Summary
为研究神经系统在体内的功能提供了一个独特的平台。我们描述了在正常饲养条件下或受伤后评估生活的幼虫嗅觉信息处理的方法。
Abstract
为研究神经系统的功能提供了一个独特的平台。它们提供了多种实验优势, 例如多种成像方法、电生理技术和行为检测。嗅觉系统特别适合于研究在正常发育过程中建立的突触功能或损伤后的改造功能。在这里, 我们描述的方法来评估处理嗅觉信息的生活幼虫。我们概述了在体内测量的突触前钙反应的结合在分子引导的行为检测的嗅觉球球球肾小球。方法可与嗅觉神经横断相结合, 研究突触连接的重新布线。实验是使用野生类型和转基因动物表达 gfp 记者在中枢神经系统细胞。应用所描述的转基因的方法可以很好地解开定义脊椎动物行为的分子基础。
Introduction
是研究神经系统正常功能的优秀动物模型。透明, 一个完全测序的基因组1,2, 以及可获得的手术, 电生理和成像技术是独特的属性, 希望研究神经元在体内的功能 3.这种动物模型的多种实验可能性通过对感官和运动系统 4,5,6进行的彻底研究说明了这一可能性。一个特别适合的神经元电路, 研究在突触水平的信息处理的许多方面是嗅觉系统 7。首先, 它的突触连接是很好的定义: 嗅觉感受器神经元 (orn) 项目嗅觉灯泡和建立突触接触与树突的二尖瓣簇状细胞在肾小球内产生气味图。其次, 它的 orn 是由一生的神经发生持续产生的, 以保持嗅觉路径8的功能.第三, 由于嗅觉系统显示出巨大的再生能力, 在烧蚀9后能够完全改造它们的嗅球.
本文介绍了将活树中嗅觉肾小球的成像与行为实验相结合的方法, 以研究嗅觉通路的功能。采用本文详细研究了嗅球在嗅觉神经横截面10后肾小球连接的功能恢复问题。在中获得的数据是脊椎动物的代表, 因为嗅觉处理是进化守变的。
所描述的方法是用x. tropicalis进行的, 但它们可以很容易地在x 中实现。莱维斯。尽管成年的较大, 但这两个物种在阶段都非常相似。主要的差异在于基因组水平。月牙的遗传可追踪性较差, 主要由其异倍体基因组和长时间 (约 1年) 决定。相反,热带 x由于生成时间较短 (5-8个月) 和二倍体基因组, 更适合基因改造。介绍了野生动物和三个不同的转基因线的代表性实验: hb9:gfp (x. tropicalis)、Hb9:GFP (x. tropicalis) 和 tub2:gfp (x. laevis)。
目前工作中概述的方法应与xenopus领域的遗传进展一并考虑。所介绍的技术的简单性和易于实现使其特别有用, 用于评估已经描述的突变体11, 以及 crispr-cas9 技术12生成的xenopus线.我们还描述了一种用于横切嗅觉神经的外科手术, 这种手术可以在任何实验室中实施, 可以接触到。用于评估突触前钙反应和嗅觉引导行为的方法需要特定的设备, 尽管以适中的成本提供。方法以简单的形式提出, 以促进其在研究小组中的使用, 并可通过实施改进或与其他技术, 即组织学或遗传方法的联系, 为更复杂的检测奠定基础。
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Protocol
所有程序都得到了巴塞罗那大学动物研究伦理委员会的批准。
请注意:按照标准方法13、14饲养热带和小。水是通过在反渗透获得的水中添加商业盐 (见材料表) 来制备的。电导率分别调整为 x .营养素和x. laevis 的 ~ 700μs 和 ~ 1400μs。幼虫可以通过自然交配或体外受精获得14。胚胎被 djely而至 2% l-半胱氨酸准备在 0.1 x 马克的修改环 (mmr)。1x mM 包含 (mm): 100 氯化碳, 2 kcl, 1 mgso 4, 2 ccl2,5 hepes, 0.1 edta, ph 7.8。幼虫在 2-3天 (第25个阶段) 后转移到2升储罐中, 并有水。当达到 nieuwkoop-faber (nf) 标准15的第40个阶段时, 它们被放置在5升的储罐中, 并保持在10动物的密度, x. tropicalis和x. laevis的温度保持在23–25°c 和18-20°c 的恒定温度。分别是。在 nf 标准的48-52 阶段发现的动物被用于实验。
1. 嗅觉神经的横截面
- 在室温下, 在50毫升的水中制备 0.02% ms-222 的麻醉液。
- 准备一个小水箱 (1-2 l) 与水, 使动物在手术后恢复。
- 切割长方形的纤维素定性滤纸 (4 厘米 x3 厘米, 见材料表)。
- 将2块纤维素定性滤纸放入 0.02% ms-222 溶液中, 置于解剖范围内。
- 从水箱中挑出一根子, 将其浸入麻醉溶液中。动物在2-4分钟内停止游泳, 不会对使用推子在尾部施加的机械刺激做出反应。
-
将麻醉后的子放在矩形滤纸上。将动物的背侧朝上放置, 这样大脑结构就可以可视化。
- 使用 vannas 剪刀 (见材料表) 切割一个或两个嗅觉神经 (取决于要进行的检测类型)。将单个神经交叉用于需要对神经损伤进行内部控制的实验。
- 对于行为实验, 横切这两个神经, 以抑制所有气味信息到达嗅觉灯泡。在解剖范围内, 可以很容易地观察到嗅觉神经的切片效率;然而, 色素沉着或动物的位置可能是限制因素。
