Summary
Qui descriviamo e confrontiamo due posizioni per ottenere la vista apicale a quattro camere nei topi. Queste posizioni consentono la quantificazione della funzione ventricolare destra, forniscono risultati comparabili e possono essere utilizzate in modo intercambiabile.
Abstract
La disfunzione diastolica è una caratteristica prominente del rimodellamento ventricolare destro (RV) associato a condizioni di sovraccarico di pressione. Tuttavia, la funzione diastolica RV è raramente quantificata negli studi sperimentali. Ciò potrebbe essere dovuto a difficoltà tecniche nella visualizzazione del camper nella vista apicale a quattro camere nei roditori. Qui descriviamo due posizioni che facilitano la visualizzazione della vista apicale a quattro camere nei topi per valutare la funzione diastolica RV.
La vista apicale a quattro camere è abilitata inclinando la piattaforma di fissaggio del mouse a sinistra e caudally (LeCa) o a destra e cranicamente (RiCr). Entrambe le posizioni forniscono immagini di qualità comparabile. I risultati della funzione diastolica RV ottenuti da due posizioni non sono significativamente diversi. Entrambe le posizioni sono comparabilmente facili da eseguire. Questo protocollo può essere incorporato nei protocolli pubblicati e consente indagini dettagliate sulla funzione RV.
Introduction
La disfunzione diastolica è una caratteristica prominente del rimodellamento ventricolare destro (RV)1 ed è associata alle condizioni di sovraccarico di pressione2. L'ecocardiografia (EchoCG) può essere utilizzata per la caratterizzazione della disfunzione diastolica RV3,4. Nonostante i recenti sviluppi nell'ecocardiografia animale di piccole dimensioni, le misurazioni dei parametri diastolici sono raramente riportate. Al contrario, le misurazioni della funzione sistolica sono ampiamente utilizzate per la caratterizzazione dei topi transgenici5, nonché per la valutazione di una risposta al trattamento6.
Ciò può essere in parte spiegato dalle difficoltà nella misurazione dei parametri diastolici dalla vista apicale a quattro camere. La visualizzazione del cuore in questa posizione può essere facilitata inclinando la piattaforma di fissaggio LeCa o RiCr. Anche se vengono utilizzate queste manipolazioni, gli ecocardiografi non li riportano nei loro manoscritti4,7. Pertanto, non è chiaro se queste manipolazioni forniscano risultati comparabili. Inoltre, ciò preclude anche uno sviluppo di nomenclatura standardizzata di questa posizione per i topi.
Lo scopo di questo studio era quello di descrivere due posizioni per la visualizzazione apicale della vista a quattro camere e confrontarne i risultati. Per determinare le differenze tra le due posizioni, abbiamo utilizzato il modello di fasciatura dell'arteria polmonare del topo (PAB), in cui una clip di tantalio porta ad un'occlusione parziale dell'arteria polmonare. Questa occlusione si traduce in un giusto rimodellamento del ventricolo e disfunzione. Tutti i dettagli dell'operazione PAB sono disponibili nel lavoro pubblicato in precedenza3. I topi a base di sham, dove la clip è stata posizionata accanto all'arteria polmonare, sono stati utilizzati per il confronto. Le indagini EchoCG sono state eseguite tre settimane dopo l'uso utilizzando il sistema di imaging con una testina di scansione a 30 MHz (vedere Tabella dei materiali per entrambi). La nomenclatura per la descrizione delle posizioni e degli orientamenti tra il mousee il fascio a ultrasuoni viene utilizzata come descritto da .
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Protocol
Lo studio è stato condotto secondo le normative nazionali per la sperimentazione animale e la direttiva UE 2010/63. Preparare l'attrezzatura come descritto in precedenza da Brittain et al.
1. Preparazione del mouse
- Ottenere 12 a 13 settimana di topi maschi C57Bl6 / J e ospitarli con un ciclo di luce / buio 12 h, a temperatura ambiente costante, e con accesso ad libitum alla chow di laboratorio standard e acqua, fino all'inizio dell'esperimento.
