Summary
Xenopus rumpetroll tilbyr en unik plattform for å undersøke funksjon av det nervøse systemet i vivo. Vi beskriver metoder for å vurdere behandling av olfactory informasjon i levende Xenopus Larvene normale oppdrett forhold eller skade.
Abstract
Xenopus rumpetroll tilbyr en unik plattform for å undersøke funksjon av nervesystemet. De gir flere eksperimentelle fordeler, for eksempel tilgjengelighet til mange tenkelig tilnærminger, elektrofysiologiske teknikker og atferdsmessige analyser. Xenopus rumpetroll olfactory systemet er spesielt godt egnet til undersøke funksjonen i synapser etablert under normal utvikling eller reformert etter skader. Her beskriver vi metoder for å vurdere behandling av olfactory informasjon i levende Xenopus larver. Vi skissere en kombinasjon av i vivo målinger av presynaptic kalsium svar i glomeruli av olfactory pære med olfactory-guidede atferd analyser. Metoder kan kombineres med transection av olfactory nerver å studere rewiring av synaptic. Eksperimenter presenteres bruke både vill-type og genmodifiserte dyr uttrykke GFP journalister i sentralnervesystemet celler. Anvendelse av tilnærminger beskrevet å genmodifiserte rumpetroll kan være nyttig for unraveling molekylær baser som definerer virveldyr atferd.
Introduction
Xenopus rumpetroll utgjør en utmerket dyr modell for å studere normal funksjon av nervesystemet. Åpenhet, fullt sekvensert genomet1,2og tilgjengelighet til kirurgisk, elektrofysiologiske og imaging teknikker er unike egenskaper av Xenopus Larvene at undersøke neuronal funksjoner i vivo3 . Noen av flere eksperimentelle mulighetene av denne dyr modellen er illustrert av de grundige studiene utført i rumpetroll sensorisk og motor4,5,6. En spesielt velegnet neuronal krets å studere mange aspekter av informasjonsbehandling på nivå med synapser er Xenopus rumpetroll olfactory system7. For det første, dens synaptic connectivity er godt definert: olfactory reseptor neurons (ORNs) prosjektet til olfactory pære og synaptic kontakter med dendrites av mitral/tuftede celler i glomeruli å generere lukt kart. For det andre, sin ORNs er kontinuerlig generert av neurogenesis hele livet å opprettholde funksjonen av olfactory trasé8. For det tredje, fordi olfactory systemet viser en stor regenerativ evne, Xenopus rumpetroll er kjøpedyktig helt reformere sine Luktelappen etter ablasjon9.
I dette papir beskriver vi innfallsvinkler som kombinerer avbilding av olfactory glomeruli i levende rumpetroll med atferdsmessige eksperimenter å studere funksjonaliteten av olfactory. Metodene finnesher ble brukt til å studere den funksjonelle utvinningen av glomerular i olfactory pære etter olfactory nerve transection10. Data innhentet i Xenopus rumpetroll er representant for virveldyr siden olfactory behandling er evolusjonære bevart.
Metodene som er beskrevet er eksemplifisert ved hjelp av X. tropicalis , men de kan lett bli implementert i X. laevis. Til tross for større størrelsen på voksen X. laeviser både arter bemerkelsesverdig lik i rumpetroll fasen. Hovedforskjellen ligger på genomisk nivå. X. laevis viser dårlig genetisk tractability, avhengig av allotetraploid genomet og lang generasjonstid (ca 1 år). Derimot er X. tropicalis mer mottakelig for genetiske modifikasjoner pga kortere generasjonstid (5-8 måneder) og diploide genom. Representant eksperimenter er illustrert vill-type dyr og tre forskjellige transgene linjer: Hb9:GFP (X. tropicalis), NBT:GFP (X. tropicalis) og tubb2:GFP (X. laevis).
Metodikkene i arbeidet bør vurderes sammen med de genetiske utvikler i feltet Xenopus . Enkelhet og enkel implementering av teknikkene presentert gjør dem spesielt nyttig for å vurdere allerede beskrevet mutanter11, samt Xenopus linjer genereres av CRISPR-Cas9 teknologi12. Vi beskriver også kirurgisk prosedyre for å mudderbunn olfactory nerver som kan gjennomføres i et laboratorium har tilgang til Xenopus rumpetroll. Tilnærminger brukt for å evaluere presynaptic kalsium svar og olfactory-guidede problemet krever bestemt utstyr, enskjønt anvendelig til en moderat pris. Metoder er presentert i et enkelt skjema for å fremme deres bruk i forskningsgrupper og kan angi grunnlaget for mer kompliserte analyser ved å implementere forbedringer eller foreningen andre teknikker, i.e., histologiske eller genetiske tilnærminger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer ble godkjent av den Forsøksdyrutvalget etiske komiteen ved Universitetet i Barcelona.
Merk: X. tropicalis og X. laevis rumpetroll er reared i henhold til standard metoder13,14. Rumpetroll vann er utarbeidet ved å legge til kommersielle salter (se Tabell for materiale) vann ved omvendt osmose. Ledningsevne justeres til ∼700 µS og ∼1, 400 µS for X. tropicalis og X. laevis rumpetroll, henholdsvis. Larvene finnes naturlig mating eller in vitro fertilisering14. Embryo er dejellied med 2% L-cystein forberedt i 0,1 x Marc endret Ringers (MMR). 1 x MMR inneholder (i mM): 100 NaCl, 2 KCl, 1 MgSO4, 2 CaCl2, 5 HEPES, 0.1 EDTA, pH 7,8. Larver overføres etter 2-3 dager (scenen 25) til 2 L tanker med rumpetroll vann. Når rumpetroll når scenen 40 av Nieuwkoop-Faber (NF) vilkår15, de er plassert i 5 L tanker og opprettholdt på en tetthet av 10 dyr/L. temperaturen holdes konstant på 23-25 ° C og 18-20 ° C for X. tropicalis og X. laevis rumpetroll, henholdsvis. Dyr funnet på stadier 48-52 NF kriteriene brukes for eksperimenter.
1. transection av Olfactory nerver
- Forberede en anesthetizing løsning av 0.02% MS-222 i 50 mL rumpetroll vann ved romtemperatur.
- Forbered en liten tank (1-2 L) med rumpetroll vann som tillater gjenoppretting av dyr etter operasjonen.
- Kuttet rektangulære biter av cellulose kvalitativ filter papir (4 cm x 3 cm, se Tabellen for materiale).
- Våt 2 stykker av cellulose kvalitativ filter papir i 0.02% MS-222 løsningen og plassere dem under dissecting omfanget.
- Velg en rumpetroll fra tanken og dyppe den i anesthetizing løsningen. Dyret stopper svømming innen 2-4 min og reagerer ikke på mekanisk stimuli brukes på halen nivå ved hjelp av pinsett.
-
Plass de bedøvet rumpetroll på rektangulære stykker av filter papir. Plasser dyret med sin dorsal vendt oppover, slik at hjernen strukturer kan visualiseres.
- Bruke vannas saks (se Tabell for materiale) kuttet en eller begge olfactory nerver (avhengig av analysen utføres). Mudderbunn en enkelt nerve for eksperimenter som krever en intern kontroll av nerve skade.
- I atferdsmessige eksperimenter, mudderbunn både nerver for å undertrykke all odorant informasjon kommer til olfactory pære. Effektiviteten av skjæring av olfactory nerver kan lett observeres under dissecting omfanget; men kan pigmentering eller dyr være Begrensende faktorer.