请注意:(可选)证明该程序有效性的最佳方法是使用转基因表示他们的神经系统上的荧光记者 (见代表性的结果)。为此, 有必要使用装有荧光的解剖示波器 (图 1)。如果只有野生类型的动物可用, 可以使用 CM-diI 跟踪。按照协议 2 (见下文) 在鼻腔胶囊中注入 0.5 mg/ml 溶液中的 cm-dii 在 0.3 m 蔗糖中制备。有关 cm-dii 的制备和储存的详细信息, 请参见16 。必须尽量减少染料从主腔中泄漏。为此, 有必要修改注射压力和微移液器的打开。应用 cm-di 24小时后, 嗅球肾小球层水平的荧光明显。目前的工作使用标签与 CM-diI 只是为了证明横截面程序;然而, 该方法也可用于利用常规组织学程序获取嗅觉肾小球的形态信息。
- 将动物转移到回收池。应在 ~ 10分钟内恢复正常游泳, 对出血的存在进行仔细检查, 预计约1% 的动物接受手术。
- 在 0.2% ms-222 溶液中对受伤动物进行安乐死。
2. 用荧光钙指标标记嗅觉受体神经元
- 准备含有12% 的格林-1-糊精钙 (见材料表)、0.1% triton x-100 和 1 mm ncl17的溶液。如果在一个月内不使用溶液, 请将溶液存放在-20°c 或-80°c。
- 准备尖端开孔 ~ 1–2μm 的玻璃移液器 (与用于膜片钳实验的微电极相似), 用于使用微移液器拉拔器进行微注射 (见材料表)。
- 校准微注射的体积。使用蒸馏水, 调整压力和注射时间, 以获得0.15–0.3μl 的注射量。
请注意:一个简单的过程是计算清空充满1μl 水的移液器所需的脉冲数。典型的参数是 30 psi 和 50 ms 注入时间的压力。 - 将移液器放入微喷射器中, 并使用 ~ 2μl 的绿色-1 右旋糖酐溶液加载。
- 按照步骤1.1 到1.6 准备一只子。
- 将移液器的尖端移动到鼻腔胶囊的主腔中。
请注意:参见图 2a 描述了中嗅觉路径的位置。 - 使用2.3 中获得的设置, 提供几个吹泡。将染料的存在限制在鼻腔胶囊上。
- 让休息 2-3分钟, 使用巴斯德移液器, 在动物较多的尾端上倒入0.02% 的 ms-222 溶液, 以避免干燥。
- 将动物转移到回收槽中。
请注意:应在 ~ 10分钟内恢复正常游泳, 操纵动物可能会造成伤害。 - 使用 0.2% ms-222 溶液在注射15分钟后不恢复正常游泳行为的小。
- 在注射后的第二天观察嗅球肾小球层水平的荧光。
3. 突触前反应实时成像用的制备
- 在进行实验前24–48小时, 用有机硅弹性体 (例如, sylgard) 涂覆直径为35毫米的4-6 粒培养皿。一旦弹性体聚合, 就用一个长方形的井来安装。
请注意:在48–52个 nf 阶段发现的x . 热带的典型尺寸为10毫米 x 4 毫米。 - 制备一个160μm 至 1 mm 氨基酸溶液的100毫升, 作为对的气味刺激。该溶液可包含多种氨基酸的混合物: 蛋氨酸、亮氨酸、组氨酸、精氨酸和赖氨酸。稀释xenopus ringer 溶液中的氨基酸, 由 (mm) 组成: 100 氯化萘、2 kcl、1 ccl2、2 mgcl 2、10葡萄糖、10 hepes、240 mosmkg、ph 7.8。确保 ph 值保持在7.8。
- 用20毫升的氨基酸溶液填充高架储层。用聚乙烯导管将储罐连接到放置在鼻腔胶囊上方的28g 毛细管 (见材料表)。
请注意:毛细管安装在微机械手上 (见材料表)。灌注系统中必须没有气泡。 - 使用电磁阀夹紧阀的晶体管-晶体管逻辑 (ttl) 控制, 实现氨基酸溶液的应用时间精度 (见材料表)。刺激器用于产生 ttl 脉冲 (见材料表)。通过更改 ttl 脉冲的持续时间 (即0.1 至 1秒), 检查时间精度以提供气味溶液。
- 用100毫升的溶液填充另一个高架水库。
- 对进行麻醉, 并将其置于解剖范围内 (步骤1.1 至 1.6)。
- 准备一只用于成像的。如果白化病是可用的, 请继续执行步骤 3.9, 否则将嗅球上方的皮肤移开, 因为它含有损害成像的黑素细胞 (步骤 3.8)。
请注意:根据动物的色素沉着情况, 有两种方法可以进行实验。最好使用白化病动物。白化病菌株可用于x. laevis 和白化病 x. 热带病毒线最近已生成的 crispr-cas9 12或 talens 18。 - 使用万纳剪刀, 在中枢神经系统边缘的皮肤上做一个外侧切口。使切割应在嗅球的水平上进行, 永远不会达到球的位置, 这可以很容易地通过视神经的位置来识别。
- 用推子捏伤口的皮肤, 把它拉过神经系统。通过嗅球上方没有黑素细胞来验证成功去除。使用巴斯德移液器浇注 0.02% ms-222 溶液, 保持动物湿润。
- 将子放入涂层盘的井 (见材料表)。在动物上方涂上涂上高真空油脂的玻璃盖板。将盖板放置到尾部的顶部。
- 确保嗅球和胎盘保持暴露在细胞外介质中。在成像过程中保持不动。用含有100μm 管尿款 (见材料表) 的 xenopus 林格液填充培养皿, 以防止肌肉收缩.
请注意:在-80°c 下, 在不超过6个月的温度下, 将其储存在脂肪中。 - 将盘子放在直立的显微镜下, 将子放在一起。使用聚乙烯管材 (见材料表) 将含有xenopus林格溶液的储层与使用聚乙烯管材 (见材料表) 的盘连接, 以便连续灌注 xenopus 林格溶液, 以保持动物的生命, gt;1 h.
