Summary
Los renacuajos de Xenopus ofrecen una plataforma única para investigar la función del sistema nervioso en vivo. Se describen metodologías para evaluar el procesamiento de la información olfativa en la vida de Xenopus larvas en condiciones normales de cría o después de la lesión.
Abstract
Los renacuajos de Xenopus ofrecen una plataforma única para investigar la función del sistema nervioso. Proporcionan múltiples ventajas experimentales, tales como accesibilidad a numerosos métodos de proyección de imagen, técnicas electrofisiológicas y ensayos de comportamiento. El sistema olfativo del renacuajo Xenopus es particularmente idóneo para investigar la función de sinapsis establecidas durante el desarrollo normal o reformado después de la lesión. Aquí, describimos las metodologías para evaluar el procesamiento de la información olfativa en la vida de las larvas de Xenopus . Esbozamos una combinación de medidas en vivo de las respuestas de calcio presinápticos en glomérulos del bulbo olfativo con ensayos de comportamiento olfativo guiado. Métodos pueden combinarse con la transección de nervios olfativos para el estudio de la configuración de la conectividad sináptica. Los experimentos se presentan animales de tipo salvaje y genéticamente modificados expresando reporteros GFP en células del sistema nervioso central. Aplicación de los enfoques descritos a los renacuajos genéticamente modificados puede ser útil para desentrañar las bases moleculares que definen comportamiento vertebrado.
Introduction
Los renacuajos de Xenopus constituyen un excelente modelo animal para estudiar la función normal del sistema nervioso. Transparencia, un genoma completamente secuenciado1,2y accesibilidad a las técnicas quirúrgicas, electrofisiológicos y de imagenológicos son propiedades únicas de las larvas de Xenopus que permiten investigar las funciones neuronales in vivo3 . Algunas de las múltiples posibilidades experimentales de este modelo animal son ilustrados por los estudios cuidadosos en renacuajo sistemas sensorial y motor4,5,6. Un circuito neuronal particularmente bien adaptado para el estudio de muchos aspectos de procesamiento a nivel de las sinapsis de información es el de sistema olfativo de renacuajo Xenopus 7. En primer lugar, su conectividad sináptica está bien definido: neuronas receptoras olfatorias (ORNs) proyecto para el bulbo olfatorio y establecen contactos sinápticos con las dendritas de células mitrales/tufted dentro de glomérulos para generar mapas de olor. En segundo lugar, sus ORNs continuamente se generan por la neurogénesis durante toda la vida para mantener la funcionalidad de vías olfatorias8. Y en tercer lugar, porque el sistema olfativo muestra una gran capacidad regenerativa, los renacuajos de Xenopus son capaces de reformar completamente su bulbo olfatorio después de ablación9.
En este papel, describimos los enfoques que combinan la proyección de imagen de glomérulos olfativos en los renacuajos vivos con experimentos conductuales para el estudio de la funcionalidad de las vías olfatorias. Los métodos detallados aquí fueron usados para el estudio de la recuperación funcional de conectividad glomerular del bulbo olfatorio de transección del nervio olfatorio10. Datos obtenidos en los renacuajos de Xenopus son representativas de vertebrados desde procesamiento olfativo es evolutivo conservado.
Los métodos descritos se ejemplifican mediante X. tropicalis pero puede implementarse fácilmente en X. laevis. A pesar del tamaño más grande de adultos X. laevis, ambas especies son notablemente similares durante etapas de renacuajo. Las principales diferencias residen en el nivel genomic. X. laevis muestra pobre maleabilidad genética, determinada sobre todo por su genoma tetraploide y tiempo de generación largo (aproximadamente 1 año). En cambio, x. tropicalis es más susceptible a modificaciones genéticas debido a su corto tiempo de generación (5 – 8 meses) y el genoma diploide. Los experimentos representativos se ilustran para animales de tipo silvestre y tres líneas transgénicas: Hb9:GFP (X. tropicalis), NBT:GFP (X. tropicalis) y tubb2:GFP (X. laevis).
Las metodologías descritas en el presente trabajo deben considerarse junto con los avances genéticos en el campo de Xenopus . La simplicidad y fácil aplicación de las técnicas presentadas los hace particularmente útiles para evaluar ya descrito mutantes11, así como líneas de Xenopus generadas por CRISPR Cas9 tecnología12. También describimos un procedimiento quirúrgico que se utiliza para nervios olfativos que puede implementarse en cualquier laboratorio de tener acceso a los renacuajos de Xenopus de transectos. Los enfoques utilizan para evaluar las respuestas de calcio presinápticos y comportamiento olfativo guiadas requieren equipamiento específico, aunque en un coste moderado. Metodologías se presentan en una forma simple para promover su uso en grupos de investigación y podrían sentar las bases de análisis más complejos mediante la implementación de mejoras o de la asociación a otras técnicas, es decir,, histológicos o genéticos enfoques.
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Protocol
Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité de ética de investigación animal de la Universidad de Barcelona.