- Anestesizzare il topo utilizzando l'anestesia generale approvato dall'Istituto e verificare la mancanza di risposta al pizzico delle dita dei dei idi. In anestesia lieve con isoflurane 0.8%–1.2%, fissare il mouse su una piattaforma riscaldata. Applicare il gel elettrodo alle estremità per il monitoraggio continuo della frequenza cardiaca e della temperatura.
- Depilate i peli del topo toracico con crema di depilazione. Per ridurre la pressione sul torace, non applicare il gel di accoppiamento ad ultrasuoni direttamente sul torace; piuttosto, applicare uno strato di gel sulla punta del trasduttore.
2. Acquisizione di immagini
- Vista a quattro camere Apical con inclinazione sinistra e caudale della piattaforma
- Dopo la preparazione del topo, angula la piattaforma a sinistra a 10–15 gradi e poi caudally a 10–15.
- Posizionare il trasduttore sopra l'apice con il piano di imaging di 45 gradi sul piano coronale e l'asse centrale del fascio a ultrasuoni diretto cranicamente, posteriore e a sinistra per ottenere la vista apicale a quattro camere. Premere il pulsante B-Mode (Modalità B) per attivare l'immagine B-mode/2-D.
NOT: Il trasduttore può essere tenuto manualmente o fissato da una fase. Il termine "B-mode" deriva dal sistema di imaging che è stato utilizzato al posto del termine più familiare "bidimensionale" (2D) e viene utilizzato in tutto il protocollo. - Cercare l'aspetto delle seguenti strutture nella finestra acustica: il ventricolo sinistro (LV), l'atrio sinistro (LA), il rV, l'atrio destro (RA), la valvola mitrale (MV) e la valvola tricuspida (TV).
- Manipolare il piano di imaging nel piano coronale e ruotare in senso orario e dell'orologio attorno all'asse centrale fino a quando entrambi i ventricoli non vengono visualizzati alla loro dimensione più lunga ed entrambi gli atri sono visibili. Questa è la vista a quattro camere (Figura 1).
- Premere il pulsante Cine store per salvare la registrazione.
- Premere il pulsante Scansione/Congela per mettere in pausa il sistema.
- Misurazione delle velocità transtripide del flusso sanguigno
- Premere il pulsante Scansione/Congela per attivare il sistema.
- Premere più volte il pulsante Sovrapponi per attivare il volume del campione per la modalità PW (onda pulsata).
- Mantenendo la vista a quattro camere ottenuta, utilizzare la trackball per posizionare il volume del campione all'apertura delle valvole tricuspid per la misurazione delle velocità di afflusso (velocità di picco E e A).
- Premere il pulsante della modalità PW per la misurazione delle velocità di afflusso (velocità di picco E e A).
NOT: Poiché le valvole tricuspide sono difficili da visualizzare in questa posizione, l'esecuzione di diverse misurazioni aiuta ad allineare correttamente il volume del campione con il flusso sanguigno. Eseguire il campionamento Doppler con il più piccolo angolo di incidenza tra il fascio doppler e la direzione del flusso sanguigno. Il profilo del flusso sanguigno ottenuto deve corrispondere ai seguenti criteri: 1) un profilo di afflusso simile a una forma M con il primo picco inferiore al secondo; 2) una modulazione respiratoria con maggiore ampiezza all'ispirazione; 3) un'ampiezza massima delle velocità in diverse misurazioni (Figura 2). - Premere il pulsante Cine store per salvare la registrazione ottimizzata.
- Premere il pulsante Scansione/Congela per mettere in pausa il sistema.
- Misurazione dell'escursione sistolica del piano anulare tricuspid (TAPSE)
- Premere il pulsante Scansione/Congela per attivare il sistema.
- Passare alla modalità B premendo il pulsante B-Mode. Alcune manipolazioni sull'immagine potrebbero essere necessarie per recuperare la corretta vista a quattro camere.
- Premere più volte il pulsante Sovrapponi per attivare il volume campione della modalità M. Utilizzando il trackball, allineare il volume del campione con la parte laterale dell'annulo tricuspid. Tirando i bordi del volume del campione utilizzando la trackball, allineare la lunghezza del volume del campione per coprire l'intera ampiezza del movimento cardiaco durante il ciclo cardiaco.