Merk: (Valgfritt) Den beste måten å bekrefte gyldigheten av prosedyren bruker transgene rumpetroll som uttrykker fluorescerende journalister på deres nervesystemet (se representant resultater). Til dette målet er det nødvendig å bruke en disseksjon omfang utstyrt med fluorescens (figur 1). Hvis bare vill-type dyr er tilgjengelig, kan sporing med CM-diI anvendes. Følg protokollen 2 (se nedenfor) for å injisere en 0,5 mg/mL løsning av CM-diI i 0,3 M sukrose i nasal kapselen. Se 16 for informasjon om forberedelse og lagring av CM-diI. Lekkasje av fargestoff utenfor viktigste hulrommet må være minimere. Til dette målet er det nødvendig å endre trykket av injeksjon og åpningen av Mikropipetter. Fluorescens på nivå med glomerular laget av olfactory pære blir tydelig 24 timer etter CM-diI. Dette arbeidet bruker merking med CM-diI bare for å sertifisere transection prosedyren; Denne metoden kan imidlertid også brukes til å få morfologiske informasjon av olfactory glomeruli bruke konvensjonelle histologiske prosedyrer.
- Overføre dyr til utvinning tanken. Rumpetroll skal gjenopprette normale svømming i ~ 10 min. utføre en forsiktig inspeksjon for tilstedeværelsen av blødninger, som forventes i ~ 1% av dyr utsatt for kirurgi.
- Euthanize skadde dyr i en 0,2% MS-222 løsning.
2. merking av Olfactory reseptor Neurons med fluorescerende kalsium indikatorer
- Forberede en løsning som inneholder 12% kalsium Green-1-dekstran (se Tabell for materiale), 0,1% Triton X-100 og 1 mM NaCl17. Lagre løsningen ved 20 ° C eller-80 ° C hvis den ikke skal brukes i en måned.
- Forberede glass Pipetter med tips åpninger ~ 1 – 2 µm (lignende diameter til microelectrodes brukes for oppdateringen-klemme eksperimenter) microinjection bruker en brønnene avtrekker (se Tabell for materiale).
- Kalibrere volumet av microinjections. Med destillert vann, justere trykket og injeksjon for å få injeksjon mengder 0,15-0,3 µL.
Merk: En enkel prosedyre består i å telle antall pulser må tømme en pipette fylt med 1 µL av vann. Typisk er en av 30 psi og 50 ms injeksjon tidspress. - Plasser en pipette i microinjector og laste den med ~ 2 µL av kalsium grønn-1 dekstran løsning.
- Forberede en rumpetroll følgende 1.1 til 1.6.
- Flytte tuppen av pipette inn i viktigste hulrommet i nasal kapselen.
Merk: Se figur 2A beskriver plasseringen av olfactory stier i en Xenopus rumpetroll. - Bruker innstillinger som er innhentet i 2.3, levere et par puffs. Begrense fargestoff tilstedeværelse til nasal kapselen.
- La i rumpetroll hvile i 2-3 min. bruker en Pasteur pipette, hell dråper 0.02% MS-222 løsning på mer caudal deler av dyr å unngå tørking.
- Overføre dyret til utvinning tanken.
Merk: Det skal gjenopprette normale svømming i ~ 10 min. manipulering av dyr kan forårsake skader. - Euthanize rumpetroll som ikke gjenopprette normale svømming atferd 15 min etter injeksjon bruker en 0,2% MS-222 løsning.
- Observere fluorescens på nivå med glomerular laget av olfactory pære på dagen etter injeksjon.
3. forberedelse i rumpetroll til Live bildebehandling av Presynaptic svar
- 24 – 48 h før gjennomføre eksperimentet coat 4-6 Petri retter av 35 mm diameter med silikon-elastomer (f.eks Sylgard). Når elastomer har polymerized, dikte et rektangulært godt passer i rumpetroll.
Merk: Typisk dimensjoner for X. tropicalis rumpetroll på NF stadier 48-52 er 10 x 4 mm. - Forberede 100 mL en 160 µM 1 mM aminosyre løsningen fungerer som en odorant stimulans for rumpetroll. Løsningen kan inneholde en blanding av flere aminosyrer: metionin, leucine, histidin, arginin og lysin. Fortynne aminosyrer i Xenopus Ringer i løsningen består av (i mM): 100 NaCl, 2 KCl, 1 CaCl2, 2 MgCl2, 10 glukose, 10 HEPES, 240 mOsm/kg, pH 7,8. Kontroller at pH er opprettholdt på 7,8.
- Fyll en forhøyet reservoaret med 20 mL av aminosyre løsningen. Koble reservoaret polyetylen rør til en 28 G kapillær tube (se Tabell for materiale) plassert over nasal kapselen.
Merk: Kapillarrør er montert på en micromanipulator (se Tabell for materiale). Luftbobler må være borte fra perfusjon systemet. - Oppnå verdslige presisjon i bruk aminosyre løsningen transistor-transistor logikk (TTL) kontrollen av solenoid knipe ventiler (se Tabell for materiale). En stimulator brukes til å generere TTL pulser (se Tabell for materiale). Når timelige presisjon for å levere odorant løsningen ved å endre varigheten av TTL pulser, i.e., 0,1 til 1 s.
- Fyll en forhøyet reservoaret med 100 mL Xenopus Ringer.
- Bedøve en rumpetroll og plasser den innenfor dissecting (trinn 1.1 til 1.6).
- Forberede en rumpetroll bildebehandling. Hvis albino rumpetroll videre til trinn 3.9, ellers fjerne huden over olfactory pære fordi den inneholder melanocytter som svekke imaging (trinn 3.8).
Merk: Det er to måter å utføre eksperimentet avhengig av pigmentering av dyret. Det anbefales å bruke albino dyr. Albino stammer er tilgjengelig for X. laevis og albino X. tropicalis linjer har nylig blitt generert av CRISPR-Cas9 12 eller TALENs18. - Bruke vannas saks, lage en lateral snitt i rumpetroll huden på kanten av det sentrale nervesystemet. Gjør kuttet bør gjøres på olfactory pære og aldri nådde posisjonen til tectum, som kan lett identifiseres ved plasseringen av synsnerven.
- Knip kutt huden ved hjelp av pinsett og dra den over nervesystemet. Kontroller vellykket fjerning av fraværet av melanocytter over olfactory pære. Holde dyr fuktig av helle dråper 0.02% MS-222 løsning ved hjelp av en Pasteur pipette.
- Plasser i rumpetroll i av belagt parabolen (se Tabell for materiale). Sett et glass dekkglassvæske belagt med høy vakuum fett over dyret. Plasser dekkglassvæske for å dekke toppen av tectum til slutten av halen.
- Sikre at Luktelappen og placodes fortsatt utsatt for den ekstracellulære mediet. Holde i rumpetroll immobile under bildebehandling. Fylle Petriskål med Xenopus Ringer i solutioncontaining 100 µM tubocurarin (se Tabell of Materials) til å forhindre muskelsammentrekninger.
Merk: Tubocurarin lagres i dele ved-80 ° C ikke lenger enn 6 måneder. - Plass rett holder i rumpetroll under en oppreist mikroskop. Koble reservoaret inneholder Xenopus Ringer i løsning med parabolen bruker polyetylen rør (se Tabell for materiale) for kontinuerlig perfusjon Xenopus Ringer i løsning for å holde dyr i live > 1t.