Nota: Los renacuajos de X. tropicalis y X. laevis son criados según los métodos estándar13,14. Agua de renacuajo es preparado agregando sales comerciales (véase Tabla de materiales) al agua obtenida por ósmosis inversa. Conductividad se ajusta a ∼700 μs y ∼1, 400 μs para los renacuajos de X. tropicalis y X. laevis , respectivamente. Las larvas pueden obtenerse ya sea por monta natural o fecundación in vitro14. Embriones son dejellied con el 2% de que l-cisteína preparada en de 0.1 x Marc modificado timbres (MMR). 1 x MMR contiene (en mM): NaCl 100, 2 KCl, 1 MgSO4, 2 CaCl2, 5 HEPES, EDTA 0,1, pH 7,8. Las larvas son transferidas después de 2-3 días (etapa 25) a los tanques de 2 L con agua de renacuajo. Cuando los renacuajos alcanzan la etapa 40 de los criterios de Nieuwkoop-Faber (NF)15, se colocan en tanques de 5 L y mantienen a una densidad de 10 animales/L. temperatura se mantiene constante en 23 – 25 ° C y 18-20 ° C para X. tropicalis y X. laevis renacuajos, respectivamente. Animales que se encuentran en etapas 48 – 52 de los criterios de NF se utilizan para los experimentos.
1. transección de nervios olfativos
- Preparar una solución de anestesia de 0.02% MS-222 en 50 mL de agua de renacuajo a temperatura ambiente.
- Preparar un pequeño tanque (1 – 2 L) con renacuajo agua para permitir la recuperación de los animales después de la cirugía.
- Cortar piezas rectangulares de papel de filtro cualitativo celulosa (4 cm x 3 cm, véase Tabla de materiales).
- Mojar 2 pedazos de papel de filtro cualitativo celulosa en solución al 0,02% MS-222 y colocarlos bajo el alcance de la disección.
- Escoja un renacuajo del tanque y sumergirlo en la solución de anestesia. El animal deja de nadar dentro de 2 a 4 minutos y no reacciona a estímulos mecánicos aplicados en el plano de cola con unas pinzas.
-
Coloque el renacuajo anestesiado en piezas rectangulares de papel de filtro. Posición del animal con su lado dorsal hacia arriba, por lo que se pueden visualizar las estructuras del cerebro.
- Usando tijeras de vannas (véase Tabla de materiales), corte uno o ambos nervios olfativos (dependiendo del tipo de análisis a realizar). Transecto de un solo nervio para experimentos que requieren de un control interno de la lesión del nervio.
- Experimentos conductuales, transecto ambos nervios para suprimir toda la información olfativa llega al bulbo olfatorio. La eficacia de seccionamiento del nervios olfativos se puede observar fácilmente en el ámbito de la disección; sin embargo, posición de pigmentación o animal puede ser factores limitantes.
Nota: (Opcional) La mejor manera de certificar la validez del procedimiento es utilizando los renacuajos transgénicos que expresan reporteros fluorescentes en su sistema nervioso (véase resultados representativos). Para ello, es necesario utilizar un ámbito de disección equipado con fluorescencia (figura 1). Si sólo se dispone de animales de tipo silvestre, trazado con CM-diI puede ser empleada. Seguir protocolo 2 (véase abajo) para inyectar una solución de 0,5 mg/mL de CM-diI en sacarosa de 0,3 M en la cápsula nasal. Ver 16 para más detalles sobre la preparación y almacenamiento de CM-diI. Salida de contraste fuera de la cavidad principal se debe minimizar. Para ello, es necesario modificar la presión de inyección y la apertura de Micropipetas. Fluorescencia en el nivel de la capa glomerular del bulbo olfatorio se convierte en obvio 24 h después de la aplicación del CM-diI. El presente trabajo utiliza etiquetado con CM-diI para certificar el procedimiento de corte transversal; sin embargo, este método también puede utilizarse para obtener información morfológica de glomérulos olfativos utilizando procedimientos histológicos convencionales.
- Transferencia de animales para el tanque de recuperación. Los renacuajos deben recuperar natación normal dentro de ~ 10 minutos realizar una inspección cuidadosa de la presencia de hemorragias, que se espera en el ~ 1% de los animales sometida a cirugía.
- Eutanasia de animales heridos en una solución de 0,2% MS-222.
2. etiquetado de las neuronas receptoras olfatorias con indicadores fluorescentes calcio
- Preparar una solución que contiene 12% calcio verde-1-dextrano (véase Tabla de materiales), 0,1% Tritón X-100 y 1 mM de NaCl17. Almacenar la solución a-20 ° C o a-80 ° C si no debe ser utilizado dentro de un mes.
- Preparación de pipetas de vidrio con punta aberturas ~ 1-2 μm (diámetro similar a microelectrodos usados para los experimentos de patch-clamp) para microinyección utilizando un extractor de micropipeta (véase Tabla de materiales).
- Calibrar el volumen de microinyecciones. Utilizando agua destilada, ajustar el tiempo de inyección y presión para obtener volúmenes de inyección de 0.15 – 0.3 μl.
Nota: Un procedimiento sencillo consiste en contar el número de pulsos necesaria para vaciar una pipeta llenada con 1 μl de agua. Parámetros típicos son una presión de 30 psi y 50 ms el tiempo de inyección. - Colocar una pipeta en la microinyectora y carga con 2 μl de solución de dextrano 1 verde de calcio.