- Premere il tasto M-Mode per attivare la modalità M. I movimenti di Tricuspid annulus dovrebbero apparire come un'onda (Figura 2).
- Premere il pulsante Cine store per salvare la registrazione.
- Premere il pulsante Scansione/Congela per mettere in pausa il sistema.
- Misurazione dei parametri di Doppler dei tessuti
- Premere il pulsante Scansione/Congela per attivare il sistema.
- Premere il pulsante B-Mode per attivare la modalità B.
NOT: Alcune manipolazioni per angolazione nel piano coronale e rotazione orologio e antiorario intorno all'asse centrale dell'immagine potrebbe essere necessario per recuperare la corretta vista a quattro camere. - Premere più volte il pulsante Sovrapponi per attivare il volume del campione per la TDI (Tissue Doppler imaging). Utilizzando la trackball, allineare il volume del campione con la parte laterale dell'annulo tricuspid, dove la parete libera RV crea un angolo con la valvola tricuspid. Tirando i bordi del volume del campione utilizzando il trackball, regolare il volume del campione per includere sia la posizione sistolica che quella diastolica dell'annulo.
-
Premere il pulsante Tessuto per attivare la modalità TDI.
NOTA: il tracciamento giallo della registrazione TDI appare corrispondente ai seguenti criteri:1) una registrazione simile a una forma M invertita; 2) picchi E ' e A' chiaramente distinguibili durante la diastole e la vetta di S durante la sistole; 3) un'ampiezza massima delle velocità in diverse misurazioni (Figura 2). - Premere il pulsante Cine store per registrare un'immagine ottimizzata.
- Premere il pulsante Scansione/Congela per mettere in pausa il sistema.
- Vista a quattro camere Apical con inclinazione destra e cranica della piattaforma
- Anguilla la piattaforma a destra a 10–15 e poi craniale a 10–15. Eseguire le misurazioni come descritto nelle sezioni precedenti per i passaggi LeCa (passaggi 2.1, 2.2, 2.3 e 2.4).
NOT: Durante l'indagine, l'isoflurane deve essere titolato tra 0.–1.2 per mantenere la frequenza cardiaca del mouse a 400-440 bpm. In questo intervallo, sono misurabili picchi separati di flusso sanguigno transtricuspide e velocità di Doppler dei tessuti (DTI). Per evitare gli effetti della perdita di calore sull'emodinamica, i dati vengono registrati e l'analisi viene eseguita off-line. Solo i segnali ottenuti alla fine della scadenza vengono utilizzati per l'analisi. Le misurazioni da 3 a 5 battiti cardiaci sono mediate.
- Anguilla la piattaforma a destra a 10–15 e poi craniale a 10–15. Eseguire le misurazioni come descritto nelle sezioni precedenti per i passaggi LeCa (passaggi 2.1, 2.2, 2.3 e 2.4).
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Representative Results
La vista apicale a quattro camere è difficile da ottenere nei topi. Pertanto, le manipolazioni della posizione della piattaforma possono aiutare a visualizzare il cuore cambiando la sua posizione nel torace. L'inclinazione della piattaforma a sinistra e a destra ha migliorato la finestra acustica e fornito immagini di qualità comparabile in modalità B (Figura 1). Dopo aver ottenuto le posizioni corrette, le misurazioni nelle modalità PW-, M-, e TDI hanno fornito immagini di qualità comparabile (Figura 2). La misurazione dei parametri diastolici è stata eseguita su topi con sham e PAB (Tabella 1). Entrambe le posizioni (RiCr e LeCa) hanno dato risultati simili nei parametri diastolici (Tabella2). Inoltre, le indagini EchoCG in entrambe le posizioni hanno rivelato differenze simili tra i gruppi sham e PAB (Tabella2, test di Dunnet). L'analisi di correlazione ha rivelato un buon accordo tra i valori ottenuti da queste due posizioni agevolute (Figura 3). Poiché per questo studio sono stati utilizzati piccoli gruppi di animali, sono stati applicati test non parametrici9,10. La variabilità intra-osservatore per alcuni parametri analizzati è stata pubblicata in precedenza3.