请注意:微型磁性夹具 (见材料表) 对于将管道稳定地连接到盘子非常有用。输液管和吸管必须位于 ~ 180°角。 - 开始完善xenopus林格的解决方案。在整个实验过程中, 保持菜品溶液的水平不变。通过观察血管内的血液循环, 持续评估的生存能力。
4. 突触前钙 2+嗅觉肾小球变化的实时成像
请注意:成像过程描述了广域显微镜, 但可以很容易地适应共聚焦显微镜通过调整采集设置。成像应在安装在防振台上的立式显微镜中进行。
- 用低放大倍率来可视化子, 例如5倍。
- 移动微机械手轴, 将毛细管输送气味溶液放在一个鼻囊的顶部, 用嗅觉神经形成90°角。应避免嗅球上方的气味溶液流动, 因为它可能会引起扭曲成像的湍流。
- 使用高放大倍率、长工作距离、水浸目标: 60xx、0.9 n. a., 找到位于鼻囊侧的嗅球 (受刺激)。
- 检查眼睛的荧光发射。肾小球结构应该是明显的 (图 2b)。
- 使用适用于钙成像的相机进行现场采集。定义一个包含整个嗅觉灯泡的框, 通常为 256 x 256 或 512 x 512 像素。将采集帧速率采集设置为 20–40 hz. 调整增益, 使基部荧光值约为饱和度的20%。获取5秒的视频。
- 可视化影片。检查图像焦点、没有运动工件和包含饱和像素的区域。如果使用16位相机, 肾小球区域的典型荧光值应为 5000–20000 a. u.。如果成像条件最佳, 请继续执行下一步。如果需要, 请重复步骤 4.6, 以提高图像质量或调整增益设置。
- 开始延时采集, 记录嗅觉刺激引起的反应。
请注意:气味溶液的精确应用由 ttl 刺激控制。一个典型的实验包含基线周期为 4秒, 然后是从0.1 到0.5秒的刺激时间和6-10秒的恢复期。 - 对气味进行重复刺激, 以达到时间间隔 & gt;2 分钟, 将流速设置为 1-1 ml·min-1.由于在所有实验过程中都进行了全球灌注, 局部应用的氨基酸被冲走。
请注意:盘中溶液的体积约为3毫升。 -
图像分析
- 检测响应
- 将电影导出到 imagej。
请注意:目标是检测对刺激有反应的肾小球区域的存在。 - 将荧光图像的原始序列转换为 fa00电影。根据以下关系测量基部荧光的相对变化: (f-f0)/f0, 其中 f0表示基线荧光水平。
- 在刺激过程中, 在显示假定荧光的区域周围绘制感兴趣的区域 (roi) 会增加, 并记录它们在 roi 管理器中的位置 (图 2e)。绘制 roi, 以检测无肾小球结构区域的背景荧光水平。
- 将电影导出到 imagej。
- 答复的量化。
- 将定义的 roi 放在荧光图像的原始序列中。获取每个帧所选 roi 的平均灰度值。将获得的值序列传输到分析程序 (例如, igor pro)。
- 减去背景荧光, 然后计算每个 roi 的 fa0 f0变化(图 2f)。为所选的每个 roi 绘制 " f/f 0" 中的增量。计算基部 fcf0 的标准偏差 (刺激前)。
请注意:如果在刺激过程中得到的 fcf0的增加大于基值的2个标准偏差, 则考虑正反应。
- 检测响应
5. 嗅觉引导下的行为检测
请注意:执行检测的设置示意图如图 3所示。
- 在6井盘的上部打小孔, 以容纳 1.57 mm 的 o. d. x 1.57 mm i. d. 管材。使用环氧树脂粘合剂插入管材和密封件 (参见材料表)。
请注意:经修改的菜可以在用蒸馏水彻底清洗后重复使用多次。 - 制备含有蛋氨酸、亮氨酸、组氨酸、精氨酸和赖氨酸的氨基酸溶液50毫升 (详见步骤 3.2)。浓度范围为160μm 至 1 mm。将溶液的20毫升置于高架储集层中。
- 在检测前至少12小时内不要给虫喂食。从它们的外壳水箱中取出6头, 并将它们放入2升的干净水中, 以尽量减少接触气味。
- 将修改后的6口井盘放在白色 led 透射照明器上 (图 3)。
- 使用流形将灌注入口与含有氨基酸溶液的储层结合在一起 (见材料表)。检查灌注系统, 消除气泡。同时填充6口井。调整储层高度, 允许在 ~ 30秒内输送≥5毫升的气味溶液。
请注意:在接触气味溶液后, 用双蒸馏水清洗每口井4次。 - 在每口井里灌满10毫升的水。放置1塔多内利/井。休息 gt;3 分钟。
- 设置图像采集。使用传统的 ccd 摄像机, 可以在≥5 hz 的情况下获取图像. 将相机连接到计算机。在这里, 使用蔡司 mrc5 相机控制禅宗软件, 但其他等效配置可以使用。如果需要提高帧速率, 请应用像素分组。图片应该显示整个6井菜。
- 开始图像采集, 使电影包含基础 (30秒)、刺激 (25–35 s) 和恢复 (30–60秒) 周期。
- 成像后将6口井的动物送回水箱。
- 使用诸如 wrmtrck19、20等插件在 imagej中分析影片, 这些插件提供了与动力相关的多个参数。
- 要准备要分析的图像, 首先要通过绘制 35 mm x 35 mm 的矩形 roi 来选择井 (图 4a)。通过计算整个序列的最大投影来获取背景图像。它应该在没有的情况下显示井的图像。
- 从原始影片中减去最大投影。对生成的32位影片执行阈值, 并应用 wrmtrck 插件。调整 wrmtrck 参数, 以可靠地跟踪动物的运动。将得到的 x、y 坐标传输到分析程序中。
- 使用 x-y 坐标, 通过应用以下公式计算到气味源 (井中的灌注入口) 的欧几里得距离:
其中 os 指示气味源的位置, tad 表示在给定时间的位置。有关详细信息, 请参阅图 4a 。
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Representative Results