- Preparar un renacuajo siguiendo los pasos 1.1 al 1.6.
- Mueva la punta de la pipeta a la cavidad principal de la cápsula nasal.
Nota: Vea la figura 2A describir la situación de las vías olfatorias en un renacuajo Xenopus. - Parámetros obtienen en 2.3, entregar un par de bocanadas. Restringir la presencia de tinte a la cápsula nasal.
- Deje que el renacuajo descansar durante 2 – 3 minutos usando una pipeta Pasteur, verter gotas de solución de MS-222 de 0.02% en las partes más caudales del animal para evitar la sequedad.
- Traslado del animal al tanque de recuperación.
Nota: Él debe recuperar natación normal dentro de ~ 10 minutos manipulación de animales puede causar lesiones. - Eutanasia a los renacuajos que no se recuperan natación normal comportamiento 15 min después de la inyección con una solución de 0,2% MS-222.
- Observar la fluorescencia en el nivel de la capa glomerular del bulbo olfatorio en el día después de la inyección.
3. preparación de los renacuajos en proyección de imagen de respuestas presinápticas
- 24 – 48 h antes de realizar el experimento, capa de 4 a 6 placas de Petri de 35 mm de diámetro con elastómero de silicona (por ejemplo, Sylgard). Una vez que el elastómero se ha polimerizado, fabricar un pozo rectangular para caber el renacuajo.
Nota: Dimensiones típicas para los renacuajos de X. tropicalis encontradas etapas de NF 48 – 52 son 10 x 4 mm. - Preparar 100 mL de una 160 μm a la solución de aminoácido 1 mM actuando como estímulo odorante para los renacuajos. La solución puede contener una mezcla de varios aminoácidos: metionina, leucina, histidina, arginina y lisina. Diluir los aminoácidos en solución de Ringer de Xenopus , compuesta por (en mM): NaCl 100, 2 KCl, 1 CaCl2, 2 MgCl2, glucosa 10, 10 HEPES, 240 mOsm/kg, pH 7,8. Asegurar que el pH se mantiene en 7.8.
- Llenar un depósito elevado con 20 mL de la solución de aminoácido. Conecte el depósito polietileno tubo a un tubo capilar de 28 G (véase Tabla de materiales) colocado por encima de la cápsula nasal.
Nota: El tubo capilar está montado sobre un micromanipulador (véase Tabla de materiales). Burbujas de aire deben estar ausentes del sistema de perfusión. - Alcanzar la precisión temporal en la aplicación de la solución de aminoácidos mediante el control de la lógica (TTL) de transistor-transistor de pizca de electroválvulas (véase Tabla de materiales). Se utiliza un estimulador para generar pulsos TTL (véase Tabla de materiales). Compruebe la precisión temporal para ofrecer una solución de odorante por cambiar la duración de pulsos TTL, es decir., s de 0,1 a 1.
- Llenar otro depósito elevado con 100 mL de solución de Ringer de Xenopus .
- Anestesiar un renacuajo y colóquelo en el ámbito de la disección (pasos 1.1 a 1.6).
- Preparar un renacuajo para la proyección de imagen. Si se dispone de los renacuajos albinos proceda al paso 3.9, lo contrario quitar la piel sobre el bulbo olfativo ya que contiene melanocitos que deterioran la proyección de imagen (paso 3.8).
Nota: Hay dos maneras de realizar el experimento según la pigmentación del animal. Es preferible usar animales albinos. Cepas de Albino están disponibles para X. laevis y líneas de albino X. tropicalis recientemente se han generado por CRISPR Cas9 12 o TALENs18. - Usando las tijeras de vannas, haga una incisión lateral en la piel de renacuajo en el borde del sistema nervioso central. Hacer el corte debe hacerse a nivel del bulbo olfativo y nunca llegar a la posición de tectum, que puede ser fácilmente identificado por la localización del nervio óptico.
- Pellizcar la piel corte con pinzas y colocárselo sobre el sistema nervioso. Verificar Retiro acertado por la ausencia de melanocitos sobre el bulbo olfatorio. Mantenga el animal húmedo vertiendo gotas de 0.02% MS-222 solución utilizando una pipeta Pasteur.
- Coloque el renacuajo en el pozo del plato cubierto (véase Tabla de materiales). Poner un cubreobjetos de vidrio recubierto con grasa para alto vacío sobre el animal. Coloque el cubreobjetos para cubrir la parte superior del tectum hasta el final de la cola.
- Asegurar que el bulbo olfatorio y placodes permanecen expuestas al medio extracelular. Mantenga el renacuajo inmóvil durante proyección de imagen. Llene la caja Petri con tubocurarina de Xenopus Ringer solutioncontaining 100 μm (véase Tabla de materiales) para evitar las contracciones musculares.
Nota: Tubocurarina se almacena en alícuotas a-80 ° C no más de 6 meses. - Coloque el plato con el renacuajo un microscopio vertical. Conecte el depósito que contiene solución de Ringer de Xenopus con el plato utilizando polietileno de la tubería (véase Tabla de materiales) para perfusión continua de solución de Ringer de Xenopus para mantener al animal vivo para > 1 h.