Figura 1 : Immagini rappresentative della vista apicale a quattro camere. La vista apicale a quattro camere è abilitata inclinando la piattaforma di fissaggio del mouse a sinistra e caudally (LeCa) o a destra e cranicamente (RiCr). LA - atrio sinistro; LV - ventricolo sinistro; RA - atrio destro; RV - ventricolo destro. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : immagini rappresentative delle misurazioni del flusso TAPSE, TDI e transtricuspid ottenute da due posizioni di visualizzazione apicali a quattro camere facilitate. TAPSE - escursione sistolica del piano annulus tricuspid; E' il picco iniziale della velocità di rilassamento ventricolare destro; A' - picco tardivo della velocità di rilassamento ventricolare destro; S' - velocità della contrazione ventricolare destra; E - picco precoce dell'afflusso tricuspido diastolico; Un picco di influsso tricuspido tardivo. Si noti il cambiamento nel profilo del flusso sanguigno transtricuspid all'ispirazione (Insp). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : analisi di correlazione dei dati ottenuti da due posizioni apicali facilitate. L'analisi della correlazione è stata eseguita utilizzando il test di Spearman non parametrico. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Tabella 1: Caratterizzazione dei gruppi operati tre settimane dopo l'operazione. RVFW - spessore della parete libera ventricolare destro; VTI - intervallo di velocità-tempo.
Tabella 2: Confronto dei risultati ottenuti dalla vista apicale a quattro camere facilitata dall'inclinazione della piattaforma cranica sinistra o caudala destra. Vengono visualizzati i parametri funzionali RV derivati da EchoCG. Come ogni topo è stato studiato in entrambe le posizioni, il test di rango firmato Wilcoxon è stato utilizzato per confronti all'intra-gruppo. § p > 0,05 tra RiCr e LeCa. Il test Kruskal-Wallis, seguito dal test post hoc di Dunnet, è stato utilizzato per confronti di più gruppi. I risultati di due confronti intergruppo selezionati sono presentati nella tabella. : p < 0,05, p < 0,01. PAB - bande arteriose polmonari; Leca: inclinazione caudale sinistra; RiCR - inclinazione cranica destra; E - picco precoce dell'afflusso tricuspido diastolico; Un picco di influsso tricuspido diastolico; TAPSE - escursione sistolica del piano annulus tricuspid; e' il picco iniziale della velocità di rilassamento ventricolare destro; a' - picco tardivo della velocità di rilassamento ventricolare destro; S' - velocità della contrazione ventricolare destra; HR - frequenza cardiaca; bpm - battiti al minuto.
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Discussion
La funzione RV ecocardiografica e la valutazione della dimensione da posizioni parasternali sono state ben descritte. Al contrario, la posizione apicale nell'ecocardiografia del mouse è stata trascurata in parte a causa di difficoltà tecniche. Utilizzando una posizione orizzontale della piattaforma, è difficile ottenere una finestra acustica sufficiente per l'imaging della vista a quattro camere. Per facilitare l'imaging di questa posizione, la piattaforma può essere inclinata a sinistra, una manipolazione simile al posizionamento laterale sinistro dei pazienti. Questo dovrebbe portare a un posizionamento verso sinistra e più superiore del cuore, migliorando così la finestra acustica. Pertanto, LeCa è la nostra posizione standardizzata per la visualizzazione apicale. Tuttavia, in circa il 30%-35% dei topi, la qualità dell'immagine in questa posizione può essere insufficiente. Qui, l'imaging nella posizione RiCr può essere utile.
Da queste posizioni, è possibile misurare le velocità transtricuspide del flusso sanguigno (E e A) e le velocità di Doppler dei tessuti (E' e A'), fornendo informazioni sulla funzione diastolica RV. Abbiamo osservato una buona correlazione tra i parametri TDI ottenuti dalle due posizioni. Meno soddisfacente è stata la correlazione di E. In generale, la visualizzazione del profilo del flusso sanguigno transtricuspidal è stata la parte più impegnativa del protocollo qui presentato e ha mostrato la più alta variabilità. La misurazione di TAPSE e S' da Doppler tessuto fornito una stima della funzione sistolica RV. Tuttavia, alla luce dei recenti risultati, il significato fisiologico di TAPSE non è chiaro11. Non misuriamo regolarmente l'area frazionaria RV di contrazione dalla posizione apicale perché, nelle condizioni di sovraccarico di pressione, la parte laterale del camper allargato è parzialmente coperta dallo sterno e non completamente visibile da questa posizione3. Così, la visualizzazione della posizione apicale nei topi consente la misurazione dei parametri abitualmente utilizzati in clinica e, quindi, fornisce ulteriori informazioni, che consente una caratterizzazione funzionale più completa.