Merk: Mini magnetiske klemmer (se Tabell for materiale) er svært nyttig stabilt koble slangen til parabolen. Perfusjon og sugekraft rør må være plassert i ~ 180° vinkel. - Starte perfusing Xenopus Ringer i løsningen. Opprettholde løsningen i parabolen konstant gjennom hele eksperimentet. Kontinuerlig evaluere rumpetroll levedyktighet ved å observere blodkretsløp gjennom blodårene.
4. bor Imaging Presynaptic Ca2 + endringer i Olfactory Glomeruli
Merk: Tenkelig prosedyren er beskrevet for wide-field mikroskopi, men kan enkelt tilpasses til AC confocal mikroskop ved å justere innstillingen oppkjøpet. Imaging skal utføres i en oppreist mikroskop montert på en anti-vibrasjon tabell.
- Visualisere i rumpetroll med et lavt forstørrelse mål, for eksempel 5 x.
- Flytte micromanipulator aksene plassere av kapillær levere odorant løsningen på en nasal kapsel danner en 90-graders vinkel med på olfactory nerve. Flyten av odorant løsning over olfactory pære bør unngås fordi den kan føre turbulens som forvrenger bildebehandling.
- Finn olfactory pære ligger ipsilaterally nasal kapselen (avhengig stimulering) bruker en høy forstørrelse, lenge arbeidsavstand, vann nedsenking målet: 60Xx, 0,9 N.A.
- Sjekk fluorescens utslipp av øyet. Glomerular strukturer skal åpenbare (figur 2B).
- Utføre live oppkjøp med et kamera som er egnet for kalsium bildebehandling. Definere en boks som inneholder hele olfactory pære, vanligvis på 256 x 256 eller 512 x 512 piksler. Sett oppkjøpet rammen rate oppkjøpet til 20-40 Hz. Juster gevinst, slik at verdiene i basale fluorescens er ~ 20% av metning. Kjøpe en 5 s-video.
- Visualisere filmen. Sjekk bilde fokus, fravær av bevegelsen gjenstander og regioner som inneholder mettet piksler. Typisk fluorescens verdiene i glomerular områder bør være 5000-20.000 a.u. Hvis bruker et 16-biters kamera. Gå videre til neste trinn hvis tenkelig forholdene optimale. Gjenta trinn 4.6 hvis nødvendig for å forbedre bildekvaliteten eller justere innstillingene for gevinst.
- Starte en time-lapse oppkjøpet å registrere svar fremkalt av olfactory stimuli.
Merk: Nøyaktig anvendelse av den odorant løsningen er kontrollert av TTL stimuli. En typisk eksperiment inneholder en planlagt periode av 4 s, etterfulgt av stimulering ganger varierer fra 0,1 til 0,5 s og en restitusjonsperiode 6 – 10 s. - Utfør repeterende stimulations av odorants for tidsintervaller > 2 min. satt infusjonshastigheten til 1-1,5 mL·min-1. Siden den globale perfusjonen er på under alle eksperimenter, vasket lokalt anvendt aminosyrer ut.
Merk: Volumet av løsningen i parabolen er ~ 3 mL. -
Bildeanalyser
- Påvisning av svar
- Eksportere filmer til ImageJ.
Merk: Målet er å oppdage tilstedeværelsen av glomerular regioner svarer på stimuli. - Transformere den rå rekken fluorescens bilder til en ΔF/F0 film. Måler relative endringer i basale fluorescens etter følgende forhold: (F-F0) /F0, der F0 angir opprinnelige fluorescens nivåer.
- Tegne regioner av interesse (ROI) rundt områder viser antatte fluorescens øker stimulering og ta sin posisjon i Avkastningen manager (figur 2E). Tegne en avkastning for å finne bakgrunnen fluorescens nivåer i et område uten glomerular strukturer.
- Eksportere filmer til ImageJ.
- Kvantifisering av svar.
- Plass de definerte ROIs i rå sekvensen av fluorescens bilder. Få grå middelverdien av valgte ROIs for hver ramme. Overføre sekvensen av verdier hentet en analyse program (f.eks., Igor Pro).
- Trekke fra bakgrunnen fluorescens, og deretter beregne ΔF/F0 endringer for hver avkastning (figur 2F). Tegne økningen i ΔF/F0 for hver av ROIs valgt. Beregne standardavviket basale ΔF/F0 (før stimulering).
Merk: En positiv respons regnes om økninger i ΔF/F0 fikk under stimulering er større enn 2 standardavvik av basale verdier.
- Påvisning av svar
5. olfactory-guidede atferd analysen
Merk: En skjematisk diagram for for å utføre analysen er vist i Figur 3.
- Gjøre små hull å passe 1,57 mm OD x 1.14 mm ID rør i den øvre delen av hver brønn av en 6-vel rett. Sett slangen og forsegle med epoxy lim (se Tabell for materiale).
Merk: Modifisert parabolen kan brukes på nytt mange ganger etter grundig vask med destillert vann. - Forberede 50 mL av en aminosyre løsning som inneholder metionin, leucine, histidin, arginin og lysin (se trinn 3.2 for detaljer). Konsentrasjonen kan variere fra 160 µM til 1 mM. Plass 20 mL løsningen i en opphøyet reservoaret.
- Ikke mat rumpetroll minst 12 h før analysen. Ta 6 tadpoles fra deres bolig tank og plassere dem i 2 L ren rumpetroll vann å minimere eksponering odorants.
- Plass endret 6 brønner rett på en hvit LED-transilluminator (Figur 3).
- Par perfusjon viker til reservoaret inneholder aminosyren løsningen bruker en manifold (se Tabell for materiale). Sjekk perfusjon systemet og fjerne luftbobler. Fyll 6 brønnene samtidig. Juster høyden på reservoaret for å tillate ≥5 mL odorant løsning innen ~ 30 s.
Merk: Vask godt 4 ganger med dobbel destillert vann etter eksponering for det odorant løsningen. - Fyll hver med 10 mL rumpetroll vann. Sted 1 rumpetroll/vel. La hvile for > 3 min.
- Definere bildeopptak. Bruk et vanlig CCD kamera som kan hente bilder på ≥5 Hz. koble kameraet til en datamaskin. Her, bruk en Zeiss MRC5 kameraet styres av Zen programvare men andre tilsvarende konfigurasjoner kan brukes. Hvis det er nødvendig å øke Rammehastigheten, bruke piksel binning. Bilder skal vise hele 6-vel parabolen.
- Starte bildeopptak slik at filmene inneholder basale (30 s), stimulans (25-35 s) og gjenopprettingsperioder (30-60 s).
- Returnere dyr fra 6 brønner retten til tanker etter bildebehandling.
- Analysere filmer i ImageJ bruker plugins som wrMTrck19,20 som gir flere parametere knyttet til motilitet.
- For å forberede bilder for analyse, må du først velge et godt ved å tegne en rektangulær avkastning av 35 mm x 35 mm (Figur 4A). Få et bakgrunnsbilde ved å beregne maksimal projeksjon av hele sekvensen. Den skal vise et bilde av brønnen uten i rumpetroll.
- Trekk maksimal projeksjon fra rå filmen. Utføre terskelverdi på genererte 32-biters filmen og bruke wrMTrck plugg. Justere WrMTrck parametere for å spore pålitelig dyr bevegelser. Overføre innhentet X, Y-koordinater i en analyseprogram.