本文提出了两种互补方法的组合, 对的功能进行体内研究: i) 一种成像突触前钙 2+生命肾小球变化的方法使用荧光钙指示剂的, 和 ii) 气味引导行为检测, 可用于研究对特定水性气味的反应。由于这些方法已被用来评估受伤 10后嗅觉处理的恢复情况, 因此还介绍了一种简单的造嗅觉神经横切方法。
在嗅觉通道的横截面谢诺普乌斯塔托茨
有两种方法可以证明该程序的有效性。两者都依赖于使用荧光记者对嗅觉神经进行可视化。一种方法是基于转基因的小, 表达荧光蛋白在他们的神经系统。在神经元β-管蛋白启动子下表达 gfp 的两条推荐行是x. laevis tub2b-gfp 和x. tropicalis tubb2b (图 1, 见材料表)。如果只有野生类型的动物可用, CM-diI 可以使用 (见步骤 1.8)。图 1显示了 tub2-gfp x. laevis的图像。图片来自四个不同的动物, 其中一个嗅觉神经被横切。在解剖范围内, 切割应该是显而易见的。使用转基因线的优点是, 嗅觉神经的改造可以在一段时间内进行。在进行顺序观察时, 建议尽量减少暴露于荧光灯, 以防止光斑。当需要进行内部控制时, 单个嗅觉神经的切片是有用的, 例如, 将通常开发的与重新连接的肾小球单位进行比较。当目的完全抑制信息的传递时, 应对两个嗅觉神经进行切片。
嗅觉刺激突触前反应的实时成像
使用电场显微镜可以在嗅觉灯泡 (图 2a) 的水平上观察到 orn 与绿色-1 糊精的正确标记。肾小球是明显的 (图 2b), 应该通过移动聚焦平面出现在不同的层中。如果使用共聚焦显微镜代替, 可以更好地解决肾小球结构的形态 (图 2c)。标记的肾小球的数量取决于在嗅觉上皮水平上的染料吸收。因此, 此过程不允许所有肾小球单位的可视化。在进行成像实验之前, 应选择显示肾小球区域更强烈荧光染色的动物, 因为它们含有更多的 orn 标记。为了提高实验吞吐量, 强烈建议使用这种操作, 并应在配备荧光灯的解剖范围内进行。拒绝不显示标记肾小球单位或显示荧光限制在肾小球层特定区域的动物。在染料加载后的1天内, 即可观察到突触前钙 2+的反应。为了进行成像实验, 最好使用高数值孔径的目标, 通常≥0.9。
突触前钙水平的增加可以引起将 orn 的树突旋钮暴露给氨基酸。将毛细管放置在鼻腔胶囊上方输送气味溶液是很重要的。应注意避免接触, 因为它可能堵塞毛细血管的尖端和/或导致机械刺激的 orn。突触前钙水平的短暂增加可以观察到刺激≥0.1 秒 (图 2d), 并表明正确的嗅觉转导。同样重要的是, 要可视化基础钙水平与低相机增益。orn 的前突触终端显示出较高的荧光增加, 避免信号饱和是必不可少的。宽场显微镜可以实现较高的时间分辨率。例如, 使用电子倍增 ccd 摄像机, 可以实现 50 hz 或更高的帧速率。共聚焦显微镜的使用降低了时间分辨率, 但可以更好地定义肾小球结构。
钙绿色对结合钙 (190 nm) 的高亲和力对于检测小的反应特别有用。在肾小球层中检测到的短暂细胞内钙的增加是可变的。一些肾小球区域显示了 fe0≥0.2 的变化, 而相邻的过程甚至可能没有反应 (图 2d).以下因素促成了肾小球单位反应的变异性: (一) 标记肾小球的总数, (二) 细胞内钙绿色的浓度, 以及 iii) orn 检测氨基酸的选择性。由于标记的肾小球数量太少可能会排除观察反应, 因此绝对有必要对含有尽可能多的标记 orn 的动物进行这些实验。
低因素引导的行为
数据分析
使用定制系统研究了低因素引导行为。图 3显示了用于进行分析的设备的示意图。这项测试的基础是检测氨基酸存在的能力, 这些氨基酸起到了气味的作用。一种结合五种不同氨基酸 (蛋氨酸、亮氨酸、组氨酸、精氨酸和赖氨酸) 的溶液用于刺激。解决方案是在30米的地方输送到一个35毫米的井, 里面有一个自由游泳的。对传入溶液的直接反应是动力的增加。在溶液应用的初始 ~ 5–10 s 过程中发生的随机运动之后, 直接向气味的来源游去。在输送氨基酸的过程中, 在喷嘴附近停留几秒钟, 并逐渐在随机方向恢复运动 (参见补充视频 1, 2)。
所描述的实验条件允许热带的正常游泳, 48-52 级;然而, 必须考虑到, 在35毫米的井中, 较大动物的动力可能会受到限制。使用 ccd 摄像机记录了的运动。气味溶液的吸引力可以检测为欧几里得距离从位置分离灌注入口的减少 (图 4)。通过跟踪35毫米 x35 毫米 (或像素大小) 内的头位置, 可以获得对嗅觉引导行为的定量分析 (图 4a)。利用图像分析得到的 x-y 坐标构造了个别的子运动图 (图 4b)。提取的运动图必须忠实地再现视频图像。
有两种可能的方法来解释嗅觉引导的行为实验。第一种方法是在之前使用斑马鱼21的研究中受到启发的。测量在喷口附近运送气味所花费的时间, 证明存在积极的取向。以溶液入口为中心的8.75 毫米半径 (相当于井径的 1) 的感兴趣区域, 用于对动物与气味源的距离进行分类 (图 4 a, 4A)。在规定的时间内, 即15秒的间隔,用杆将时间固定在喷嘴附近, 从而能够识别检测氨基酸溶液的能力 (图 4d)。通过绘制单个数据的分布图, 可以获得种群的整体行为 (图 5a)。当蛋氨酸、亮氨酸、组氨酸、精氨酸和赖氨酸溶液在 1 mm 或160μm 或160μm 时, 可以检测到正取向 (图 5a和5A)。动物对水的应用没有反应 (图 5c), 从而放弃了机械敏感机制的参与。利用邓恩的多重比较测试, 可以利用非参数重复测量方差分析来确定每个实验组中定义的时间间隔之间的差异。在15秒的时间间隔内对数据进行分组的缺点是时间分辨率降低。