L'analisi del ceppo, la velocità di deformazione e l'ecocardiografia di tracciamento delle macchie sono nuove modalità di ecografia cardiaca12. La sua alta sensibilità può rilevare la disfunzione cardiaca nelle fasi iniziali13 e ha il potere di prevedere la mortalità14; pertanto, la sua applicazione è giustificata anche da studi sperimentali. Sfortunatamente, nei topi, la parete libera del camper è in parte nascosta dietro l'ombra dello sterno, il che potrebbe ostacolare l'analisi della deformazione. Inoltre, l'analisi delle macchie richiede una buona qualità dell'immagine e la visualizzazione dell'intera parete libera.
Il sistema cardiovascolare risponde rapidamente ai cambiamenti nella postura attivando i meccanismi del barorecettore15. Pertanto, ci si potrebbe aspettare che l'inclinazione cranica della piattaforma provochi cambiamenti riflettenti nei parametri cardiaci misurati. Infatti, sia la posizione di inclinazione head-up e head-down ha causato un cambiamento transitorio nella frequenza cardiaca e nell'asse elettrico cardiaco nei topi16. Mentre un'inclinazione testa a testa alta provoca un aumento della frequenza cardiaca, un'inclinazione testa a testa in giù di 90 gradi ha causato bradycardia transitoria e statisticamente insignificante. Al contrario, si consiglia di inclinare il mouse solo di 10–15 gradi in entrambe le direzioni. Questi lievi cambiamenti nella postura non hanno causato perturbanze emodinamici misurabili.
La funzione diastolica LV nei topi è un'altra area poco studiata. Anche se non testato in questo studio, il protocollo qui presentato dovrebbe essere in grado di essere utilizzato per la quantificazione della funzione diastolica LV.
Le limitazioni teoriche e pratiche del piccolo animale EchoCG sono state descritte in dettaglio altrove8. In questo protocollo, le misurazioni vengono eseguite a battiture di 400-440 bpm. A questa gamma di frequenza cardiaca, le misurazioni dei picchi di velocità E e A, così come degli indici TDI, sono fattibili. A tassi cardiaci più alti, i picchi si fondono, rendendo impossibile la quantificazione. Poiché la frequenza cardiaca fisiologica dei topi è 500-600 bpm, la frequenza cardiaca utilizzata in questo protocollo è piuttosto bassa. Tuttavia, le misurazioni a questa gamma di frequenza cardiaca appaiono affidabili e consentono di distinguere tra fenotipi fisiologici e disfunzionali3.
Abbiamo descritto un protocollo per due posizioni che facilita la valutazione dei parametri funzionali della camper da viste a quattro camere nei topi. Le posizioni forniscono risultati comparabili e possono essere utilizzate in modo intercambiabile.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Lo studio è stato finanziato dall'Istituto Ludwig Boltzmann per la ricerca vascolare polmonare.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RMV-707B scan head 30 MHz | Visual Sonics | P/N 11459 | mouse scan head |
| VisualSonics Vevo 770® High-Resolution Imaging System | Visual Sonics | 770-230 | ultrasound machine |
| Veet depilation creme for sensitive skin | Veet | 07768307 | |
| Surgical tape Durapore 3M | 3M Deutschland GmbH | 1538-1 | for fixation |
| Askina Brauncel cellulose swabs | B.Braun | 9051015 | |
| Aquasonic ultrasound gel | Parker Laboratories Inc. | BT025-0037L | |
| Electrode Gel | GE medical systems information technologies Inc. | 2034731-002 | apply to extremities for countinous ECG and heart rate monitoring |
| Thermasonic gel warmer | Parker Laboratories Inc. | 82-04-20 | to reduce heat loss warm up the ultrasound gel before use |
References
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