 to 180 nm by defined dialysis of lipid-detergent-mixed micelles. Biochimica Et Biophysica Acta. 640 (1), 252-262 (1981).
- Verchere, A., Broutin, I., Picard, M. Photo-induced proton gradients for the in vitro investigation of bacterial efflux pumps. Scientific Reports. 2 (306), (2012).
- Chevallet, M., Luche, S., Rabilloud, T. Silver staining of proteins in polyacrylamide gels. Nature Protocols. 1 (4), 1852-1858 (2006).