Nota: Mini pinzas magnéticas (véase Tabla de materiales) son muy útiles para estable conectar la tubería al plato. Tubos de succión y de perfusión deben estar ubicados en el ángulo de ~ 180°. - Inicio perfundiendo solución de Ringer de Xenopus . Mantener el nivel de la solución de la constante del plato durante todo el experimento. Evaluar viabilidad del renacuajo de manera continua mediante la observación de la circulación sanguínea a través de los vasos.
4. proyección de imagen de presinápticos Ca2 + cambios en los glomérulos olfativos en vivo
Nota: El procedimiento imagenológico se describe para microscopía de amplio campo, pero podría adaptarse fácilmente a un microscopio confocal mediante el ajuste de los parámetros de adquisición. Se realizará la proyección de imagen en un microscopio vertical montado en una mesa antivibración.
- Visualizar el renacuajo con un objetivo de bajo aumento, por ejemplo 5 x.
- Movimiento de los ejes de instrumental quirúrgico para colocar el capilar entregando la solución de olor en la parte superior una cápsula nasal forma un ángulo de 90 º con el nervio olfatorio. El flujo de solución de olor sobre el bulbo olfativo debe evitarse porque puede causar turbulencias que distorsionan la imagen.
- Encontrar el bulbo olfatorio situado ipsilaterally a la cápsula nasal (sujeta a estimulación) usando una alta magnificación, distancia de funcionamiento larga, objetivo de inmersión de agua: 60Xx, 0.9 N.A.
- Verificar la emisión de fluorescencia por el ojo. Estructuras glomerulares deberían ser obvio (figura 2B).
- Realizar adquisición vivo con una cámara adecuada para proyección de imagen de calcio. Definir un cuadro que contiene el bulbo olfatorio entero, normalmente de 256 x 256 o 512 x 512 píxeles. Conjunto la adquisición de tasa marco de adquisición de 20 a 40 Hz. Ajuste la ganancia, por lo que los valores de fluorescencia basal son ~ 20% de saturación. Adquirir un vídeo s 5.
- Visualizar la película. Comprobar el foco de la imagen, la ausencia de artefactos de movimiento y de las regiones que contienen píxeles saturados. Valores de fluorescencia típico de regiones glomerulares deben ser de 5.000 – 20.000 a.u. Si usando una cámara de 16 bits. Proceder al siguiente paso si de las condiciones son óptimas. Repita el paso 4.6 si es necesario para mejorar la calidad de la imagen o ajustar la configuración de ganancia.
- Comienza un lapso de tiempo adquisición para registrar respuestas evocadas por estímulos olfativos.
Nota: Aplicación precisa de la solución de olor es controlada por los estímulos de la TTL. Un experimento típico contiene un punto de referencia de 4 s, seguido por el estímulo de las épocas que van desde 0.1 a 0.5 s y un periodo de recuperación de 6 – 10 s. - Realizar estímulos repetitivos de Odorantes para intervalos de tiempo > 2 min fijar el caudal a 1 – 1,5 mL·min-1. Puesto que la perfusión global está encendido durante todos los experimentos, se lavar localmente aplicados aminoácidos.
Nota: El volumen de solución en el plato es de ~ 3 mL. -
Análisis de imagen
- Detección de respuestas
- Exportar películas a ImageJ.
Nota: El objetivo es detectar la presencia de regiones glomerulares en respuesta a estímulos. - Transformar la materia prima secuencia de imágenes de fluorescencia para una película de0 ΔF/F. Medir los cambios relativos en la fluorescencia basal según la siguiente relación: (F-F0) / f0, donde F0 indica los niveles de fluorescencia basal.
- Dibujar las regiones de interés (ROI) alrededor de las áreas que muestra supuesta de la fluorescencia aumenta durante la estimulación y registrar su posición en el administrador de ROI (figura 2E). Dibujar un ROI para detectar niveles de fluorescencia de fondo en una zona carente de estructuras glomerulares.
- Exportar películas a ImageJ.
- Cuantificación de las respuestas.
- Lugar las ROIs definidos en la secuencia cruda de imágenes de fluorescencia. Obtener el valor medio de gris de las ROIs para cada fotograma. La secuencia de los valores obtenidos para un programa de análisis de la transferencia (por ejemplo., Igor Pro).
- Reste la fluorescencia del fondo y luego calcular cambios de0 ΔF/F para cada ROI (figura 2F). Parcela los aumentos en ΔF/F0 para cada uno de los ROIs seleccionadas. Calcular la desviación estándar de basal ΔF/F0 (antes del estímulo).
Nota: Se considera una respuesta positiva si aumenta en ΔF/F0 obtenidos durante estimulación son más grandes que 2 desviaciones estándar de los valores basales.
- Detección de respuestas
5. ensayo de comportamiento olfativa guiada por
Nota: En la figura 3se muestra un diagrama esquemático de la instalación para realizar el análisis.
- Hacer pequeños agujeros para tubos de 1,14 mm de D.I. de O.D. x 1,57 mm en la parte superior de cada pozo de la fuente 6-bien. Inserte la tubería y selle con un adhesivo epoxy (véase Tabla de materiales).