- Ved hjelp av X-og Y-koordinater, beregne euklidsk avstanden til odorant kilden (perfusjon innløp brønnen), ved hjelp av følgende ligning:
der os angir plassering av lukt og tad angir rumpetroll plassering på et gitt tidspunkt. Se Figur 4A for detaljer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I dette papiret, vi presentere en kombinasjon av komplementære metodene å utføre i vivo studie av funksjonaliteten i Xenopus rumpetroll olfactory systemet: jeg) metode for imaging presynaptic Ca2 + endringer i glomeruli å leve rumpetroll bruke fluorescerende kalsium indikator, og ii) guidet en lukt atferdsdata analyse som kan brukes til å undersøke respons til bestemte vannbaserte odorants. Siden disse metodene har vært ansatt å vurdere utvinning av olfactory behandling etter skade10, er også en enkel metode for transecting olfactory nerver beskrevet.
Transection av olfactory i Xenopus rumpetroll
Det er to måter å bekrefte gyldigheten av prosedyren. Begge stole på visualisering av olfactory nerver bruke fluorescerende journalister. En metode er basert på transgene rumpetroll som uttrykker fluorescerende proteiner i deres nervesystemet. To anbefalte linjer som uttrykker GFP under en neuronal β-tubulin promoter er X. laevis tubb2b-GFP og X. tropicalis NBT-GFP (figur 1, se Tabellen for materiale). Hvis bare vill-type dyr er tilgjengelig, CM-diI kan brukes (se trinn 1.8). Figur 1 viser bilder av tubb2-GFP X. laevis rumpetroll. Bilder er fra fire forskjellige dyr der en enkelt olfactory nerve var transected. Kuttet skal åpenbare innenfor disseksjon. Fordelen med å bruke transgene linjer er at reformasjon av olfactory nerve kan følges over en tidsperiode. Når du gjør sekvensiell observasjoner, anbefales det å minimere eksponering for lysstoffrør å hindre photodamage. Inndeling av en enkelt olfactory nerve er nyttig når en intern kontroll er nødvendig, som for eksempel sammenligne normalt utviklet vs rewired glomerular enheter. Snitting av både olfactory nerver bør brukes når målet er fullstendig undertrykke overføring av informasjon.
Live bildebehandling presynaptic svar på olfactory stimuli
Riktig merking av ORNs med kalsium grønn-1 dekstran kan observeres på nivået av olfactory pære (figur 2A) med widefield mikroskopi. Glomeruli er åpenbart (figur 2B) og skal vises i forskjellige lag ved å flytte fokus flyet. Morfologi av glomerular strukturer kan løses bedre hvis AC confocal mikroskop brukes i stedet (figur 2C). Antall merket glomeruli avhenger av fargestoff opptak på nivået av olfactory epitel. Denne prosedyren kan derfor ikke visualisering av alle glomerular enheter. Dyr viser en mer intens fluorescens flekker i glomerular regionen skal velges før du utfører tenkelig eksperimenter, siden de inneholde flere ORNs merket. Denne manøveren anbefales for å øke eksperimentelle gjennomstrømming og bør utføres under en dissecting omfang utstyrt med fluorescens lampe. Avvise dyr som viser ikke merket glomerular enheter eller som viser fluorescens begrenset til bestemte områder av glomerular laget. Presynaptic Ca2 + svar kan observeres så snart 1 dag etter fargestoff lasting. For å gjennomføre imaging eksperimenter er det ønskelig å bruke mål av høy numeriske blenderåpning, vanligvis ≥0.9.
Øker presynaptic kalsium nivåer kan være fremkalt utsette dendrittiske knotter av ORNs til aminosyrer. Det er viktig å plassere av kapillær levere odorant løsningen over nasal kapselen. Forsiktighet bør utvises å unngå kontakt fordi det kan tette spissen av av kapillær og/eller føre til mekanisk stimulering av ORNs. Forbigående økninger i presynaptic kalsium nivåer kan være observert for stimuli ≥0.1 s (figur 2D) og er tegn på en riktig olfactory signaltransduksjon. Det er også viktig å visualisere basale kalsium nivåer med lav kameraet gevinst. Presynaptic terminalene på ORNs høy fluorescerende øker og det er viktig å unngå signal metning. Timelige høyoppløselig kan oppnås med widefield mikroskopi. For eksempel er bruker et elektron-multiplisert CCD kamera, det mulig å oppnå bildefrekvens på 50 Hz eller høyere. Bruk av AC confocal mikroskopi reduserer midlertidig løsning, men gir en bedre definisjon av glomerular strukturer.
Høy affinitet av kalsium grønne for innbinding kalsium (190 nM) er spesielt nyttig å oppdage små svar. Forbigående intracellulær kalsium øker oppdaget i glomerular laget er variabel. Noen glomerular regioner viser endringer i ΔF/F0 ≥0.2, mens nærliggende prosesser ikke kan engang svare (figur 2D). Følgende faktorer bidrar til variasjon av responsen på glomerular enheter: i) det totale antallet merket glomeruli, ii) intracellulær konsentrasjonen av kalsium grønne og iii) selektivitet av ORNs å oppdage aminosyrer. Siden et lavt antall merket glomeruli kan utelukke observere svar, er det helt nødvendig å gjennomføre disse eksperimentene med dyr som inneholder så mange merket ORNs som mulig.
Olfactory-guidede atferd
Dataanalyse
Olfactory-guidede atferd er studert med en spesialbygd system. Figur 3 viser en skjematisk tegning av utstyr som brukes til å utføre analysen. Testen er basert i rumpetroll evnen til å oppdage tilstedeværelsen av aminosyrer, som fungerer som odorants. En løsning som kombinerer fem ulike aminosyrer (metionin, leucine, histidin, arginin og lysin) brukes til stimulering. Løsningen leveres lokalt under 30 å 35 mm vel som inneholder et frittlevende rumpetroll. Den umiddelbare svaret i rumpetroll innkommende løsningen er en økning i motilitet. Tilfeldige bevegelser skjer under den første ∼5-10 s løsning programmet følges av en direkte svømme mot kilden til odorants. Rumpetroll forbli i flere sekunder i munnstykket under levering av aminosyrer, og gjenopprette gradvis motilitet i tilfeldige retninger (se utfyllende videoer 1, 2).
Eksperimentelle forhold beskrevet tillater vanlig svømme av X. tropicalis rumpetroll stadier 48-52; Det må imidlertid tas i betraktning at motilitet i større dyr kan være begrenset i 35 mm brønner. Rumpetroll bevegelser blir registrert med CCD kamera. Attraksjon for det odorant kan registreres som en reduksjon av euklidsk avstanden skille perfusjon vik fra rumpetroll posisjon (Figur 4). Sporing av rumpetroll hodet posisjoner innen et område av 35 x 35 mm (eller tilsvarende størrelsen i piksler) kan få en kvantitativ analyse av olfactory-guidede atferd (Figur 4A). Individuelle tomter i rumpetroll bevegelser er konstruert ved hjelp av X-og Y-koordinater ved bildeanalyser (Figur 4B). Utdraget motilitet tomter må gjengi bilder.
