Summary
Xenopus haletudser tilbyder en unik platform for at undersøge funktionen af nervesystemet in vivo. Vi beskriver metoder til at vurdere behandling af olfaktoriske oplysninger i levende Xenopus larver paa normale opdræt eller efter skade.
Abstract
Xenopus haletudser tilbyder en unik platform for at undersøge funktionen af nervesystemet. De giver flere eksperimentelle fordele, såsom adgang til talrige imaging tilgange, elektrofysiologiske teknikker og adfærdsmæssige assays. Xenopus haletudse olfaktoriske system er særlig velegnet til at undersøge funktionen af synapser etableret under normale udvikling eller reformeret efter skade. Her, vi beskriver metoder til at vurdere behandling af olfaktoriske oplysninger i levende Xenopus larver. Vi skitsere en kombination af in vivo målinger af præsynaptiske calcium svar i glomeruli af olfaktoriske pære med olfaktoriske-styrede adfærd assays. Metoder kan kombineres med transection af olfaktoriske nerver at studere rewiring af synaptisk forbindelse. Eksperimenter er præsenteret ved hjælp af både vilde-typen og genetisk modificerede dyr udtryk for normal god landbrugspraksis journalister i centralnervesystemet celler. Anvendelsen af metoderne til genetisk modificerede haletudser beskrevne kan være nyttige for optrævler det molekylære grundlag, der definerer hvirveldyr adfærd.
Introduction
Xenopus haletudser udgør en fremragende dyremodel for at studere den normale funktion af nervesystemet. Gennemsigtighed, fuldt sekventeret genom1,2og tilgængelighed til kirurgisk, elektrofysiologiske og Billeddannende teknikker er unikke egenskaber af Xenopus larver, der giver mulighed for at undersøge neuronal funktioner in vivo3 . Nogle af flere eksperimentelle mulighederne for dette dyr model er illustreret ved de grundige undersøgelser udført på haletudse sensoriske og motoriske systemer4,5,6. En særlig velegnet neuronal kredsløb til at studere mange aspekter af informationsbehandling på niveauet af synapser er Xenopus haletudse olfaktoriske system7. For det første, dens synaptisk forbindelse er veldefineret: olfaktoriske receptor neuroner (ORNs) projekt til olfaktoriske pære og etablere synaptic kontakter med dendritter af mitral/tuftet celler i glomeruli at generere lugt kort. For det andet genereres dens ORNs kontinuerligt af neurogenese hele livet at opretholde funktionaliteten af olfaktoriske veje8. Og for det tredje fordi det olfaktoriske system viser en stor regenerative evne, Xenopus haletudser er købedygtig helt reformere deres lugtekolben efter ablation9.
I dette papir beskriver vi tilgange, der kombinerer billeddannelse af olfaktoriske glomeruli i levende haletudser med adfærdsmæssige eksperimenter til at studere funktionaliteten af olfaktoriske veje. Metoderne detaljeret her blev brugt til at studere den funktionelle genopretning af glomerulær connectivity i de olfaktoriske pære efter lugtenerven transection10. Oplysninger indhentet i Xenopus haletudser er repræsentant for hvirveldyr da olfaktoriske forarbejdning er evolutionær bevares.
De beskrevne metoder er eksemplificeret ved hjælp af X. tropicalis , men de kan nemt implementeres i X. Bærmispel. Trods den større størrelse af voksen X. laeviser begge arter bemærkelsesværdigt ens haletudse gennemførelsesstadier. De væsentligste forskelle findes på genomisk niveau. X. laevis viser dårlig genetiske sporbarhed, overvejende bestemt af sin allotetraploid genom og lange generationstid (ca 1 år). Derimod er X. tropicalis mere modtagelig for genetiske modifikationer på grund af dens kortere generationstid (5-8 måneder) og diploide genom. De repræsentative eksperimenter er illustreret for wild-type dyr og tre forskellige transgene linjer: Hb9:GFP (X. tropicalis), NBT:GFP (X. tropicalis) og tubb2:GFP (X. laevis).
De metoder, der er skitseret i det nuværende arbejde bør overvejes sammen med de genetiske skrider frem i feltet Xenopus . Enkelhed og nem implementering af de teknikker præsenteret gør dem særligt nyttigt for evaluering allerede beskrevet mutanter11, samt Xenopus linjer genereret af CRISPR-Cas9 teknologi12. Vi også beskrive en kirurgisk procedure, der anvendes til Transekttællinger olfaktoriske nerver, der kan gennemføres i et laboratorium, der har adgang til Xenopus haletudser. Metoderne anvendes for at vurdere præsynaptiske calcium svar og olfaktoriske-styrede adfærd kræver specifikke udstyr, omend på en moderat omkostninger. Metoder er præsenteret i en simpel formular til at fremme deres anvendelse i forskningsgrupper og kunne angive grundlaget for mere komplekse assays, enten ved at gennemføre forbedringer eller ved association til andre teknikker, dvs, histologiske eller genetiske metoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer blev godkendt af det animalske videnskabsetisk komité på University of Barcelona.
Bemærk: X. tropicalis og X. laevis haletudser opdrættes efter standardmetoder13,14. Haletudse vand er udarbejdet ved at tilføje kommercielle salte (Se Tabel af materialer) til vand ved omvendt osmose. Ledningsevne er tilpasset til ∼700 µS og ∼1, 400 µS for X. tropicalis og X. laevis haletudser, henholdsvis. Larverne kan opnås enten ved naturlig parring eller in vitro-befrugtning14. Embryoner er dejellied med 2% L-Cystein forberedt i 0,1 x Marcs modificerede Ringers (MFR). 1 x MFR indeholder (i mM): 100 NaCl, 2 KCl, 1 MgSO4, 2 CaCl2, 5 HEPES, 0.1 EDTA, pH 7,8. Larverne er overført efter 2-3 dage (fase 25) til 2 L tanke med haletudse vand. Når haletudser nå fase 40 Nieuwkoop-Faber (NF) kriterier15, de er placeret i 5 L tanke og vedligeholdes med en tæthed på 10 dyr/L. temperaturen holdes konstant på 23-25 ° C og 18-20 ° C for X. tropicalis og X. laevis haletudser, henholdsvis. Dyr findes på stadier 48-52 af NF kriterier bruges til eksperimenter.
1. transection af olfaktoriske nerver
- Forberede en bedøve opløsning på 0,02% MS-222 i 50 mL haletudse vand ved stuetemperatur.
- Forberede en lille tank (1-2 L) med haletudse vand at tillade genoprettelse af dyr efter kirurgi.
- Skære rektangulære stykker af cellulose groft filtrerpapir (4 cm x 3 cm, se Tabel af materialer).
- Våd 2 stykker af cellulose groft filtrerpapir i 0,02% MS-222 løsning og placere dem under dissekere anvendelsesområdet.
- Vælge en haletudse fra tanken og fordybe den i den bedøve løsning. Dyret standser svømning inden for 2 – 4 min og reagerer ikke på mekaniske stimuli anvendes på niveauet hale med pincet.
-
Placer den bedøvede haletudse på de rektangulære stykker filtrerpapir. Placer dyret med sin dorsale side vender opad, så hjernestrukturer kan visualiseres.
- Brug markriyor saks (Se Tabel af materialer) skåret en eller begge olfaktoriske nerver (afhængigt af analysen skal udføres). Transekttællinger en enkelt nerve for eksperimenter, der kræver en intern kontrol af nerveskade.
- Adfærdsmæssige eksperimenter, Transekttællinger begge nerver for at undertrykke alle lugtstof oplysninger ankommer til olfaktoriske pære. Effektiviteten af skæring af olfaktoriske nerver kan let observeret dissekere omfattet; men pigmentering eller dyr position kan være begrænsende faktorer.