Nota: El plato modificado puede ser reutilizado muchas veces después de lavado exhaustivo con agua destilada. - Preparar 50 mL de una solución de aminoácidos que contiene metionina, leucina, histidina, arginina y lisina (ver paso 3.2 para más detalles). Las concentraciones pueden variar desde 160 μm a 1 mM. Colocar 20 mL de la solución en un depósito elevado.
- No se alimentan los renacuajos durante al menos 12 h antes del ensayo. Tomar 6 renacuajos desde el tanque de su vivienda y colocarlos en 2 L de agua de renacuajo limpia para minimizar la exposición a olores.
- Coloque el plato de 6 pozos modificado en un transiluminador de LED blanco (figura 3).
- Par las entradas de perfusión al depósito que contiene la solución de aminoácido con un múltiple (véase Tabla de materiales). Compruebe el sistema de perfusión y eliminar burbujas de aire. Llenar los 6 pozos simultáneamente. Ajustar la altura del embalse para permitir la entrega de ≥5 mL de solución de olor dentro de ~ 30 s.
Nota: Lavar cada pozo 4 veces con agua destilada después de la exposición a la solución de olor. - Rellenar cada una con 10 mL de agua de renacuajo. Lugar 1 renacuajo/bien. Dejar reposar > 3 minutos.
- Establecer la adquisición de la imagen. Utilizar una cámara de CCD convencional que puede adquirir imágenes en ≥5 Hz. Conecte la cámara a un ordenador. Aquí, utilice una cámara Zeiss MRC5, controlada por el software Zen pero pueden utilizarse otras configuraciones equivalentes. Si es necesario aumentar la velocidad de fotogramas, aplicar pixel binning. Imágenes deben mostrar el plato entero 6-bien.
- Iniciar la adquisición de la imagen que contienen películas basal (30 s), estímulo (25 – 35 s) y períodos de recuperación (30 a 60 s).
- Animales retorno del plato 6 pozos a los tanques después de la proyección de imagen.
- Analizar películas en ImageJ usando plugins como wrMTrck19,20 que proporcionar varios parámetros asociados a la movilidad.
- Para preparar imágenes para el análisis, primero seleccione un pozo dibujando un ROI rectangular de 35 x 35 mm (figura 4A). Obtener una imagen de fondo mediante el cálculo de la proyección máxima de toda la secuencia. Debe mostrar una imagen del bien sin el renacuajo.
- Restar la máxima proyección de la película cruda. Realizar el umbral en la película de 32-bit generada y aplicar el plugin de wrMTrck. Ajustar los parámetros de WrMTrck para seguir confiablemente los movimientos animales. Transferir los obtenidos X, Y coordenadas en un programa de análisis.
- X-Y utilizando coordenadas, calcular la distancia Euclídea a la fuente de olor (entrada de la perfusión en el pozo), aplicando la siguiente ecuación:
donde os indica la posición de la fuente del olor y tad indica la posición de renacuajo en un momento dado. Ver figura 4A para más detalles.
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Representative Results
En este trabajo presentamos una combinación de dos enfoques complementarios para realizar el estudio en vivo de la funcionalidad del sistema olfativo renacuajo Xenopus : i) un método para la proyección de imagen presináptica Ca2 + cambios en los glomérulos de la vida los renacuajos con un indicador fluorescente de calcio y ii) un olor guiado ensayo conductual que puede utilizarse para investigar la respuesta a olores específicos de transmitidas por el agua. Puesto que estos métodos han sido empleados para evaluar la recuperación de olfativo procesamiento después de la lesión10, también se describe un método simple para transecting nervios olfativos.
Corte transversal de vías olfatorias en Xenopus renacuajos
Hay dos formas de certificar la validez del procedimiento. Ambos se basan en la visualización de los nervios olfativos utilizando reporteros fluorescentes. Un método se basa en los renacuajos transgénicos que expresan proteínas fluorescentes en su sistema nervioso. Dos líneas recomendadas que expresan GFP bajo un promotor neuronal β-tubulina son X. laevis tubb2b-GFP y X. tropicalis NBT-GFP (figura 1, véase Tabla de materiales). Si sólo se dispone de animales de tipo silvestre, CM-diI puede utilizarse (ver paso 1.8). La figura 1 muestra imágenes de los renacuajos de X. laevis tubb2-GFP. Las imágenes son de cuatro animales diferentes en un solo nervio olfatorio transected. El corte debe ser evidente en el ámbito de la disección. La ventaja de usar líneas transgénicas es que reforma del nervio olfatorio puede seguirse durante un período de tiempo. Al hacer observaciones secuenciales, se recomienda para minimizar la exposición a la luz fluorescente para prevenir el fotoenvejecimiento. Seccionamiento de un solo nervio olfatorio es útil cuando un control interno se requiere, como por ejemplo, para comparar unidades glomerulares normalmente desarrollados vs despolarizada. Sección de ambos nervios olfativos se debe aplicar cuando el objetivo es suprimir totalmente la transmisión de información.