Det finnes to mulige metoder tolke olfactory-guidede atferd eksperimenter. Første tilnærmingen er inspirert på en tidligere studie med zebrafishes21. Måling av tid brukt i munnstykket levere odorants bevis tilstedeværelsen av en positiv tropism. Et område av interesse av 8.75 mm radius (tilsvarende lag ¼ av godt diameter) sentrert rundt løsning innløp brukes til å klassifisere dyrene nærhet til odorant kilde (figur 4A, 4 C). Binning tiden som brukes av tadpoles i munnstykket i definerte perioder, dvs. 15 s intervaller, kan identifisere muligheten til å oppdage aminosyre løsninger (Figur 4D). Den generelle situasjonen i rumpetroll innbyggere kan fås ved å plotte fordelingen av personlige data (figur 5et). En positiv tropism kan oppdages når løsningen av metionin, leucine, histidin, arginin og lysin er forberedt enten på 1 mM eller 160 μM (figur 5A og 5B). Dyr svarer ikke til vann program (figur 5C), dermed forkaster deltakelse av mechanosensitive mekanismer. Forskjeller mellom tid intervaller som er definert i hver forsøksgruppen kan etableres ved hjelp av parametriske gjentatte measures VARIANSANALYSE med Dunns flere sammenligninger test. Ulempen med binning data i tidsintervaller på 15 s er en redusert midlertidig løsning.
En måte å øke timelige informasjon for de atferdsmessige respons er å gjennomsnittlig tomter euklidsk avstander fra lukt kilde. Selv om rumpetroll bevegelser viser en iboende variasjon, viser gjennomsnittlig motilitet i en populasjon av dyr (vanligvis ≥40) olfactory-guidede virkemåten. For å utføre denne analysen er det nødvendig å gruppe dyr stillinger før utbruddet av stimulering. Siden rumpetroll finnes på forskjellige steder når den odorant løsningen kommer inn i brønnen er det nødvendig å sette euklidsk avstanden til 0 like før stimulering (figur 6A, se også inklusjonskriterier i figur 7). Negative og positive verdier derfor angi en tiltrekning eller frastøting fra lukt kilde, henholdsvis. En attraksjon for lukt er godt beskrevet av en lineær passform med regresjon koeffisienter ≥0.9. Hvis vannet er levert, bevegelser euklidsk avstand er fordelt rundt 0 og det er ikke mulig å tilpasse en linje under odorant stimulering, noe som indikerer at en olfactory-guidede atferd (figur 6B). Sammenligning av gjennomsnittlig tomter euklidsk avstander aminosyre løsninger forberedt på 1 mM og 160 µM foreslår ulike forsinkelser i olfactory-guidede svaret (sammenlign figur 6A og C). Tidsintervallet må starte bevegelse mot kilden til odorants er kortere når aminosyrer brukes på en høyere konsentrasjon. Mangel på olfactory-guidede atferd er observert i rumpetroll med både olfactory nerver transected (figur 6D).
En begrensning av beskrevet olfactory-guidede atferdsmessige analysen er etablering av komplekse væske fjær. Dette kan sees hvis aminosyre løsningen er erstattet av en farge, som raskt grønn, når systemet. Bruk av farget løsninger bekrefter dannelsen av fjær og viser at vannfortynnbare odorants nå en del av brønnen i 5 s. turbulens forårsaket av levering av løsningen er trolig oppdaget av sidelinjen i rumpetroll og sannsynligvis bidra til variasjon observert i dyr motilitet men forstyrrer ikke olfactory guidede atferd. Kontroll eksperimenter utført av bruk av vann istedenfor aminosyre løsninger viser at rumpetroll er i stand til å diskriminere olfactory fra mekanisk stimuli. Estimering av tiden i en region av interesse (figur 5) og gjennomsnittlig handlingen i euklidsk avstander (figur 6) er to utfyllende metoder å beskrive olfactory-guidede responsen i rumpetroll.
Inklusjonskriterier
Inklusjonskriterier må også tas hensyn for dataanalyse. Noen rumpetroll viser en resonant bevegelse, noe som illustreres av montering av handlingen i euklidsk avstander til en sinusformet funksjon (figur 7et). Rumpetroll viser dette må slettes fra alle analyse.
Utelukkelse av dyr som ved utbruddet av odorant løsninger på maksimalt (> 30 mm figur 7B) eller en euklidsk minsteavstand (< 5 mm, figur 7C) fra munnstykket kan redusere variasjon de gjennomsnittlige tomter. Eksemplet i figur 7B viser en positiv tropism aminosyre løsning. I rumpetroll ligger ved maksimal avstand på løsning vik ved utbruddet av stimulering. Derfor kan denne relative posisjonen bare avsløre en attraksjon for lukt kilde. Figur 7 Viser motsatte situasjonen. Her ligger en rumpetroll i munnstykket levere aminosyre løsningen. Kvantifisering av tidsbruk nær lukt kilden viser et svar (metoden brukes i figur 5). Det kan imidlertid vise en netto bevegelse mot mengden.
Oppsummert definerer foreslåtte analysen av olfactory-guidede atferd en binær test. Denne metoden kan brukes til å oppdage en forsøksgruppen i rumpetroll evnen til å svare på odorants. Ytterligere forbedringer kreves hvis målet er etablering forskjeller komplekse olfactory-guidede svar, som for eksempel bestemmer innstillinger for gitt lukt.
Figur 1: Transection av olfactory nerver. Representant bilder av tubb2-GFP X. laevis rumpetroll innhentet etter transection av en enkelt olfactory nerve (piler). Nerver av tubb2-GFP rumpetroll viser sterk fluorescens. Nerve transection er åpenbart umiddelbart etter kirurgi (D0). Gjenvekst av olfactory nerve er tydelig 4 dager etter kutt (D4). Åtte dager etter operasjonen (D8) det er liten forskjell mellom kontrollen og reformert nerver. Rumpetroll var anesthetized 0,02% MS-222 å samle bildene. Luktelappen (O.B.), olfactory nerve (O.N.), nasal kapsel (N.C.), tectum (Tec), synsnerven (Op.N.). Pilene angir plasseringen av transected nerve. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Merking av olfactory reseptor neurons med kalsium grønne dekstran og visualisering av presynaptic kalsium tilstrømningen ved stimulering med aminosyrer. (A) overførte lys bilde av en rumpetroll viser plasseringen av olfactory epitel, olfactory nerver og glomerular laget av olfactory pære. (B) bilde av en olfactory pære visualisert ved widefield (wf) mikroskopi. Neurons var benevnt ved kalsium grønn-1 dekstran på nese kapselen. Fluorescens observert tilsvarer presynaptic terminaler fra olfactory reseptor neurons danner glomeruli. O.N: olfactory nerve; O.B: Luktelappen. (C) AC Confocal delen ligger ytterst fra oppføringen av olfactory nerve pære. Presynaptic komponenten av olfactory glomeruli var merket med kalsium grønn-1 dekstran, som B). (D) Presynaptic terminaler øke transiently deres kalsium nivåer ved eksponering av olfactory epitel til en løsning som inneholder fem ulike aminosyrer. Relativ endringer i kalsium fluorescens innhentet før, under og etter 1 s stimulering. (E) distribusjon av 10 forskjellige områder av interesse (ROIs) brukt om å kvantifisere ΔF/F0 endringer. ROI11 er utenfor det glomerular laget og brukes til å definere bakgrunn nivåer av fluorescens. (F) personlige ΔF/F0 svar for ROIs definert i E). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Olfactory-guidede atferd analysen. (A) skjematisk diagram viser utstyret brukes i testen. (B) eksempel på motilitet spor spilt inn over 90 s. Hver sirkel representerer en godt inneholder en enkelt dyr. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Sporing av olfactory-guidede. (A) eksempel viser en brønn som brukes for atferdsdata analysen. Blå purpurprikkete linjen indikerer plasseringen av X, Y-koordinater (i mm) brukes til å spore rumpetroll bevegelser (se også utfyllende Video 1). Grønne ellipsen representerer plasseringen inntakets løsning. Den prikkete svart linjen angir proksimale området til røret leverer aminosyre løsningen (se tekst for detaljer). (B) motilitet i rumpetroll vises i A) under atferdsmessige analysen. Fargekodede spor angir posisjonen til dyret før (grå) og etter olfactory stimulering (fiolett). Bevegelser under påføring av odorant løsningen er illustrert i en timelig fargegradering (30 s, rød til blå). (C) ved hjelp av X, Y rumpetroll posisjoner er det mulig å beregne endringer i euklidsk avstanden fra rumpetroll hodet i perfusjon innløpet. Avstander kortere enn 8.75 mm tilsvarer den proksimale delen av munnstykket. (D) plott av tiden som brukes av tadpoles i regionen definert av den stiplede linjen i A). Hvert punkt angir en 15 s periode. Dyret er tiltrukket av den odorant løsningen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 : Rumpetroll tiltrekkes av aminosyrer. (A) tid brukt av tadpoles i lukt kilde. Hver hylle består av en 15 s periode. Boksen plott representerer medianen (svart vannrett linje), 25 til 75% kvartiler (bokser), og dataområder (værhår). Levering av en 1 mM aminosyre løsning tiltrukket rumpetroll til lukt kilde. (B) rumpetroll ble tiltrukket av den odorant løsningen når konsentrasjonen av aminosyrer ble redusert til 160 μM. (C) levering av vann endret ikke dyr oppførsel. Gjentatte measures VARIANSANALYSE med Dunn er flere sammenligninger test, p < 0,05. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6 : Timelige svar i rumpetroll odorants. (A) plott av gjennomsnittlig euklidsk avstand til lukt kilde som en funksjon av tid. Euklidsk avstanden ble satt til 0 før stimulering i hvert enkelt spor. Negative og positive verdier angir en nedgang og en økning i avstand til lukt kilden, henholdsvis. Attraksjon til lukt kilde kan beskrives ved en lineær plass (r2= 0.98). (B) levering av vann endrer ikke avstanden til lukt kilde. (C) rumpetroll svare på anvendelse av en 160 μM løsning av aminosyrer som åpenbart av en lineær plass (r2= 0.96). (D) rumpetroll med både olfactory nerver transected svarer ikke til aminosyrer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7 : Inklusjonskriterier for olfactory-guidede atferd analysen. (A) noen rumpetroll viser et klangfulle bevegelse. Dette er åpenbart av vellykket tilpasning av en sinusformet funksjon handlingen i euklidsk avstanden til lukt kilde. Rumpetroll vise denne aktiviteten bør utelukkes fra testen. (B, C) En måte å redusere variasjonen i gjennomsnittlige timelig svaret til odorants (figur 6) er ved å ekskludere dyr på maksimalt (B) eller en (C) euklidsk minsteavstand ved utbruddet av stimulering. Røde prikkede linjer angir terskelverdien (30 mm og 5 mm). Euklidsk avstanden før utbruddet av stimulering (pil, forlot tomter) er satt til "0" rapporten verdier attraktiv eller frastøtende atferd som negative eller positive (høyre tomter), henholdsvis. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Supplerende Video 1: Olfactory-guidede atferd utløst av levering av en aminosyre løsning. Filmen viser en rumpetroll fritt svømming på 35 mm godt. Blå ellipsen angir plasseringen av dysen levere odorant løsning. Starten og slutten av stimulering er angitt med grønne og røde prikker, henholdsvis. Figur 4 viser analyse av virkemåten observert. Vennligst klikk her å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Supplerende Video 2: rumpetroll motilitet under levering vann. Filmen viser en rumpetroll fritt svømming på 35 mm godt. Blå ellipsen angir plasseringen av dysen slippe MQ vann. Starten og slutten av vann levering er angitt med grønne og røde prikker, henholdsvis. Vennligst klikk her å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette dokumentet beskriver teknikker som er nyttig å undersøke funksjonaliteten av olfactory i levende Xenopus rumpetroll. Gjeldende protokollen er spesielt nyttig for de laboratoriene som fungerer, eller har tilgang til Xenopus; men er det også interessant for de forskerne studere cellulære og molekylære baser av neuronal regenerering og reparasjon. Resultatene i Xenopus kan kombineres med data samlet i andre virveldyr modeller å identifisere bevarte mekanismer. Metodene beskrevet nytte utviklingen av genmodifiserte Xenopus18,22,23 og gjelder for eksperimentelle modeller av nervesystemet sykdommer i rumpetroll24, 25.
For å få reproduserbar i vivo data, er det viktig å riktig bak Xenopus rumpetroll. Spesielt er X.tropicalis svært følsom for dårlig boforhold. For eksempel de tolererer ikke temperaturer under 20 ° C og bør holdes i tanker eller vann systemer mellom 24 til 28 ° C. Det er også viktig å ikke øke dyr tetthet over etablerte grenser, regelmessig feed tadpoles og holde en optimal vann kvalitet13. Behandling av dyr kolonier følge standardiserte forholdene er helt nødvendig for å få reproduserbarhet i vivo eksperimenter.
Metoden beskrevet av kalsium imaging er nyttig å oppdage et riktig olfactory Albin på ORNs i vivo. Lasting av ORNs med kalsium grønn-1 dekstran oppnås ved forbigående permeabilization av plasma membranen bruker en lav konsentrasjon av Triton X-100, som tidligere rapporterte17. Den største fordelen med denne lasting metoden er enkelhet, fordi den krever bare en microinjector. En ulempen er at Triton X-100 forårsaker forbigående eliminering av olfactory flimmerhårene og microvilli. Olfactory epitel i sebrafisk regenererer innen 48 timer etter behandling17. Fornyelse i Xenopus rumpetroll kan være enda raskere siden Svar å odorants kan observeres 1 dag etter fargestoff lasting (figur 2D). En detaljert morfologisk analyse er imidlertid nødvendig å nøyaktig beregne fornyelse tid olfactory epitel etter Triton X-100 behandling.
Merking ORNs med kalsium grønn-1 dekstran er bare effektivt i en populasjon av neurons, slik at effekten av presynaptic terminaler med en høy signal-til-støy-forhold (figur 2B og 2 C). Nesten fullstendig fravær av bakgrunnen er en fordel hvis sammenlignet med lasting av hele olfactory pære med AM ester former for kalsium fargestoffer. Antall fluorescerende ORNs er forskjellig fra dyr til dyr. Dermed er det nødvendig å bruke en bred olfactory stimulans av flere aminosyrer. Vi har fått vellykkede resultater ved hjelp av metionin, leucine, histidin, arginin og lysin. Andre kombinasjoner av ulike aminosyrer kan også være effektiv. En alternativ metode laste ORNs med kalsium indikatorer er electroporation26, som er mye brukt til å uttrykke genetisk kodet fluorescerende journalister i rumpetroll neurons27. Electroporation kan gjøres ved hjelp av kommersielle eller skreddersydd og lar visualisering av neuronal strukturer med en utmerket signal-til-støy-forhold28. På samme måte som beskrevet tilnærming, celle populasjoner merket er heterogene og skiller seg fra dyr til dyr. Transgenesis er ønskelig hvis målet undersøker definerte innbyggere neurons22. For eksempel kan kjører uttrykk for genetisk kodet kalsium indikatorer som GCaMPs i en begrenset gruppe ORNs, være svært nyttig å undersøke respons på et definert sett med presynaptic terminaler til odorants.