Bemærk: (Valgfrit) Den bedste måde at bekræfte gyldigheden af proceduren, der er ved hjælp af transgene haletudser, som udtrykker fluorescerende reportere på deres nervesystem (Se repræsentative resultater). I dette øjemed er det nødvendigt at bruge et dissektion område udstyret med fluorescens (figur 1). Hvis kun wild-type dyr er tilgængelige, kan være ansat sporing med CM-diI. Følg protokol 2 (se nedenfor) for at injicere en 0,5 mg/mL opløsning af CM-diI forberedt i 0.3 M saccharose i den nasale kapsel. Se 16 for detaljer om tilberedning og opbevaring af CM-diI. Skal minimere udsivning af farvestof ud af de vigtigste hulrum. I dette øjemed er det nødvendigt at ændre presset af injektion og åbningen af Mikropipetter. Fluorescens på niveau med den glomerulær lag af olfaktoriske pære bliver indlysende 24 timer efter påføring af CM-diI. Den nuværende arbejde bruger mærkning med CM-diI bare for at attestere transection procedure; denne metode kan dog også bruges til at indhente morfologiske oplysninger af olfaktoriske glomeruli ved hjælp af konventionelle histologiske procedurer.
- Overføre dyr til recovery tank. Haletudser skal genoprette normale svømning indenfor ~ 10 min. udføre en omhyggelig kontrol for tilstedeværelse af hemorrhages, som forventes af ~ 1% af dyrene udsat for kirurgi.
- Aflive tilskadekomne dyr i en 0,2% MS-222 løsning.
2. mærkning af olfaktoriske Receptor neuroner med fluorescerende Calcium indikatorer
- Der fremstilles en opløsning indeholdende 12% Calcium grøn-1-dextran (Se Tabel af materialer), 0,1% Triton X-100, og 1 mM NaCl17. Gemme løsningen på-20 ° C eller på-80 ° C, hvis den ikke skal bruges inden for en måned.
- Forberede mikroinjektion med en mikropipette puller glas pipetter med tip åbninger ~ 1 – 2 µm (samme diameter til microelectrodes anvendes til patch-clamp eksperimenter) (Se Tabel af materialer).
- Kalibrere volumen af microinjections. Med destilleret vand, justere pres og injektion tid for at opnå injektionsvolumener på 0,15-0,3 µL.
Bemærk: En simpel procedure består i at tælle antallet af bælgfrugter kræves for at tømme en pipette, fyldt med 1 µL vand. Typiske parametre er et tidspres 30 psi og 50 ms injektion. - Placer en pipette i microinjector og indlæse det med ~ 2 µL af calcium green-1 dextran løsning.
- Forberede en haletudse følgende trin 1.1 til 1.6.
- Flytte spidsen af pipetten ind i den største hulrum af den nasale kapsel.
Bemærk: Se figur 2A beskriver placeringen af olfaktoriske veje i en Xenopus haletudse. - Ved hjælp af indstillingerne fremstillet i 2.3, leverer et par pust. Begrænse farvestof tilstedeværelse til den nasale kapsel.
- Lad haletudse hvile i 2-3 min. ved hjælp af Pasteurs pipette, hæld dråber af 0,02% MS-222 løsning på de mere caudale dele af dyret til at undgå tørring.
- Overføre dyret til recovery tank.
Bemærk: Det bør gendanne normal svømning indenfor ~ 10 min. Manipulation af dyr kan forårsage skader. - Aflive haletudser, ikke genvinder normal svømning adfærd 15 min efter injektion bruger en 0,2% MS-222 løsning.
- Observere fluorescens på niveau med den glomerulær lag af olfaktoriske pære på dagen efter injektion.
3. forberedelse af haletudser til Live Imaging præsynaptiske svar
- 24 – 48 h før udførelse eksperimentet, pels 4 – 6 petriskåle af 35 mm diameter med silikoneelastomer (f.eks. Sylgard). Når elastomer har polymeriserede, Fremstil en rektangulær brønd for at passe haletudse.
Bemærk: Typiske dimensioner for X. tropicalis haletudser fundet i NF faser 48-52 er 10 mm x 4 mm. - Forberede 100 mL af en 160 µM til 1 mM aminosyre løsning som en lugtstof stimulus for haletudser. Løsningen kan indeholde en blanding af flere aminosyrer: methionin, leucin, histidin, arginin og lysin. Fortynd aminosyrer i Xenopus Ringers løsning, sammensat af (i mM): 100 NaCl, 2 KCl, 1 CaCl2, 2 MgCl2, 10 glukose, 10 HEPES, 240 mOsm/kg, pH 7,8. Sikre, at pH forbliver på 7,8.
- Fyld en forhøjet reservoir med 20 mL af opløsningen, aminosyre. Tilslut reservoiret med polyethylen rør til en 28 G kapillarrør (Se Tabel af materialer) placeret over den nasale kapsel.
Bemærk: Den kapillarrør er monteret på en micromanipulator (Se Tabel af materialer). Luftbobler må være fraværende fra perfusion system. - Opnå tidsmæssige præcision i anvende aminosyre løsning ved hjælp af kontrolelementet transistor-transistor logic (TTL) af magnetventil knivspids ventiler (Se Tabel af materialer). En stimulator bruges til at generere TTL pulser (Se Tabel af materialer). Kontrollere den tidsmæssige præcision for at levere lugtstof løsningen ved at ændre varigheden af TTL pulser, dvs., 0,1 til 1 s.
- Fyld en anden forhøjede reservoir med 100 mL Xenopus Ringers opløsning.
- Bedøver en haletudse og placere den under dissekere anvendelsesområdet (trin 1.1 til 1.6).
- Forberede en haletudse til billedbehandling. Hvis albino haletudser findes Fortsæt til trin 3.9, ellers fjerne huden over lugtekolben, fordi det indeholder melanocytter, der forringer imaging (trin 3.8).
Bemærk: Der er to måder at udføre eksperimentet afhængigt af pigmentering af dyret. Det er at foretrække at bruge albino dyr. Albino stammer er tilgængelige for X. laevis og albino X. tropicalis linjer har for nylig oprettet af CRISPR-Cas9 12 eller TALENs18. - Brug markriyor saks, lave et tværgående snit på haletudse huden på kanten af det centrale nervesystem. Gøre cut bør foretages på niveau med de olfaktoriske pære og aldrig nåede stillingen som tectum, som let kan identificeres af placeringen af synsnerven.
- Knivspids skåret huden ved hjælp af pincet og stikke det i nervesystemet. Bekræft vellykket fjernelse ved fravær af melanocytter ovenfor olfaktoriske pære. Holde dyret fugtig ved at hælde dråber af 0,02% MS-222 løsning ved hjælp af Pasteurs pipette.
- Placer haletudse i brønden af belagte fad (Se Tabel af materialer). Sætte et glas coverslip belagt med højt vakuum fedt over dyret. Placere coverslip for at dække toppen af tectum til slutningen af halen.
- Sikre at de olfaktoriske pære og placodes fortsat er udsat for den ekstracellulære medium. Holde haletudse immobile under imaging. Fyld petriskålen med Xenopus Ringer solutioncontaining 100 µM tubocurarin (Se Tabel af materialer) at forhindre muskelsammentrækninger.
Bemærk: Tubocurarin opbevares i alikvoter ved-80 ° C ikke længere end 6 måneder. - Placer fadet holding haletudse under en opretstående mikroskop. Tilslut reservoiret indeholdende Xenopus Ringers løsning med fadet med polyethylen slanger (Se Tabel af materialer) for kontinuerlig perfusion af Xenopus Ringers løsning til at holde dyrene i live for > 1 h.