Proyección de imagen de presinápticas respuestas a los estímulos olfativos en vivo
El etiquetado correcto de ORNs con dextrano de calcio green-1 se puede observar en el nivel del bulbo olfatorio (figura 2A) mediante microscopia de campo amplio. Glomérulos son evidentes (figura 2B) y deben aparecer distribuidos en diferentes capas moviendo el plano de enfoque. La morfología de estructuras glomerulares puede resolverse mejor si un microscopio confocal utiliza en su lugar (figura 2C). El número de glomérulos etiquetados depende de absorción del tinte a nivel del epitelio olfativo. Por lo tanto, este procedimiento no permite la visualización de todas las unidades glomerulares. Animales que muestran una tinción de fluorescencia más intensa de la región glomerular deben seleccionarse antes de realizar experimentos de proyección de imagen, ya que contienen más ORNs etiquetados. Esta maniobra es altamente recomendable para aumentar el rendimiento experimental y debe realizarse bajo un disección alcance equipado con una lámpara de fluorescencia. Rechazar los animales que no muestran marcadas unidades glomerulares o que presentan fluorescencia restringida a determinadas zonas de la capa glomerular. Presinápticos Ca2 + las respuestas pueden observarse tan pronto como 1 día después de la carga de tinte. Para llevar a cabo experimentos de imagen es recomendable el uso de objetivos de gran apertura numérica, típicamente ≥0. 9.
Aumentos de los niveles de calcio presinápticos pueden ser evocados exponiendo las perillas dendríticas de ORNs a aminoácidos. Es importante colocar el capilar entregando la solución de olor encima de la cápsula nasal. Debe tenerse cuidado para evitar el contacto porque podría obstruir la punta del tubo capilar o causar estimulación mecánica de ORNs. Aumentos transitorios en los niveles de calcio presináptico se observan para estímulos ≥0. 1 s (figura 2D) y son indicativos de una correcta transducción olfativa. También es importante visualizar los niveles de calcio basal con aumento de la cámara baja. Los terminales presinápticos de ORNs Mostrar aumentos fluorescentes alta y es esencial para evitar la saturación de la señal. Alta resolución temporal puede conseguirse con microscopía de campo amplio. Por ejemplo, usando una cámara CCD electrón multiplicado, es posible alcanzar velocidades de fotogramas de 50 Hz o superior. Uso de la microscopia confocal reduce la resolución temporal pero permite una mejor definición de las estructuras glomerulares.
La alta afinidad del calcio verde para atar calcio (190 nM) es particularmente útil para detectar pequeñas respuestas. Aumento de calcio intracelular transitoria detectado en la capa glomerular es variable. Algunas regiones glomerulares muestran cambios en ΔF/F ≥0.2 de0 , mientras que vecinos procesos incluso no podrían responder (figura 2D). Los siguientes factores contribuyen a la variabilidad de la respuesta de las unidades glomerulares: i) el número total de glomérulos marcadas, ii) la concentración intracelular de calcio verde y iii) la selectividad de ORNs detectar aminoácidos. Puesto que un número demasiado bajo de glomérulos etiquetados podría impedir observar las respuestas, es absolutamente necesario para llevar a cabo estos experimentos con animales que contengan como muchos etiquetan ORNs como sea posible.
Comportamiento olfativo-dirigida
Análisis de datos
Se estudia comportamiento olfativo-dirigida mediante un sistema a la medida. La figura 3 muestra un dibujo esquemático del equipo utilizado para llevar a cabo el ensayo. La prueba se basa en la capacidad de los renacuajos para detectar la presencia de aminoácidos, que actúan como olores. Una solución que combina cinco diversos aminoácidos (metionina, leucina, histidina, arginina y lisina) se utiliza para la estimulación. La solución se entrega localmente durante 30 s a un 35 mm que también contiene un renacuajo nadan libremente. La respuesta inmediata de los renacuajos a la solución entrante es un aumento en la motilidad. Movimientos al azar que ocurre durante la inicial ∼5 – 10 s de aplicación de la solución son seguidos por un baño directo hacia la fuente de olores. Los renacuajos permanecen durante varios segundos en las proximidades de la boquilla durante la entrega de los aminoácidos y recuperan gradualmente la movilidad en direcciones aleatorias (véase complementaria vídeos 1, 2).
Las condiciones experimentales descritas permiten el nado normal de las etapas de los renacuajos de X. tropicalis 48-52; sin embargo, debe tenerse en cuenta que la motilidad de los animales más grandes puede restringirse en pozos de 35 mm. Movimientos de renacuajo se graban con una cámara CCD. Atracción para la solución de olor puede ser detectado como una reducción de la distancia euclidiana que separa la entrada de la perfusión desde la posición de renacuajo (figura 4). Seguimiento de renacuajo posiciones de la cabeza dentro de un área de 35 x 35 mm (o la talla equivalente en pixeles) permite obtener un análisis cuantitativo de comportamiento olfativo-dirigida (figura 4A). Parcelas individuales de movimientos de renacuajo se construyen utilizando coordenadas X-Y obtenidos por análisis de imagen (figura 4B). Las parcelas motilidad extraído deben reproducir fielmente las imágenes de vídeo.