Metoden beskrevet med kalsium-grønn 1 dekstran rapporterer presynaptic terminal funksjon i vivo. Observasjon av intracellulær kalsium øker er veiledende riktig olfactory signaltransduksjon og utgivelsen av glutamat på nivået av glomeruli. Kvantitativ analyse av endringer i fluorescens er imidlertid begrenset. Stimulering av presynaptic terminaler øker intracellulær kalsium nivåer micromolar utvalg og metning av en høy affinitet kalsium indikator som kalsium grønne må tas i betraktning. Illustrert i figur 2 får resultater widefield mikroskopi. Dette er den enkleste tilnærmingen kan implementeres i de fleste laboratorier. Bedring ved hjelp av to-fotonet mikroskopi eller genetisk kodet fluorescerende journalister å gjøre mer kvantitative beregninger av presynaptic funksjon.
For live bildebehandling av kalsium svar er det avgjørende at det er riktig plassering av kapillær levere odorant løsning. Den bør plasseres over nasal kapselen unngå alltid direkte kontakt med vev. Både korrekt leveranse av odorant løsningen og flyten av perfusjonen bør sjekkes før du plasserer i rumpetroll under mikroskopet. Alle rør som brukes for perfusjonen kontrolleres for luftbobler. Tekstflyten endres av aminosyre løsningen må umiddelbart svare på etterfølgende åpning og lukking av magnetventil. Forsinkelser er indikativ av tilstedeværelsen av luft. Det er også effektivt til å se etter riktig volumet øker eller minsker løsning levert etter skiftende åpningstid, i.e., fra 0,1 s til 1 s eller omvendt. Bruk lav lav intensitet stund innfatning eksperimentelle parametere (trinn 4.6) for å minimere photobleaching.
Selv om viktigheten av luktesans i rumpetroll biologi er veletablert29, er det mangel på tester direkte vurdere olfactory-guidede atferd i Xenopus larver. Metoden beskrevet i dette dokumentet er en enkel test som gjør oppdagelsen av et svar på en lukt stimulans i en stor befolkning av dyr. Siste beskrivelsen av odorant sensitivitet av Rana catesbeianus rumpetroll for tilstedeværelsen av kjemikalier i vann illustrerer de komplekse mekanismene kopling luktesans til motor atferd30. Analysen beskrevet i dette dokumentet tar hensyn iboende variasjon av olfactory-guidede atferd i rumpetroll. Bruk av en 6-vel rett i stedet for enkelt brønner øker eksperimentelle gjennomstrømming. Faktorer som bidrar til variasjon er slik basale motilitet, relative plasseringen til perfusjon vik og fjær generert av odorant løsningen overvunnet av snitt mange rumpetroll. Ca 40 uavhengige målinger må beskrive kontroll attraktive svaret for aminosyrer.
Vi tilbyr to typer analyse for luktesans testen. Første tilnærmingen kvantifiserer tidsbruk nær lukt kilden over en definert periode. Det er spesielt godt egnet for statistisk analyse. Den andre tilnærmingen er basert på gjennomsnittlig tomten av euklidsk avstander fra lukt kilde og er nyttig å beskrive timelige responsen på odorants. Begge typer analyse er komplementære og generert av de samme dataene. Tolkningen er binære og gjør skille dyr denne forstand odorants fra dem som ikke10.
Hvordan kunne metodene beskrevet være nyttig for Xenopus samfunnet? Men metodene er egentlig illustrert for vill-type dyr, bør det tas hensyn til at genetisk muligheter kontinuerlig utvide i feltet Xenopus . Kombinert studie i vivo ORN svar og tilstedeværelsen av olfactory-guidede atferd kan også være svært nyttig å undersøke riktig behandling av olfactory informasjon i Xenopus mutanter opprettet ved fremover eller bakover genetisk skjermene 11. informasjonen fra kalsium imaging og atferdsmessige analysen kan kombineres. For eksempel en mutasjon selektivt påvirker granule celler av olfactory pære ville ikke endre presynaptic svar ORNs men ville trolig svekke olfactory-guidede atferd.
Metodene knytte mobilnettet og atferdsdata svar i vivo er særlig aktuelt for genetisk dissection nevrale kretser. Tolkning av resultatene kan bli hjulpet av tidligere morfologiske arbeider, som har gitt en anatomisk kart over det glomerular laget i rumpetroll31. Informasjon innhentet fra olfactory pære skiver Xenopus rumpetroll32 er også svært verdifullt. Kalsium imaging mitral/tuftede celler i olfactory pære skiver har avdekket grunnleggende trekk ved olfactory behandling i Xenopus rumpetroll, som for eksempel følsomheten til ORNs til ulike aminosyrer33 eller relevansen av svar ventetid i koding av olfactory informasjon7. Hjernen skiver viser imidlertid begrenset kapasitet å gjenskape de komplekse integrerende mekanismene knytte forskjellige nevrale kretser på grunn av inndeling av mange neuronal anslag. Karakteristikk av egenskapene for individuelle glomerular enheter er også ennå unnvikende unntatt γ-glomerulus34. Spørsmålet om single glomerular enheter finne spesifikk atferd i rumpetroll besvares bare ved å kombinere genetisk verktøy, i vivo tenkelig tilnærminger og atferdsmessige analyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra El Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO; SAF2015-63568-R) cofunded av den europeiske Regional Development Fund (ERDF), av konkurransedyktig forskning priser fra M. G. F. Fuortes Memorial fellesskap, Stephen W. Kuffler fellesskap fondet, Laura og Arthur Colwin utstyrt sommer Research Fellowship Fund , Fischbach fellesskap og stor generasjon fondet Marine Biological Laboratory og den nasjonale Xenopus ressurs RRID:SCR_013731 (Woods Hole, MA) hvor en del av dette arbeidet ble utført. Vi takker også Søk etter Program / Generalitat de Catalunya for institusjonelle støtte. Al er en Serra Húnter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Salts for aquariums (Instant Ocean Salt) | Tecniplast | XPSIO25R | |
| Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| Tweezers #5 (tip 0.025 x 0.005 mm) | World Precision Instruments | 501985 | |
| Vannas Scissors (tip 0.015 x 0.015) | World Precision Instruments | 501778 | |
| Whatman qualitative filter paper | Fisher Scientific | WH3030917 | |
| X. laevis tubb2-GFP | National Xenopus Resource (NXR), RRID:SCR_013731 | NXR_0.0035 | |
| X.tropicalis NBT-GFP | European Xenopus Resource Center (EXRC) RRID:SCR_007164 | ||
| CellTracker CM-DiI | ThermoFisher Scientific | C-7001 | |
| Calcium Green dextran, Potassium Salt, 10,000 MW, Anionic | ThermoFisher Scientific | C-3713 | |
| Borosilicate capillaries for microinjection | Sutter Instrument | B100-75-10 | O.D.=1.0 mm., I.D.=0.75 mm. |
| Puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Microinjector | Parker Instruments | Picospritzer III | |
| Sylgard-184 | Sigma-Aldrich | 761028-5EA | |
| Microfil micropipettes | World Precision Instruments | MF28G-5 | |
| Upright microscope | Zeiss | AxioImager-A1 | |
| Master-8 stimulator | A.M.P.I. | ||
| CCD Camera | Hamamatsu | Image EM | |
| Solenoid valves | Warner Instruments | VC-6 Six Channel system | |
| Dow Corning High Vacuum Grease | VWR Scientific | 636082B | |
| Tubocurarine hydrochloride | Sigma-Aldrich | T2379 | |
| CCD Camera | Zeiss | MRC-5 Camera | Controlled by Zen software |
| camera lens | Thorlabs | MVL8ML3 | There are multiple possibilities that should be adapted to the camera model used |
| Epoxy resin | RS Components | ||
| Manifold | Warner Instruments | MP-6 perfusion manifold | |
| Micromanipulator for local delivery of solutions | Narishige | MN-153 | |
| Mini magnetic clamps | Warner Instruments | MAG-7, MAG-6 | |
| Polyethylene tubing | Warner Instruments | 64-0755 | O.D.=1.57 mm., I.D.=1.14 mm. |
References
- Hellsten, U., et al. The genome of the Western clawed frog Xenopus tropicalis. Science. 328 (5978), 633-636 (2010).