Bemærk: Mini magnetisk klemmer (Se Tabel af materialer) er meget nyttigt at stabilt Tilslut slangen til fadet. Perfusion og suge rør skal være placeret i ~ 180° vinkel. - Start perfusing Xenopus Ringers løsning. Opretholde den løsning i parabol konstant gennem hele eksperimentet. Løbende at evaluere haletudse levedygtighed ved at observere blodcirkulationen gennem fartøjerne.
4. live Imaging præsynaptiske Ca2 + ændringer i olfaktoriske Glomeruli
Bemærk: Med billedbehandling er beskrevet for wide-felt mikroskopi men kunne tilpasses nemt til en Konfokal mikroskop ved at justere indstillingerne for erhvervelse. Imaging bør udføres i en opretstående mikroskop monteret på et Vibrationsdæmpende tabel.
- Visualisere haletudse med en lav forstørrelse mål, for eksempel 5 x.
- Flytte micromanipulator akser til at placere kapillær levere lugtstof løsning på toppen af en nasal kapsel danner en 90 ° vinkel med lugtenerven. Strømmen af lugtstof løsning ovenfor lugtekolben bør undgås, fordi det kan forårsage uro, der fordrejer billeddannelse.
- Find den lugtekolben ligger ipsilaterally til den nasale kapsel (afhængigt af stimulation) ved hjælp af en høj forstørrelse, lange arbejde afstand, vand fordybelse mål: 60Xx, 0,9 N.A.
- Kontrollere fluorescens emission af øjet. Glomerulær strukturer bør være indlysende (figur 2B).
- Udføre live erhvervelse med et kamera egnet til calcium billeddannelse. Definere en kasse der indeholder hele lugtekolben, typisk på 256 x 256 eller 512 x 512 pixel. Sæt erhvervelse frame rate erhvervelse til 20 – 40 Hz. justere gevinst, således at værdierne af basal fluorescens ~ 20% af mætning. Erhverve en 5 s video.
- Visualisere filmen. Kontroller billede fokus, manglende bevægelse artefakter og regioner som indeholder mættet pixels. Typiske fluorescens værdier af glomerulær regioner bør være 5.000-20.000 a.u. Hvis bruger en 16-bit kamera. Fortsæt til næste trin, hvis imaging betingelser er optimale. Gentag trin 4.6, hvis det er nødvendigt at forbedre billedkvaliteten eller justere gain-indstillinger.
- Starte en time-lapse erhvervelse for at registrere svar fremkaldt af olfaktoriske stimuli.
Bemærk: Præcise anvendelse af lugtstof løsning styres af TTL stimuli. En typisk eksperiment indeholder en oprindelig periode på 4 s, efterfulgt af stimulation gange alt fra 0,1 til 0,5 s og et opsving periode af 6 – 10 s. - Udføre gentagne stimulering af Duftenes tidsintervaller > 2 min. sat flowet til 1 – 1,5 mL·min-1. Da den globale perfusion er på under alle eksperimenter, er lokalt anvendte aminosyrer vasket ud.
Bemærk: Rumfang af opløsning i skålen er ~ 3 mL. -
Billedanalyse
- Påvisning af svar
- Eksportere film til ImageJ.
Bemærk: Målet er at opdage tilstedeværelsen af glomerulær regioner besvarelsen stimuli. - Omdanne den rå sekvens af fluorescens billeder til en ΔF/F0 film. Måle relative ændringer i basal fluorescens efter den følgende relation: (F-F0) f0, hvor F0 angiver baseline fluorescens niveauer.
- Tegne regioner af interesse (ROI) omkring områder viser formodede fluorescens stigninger under stimulation og optage deres position i ROI manager (figur 2E). Tegne en ROI for at opdage baggrund fluorescens niveauer i et område glomerulær strukturer.
- Eksportere film til ImageJ.
- Kvantificering af svar.
- Placer de definerede ROIs i den rå sekvens af fluorescens billeder. Få grå gennemsnitsværdien af valgte ROIs for hver ramme. Overføre rækkefølgen af værdier opnået et analyse-program (fx., Igor Pro).
- Subtrahere baggrund fluorescens, og derefter beregne ΔF/F0 ændringer for hver ROI (figur 2F). Plot stigninger i ΔF/F0 for hver enkelt af de ROIs valgt. Beregn standardafvigelsen af basal ΔF/F0 (før stimulation).
Bemærk: En positiv reaktion betragtes som hvis stigninger i ΔF/F0 opnået under stimulation er større end 2 standardafvigelser af basale værdier.
- Påvisning af svar
5. olfaktoriske-styrede adfærd analyse
Bemærk: Et skematisk diagram over setup til at udføre analysen er vist i figur 3.
- Lave små huller til at passe 1.57 mm O.D. x 1,14 mm I.D. slanger i den øverste del af hver brønd med en 6-godt parabol. Indsæt slangen og forsegle ved hjælp af en epoxy lim (Se Tabel af materialer).
Bemærk: Den modificerede parabol kan genanvendes mange gange efter grundig vask med destilleret vand. - Forberede 50 mL af en aminosyre løsning der indeholder methionin, leucin, histidin, arginin og lysin (Se trin 3.2 for detaljer). Koncentrationerne kan variere fra 160 µM til 1 mM. Sted 20 mL af opløsning i en forhøjet reservoir.
- Må ikke fodre haletudser i mindst 12 timer før analysen. Tag 6 haletudser fra deres bolig tank og placere dem i 2 L ren haletudse vand at minimere eksponeringen for duftstoffer.
- Placer den modificerede 6 wells parabol på en hvid LED-transilluminator (figur 3).
- Par perfusion indløb til reservoiret indeholder aminosyren løsning ved hjælp af en manifold (Se Tabel af materialer). Kontrollere perfusion system og fjerne luftbobler. Fylde de 6 wells samtidigt. Justere højden på reservoir til at tillade levering af ≥5 mL af lugtstof løsning inden for ~ 30 s.
Bemærk: Vask hver godt 4 gange med dobbeltdestilleret vand efter udsættelse for lugtstof løsning. - Fyld hver godt med 10 mL haletudse vand. Sted 1 haletudse/godt. Lad det hvile i > 3 min.
- Opret billede erhvervelse. Bruge en konventionel CCD-kamera, der kan erhverve billeder på ≥5 Hz. Tilslut kameraet til en computer. Bruger her en Zeiss MRC5 kameraet kontrolleret af Zen software men andre tilsvarende konfigurationer kan bruges. Hvis det er nødvendigt at øge billedhastighed, anvende pixel binning. Billederne skal vise hele 6-godt parabol.
- Start billede erhvervelse, så film indeholder basal (30 s), stimulus (25 – 35 s) og fredninger (30 – 60 s).
- Returnere dyr fra 6 wells parabol til tanke efter billeddannelse.
- Analysere film i ImageJ bruger plugins såsom wrMTrck19,20 , der giver flere parametre tilknyttet motilitet.
- For at forberede billeder til analyse, skal du først vælge et godt ved at tegne en rektangulær ROI på 35 mm x 35 mm (figur 4A). Få et baggrundsbillede ved beregning af den maksimale projektionen af hele sekvensen. Det skal vise et billede af godt uden haletudse.
- Fratræk den maksimale fremskrivning fra den rå film. Udføre tærskel på den genererede 32-bit film og anvende wrMTrck plugin. Justere WrMTrck parametre til at pålideligt spore flytninger af dyr. Overføre de opnåede X, Y koordinater i en analyse program.