Hay dos métodos posibles de interpretar experimentos de comportamiento olfativo guiado. El primer enfoque está inspirado en un estudio anterior usando zebrafishes21. Medición de tiempo en las proximidades de la boquilla ofrece olores pone en evidencia la presencia de un tropismo positivo. Una región de interés de radio 8,75 mm (correspondiente a 1/4 del diámetro del pozo) centrado en la entrada de la solución que se utiliza para clasificar la proximidad de los animales a la fuente de olor (Figura 4A, 4C). Binning el tiempo empleado por los renacuajos en las proximidades de la boquilla durante períodos definidos, es decir, 15 intervalos de s, permite identificar la capacidad de detectar soluciones de aminoácidos (figura 4D). El comportamiento global de una población de renacuajos puede obtenerse mediante el trazado de la distribución de los datos individuales (figura 5A). Un tropismo positivo puede detectarse cuando se prepara la solución de la metionina, leucina, histidina, arginina y lisina en 1 mM o 160 μM (figura 5A y 5B). Los animales no responden a la aplicación de agua (figura 5C), descartando así la participación de mecanismos mechanosensitive. Prueba de las diferencias entre tiempo de intervalos definidos en cada grupo experimental pueden establecerse con medidas repetidas no paramétricas ANOVA de comparaciones múltiples de Dunn. La desventaja de binning datos en intervalos de tiempo de 15 s es una menor resolución temporal.
Una manera de aumentar la información temporal de la respuesta conductual es haciendo parcelas promedio de distancias euclidianas de la fuente de olor. Aunque los movimientos renacuajo muestran una variabilidad intrínseca, la movilidad media de una población de animales (normalmente ≥ 40) muestra el comportamiento olfativa guiada. Para llevar a cabo este análisis es necesario posiciones animal grupo antes del inicio de la estimulación. Puesto que los renacuajos se encuentran en diferentes lugares cuando entra a la solución de odorante en el pozo se requiere para establecer la distancia euclidiana en 0 antes de estimulación (figura 6A, véase también los criterios de inclusión en la figura 7). Valores positivos y negativos por lo tanto indican una atracción o una repulsión de la fuente del olor, respectivamente. Una atracción para los olores es descrita bien por un ajuste lineal con coeficientes de regresión ≥0. 9. Si se entrega el agua, los cambios netos de la distancia euclidiana se distribuyen alrededor de 0 y no es posible ajustar una línea durante la estimulación olfativa, lo que indica la ausencia de un comportamiento olfativo-dirigida (figura 6B). Comparación de parcelas promedio de distancias euclidianas para soluciones de aminoácidos en 1 mM y 160 μm sugieren diferentes retrasos en la respuesta olfativa guiada (Comparar figura 6A y C). El intervalo de tiempo necesario para iniciar el movimiento hacia la fuente de olores es más corto cuando se aplican los aminoácidos en una concentración más alta. Una falta de comportamiento olfativo guiado se observa en los renacuajos con ambos nervios olfativos transversalmente (figura 6D).
Una limitación del análisis conductual olfativa guiada descrito es el establecimiento de penachos de fluidos complejos. Esto se puede ver si la solución del aminoácido es sustituida por un colorante como el verde Fast Green, al configurar el sistema. El uso de soluciones coloreadas verifica la formación de plumas y muestra que olores transmitidas por el agua llegar a cualquier región del pozo en 5 s. turbulencias causadas por la entrega de la solución probablemente es detectado por la línea lateral de los renacuajos y probablemente contribuye a la la variabilidad observada en la motilidad animal pero no interfieren con el comportamiento guiado olfativa. Experimentos de control llevado a cabo usando agua en lugar de soluciones de aminoácidos revelan que los renacuajos son capaces de discriminar olfativa de estímulos mecánicos. La estimación del tiempo de permanencia en una región de interés (figura 5) y la parcela promedio de distancias euclidianas (figura 6) son dos métodos complementarios para describir la respuesta olfativa guiada de renacuajos.
Criterios de inclusión
Criterios de inclusión también deben tenerse en cuenta para el análisis de datos. Algunos renacuajos muestran un movimiento resonante, que es ilustrado por la instalación de la parcela de distancias euclidianas a una función sinusoidal (figura 7A). Los renacuajos mostrando este comportamiento deben ser desechados de todos los análisis.
La exclusión de los animales que en el inicio de la aplicación de soluciones del olor son a un máximo (> 30 mm figura 7B) o una mínima distancia euclidiana (< 5 mm, figura 7C) de la boquilla permite disminuir la variabilidad de las parcelas promedio. Ilustrada en la figura 7B se muestra un tropismo positivo para la solución de aminoácido. El renacuajo se encuentra a una distancia máxima de la entrada de la solución en el inicio de la estimulación. Por lo tanto, esta posición relativa sólo puede revelar una atracción para la fuente de olor. Figura 7 C muestra la situación opuesta. Aquí, un renacuajo está situado en las proximidades de la boquilla de entregar la solución del aminoácido. Cuantificación del tiempo que pasó cerca de la fuente de olor presenta una respuesta (método utilizado en la figura 5); sin embargo, no se puede mostrar un movimiento neto hacia la entrada.