增加行为反应的时间信息的一种方法是使欧几里得与气味源的平均距离。虽然运动表现出内在的变异性, 但动物群体的平均运动 (通常≥40) 表现出嗅觉引导的行为。为了进行这种分析, 有必要在刺激开始前对动物的位置进行分组。由于在气味溶液进入井中时, 在不同的位置发现, 因此需要在刺激前将欧几里得距离设置为 0 (图 6a,另见图 7中的包含标准)。因此, 负值和正值分别表示来自气味源的吸引力或排斥。回归系数≥0.9 的线性拟合很好地描述了气味的吸引力。如果水被送出, 欧几里得距离的净变化分布在0左右, 在气味刺激过程中不可能安装一条线, 从而表明没有嗅觉引导的行为 (图 6b)。在 1 mm 和166μm 下制备的氨基酸溶液欧几里得平均距离的平均图的比较表明, 在油素引导的响应中出现了不同的延迟 ( 比较图 6a和 c)。当氨基酸在较高浓度下施用时, 启动向气味源移动所需的时间间隔会更短。在两个嗅觉神经相交的中观察到缺乏嗅觉引导行为 (图 6d)。
描述的油因子引导行为检测的一个局限性是建立复杂的流体羽流。如果氨基酸溶液在设置系统时被染料 (如快速绿色) 所取代, 就可以看出这一点。有色溶液的使用验证了羽流的形成, 并表明水性气味在5秒内到达井的任何区域. 溶液的输送所引起的湍流很可能是由侧线探测到的, 可能有助于在动物运动中观察到的变异性, 但不干扰嗅觉引导行为。用水代替氨基酸溶液进行的控制实验表明, 能够区分嗅觉和机械刺激。估计在感兴趣的区域中花费的时间 (图 5) 和欧几里得距离的平均图 (图 6) 是描述的嗅觉引导响应的两种互补方法。
纳入标准
数据分析还必须考虑到纳入标准。一些表现出共振运动, 这可以用欧几里得距离图与正弦函数的拟合来说明 (图 7a)。必须从所有分析中丢弃显示此行为的。
将使用气味溶液之初的动物排除在最大 (& gt;30 mm 图 7b) 或与喷嘴的最小欧几里得距离 (lt;5mm,图 7c) 之外, 可以减少变异性的平均地块。图 7b所示的示例显示了氨基酸溶液的正取向。在刺激开始时, 位于溶液入口的最大距离。因此, 这种相对位置只能揭示对气味来源的吸引力。图 7c显示了相反的情况。在这里, 一只位于提供氨基酸溶液的喷嘴附近。对气味源附近所花费的时间进行量化显示了一种响应 (图 5中使用的方法);然而, 它不能显示向入口的净运动。
总之, 所提出的嗅觉引导行为的分析定义了二元检验。该方法可用于检测实验组对气味的反应能力。如果目的是在复杂的嗅觉指导下的应对措施之间建立差异, 例如确定对特定气味的偏好, 就需要进一步改进。
图 1:嗅觉神经的横断.在单个嗅觉神经 (箭头) 横截面后获得的管材 2-gfp x. laevis 的代表性图像。管 b2-gfp 的神经显示出很强的荧光。手术后立即明显神经横断 (d0)。切开后 4天 (d4) 的嗅觉神经再生明显。手术后 8天 (d8) 控制和改革神经之间差别不大。在0.02% 的 ms-222 中对进行麻醉, 以收集图像。嗅球 (o. b.), 嗅觉神经 (o. n.), 鼻囊 (n. c.), 钛 (tec), 视神经 (op. n.)。箭头表示横切神经的位置。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 用钙绿色右旋糖酐标记嗅觉受体神经元, 并在氨基酸刺激后显示突触前钙的流入.(a) 一只的透射光图像, 显示嗅觉上皮、嗅觉神经和嗅球的肾小球层的位置。(b) 用宽场 (wf) 显微镜显示的嗅球图像。在鼻腔胶囊中使用绿色-1 糊精钙标记神经元。观察到的荧光对应于嗅觉受体神经元形成肾小球的突触前端子。嗅觉神经;o. b: 嗅球。(c) 从嗅觉神经进入灯泡的背侧部部。用绿钙-1 糊精标记了嗅觉肾小球的突触前成分, 如 b 中所示。(d) 在嗅觉上皮暴露于含有五种不同氨基酸的溶液后, 前突触端子可短暂地增加钙含量。在刺激之前、期间和之后获得的钙荧光的相对变化。(e) 10个不同感兴趣的区域的分布, 用于量化 f f0 的变化.roi11 位于肾小球层之外, 用于定义荧光的背景水平。(f) e 中定义的 roi 的单独 f/f0响应)。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3:低因子引导的行为分析.(a) 显示测试中使用的设备的示意图。(b) 记录90多秒以上的运动轨迹实例。每个圆圈代表一个包含一个动物的井。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4: 跟踪嗅觉引导的行为.(a) 显示用于行为检测的良好方法的示例。蓝色虚线表示用于跟踪子运动的 x、y 坐标 (以毫米为准) 的位置 (另见补充视频 1)。绿色椭圆表示溶液入口的位置。虚线黑线表示提供氨基酸溶液的管的近端区域 (详见文本)。(b) 行为测定过程中 a 中显示的的运动力。彩色编码的痕迹表示动物在嗅觉刺激 (紫色) 之前 (灰色) 和之后的位置。在使用气味溶液的过程中, 气味溶液的运动以时间颜色渐变 (30秒, 红色到蓝色) 表示。(c) 使用 x、y 位置可以计算出从头到灌注入口的欧几里得距离的变化。小于8.75 毫米的距离对应于喷嘴的近端区域。(d) 绘制在 a 中虚线定义的区域内由所花费的时间。每个点表示15秒的周期。这种动物被气味溶液所吸引。请点击这里查看此图的较大版本.
图 5: 被氨基酸吸引.(a) 在气味源附近被花的时间。每个垃圾桶由15秒的周期组成。框图表示数据的中值 (黑色水平线)、25% 至75% 的四分位数 (框) 和范围 (晶须)。输送 1 mm 氨基酸溶液吸引了到气味源。(b) 当氨基酸浓度降低到160μm 时, 气味溶液吸引了。(c) 供水并不改变动物的行为。用 dunn 的多重比较测试重复测量方差分析, p & lt; 0.05。请点击这里查看此图的较大版本.