- Ved hjælp af X-Y koordinaterne, beregne den euklidiske afstand til lugtstof kilde (perfusion indløb i brønden), ved anvendelse af følgende ligning:
hvor os angiver placeringen af lugt kilden og tad angiver positionen haletudse på et givet tidspunkt. Se figur 4A for detaljer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I dette papir, præsenterer vi en kombination af to komplementære metoder til at udføre i vivo undersøgelse af funktionaliteten af Xenopus haletudse olfaktoriske system: Jeg) en metode for imaging præsynaptiske Ca2 + ændringer i glomeruli af levende haletudser ved hjælp af en fluorescerende calcium indikator, og ii) guidede en lugt adfærdsmæssige analyse, der kan bruges til at undersøge svar på specifikke vandbårne duftstoffer. Da disse tilgange har været ansat til at evaluere inddrivelse af olfaktoriske behandling efter skade10, er en simpel metode til transecting olfaktoriske nerver også beskrevet.
Transection af olfaktoriske veje i Xenopus haletudser
Der er to måder at bekræfte gyldigheden af proceduren. Begge stole på visualisering af olfaktoriske nerver ved hjælp af fluorescerende journalister. Én metode er baseret på transgene haletudser, som udtrykker fluorescerende proteiner på deres nervesystem. To anbefalede linjer, at give udtryk for normal god landbrugspraksis en neuronal β-tubulin promotor er X. laevis tubb2b-normal god landbrugspraksis og X. tropicalis NBT-normal god landbrugspraksis (figur 1, se Tabel af materialer). Hvis der kun wild-type dyr er tilgængelige, CM-diI kan anvendes (Se trin 1,8). Figur 1 viser billeder af tubb2-NGL X. laevis haletudser. Billeder er fra fire forskellige dyr, hvor en enkelt lugtenerven var transected. Snittet skal være indlysende omfattet dissektion. Fordelen ved at anvende transgene linjer er, at reformationen af lugtenerven kan følges over en periode. Når du laver fortløbende observationer, anbefales det at minimere eksponering for fluorescerende lys at undgå solskader. Skæring af en enkelt lugtenerven er nyttige, når en intern kontrol er nødvendig, for eksempel, at sammenligne normalt udviklede vs rewired glomerulær enheder. Skæring af begge olfaktoriske nerver skal anvendes, når målet er helt undertrykke fremsendelse af oplysninger.
Live imaging af præsynaptiske svar til olfaktoriske stimuli
Den korrekte mærkningsbestemmelserne i ORNs med calcium green-1 dextran kan observeres på niveauet af olfaktoriske pære (fig. 2A) ved hjælp af widefield mikroskopi. Glomeruli er indlysende (figur 2B) og skal vises distribueret i forskellige lag ved at flytte fokus flyet. Morfologi af glomerulær strukturer kan løses bedre hvis en Konfokal mikroskop bruges i stedet (figur 2C). Antallet af mærket glomeruli afhænger farvestof optagelse på niveau med Lugtepithelet. Derfor, denne procedure ikke tillader visualisering af alle glomerulær enheder. Dyr, der viser en mere intens fluorescens farvning af regionen glomerulær skal vælges før du udfører imaging eksperimenter, da de indeholder flere ORNs mærket. Denne manøvre er stærkt anbefales for at øge gennemløbet af eksperimentel og bør udføres under et dissekere område udstyret med et fluorescens lampe. Afvise dyr der viser ikke mærket glomerulær enheder eller at vise fluorescens begrænset til bestemte områder af glomerulær lag. Præsynaptiske Ca2 + svar kan observeres så snart 1 dag efter farvestof lastning. For at udføre imaging eksperimenter er det ønskeligt at bruge målsætninger af høj numerisk blænde, typisk ≥0.9.
Stigninger i præsynaptiske calcium niveauer kan være fremkaldt udsætter dendritiske knopper af ORNs til aminosyrer. Det er vigtigt at placere kapillær levere lugtstof løsning ovenfor den nasale kapsel. Bør udvises forsigtighed at undgå kontakt, fordi det kunne blokere spidsen af kapillær og/eller forårsage mekaniske stimulation af ORNs. Forbigående stigninger i præsynaptiske calcium niveauer kan observeres for stimuli ≥0.1 Sørensen (figur 2D) og er vejledende for en korrekt olfaktoriske transduktion. Det er også vigtigt at visualisere basal calcium niveauer med lav kamera gevinst. Præsynaptiske terminaler af ORNs vise høj fluorescerende stigninger og det er vigtigt at undgå signal mætning. Høj tidsmæssige opløsning kan opnås med widefield mikroskopi. For eksempel er bruger en elektron-ganges CCD kamera, det muligt at opnå billedhastigheder på 50 Hz eller højere. Brug af konfokalmikroskopi reducerer tidsmæssige opløsning, men giver mulighed for en bedre definition af glomerulær strukturer.
Calcium grønne høj affinitet for binding calcium (190 nM) er særligt nyttige til at opdage små svar. Forbigående intracellulære calcium stigninger opdaget i glomerulær lag er variabel. Nogle glomerulær regioner Vis ændringer i ΔF/F0 ≥0.2, mens nærliggende processer ikke kan selv reagerer (figur 2D). Følgende faktorer bidrager til variation af glomerulær enheder reaktion: i) det samlede antal af mærket glomeruli, ii) den intracellulære koncentration af calcium grønne og iii) ORNs at opdage aminosyrer selektivitet. Da et for lavt antal mærket glomeruli kan udelukke observere svar, er det absolut nødvendigt at foretage disse eksperimenter med dyr der indeholder så mange mærket ORNs som muligt.
Olfaktoriske-styrede adfærd
Dataanalyse
Olfaktoriske-styrede adfærd er undersøgt ved hjælp af en skræddersyet system. Figur 3 viser en skematisk tegning af udstyr, der anvendes til at udføre analysen. Testen er baseret i haletudser evne til at påvise tilstedeværelsen af aminosyrer, der fungerer som duftstoffer. En løsning, der kombinerer fem forskellige aminosyrer (methionin, leucin, histidin, arginin og lysin) bruges til stimulation. Løsningen leveres lokalt under 30 s til en 35 mm godt indeholdende en fritsvømmende haletudse. Den umiddelbare reaktion af haletudser til den indgående løsning er en stigning i motilitet. Tilfældige bevægelser opstår under den indledende ∼5-10 s af løsning program er efterfulgt af en direkte svømme mod kilden til duftstoffer. Haletudser forbliver i flere sekunder i nærheden dysen under levering af aminosyrer og genoprette gradvist motilitet i tilfældig retninger (Se supplerende videoer 1, 2).
De eksperimentelle betingelser beskrevet tillade den normale svømme X. tropicalis haletudser etaper 48-52; Det skal dog tages hensyn at motilitet af større dyr kan begrænses i 35 mm brønde. Haletudse bevægelser registreres med en CCD kamera. Attraktion for lugtstof løsning kan påvises som en reduktion af den euklidiske afstand mellem perfusion indløb fra haletudse position (figur 4). Sporing af haletudse hoved positioner inden for et område af 35 mm x 35 mm (eller den tilsvarende størrelse i pixels) giver mulighed for at opnå en kvantitativ analyse af olfaktoriske-styrede adfærd (figur 4A). Enkelte parceller af haletudse bevægelser er konstrueret ved hjælp af X-Y koordinaterne fremstillet af billedanalyse (fig. 4B). Den udpakkede motilitet parceller skal trofast reproducere video billeder.