- Session, A. M., et al. Genome evolution in the allotetraploid frog Xenopus laevis. Nature. 538 (7625), 336-343 (2016).
- Zhang, L. I., Tao, H. W., Holt, C. E., Harris, W. A., Poo, M. A critical window for cooperation and competition among developing retinotectal synapses. Nature. 395 (6697), 37-44 (1998).
- Li, J., Erisir, A., Cline, H. In vivo time-lapse imaging and serial section electron microscopy reveal developmental synaptic rearrangements. Neuron. 69 (2), 273-286 (2011).
- Dietrich, H., Glasauer, S., Straka, H. Functional Organization of Vestibulo-Ocular Responses in Abducens Motoneurons. Journal of Neuroscience. 37 (15), 4032-4045 (2017).
- Buhl, E., Roberts, A., Soffe, S. R. The role of a trigeminal sensory nucleus in the initiation of locomotion. Journal of Physiology. 590, Pt 10 2453-2469 (2012).
- Junek, S., Kludt, E., Wolf, F., Schild, D. Olfactory coding with patterns of response latencies. Neuron. 67 (5), 872-884 (2010).
- Stout, R. P., Graziadei, P. P. Influence of the olfactory placode on the development of the brain in Xenopus laevis (Daudin). I. Axonal growth and connections of the transplanted olfactory placode. Neuroscience. 5 (12), 2175-2186 (1980).
- Yoshino, J., Tochinai, S. Functional regeneration of the olfactory bulb requires reconnection to the olfactory nerve in Xenopus larvae. Development, Growth & Differentiation. 48 (1), 15-24 (2006).
- Terni, B., Pacciolla, P., Masanas, H., Gorostiza, P., Llobet, A. Tight temporal coupling between synaptic rewiring of olfactory glomeruli and the emergence of odor-guided behavior in Xenopus tadpoles. Journal of Comparative Neurology. 525 (17), 3769-3783 (2017).
- Goda, T., et al. Genetic screens for mutations affecting development of Xenopus tropicalis. PLOS Genetics. 2 (6), 91 (2006).
- Nakayama, T., et al. Simple and efficient CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in Xenopus tropicalis. Genesis. 51 (12), 835-843 (2013).
- Jafkins, A., Abu-Daya, A., Noble, A., Zimmerman, L. B., Guille, M. Husbandry of Xenopus tropicalis. Methods in Molecular Biology. 917, 17-31 (2012).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early Development of Xenopus laevis. A Laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal table of Xenopus laevis (Daudin). A systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , North-Holland Publishing Company. Amsterdam. (1956).
- Xu, H., Dude, C. M., Baker, C. V. Fine-grained fate maps for the ophthalmic and maxillomandibular trigeminal placodes in the chick embryo. Developmental Biology. 317 (1), 174-186 (2008).
- Friedrich, R. W., Korsching, S. I. Combinatorial and chemotopic odorant coding in the zebrafish olfactory bulb visualized by optical imaging. Neuron. 18 (5), 737-752 (1997).
- Ishibashi, S., Cliffe, R., Amaya, E. Highly efficient bi-allelic mutation rates using TALENs in Xenopus tropicalis. Biology Open. 1 (12), 1273-1276 (2012).
- Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).
- Nussbaum-Krammer, C. I., Neto, M. F., Brielmann, R. M., Pedersen, J. S., Morimoto, R. I. Investigating the spreading and toxicity of prion-like proteins using the metazoan model organism C. elegans. Journalof Visualized Experiments. (95), e52321 (2015).
- Koide, T., et al. Olfactory neural circuitry for attraction to amino acids revealed by transposon-mediated gene trap approach in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (24), 9884-9889 (2009).
- Love, N. R., et al. pTransgenesis: a cross-species, modular transgenesis resource. Development. 138 (24), 5451-5458 (2011).
- Tandon, P., Conlon, F., Furlow, J. D., Horb, M. E. Expanding the genetic toolkit in Xenopus: Approaches and opportunities for human disease modeling. Developmental Biology. 426 (2), 325-335 (2017).
- Pratt, K. G., Khakhalin, A. S. Modeling human neurodevelopmental disorders in the Xenopus tadpole: from mechanisms to therapeutic targets. Disease Models & Mechanisms. 6 (5), 1057-1065 (2013).
- Truszkowski, T. L., et al. Fragile X mental retardation protein knockdown in the developing Xenopus tadpole optic tectum results in enhanced feedforward inhibition and behavioral deficits. Neural Development. 11 (1), 14 (2016).
- Hassenklöver, T., Manzini, I. Olfactory wiring logic in amphibians challenges the basic assumptions of the unbranched axon concept. Journal of Neuroscience. 33 (44), 17247-17252 (2013).
- Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. Single-cell electroporation for gene transfer in vivo. Neuron. 29 (3), 583-591 (2001).
- Sild, M., Van Horn, M. R., Schohl, A., Jia, D., Ruthazer, E. S. Neural Activity-Dependent Regulation of Radial Glial Filopodial Motility Is Mediated by Glial cGMP-Dependent Protein Kinase 1 and Contributes to Synapse Maturation in the Developing Visual System. Journal of Neuroscience. 36 (19), 5279-5288 (2016).
- McDiarmid, R., Altig, R. Tadpoles: The biology of anuran larvae. , The University of Chicago Press. 149-169 (1999).
- Heerema, J. L., et al. Behavioral and molecular analyses of olfaction-mediated avoidance responses of Rana (Lithobates) catesbeiana tadpoles: Sensitivity to thyroid hormones, estrogen, and treated municipal wastewater effluent. Hormones and Behavior. 101, 85-93 (2018).
- Gaudin, A., Gascuel, J. 3D atlas describing the ontogenic evolution of the primary olfactory projections in the olfactory bulb of Xenopus laevis. Journal of Comparative Neurology. 489 (4), 403-424 (2005).
- Scheidweiler, U., Nezlin, L., Rabba, J., Müller, B., Schild, D. Slice culture of the olfactory bulb of Xenopus laevis tadpoles. Chemical Senses. 26 (4), 399-407 (2001).
- Manzini, I., Schild, D. Classes and narrowing selectivity of olfactory receptor neurons of Xenopus laevis tadpoles. Journal of General Physiology. 123 (2), 99-107 (2004).
- Kludt, E., Okom, C., Brinkmann, A., Schild, D. Integrating temperature with odor processing in the olfactory bulb. Journal of Neuroscience. 35 (20), 7892-7902 (2015).