图 6: 对气味的时间反应.(a) 绘制欧几里得与气味源的平均距离作为时间的函数。欧几里得距离设置为 0, 然后在每个单独的痕迹刺激。负值和正值分别表示与气味源的距离减小和增加。对气味源的吸引力可以用线性拟合来描述 (r2= 0.98)。(b) 供水不会改变与气味来源的距离。(c) 小极响应160μm 氨基酸溶液的应用, 这体现在线性拟合 (r2= 0.96) 中。(d) 两种嗅觉神经横切的对氨基酸没有反应。请点击这里查看此图的较大版本.
图 7: 含油标准的嗅觉引导行为分析.(a) 一些表现出共振运动。这种行为是通过成功地拟合一个正弦函数到欧几里得距离气味源的剧情而揭示的。显示此活动的应从测试中排除。(B、C)减少气味平均时间反应变异性的一种方法 (图 6) 是在刺激开始时排除位于最大 (b) 或最小 (c) 欧几里得距离的动物。红色虚线表示阈值 (30 毫米和5毫米)。刺激开始前的欧几里得距离 (箭头, 左图) 设置为 "0", 分别将有吸引力或令人厌恶的行为报告为负值或正值 (右图)。请点击这里查看此图的较大版本.
补充视频 1: 由提供氨基酸溶液引发的低因素引导行为.电影显示, 一只在 3 5 毫米的井里自由游泳。蓝色椭圆表示喷嘴提供气味溶液的位置。刺激的发生和结束分别用绿点和红点表示。图 4显示了所观察到的行为分析。请点击这里观看此视频。(右键单击下载.
补充视频 2: 在供水过程中的运动.电影显示, 一只在 3 5 毫米的井里自由游泳。蓝色椭圆表示喷嘴释放 mq 水的位置。输水的开始和结束分别用绿点和红点表示。请点击这里观看此视频。(右键单击下载.
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Discussion
本文介绍了一些技术, 这些技术对于研究活中嗅觉通路的功能很有用。目前的议定书对那些工作或能够进入xenopus的实验室特别有用;然而, 这也是有趣的那些研究神经元再生和修复的细胞和分子基础的研究人员。在中获得的结果可以与其他脊椎动物模型中收集的数据结合起来, 以确定保守的机制。所描述的方法将受益于转基因18、22、23 的开发, 并适用于24中神经系统疾病的实验模型, 25岁
为了获得体内可重复的数据, 正确地饲养是关键。特别是, b. tropicalis对恶劣的住房条件非常敏感。例如, 它们不耐受低于20°c 的温度, 应保存在24至28°c 范围内的水箱或水系统中。同样重要的是, 不要将动物密度提高到规定的限度以上, 定期喂养, 并保持最佳的水质13。在标准化条件下管理动物菌落是获得体内实验重现性所必需的。
所描述的钙成像方法可用于检测 orn 在体内的正确嗅觉转导。与钙绿-1 糊精一起加载 orn 是通过使用低浓度的 triton x-100 实现质膜的瞬态渗透, 如先前报告的 17。这种加载方法的主要优点是简单, 因为它只需要一个微喷射器。一个重要的缺点是 triton x-100 导致嗅觉纤毛和微绒毛的短暂消除。斑马鱼的嗅觉上皮在治疗17后在48小时内再生。在染料加载后1天可以观察到对气味的反应, 从而使的再生速度可能会更快 (图 2d)。然而, 需要进行详细的形态分析, 以准确估计 triton x-100 处理后嗅觉上皮的再生时间。
用钙绿-1 右旋糖酐标记 orn 只在神经元群体中有效, 允许在突触前端子具有较高的信噪比 (图2b 和 2c) 的可视化。如果与用 am 酯形式的钙染料加载整个嗅球相比, 几乎完全没有背景是有利的。荧光 orn 的数量因动物而异。因此, 有必要使用几种氨基酸的广泛嗅觉刺激。我们已经得到了成功的结果, 使用了蛋氨酸, 亮氨酸, 组氨酸, 精氨酸和赖氨酸的解决方案。其他不同氨基酸的组合也可能是有效的。用钙指标加载 orn 的另一种方法是电穿孔 26, 它被广泛用于在神经元27中表达基因编码的荧光记者。电穿孔可以使用商业或定制设备完成, 并允许可视化神经元结构具有良好的信噪比28。与所述方法类似, 标记为异质性的细胞群, 因动物而异。如果目的是调查一个明确的神经元群 22, 转基因是可取的。例如, 推动基因编码钙指标 (如 gcam) 在有限的 orn 组中的表达, 对于研究一组定义的突触前端子对气味的反应可能非常有用。
所描述的使用钙绿色1右旋糖酐的方法报告了突触前末端功能。细胞内钙的增加观察表明, 谷氨酸在肾小球水平上具有正确的嗅觉转导和释放。然而, 对荧光变化的定量分析是有限的。突触前端子的刺激增加细胞内的钙含量到微摩尔范围和饱和度的高亲和力钙指标, 如钙绿色必须考虑在内。图 2所示的结果是使用广域显微镜获得的。这是最简单的方法, 可以在大多数实验室中实施。通过使用双光子显微镜或基因编码的荧光记者进行改进, 可以获得更多的突触前功能的定量估计。
对于钙反应的活成像, 重要的是有适当的定位, 提供气味溶液的毛细管。它应该位于鼻腔胶囊的上方, 并始终避免与组织直接接触。在将放在显微镜下之前, 既要检查气味溶液的正确输送, 也要检查灌注的流动。所有用于灌注的油管都必须检查是否有气泡。氨基酸溶液的流动变化必须立即响应电磁阀的连续开启和关闭。延迟表示空气的存在。还需要检查在将打开时间 (即从0.1秒更改为1秒或相反) 后交付的解决方案的正确音量增加或减少。设置实验参数时使用较低的光强 (步骤 4.6), 以最大限度地减少光漂白。
虽然嗅觉在生物学中的重要性已经确定了29 ,但还没有直接评估幼虫嗅觉引导行为的测试。本文描述的方法是一个简单的测试, 可以检测到大量动物对气味刺激的反应。最近对rana catesbeiana对水中存在化学物质的气味敏感性的描述说明了嗅觉与运动行为耦合的复杂机制30。本文描述的分析考虑到了中嗅觉引导行为的内在变异性。使用6井盘而不是单井可提高实验吞吐量。通过平均许多, 克服了导致变异性的因素, 如基本运动力、与臭剂溶液产生的灌注入口的相对位置和羽流。大约需要40个独立的测量来描述氨基酸的控制吸引力响应。
我们提出了两种类型的分析嗅觉试验。第一种方法量化在定义的时间段内在气味来源附近花费的时间。它特别适合进行统计分析。第二种方法基于欧几里得与气味源的平均距离图, 可用于描述对气味的时间响应。这两种类型的分析都是互补的, 由相同的数据生成。解释是二元的, 可以区分感觉气味的动物和不注意 10的动物。
所描述的方法如何对xenopus社区有用？虽然这些方法本质上是针对野生动物的, 但应该考虑到, 在类动物领域, 遗传可能性正在不断扩大。对体内 orn 反应和嗅觉引导行为存在的结合研究, 对于研究正向或反向基因屏幕 产生的 xenopus 突变体嗅觉信息的正确处理也非常有用11. 钙成像和行为检测提供的信息可以结合起来。例如, 有选择地影响嗅球颗粒细胞的突变不会改变 orn 的突触前反应, 但可能会损害嗅觉引导的行为。