Der er to mulige måder at fortolke olfaktoriske-styrede adfærd eksperimenter. Den første metode er inspireret på en tidligere undersøgelse ved hjælp af zebrafishes21. Måling af tidsforbrug i nærheden dysen levere Duftenes beviset interstatslig handelspraksis tilstedeværelsen af en positiv tropisme. En region af interesse på 8,75 mm radius (svarende til ¼ af den godt diameter) centreret på løsning indløb det bruges til at klassificere nærhed af dyrene til lugtstof kilden (figur 4A, 4 C). Binning haletudser i nærheden dysen tidsforbrug i definerede perioder, dvs., 15 s intervaller, giver mulighed for at identificere evne til at detektere aminosyre løsninger (figur 4D). Den samlede adfærd af en population af haletudser kan opnås ved plotte fordelingen af individuelle data (figur 5A). En positiv tropisme kan opdages, når løsningen af methionin, leucin, histidin, arginin og lysin fremstilles enten 1 mM eller 160 μM (figur 5A og 5B). Dyr, der reagerer ikke på vand program (figur 5C), således udsmid deltagelse af mechanosensitive mekanismer. Forskelle mellem gang intervaller, der defineres i hver eksperimentelle gruppe kan oprettes ved hjælp af ikke-parametrisk gentagne foranstaltninger ANAVA med Dunns flere sammenligninger test. Ulempen ved binning data i gang intervaller af 15 s er en reduceret tidsmæssige opløsning.
En måde at øge tidsmæssige oplysninger af den adfærdsmæssige reaktion er ved at lave gennemsnitlige parceller på euklidisk afstande fra lugt kilde. Selvom haletudse bevægelser viser en iboende variabilitet, viser den gennemsnitlige motilitet af en population af dyr (typisk ≥40) den olfaktoriske-styrede adfærd. For at foretage denne analyse er det nødvendigt at gruppe dyr positioner inden fremkomsten af stimulation. Da haletudser findes i forskellige steder når lugtstof løsningen ind i brønden er det nødvendigt at indstille den euklidiske afstand til 0 lige før stimulation (figur 6A, se også inklusionskriterierne i figur 7). Negative og positive værdier derfor angive en attraktion eller en frastødning fra lugt kilde, henholdsvis. En attraktion for lugte er godt beskrevet af en lineær pasform med regression koefficienter ≥0.9. Hvis vand er leveret, nettoændringerne af euklidisk afstand er fordelt omkring 0 og det er ikke muligt at passe en linje under lugtstof stimulation, således viser fraværet af en olfaktorisk-styrede adfærd (figur 6B). Sammenligning af gennemsnitlig parceller på euklidisk afstande aminosyre løsninger forberedt på 1 mM og 160 µM foreslå forskellige forsinkelser i de olfaktoriske-styrede svar (Sammenlign figur 6A og C). Tidsintervallet skal indlede bevægelsen i retning af kilden af Duftenes er kortere, når aminosyrer anvendes ved en højere koncentration. Manglende olfaktoriske-styrede adfærd er observeret i haletudser med begge olfaktoriske nerver transected (figur 6D).
En begrænsning af de beskrevne olfaktoriske-styrede adfærdsmæssige assay er oprettelsen af komplekse flydende faner. Dette kan ses hvis aminosyre løsning erstattes af et farvestof, som hurtigt grøn, når du konfigurerer systemet. Brug af farvede løsninger kontrollerer dannelsen af faner og viser, at vandbårne duftstoffer nå enhver region i godt inden for 5 s. turbulens forårsaget af levering af løsningen er sandsynligvis opdaget ved sidelinjen af haletudser og sandsynligvis bidrage til variabiliteten observeret i animalsk motilitet men forstyrrer ikke olfaktoriske guidede adfærd. Control forsøg foretaget ved hjælp af vand i stedet for aminosyre løsninger afsløre, at haletudser er i stand til at diskriminere olfaktoriske fra mekaniske stimuli. Estimering af tidsforbrug i en region af interesse (figur 5) og den gennemsnitlige plot af euklidisk afstande (figur 6) er to komplementære metoder til at beskrive den olfaktoriske-styrede svar af haletudser.
Inklusionskriterierne
Inklusionskriterierne skal også tages hensyn til dataanalyse. Nogle haletudser Vis en resonant bevægelse, som er illustreret ved montering af handlingen i euklidisk afstande til en sinusformet funktion (figur 7A). Haletudser viser denne adfærd skal kasseres fra alle analyse.
Udelukkelsen af dyr, der i starten af anvendelsen af lugtstof løsninger er højst (> 30 mm figur 7B) eller et minimum euklidisk afstand (< 5 mm, figur 7C) fra dysen giver mulighed for faldende variabilitet af de gennemsnitlige parceller. Eksempel illustreret i figur 7B viser en positiv tropisme for aminosyre løsning. En haletudse er beliggende i en maksimal afstand af løsning indløb i starten af stimulation. Derfor kan denne relative position kun afsløre en attraktion for lugt kilde. Figur 7 C viser den modsatte situation. Her, er en haletudse beliggende i nærheden af dysen levere aminosyre løsning. Kvantificering af tidsforbrug nær lugt kilde viser et svar (metode anvendes i figur 5); dog kan det vise en netto bevægelse mod fjorden.
I Resumé definerer foreslåede analysen af olfaktoriske-styrede funktionsmåde en binær test. Denne metode kan bruges til at registrere en eksperimentel musikgruppe af haletudser evne til at reagere på duftstoffer. Yderligere forbedringer er nødvendige, hvis målet er oprettelse af forskelle blandt komplekse olfaktoriske-styrede svar, som for eksempel bestemme indstillinger for bestemte lugte.
Figur 1: Transection af olfaktoriske nerver. Repræsentative billeder af tubb2-NGL X. laevis haletudser fremstillet efter transection af en enkelt lugtenerven (pile). Nerver af tubb2-NGL haletudser vise stærk fluorescens. Nerve transection er indlysende umiddelbart efter operationen (D0). Genvækst af lugtenerven er indlysende 4 dage efter cut (D4). Otte dage efter operationen (D8) der er lidt forskel mellem kontrol og reformeret nerver. Haletudser blev bedøvede i 0,02% MS-222 at indsamle billeder. Olfaktoriske pære (O.B.), lugtenerven (O.N.), nasal kapsel (N.C.), tectum (TEF), synsnerven (Op.N.). Pilene angiver placeringen af den transected nerve. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Mærkning af olfaktoriske receptor neuroner med calcium grønne dextran og visualisering af præsynaptiske calcium tilstrømning ved stimulation med aminosyrer. (A) overførte lys billede af en haletudse viser placeringen af Lugtepithelet, olfaktoriske nerver og glomerulær lag af olfaktoriske pære. (B) billede af en olfaktoriske pære visualiseret ved widefield (wf) mikroskopi. Neuroner var mærket af anvendelsen af calcium green-1 dextran på den nasale kapsel. Fluorescens observeret svarer til præsynaptiske terminaler fra olfaktoriske receptor neuroner danner glomeruli. O.N: lugtenerven; O.B: olfaktoriske pære. (C) Konfokal afsnit beliggende dorsalt fra posten i lugtenerven til pæren. Den præsynaptiske komponent af olfaktoriske glomeruli var mærket ved hjælp af calcium green-1 dextran, som i B). (D) præsynaptiske terminaler øge forbigående deres calcium niveauer ved udsættelse af Lugtepithelet for en løsning, der indeholder fem forskellige aminosyrer. Relative ændringer i calcium fluorescens fremstillet før, under og efter 1 s stimulation. (E) fordeling af 10 forskellige regioner af interesse (ROIs) bruges til at kvantificere ΔF/F0 ændringer. ROI11 er uden for det glomerulær lag og bruges til at definere baggrundsværdier for fluorescens. (F) individuelle ΔF/F0 Svar nemlig ROIs defineret i E). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Olfaktoriske-styrede adfærd assay. (A) skematisk diagram viser det udstyr, der anvendes i testen. (B) eksempel på motilitet numre indspillet over 90 s. Hver cirkel repræsenterer en godt der indeholder et enkelt dyr. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Sporing af olfaktoriske-styrede opførsel. (A) eksempel viser et godt bruges til adfærdsmæssige analysen. Blå prikkede linje angiver placeringen af X, Y koordinater (i mm) bruges til at spore haletudse bevægelser (Se også supplerende Video 1). Den grønne ellipse repræsenterer placeringen af løsning indløb. Den stiplede sorte linie angiver den proksimale område til glasset leverer aminosyre løsningen (Se tekst for detaljer). (B) motilitet af haletudse vist i A) under den adfærdsmæssige assay. Farvekodede spor viser placering af dyret før (grå) og efter olfaktoriske stimulation (violet). Bevægelser under anvendelse af lugtstof løsning er illustreret i en tidsmæssig farveforløb (30 s, røde til blå). (C) ved hjælp af X, Y haletudse positioner er det muligt at beregne ændringerne i den euklidiske afstand fra haletudse hoved til perfusion indløb. Afstande kortere end 8,75 mm svarer til den proksimale område af dysen. (D) Plot af tidsforbrug af haletudser i regionen defineret af en stiplet linje i A). Hver prik angiver en 15 s periode. Dyret er tiltrukket af lugtstof løsning. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 : Haletudser er tiltrukket af aminosyrer. (A) tid brugt af haletudser i nærheden lugt kilde. Hver bin består af en 15 s periode. Boks parceller repræsenterer median (sort vandret streg), 25-75% kvartiler (kasser) og dataområder (knurhår). Levering af en 1 mM aminosyre løsning tiltrukket haletudser til lugt kilde. (B) haletudser blev tiltrukket af lugtstof løsning når koncentrationen af aminosyrer blev reduceret til 160 μM. (C) levering af vand ikke ændre dyrs adfærd. Gentagne foranstaltninger ANAVA med Dunn's flere sammenligninger test, p < 0,05. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6 : Tidsmæssige svar af haletudser Duftenes. (A) Plot af gennemsnitlige euklidisk afstand til lugt kilde som funktion af tiden. Den euklidiske afstand blev sat til 0 før stimulation i hver enkelte spor. Negative og positive værdier angiver et fald og en forøgelse af afstanden til lugt kilde, henholdsvis. Tiltrækning til lugt kilde kan beskrives ved en lineær fit (r2= 0,98). (B) levering af vand ændrer ikke afstanden til lugt kilde. (C) haletudser reagere på anvendelsen af en 160 μM løsning af aminosyrer som afsløret ved en lineær fit (r2= 0,96). (D) haletudser med begge olfaktoriske nerver transected reagerer ikke på aminosyrer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7 : Inklusionskriterierne for olfaktoriske-styrede adfærd assay. (A) nogle haletudser Vis en resonant bevægelse. Denne adfærd er afsløret af vellykket fit for en sinusformet funktion til handlingen i den euklidiske afstand til lugt kilde. Haletudser vise denne aktivitet bør udelukkes fra testen. (B, C) En måde at reducere variation i den gennemsnitlige tidsmæssige reaktion på Duftenes (figur 6) er ved at udelukke dyr beliggende på et maksimum (B) eller et minimum c euklidisk afstand i starten af stimulation. Røde stiplede linjer Angiver tærskelværdien (30 mm og 5 mm). Den euklidiske afstand før starten af stimulation (pil, venstre parceller) er indstillet til "0" til betænkningen værdier tiltrækkende eller frastødende opførsel som negative eller positive (højre parceller), henholdsvis. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende Video 1: olfaktoriske-styrede adfærd udløses ved levering af en aminosyre løsning. Filmen viser en haletudse frit svømning på en 35 mm godt. Den blå ellipse angiver placeringen af dysen levere lugtstof løsning. I starten og slutningen af stimulation er angivet af grønne og røde prikker, henholdsvis. Figur 4 viser analysen af den adfærd, der er observeret. Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)
Supplerende Video 2: haletudse motilitet under levering af vand. Filmen viser en haletudse frit svømning på en 35 mm godt. Den blå ellipse angiver placeringen af dysen frigive MQ vand. I starten og slutningen af vand levering er angivet af grønne og røde prikker, henholdsvis. Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette papir beskriver teknikker, der er nyttige til at undersøge funktionaliteten af olfaktoriske veje i levende Xenopus haletudser. Den nuværende protokol er især nyttigt for de laboratorier, der arbejder, eller har adgang til Xenopus; Det er imidlertid også interessante for de forskere, der studerer det cellulære og molekylære grundlag af neuronal regenerering og reparation. Resultaterne fra Xenopus kan kombineres med data indsamlet i andre hvirveldyr modeller til at identificere bevarede mekanismer. De beskrevne metoder vil drage fordel af udviklingen af genetisk modificerede Xenopus18,22,23 og er gældende til eksperimentelle modeller for nervesystemet sygdomme i haletudser24, 25.
For at opnå reproducerbare in vivo data, er det nøglen til korrekt bageste Xenopus haletudser. Især er X.tropicalis meget følsomme over for dårlige boligforhold. For eksempel, de kan tåle ikke temperaturer under 20 ° C og bør opbevares i tanke eller vandsystemer i rækken af 24 til 28 ° C. Det er også vigtigt at ikke øge belægningsgrad ovenfor fastsatte grænser, regelmæssigt feed haletudser og holde en optimal vand kvalitet13. Forvaltning af animalsk kolonier efter standardiserede betingelser er absolut nødvendige for at opnå reproducerbarhed af in vivo forsøg.
Metoden beskrevet af calcium imaging er nyttige til at opdage en korrekt olfaktoriske transduktion af ORNs in vivo. Indlæsning af ORNs med calcium green-1 dextran er opnået af forbigående permeabilization i plasma membranen ved hjælp af en lav koncentration af Triton X-100, som tidligere rapporteret17. Den største fordel ved denne læsning metode er enkelhed, fordi det kun kræver en microinjector. En vigtig ulempe er, at Triton X-100 forårsager forbigående afskaffelse af olfaktoriske cilier og microvilli. Lugtepithelet af zebrafisk regenererer inden for 48 timer efter behandling17. Er muligvis endnu hurtigere regenerering i Xenopus haletudser da svar til duftstoffer kan observeres 1 dag efter farvestof indlæsning (figur 2D). En detaljeret morfologisk analyse er imidlertid forpligtet til at præcist skøn regenerering tidspunktet for Lugtepithelet efter Triton X-100 behandling.
Mærkning ORNs med calcium green-1 dextran er kun effektiv i en population af neuroner, tillade visualisering af præsynaptiske terminaler med en høj signal-støj-forhold (figur 2B og 2 C). Den næsten fuldstændige mangel på baggrund er fordel hvis i forhold til indlæsning af hele olfaktoriske pære med AM ester former for calcium farvestoffer. Antallet af fluorescerende ORNs adskiller sig fra dyr til dyr. Det er således nødvendigt at anvende en bred olfaktoriske stimulus af flere aminosyrer. Vi har opnået gode resultater ved hjælp af en opløsning af methionin, leucin, histidin, arginin og lysin. Andre kombinationer af forskellige aminosyrer kan også være effektiv. En alternativ metode til at indlæse ORNs med calcium indikatorer er elektroporation26, som er meget udbredt at udtrykke genetisk kodet fluorescerende journalister i haletudse neuroner27. Elektroporation kan gøres ved hjælp af kommercielle eller specialfremstillet udstyr og giver mulighed for visualisering af neuronal strukturer med en fremragende signal / støj-forhold28. Ligeledes at metoden beskrevet cellepopulationer mærket er heterogene og varierer fra dyr til dyr. Transgenese er ønskeligt, hvis formålet er at undersøge en afgrænset befolkning af neuroner22. Eksempelvis kunne kørsel udtryk for genetisk kodet calcium indikatorer som GCaMPs i en begrænset gruppe af ORNs, være meget nyttigt at undersøge svar på et defineret sæt af præsynaptiske terminaler duftstoffer.
Metoden beskrives ved hjælp af calcium-grøn 1 dextran rapporter præsynaptiske terminal funktion in vivo. Observation af intracellulære calcium stigninger er vejledende for en korrekt olfaktoriske transduktion og frigivelsen af glutamat på niveau med glomeruli. Kvantitativ analyse af ændringer i Fluorescens er dog begrænset. Stimulation af præsynaptiske terminaler øger intracellulære calcium niveauer til det micromolar område og mætning af en høj affinitet calcium indikator som calcium grønne skal tages i betragtning. Resultater illustreret i figur 2 er opnået ved hjælp af widefield mikroskopi. Dette er den enkleste og kan gennemføres i de fleste laboratorier. Forbedring ved hjælp af to-foton mikroskopi eller genetisk kodet fluorescerende journalister kan gøre det muligt at opnå mere kvantitative skøn over præsynaptiske funktion.
Live billedbehandling af calcium svar er det kritisk, at der er passende placering af kapillar levere lugtstof løsning. Det bør være placeret over den nasale kapsel og altid undgå direkte kontakt med væv. Både den korrekte levering af lugtstof løsning og flow af perfusion kontrolleres inden markedsføring haletudse under mikroskop. Alle slanger, der anvendes for perfusion skal inspiceres for luftbobler. Flow ændringer af aminosyre løsning skal straks reagere på hinanden følgende åbning og lukning af magnetventil. Forsinkelser er vejledende for tilstedeværelsen af luft. Det er også ønskeligt at kontrollere dem for korrekte volumen stiger eller falder af løsning leveret efter skiftende åbningstid, dvs., fra 0,1 s til 1 s eller vice versa. Brug en lav lysintensitet under indstilling eksperimentelle parametre (trin 4.6) for at minimere photobleaching.
Selv om betydningen af lugtesansen i biologi af haletudser er veletableret29, er der en mangel på tests direkte vurdering af olfaktoriske-styrede adfærd i Xenopus larver. Metoden beskrevet i denne hvidbog er en simpel test, der giver mulighed for påvisning af en reaktion på en lugt stimulus i en stor population af dyr. Den seneste beskrivelse af lugtstof følsomheden af Rana catesbeiana haletudser for tilstedeværelsen af kemikalier i vandet illustrerer de komplekse mekanismer kobling lugtesansen til motor adfærd30. Analysen beskrives i dette dokument tager hensyn til de iboende variation af olfaktoriske-styrede adfærd i haletudser. Brug af en 6-godt parabol i stedet for enkelt wells øger eksperimentelle overførselshastighed. Faktorer, der bidrager til variation er sådan basal motilitet, relative position til perfusion indløb og faner genereret af lugtstof løsning overvældet af gennemsnit mange haletudser. Cirka 40 uafhængige målinger skal beskrive kontrol attraktive svar til aminosyrer.
Vi foreslår to typer af analyse til lugtesansen test. Den første fremgangsmåde kvantificerer tidsforbrug nær lugt kilde i en nærmere afgrænset periode. Det er især velegnet til statistisk analyse. Den anden tilgang er baseret på den gennemsnitlige plot af euklidisk afstand fra kilden, lugt og er nyttig til at beskrive den tidsmæssige svar på duftstoffer. Begge typer af analyse er komplementære og genereret af de samme data. Fortolkning er binære og giver mulighed for karakteristiske dyr at forstand lugtstoffer fra dem, der ikke10.
Hvordan kunne de beskrevne metoder være nyttigt at Xenopus Fællesskabet? Selvom metoderne er hovedsagelig illustreret for wild-type dyr, bør det tages i betragtning, at genetiske muligheder kontinuerligt udvider i feltet Xenopus . Den kombinerede undersøgelse in vivo ORN svar og tilstedeværelsen af olfaktoriske-styrede adfærd kan også være meget nyttigt at undersøge den korrekte behandling af olfaktoriske oplysninger i Xenopus mutanter lavet enten frem eller omvendt genetiske skærme 11. de oplysninger, som calcium imaging og adfærdsmæssige analysen kan kombineres. For eksempel, en mutation, der selektivt påvirker granula celler i de olfaktoriske pære ville ikke ændre den præsynaptiske svar af ORNs men ville sandsynligvis svække olfaktoriske-styrede adfærd.
Metoder knytte cellulære og adfærdsmæssige reaktioner in vivo er særlig relevant for den genetiske dissektion af neuronal kredsløb. Fortolkning af resultaterne kan blive hjulpet af tidligere morfologiske værker, som har ydet en anatomisk kort over glomerulær lag i haletudser31. Oplysninger indhentet fra lugtekolben skiver af Xenopus haletudser32 er også meget værdifuldt. Calcium billeddannelse af mitral/tuftet celler i lugtekolben skiver har afsløret grundlæggende Karakteristik af olfaktoriske forarbejdning i Xenopus haletudser, som for eksempel følsomheden af ORNs til forskellige aminosyrer33 eller relevansen af svar ventetid i kodning af olfaktoriske information7. Hjernen skiver viser imidlertid en begrænset evne til at reproducere de komplekse integrative mekanismer knytte forskellige neuronal kredsløb som følge af skæring af talrige neuronal fremskrivninger. Også, en karakterisering af egenskaberne for individuelle glomerulær enheder er endnu undvigende med undtagelse af γ-glomerulus34. Spørgsmålet om, hvorvidt enkelt glomerulær enheder bestemme specifikke adfærd i haletudser vil kun besvares ved at kombinere genetiske værktøjer, i vivo billeddannelse tilgange og adfærdsmæssige assays.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra El Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO; SAF2015-63568-R) destruktionsbestemmelser af den europæiske fond for Regionaludvikling (EFRU), af konkurrencedygtige forskning priser fra M. G. F. Fuortes Memorial Fellowship, Stephen W. Kuffler Fellowship fond, Laura og Arthur Colwin begavet sommer Research Fellowship Fund , Fischbach stipendium, og den store Generation fond af den Marine biologiske laboratorium og den nationale Xenopus ressource RRID:SCR_013731 (Woods Hole, MA) hvor en del af dette arbejde blev udført. Vi takker også CERCA Program / Generalitat de Catalunya til institutionel støtte. A.L. er en Serra Húnter fyr.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Salts for aquariums (Instant Ocean Salt) | Tecniplast | XPSIO25R | |
| Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| Tweezers #5 (tip 0.025 x 0.005 mm) | World Precision Instruments | 501985 | |
| Vannas Scissors (tip 0.015 x 0.015) | World Precision Instruments | 501778 | |
| Whatman qualitative filter paper | Fisher Scientific | WH3030917 | |
| X. laevis tubb2-GFP | National Xenopus Resource (NXR), RRID:SCR_013731 | NXR_0.0035 | |
| X.tropicalis NBT-GFP | European Xenopus Resource Center (EXRC) RRID:SCR_007164 | ||
| CellTracker CM-DiI | ThermoFisher Scientific | C-7001 | |
| Calcium Green dextran, Potassium Salt, 10,000 MW, Anionic | ThermoFisher Scientific | C-3713 | |
| Borosilicate capillaries for microinjection | Sutter Instrument | B100-75-10 | O.D.=1.0 mm., I.D.=0.75 mm. |
| Puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Microinjector | Parker Instruments | Picospritzer III | |
| Sylgard-184 | Sigma-Aldrich | 761028-5EA | |
| Microfil micropipettes | World Precision Instruments | MF28G-5 | |
| Upright microscope | Zeiss | AxioImager-A1 | |
| Master-8 stimulator | A.M.P.I. | ||
| CCD Camera | Hamamatsu | Image EM | |
| Solenoid valves | Warner Instruments | VC-6 Six Channel system | |
| Dow Corning High Vacuum Grease | VWR Scientific | 636082B | |
| Tubocurarine hydrochloride | Sigma-Aldrich | T2379 | |
| CCD Camera | Zeiss | MRC-5 Camera | Controlled by Zen software |
| camera lens | Thorlabs | MVL8ML3 | There are multiple possibilities that should be adapted to the camera model used |
| Epoxy resin | RS Components | ||
| Manifold | Warner Instruments | MP-6 perfusion manifold | |
| Micromanipulator for local delivery of solutions | Narishige | MN-153 | |
| Mini magnetic clamps | Warner Instruments | MAG-7, MAG-6 | |
| Polyethylene tubing | Warner Instruments | 64-0755 | O.D.=1.57 mm., I.D.=1.14 mm. |
References
- Hellsten, U., et al. The genome of the Western clawed frog Xenopus tropicalis. Science. 328 (5978), 633-636 (2010).