方法将细胞和行为反应结合在一起, 与神经元回路的遗传解剖特别相关。对结果的解释可以通过以前的形态工作得到帮助, 这些作品提供了在层31中的肾小球层的解剖图谱。从嗅觉球茎片的 3 中获得的信息也非常有价值。嗅球片中二尖夫勒簇状细胞的钙成像揭示了嗅觉加工的基本特征, 例如 orn 对不同氨基酸的敏感性33或相关性。嗅觉信息编码中的响应延迟7。然而, 大脑切片显示出复制复杂的整合机制连接不同的神经元电路的能力有限, 因为许多神经元投影的切片。此外, 除了γ-肾小球34之外, 对单个肾小球单位的特性的表征还是难以捉摸的.单个肾小球单位是否决定的特定行为的问题, 只有通过结合遗传工具、体内成像方法和行为检测来回答。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了 el minatio de economia y v尔蒂维达德 (mineco) 的赠款的支持;由欧洲区域发展基金 (erdf) 共同资助的: m. g. f. fuortes 纪念研究金、stephen w. kuffler 研究金基金、laura wlaura 捐赠夏季研究金基金颁发的竞争性研究奖, fischbach 研究金, 以及海洋生物实验室的大一代基金和国家 xenopus 资源 RRID:SCR_013731 (伍兹霍尔, 马萨诸塞州), 在那里进行了这项工作的一部分。我们还感谢 cerca proplit/generalitit发电量 de catalunya 的机构支持。a. l. 是塞拉·胡恩特的同伴。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Salts for aquariums (Instant Ocean Salt) | Tecniplast | XPSIO25R | |
| Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| Tweezers #5 (tip 0.025 x 0.005 mm) | World Precision Instruments | 501985 | |
| Vannas Scissors (tip 0.015 x 0.015) | World Precision Instruments | 501778 | |
| Whatman qualitative filter paper | Fisher Scientific | WH3030917 | |
| X. laevis tubb2-GFP | National Xenopus Resource (NXR), RRID:SCR_013731 | NXR_0.0035 | |
| X.tropicalis NBT-GFP | European Xenopus Resource Center (EXRC) RRID:SCR_007164 | ||
| CellTracker CM-DiI | ThermoFisher Scientific | C-7001 | |
| Calcium Green dextran, Potassium Salt, 10,000 MW, Anionic | ThermoFisher Scientific | C-3713 | |
| Borosilicate capillaries for microinjection | Sutter Instrument | B100-75-10 | O.D.=1.0 mm., I.D.=0.75 mm. |
| Puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Microinjector | Parker Instruments | Picospritzer III | |
| Sylgard-184 | Sigma-Aldrich | 761028-5EA | |
| Microfil micropipettes | World Precision Instruments | MF28G-5 | |
| Upright microscope | Zeiss | AxioImager-A1 | |
| Master-8 stimulator | A.M.P.I. | ||
| CCD Camera | Hamamatsu | Image EM | |
| Solenoid valves | Warner Instruments | VC-6 Six Channel system | |
| Dow Corning High Vacuum Grease | VWR Scientific | 636082B | |
| Tubocurarine hydrochloride | Sigma-Aldrich | T2379 | |
| CCD Camera | Zeiss | MRC-5 Camera | Controlled by Zen software |
| camera lens | Thorlabs | MVL8ML3 | There are multiple possibilities that should be adapted to the camera model used |
| Epoxy resin | RS Components | ||
| Manifold | Warner Instruments | MP-6 perfusion manifold | |
| Micromanipulator for local delivery of solutions | Narishige | MN-153 | |
| Mini magnetic clamps | Warner Instruments | MAG-7, MAG-6 | |
| Polyethylene tubing | Warner Instruments | 64-0755 | O.D.=1.57 mm., I.D.=1.14 mm. |
References
- Hellsten, U., et al. The genome of the Western clawed frog Xenopus tropicalis. Science. 328 (5978), 633-636 (2010).
- Session, A. M., et al. Genome evolution in the allotetraploid frog Xenopus laevis. Nature. 538 (7625), 336-343 (2016).
- Zhang, L. I., Tao, H. W., Holt, C. E., Harris, W. A., Poo, M. A critical window for cooperation and competition among developing retinotectal synapses. Nature. 395 (6697), 37-44 (1998).