- Session, A. M., et al. Genome evolution in the allotetraploid frog Xenopus laevis. Nature. 538 (7625), 336-343 (2016).
- Zhang, L. I., Tao, H. W., Holt, C. E., Harris, W. A., Poo, M. A critical window for cooperation and competition among developing retinotectal synapses. Nature. 395 (6697), 37-44 (1998).
- Li, J., Erisir, A., Cline, H. In vivo time-lapse imaging and serial section electron microscopy reveal developmental synaptic rearrangements. Neuron. 69 (2), 273-286 (2011).
- Dietrich, H., Glasauer, S., Straka, H. Functional Organization of Vestibulo-Ocular Responses in Abducens Motoneurons. Journal of Neuroscience. 37 (15), 4032-4045 (2017).
- Buhl, E., Roberts, A., Soffe, S. R. The role of a trigeminal sensory nucleus in the initiation of locomotion. Journal of Physiology. 590, Pt 10 2453-2469 (2012).
- Junek, S., Kludt, E., Wolf, F., Schild, D. Olfactory coding with patterns of response latencies. Neuron. 67 (5), 872-884 (2010).
- Stout, R. P., Graziadei, P. P. Influence of the olfactory placode on the development of the brain in Xenopus laevis (Daudin). I. Axonal growth and connections of the transplanted olfactory placode. Neuroscience. 5 (12), 2175-2186 (1980).
- Yoshino, J., Tochinai, S. Functional regeneration of the olfactory bulb requires reconnection to the olfactory nerve in Xenopus larvae. Development, Growth & Differentiation. 48 (1), 15-24 (2006).
- Terni, B., Pacciolla, P., Masanas, H., Gorostiza, P., Llobet, A. Tight temporal coupling between synaptic rewiring of olfactory glomeruli and the emergence of odor-guided behavior in Xenopus tadpoles. Journal of Comparative Neurology. 525 (17), 3769-3783 (2017).
- Goda, T., et al. Genetic screens for mutations affecting development of Xenopus tropicalis. PLOS Genetics. 2 (6), 91 (2006).
- Nakayama, T., et al. Simple and efficient CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in Xenopus tropicalis. Genesis. 51 (12), 835-843 (2013).
- Jafkins, A., Abu-Daya, A., Noble, A., Zimmerman, L. B., Guille, M. Husbandry of Xenopus tropicalis. Methods in Molecular Biology. 917, 17-31 (2012).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early Development of Xenopus laevis. A Laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal table of Xenopus laevis (Daudin). A systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , North-Holland Publishing Company. Amsterdam. (1956).
- Xu, H., Dude, C. M., Baker, C. V. Fine-grained fate maps for the ophthalmic and maxillomandibular trigeminal placodes in the chick embryo. Developmental Biology. 317 (1), 174-186 (2008).
- Friedrich, R. W., Korsching, S. I. Combinatorial and chemotopic odorant coding in the zebrafish olfactory bulb visualized by optical imaging. Neuron. 18 (5), 737-752 (1997).
- Ishibashi, S., Cliffe, R., Amaya, E. Highly efficient bi-allelic mutation rates using TALENs in Xenopus tropicalis. Biology Open. 1 (12), 1273-1276 (2012).
- Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).
- Nussbaum-Krammer, C. I., Neto, M. F., Brielmann, R. M., Pedersen, J. S., Morimoto, R. I. Investigating the spreading and toxicity of prion-like proteins using the metazoan model organism C. elegans. Journalof Visualized Experiments. (95), e52321 (2015).
- Koide, T., et al. Olfactory neural circuitry for attraction to amino acids revealed by transposon-mediated gene trap approach in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (24), 9884-9889 (2009).
- Love, N. R., et al. pTransgenesis: a cross-species, modular transgenesis resource. Development. 138 (24), 5451-5458 (2011).
- Tandon, P., Conlon, F., Furlow, J. D., Horb, M. E. Expanding the genetic toolkit in Xenopus: Approaches and opportunities for human disease modeling. Developmental Biology. 426 (2), 325-335 (2017).
- Pratt, K. G., Khakhalin, A. S. Modeling human neurodevelopmental disorders in the Xenopus tadpole: from mechanisms to therapeutic targets. Disease Models & Mechanisms. 6 (5), 1057-1065 (2013).
- Truszkowski, T. L., et al. Fragile X mental retardation protein knockdown in the developing Xenopus tadpole optic tectum results in enhanced feedforward inhibition and behavioral deficits. Neural Development. 11 (1), 14 (2016).
- Hassenklöver, T., Manzini, I. Olfactory wiring logic in amphibians challenges the basic assumptions of the unbranched axon concept. Journal of Neuroscience. 33 (44), 17247-17252 (2013).
- Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. Single-cell electroporation for gene transfer in vivo. Neuron. 29 (3), 583-591 (2001).
- Sild, M., Van Horn, M. R., Schohl, A., Jia, D., Ruthazer, E. S. Neural Activity-Dependent Regulation of Radial Glial Filopodial Motility Is Mediated by Glial cGMP-Dependent Protein Kinase 1 and Contributes to Synapse Maturation in the Developing Visual System. Journal of Neuroscience. 36 (19), 5279-5288 (2016).
- McDiarmid, R., Altig, R. Tadpoles: The biology of anuran larvae. , The University of Chicago Press. 149-169 (1999).
- Heerema, J. L., et al. Behavioral and molecular analyses of olfaction-mediated avoidance responses of Rana (Lithobates) catesbeiana tadpoles: Sensitivity to thyroid hormones, estrogen, and treated municipal wastewater effluent. Hormones and Behavior. 101, 85-93 (2018).
- Gaudin, A., Gascuel, J. 3D atlas describing the ontogenic evolution of the primary olfactory projections in the olfactory bulb of Xenopus laevis. Journal of Comparative Neurology. 489 (4), 403-424 (2005).
- Scheidweiler, U., Nezlin, L., Rabba, J., Müller, B., Schild, D. Slice culture of the olfactory bulb of Xenopus laevis tadpoles. Chemical Senses. 26 (4), 399-407 (2001).
- Manzini, I., Schild, D. Classes and narrowing selectivity of olfactory receptor neurons of Xenopus laevis tadpoles. Journal of General Physiology. 123 (2), 99-107 (2004).
- Kludt, E., Okom, C., Brinkmann, A., Schild, D. Integrating temperature with odor processing in the olfactory bulb. Journal of Neuroscience. 35 (20), 7892-7902 (2015).