- Li, J., Erisir, A., Cline, H. In vivo time-lapse imaging and serial section electron microscopy reveal developmental synaptic rearrangements. Neuron. 69 (2), 273-286 (2011).
- Dietrich, H., Glasauer, S., Straka, H. Functional Organization of Vestibulo-Ocular Responses in Abducens Motoneurons. Journal of Neuroscience. 37 (15), 4032-4045 (2017).
- Buhl, E., Roberts, A., Soffe, S. R. The role of a trigeminal sensory nucleus in the initiation of locomotion. Journal of Physiology. 590, Pt 10 2453-2469 (2012).
- Junek, S., Kludt, E., Wolf, F., Schild, D. Olfactory coding with patterns of response latencies. Neuron. 67 (5), 872-884 (2010).
- Stout, R. P., Graziadei, P. P. Influence of the olfactory placode on the development of the brain in Xenopus laevis (Daudin). I. Axonal growth and connections of the transplanted olfactory placode. Neuroscience. 5 (12), 2175-2186 (1980).
- Yoshino, J., Tochinai, S. Functional regeneration of the olfactory bulb requires reconnection to the olfactory nerve in Xenopus larvae. Development, Growth & Differentiation. 48 (1), 15-24 (2006).
- Terni, B., Pacciolla, P., Masanas, H., Gorostiza, P., Llobet, A. Tight temporal coupling between synaptic rewiring of olfactory glomeruli and the emergence of odor-guided behavior in Xenopus tadpoles. Journal of Comparative Neurology. 525 (17), 3769-3783 (2017).
- Goda, T., et al. Genetic screens for mutations affecting development of Xenopus tropicalis. PLOS Genetics. 2 (6), 91 (2006).
- Nakayama, T., et al. Simple and efficient CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in Xenopus tropicalis. Genesis. 51 (12), 835-843 (2013).
- Jafkins, A., Abu-Daya, A., Noble, A., Zimmerman, L. B., Guille, M. Husbandry of Xenopus tropicalis. Methods in Molecular Biology. 917, 17-31 (2012).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early Development of Xenopus laevis. A Laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal table of Xenopus laevis (Daudin). A systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , North-Holland Publishing Company. Amsterdam. (1956).
- Xu, H., Dude, C. M., Baker, C. V. Fine-grained fate maps for the ophthalmic and maxillomandibular trigeminal placodes in the chick embryo. Developmental Biology. 317 (1), 174-186 (2008).
- Friedrich, R. W., Korsching, S. I. Combinatorial and chemotopic odorant coding in the zebrafish olfactory bulb visualized by optical imaging. Neuron. 18 (5), 737-752 (1997).
- Ishibashi, S., Cliffe, R., Amaya, E. Highly efficient bi-allelic mutation rates using TALENs in Xenopus tropicalis. Biology Open. 1 (12), 1273-1276 (2012).
- Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).
- Nussbaum-Krammer, C. I., Neto, M. F., Brielmann, R. M., Pedersen, J. S., Morimoto, R. I. Investigating the spreading and toxicity of prion-like proteins using the metazoan model organism C. elegans. Journalof Visualized Experiments. (95), e52321 (2015).
- Koide, T., et al. Olfactory neural circuitry for attraction to amino acids revealed by transposon-mediated gene trap approach in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (24), 9884-9889 (2009).
- Love, N. R., et al. pTransgenesis: a cross-species, modular transgenesis resource. Development. 138 (24), 5451-5458 (2011).
- Tandon, P., Conlon, F., Furlow, J. D., Horb, M. E. Expanding the genetic toolkit in Xenopus: Approaches and opportunities for human disease modeling. Developmental Biology. 426 (2), 325-335 (2017).
- Pratt, K. G., Khakhalin, A. S. Modeling human neurodevelopmental disorders in the Xenopus tadpole: from mechanisms to therapeutic targets. Disease Models & Mechanisms. 6 (5), 1057-1065 (2013).
- Truszkowski, T. L., et al. Fragile X mental retardation protein knockdown in the developing Xenopus tadpole optic tectum results in enhanced feedforward inhibition and behavioral deficits. Neural Development. 11 (1), 14 (2016).
- Hassenklöver, T., Manzini, I. Olfactory wiring logic in amphibians challenges the basic assumptions of the unbranched axon concept. Journal of Neuroscience. 33 (44), 17247-17252 (2013).
- Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. Single-cell electroporation for gene transfer in vivo. Neuron. 29 (3), 583-591 (2001).
- Sild, M., Van Horn, M. R., Schohl, A., Jia, D., Ruthazer, E. S. Neural Activity-Dependent Regulation of Radial Glial Filopodial Motility Is Mediated by Glial cGMP-Dependent Protein Kinase 1 and Contributes to Synapse Maturation in the Developing Visual System. Journal of Neuroscience. 36 (19), 5279-5288 (2016).
- McDiarmid, R., Altig, R. Tadpoles: The biology of anuran larvae. , The University of Chicago Press. 149-169 (1999).
- Heerema, J. L., et al. Behavioral and molecular analyses of olfaction-mediated avoidance responses of Rana (Lithobates) catesbeiana tadpoles: Sensitivity to thyroid hormones, estrogen, and treated municipal wastewater effluent. Hormones and Behavior. 101, 85-93 (2018).
- Gaudin, A., Gascuel, J. 3D atlas describing the ontogenic evolution of the primary olfactory projections in the olfactory bulb of Xenopus laevis. Journal of Comparative Neurology. 489 (4), 403-424 (2005).
- Scheidweiler, U., Nezlin, L., Rabba, J., Müller, B., Schild, D. Slice culture of the olfactory bulb of Xenopus laevis tadpoles. Chemical Senses. 26 (4), 399-407 (2001).
- Manzini, I., Schild, D. Classes and narrowing selectivity of olfactory receptor neurons of Xenopus laevis tadpoles. Journal of General Physiology. 123 (2), 99-107 (2004).
- Kludt, E., Okom, C., Brinkmann, A., Schild, D. Integrating temperature with odor processing in the olfactory bulb. Journal of Neuroscience. 35 (20), 7892-7902 (2015).