En Resumen, el análisis propuesto del comportamiento olfativo guiado define una prueba binaria. Este método puede utilizarse para detectar la capacidad de un grupo experimental de renacuajos para responder a los olores. Otras mejoras se requieren si el objetivo es establecer las diferencias entre las respuestas complejo olfativa guiada, como por ejemplo, determinar preferencias para los olores.
Figura 1: Transección de nervios olfativos. Imágenes representativas de los renacuajos de X. laevis tubb2-GFP obtenidos después de la transección de un solo nervio olfatorio (flechas). Los nervios de los renacuajos tubb2-GFP Mostrar fluorescencia fuerte. Transección del nervio es evidente inmediatamente después de la cirugía (D0). Nuevo crecimiento del nervio olfatorio es evidentes 4 días después del corte (D4). Ocho días después de la cirugía (D8) allí es poca diferencia entre el control y los nervios reformados. Los renacuajos fueron anestesiados en 0.02% MS-222 para recoger imágenes. Bulbo olfatorio (O.B.), nervio olfatorio (O.N.MARCOVECCHIO), cápsula nasal (N.C.), tectum (Tec), del nervio óptico (Op.N.). Las flechas indican la ubicación del nervio seccionado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Etiquetado de las neuronas receptoras olfatorias con dextrano de calcio verde y la visualización de la afluencia presynaptic del calcio Tras estimulación con aminoácidos. (A) imagen luz transmitida de un renacuajo que muestra la ubicación del epitelio olfatorio, los nervios olfatorio y la capa glomerular del bulbo olfatorio. (B) imagen de un bulbo olfatorio visualizada por microscopía de campo amplio (wf). Las neuronas fueron etiquetadas por el uso de dextrán 1 verde de calcio en la cápsula nasal. La fluorescencia observada corresponde a los terminales presinápticos de las neuronas receptoras olfatorias formando glomérulos. O.N: olfatorio nervio; O.B: bulbo olfatorio. (C) sección Confocal localizada dorsalmente desde la entrada del nervio olfatorio al bulbo. El componente presináptico de glomérulos olfativos fue etiquetado con dextrano de green-1 de calcio, como en B). Terminales presinápticos (D) aumentan transitoriamente los niveles de calcio sobre la exposición del epitelio olfativo a una solución que contiene cinco diferentes aminoácidos. Cambios relativos en fluorescencia de calcio obtenidos antes, durante y después del estímulo s 1. (E) de distribución de 10 diferentes regiones de interés (ROIs) utilizado para cuantificar cambios de0 ΔF/F. ROI11 está fuera de la capa glomerular y se utiliza para definir niveles de fluorescencia de fondo. (F) ΔF/F Individual0 respuestas por ROIs definidas en E). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Ensayo de comportamiento olfativo guiada. (A) diagrama esquemático que muestra el equipo utilizado en la prueba. (B) ejemplo de motilidad pistas grabadas más de 90 s. Cada círculo representa un bien que contiene un solo animal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 : Seguimiento de comportamiento olfativo guiada. (A) ejemplo de un pozo utilizado para el análisis de comportamiento. Azul líneas punteadas indican la ubicación de X, Y coordenadas (en mm) utilizado para seguir los movimientos de renacuajo (véase también 1 Video complementario). La elipse verde representa la posición de la entrada de la solución. La línea negra punteada indica la zona proximal al tubo de entrega de la solución de aminoácido (véase texto para más detalles). Motilidad (B) del renacuajo se muestra en la A) durante el ensayo conductual. Huellas con códigos de color indican la posición del animal antes de (gris) y después de la estimulación olfativa (violeta). Movimientos durante la aplicación de la solución de olor se ilustran en un degradado de color temporal (30 s, rojo a azul). (C) usando X, posiciones de renacuajo Y es posible calcular cambios en la distancia euclidiana de la cabeza del renacuajo a la entrada de la perfusión. Distancias más cortas a 8,75 mm corresponden a la zona proximal de la boquilla. (D) de la trama del tiempo empleado por los renacuajos en la región definida por la línea punteada en la A). Cada punto indica un período s 15. El animal es atraído por el olor la solución. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5 : Los renacuajos son atraídos por los aminoácidos. (A) tiempo invertido por los renacuajos en las cercanías de la fuente de olor. Cada compartimiento consta de un período de s 15. Diagramas de caja representa la mediana (línea horizontal negra), cuartiles 25 y 75% (cajas) y rangos (bigotes) de datos. Entrega de una solución de aminoácidos 1 mM atrajo a los renacuajos a la fuente de olor. (B) los renacuajos fueron atraídos por la solución de olor cuando la concentración de aminoácidos se redujo a 160 μM. (C) suministro de agua no modificó el comportamiento de los animales. Medidas repetidas ANOVA con Dunn's test de comparaciones múltiples, p < 0.05. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6 : Respuesta temporal de los renacuajos a odorantes. Parcela (A) de la media distancia Euclídea a la fuente de olor en función del tiempo. La distancia euclidiana fue fijada a 0 antes de la estimulación en cada rastro individual. Valores negativos y positivos indican una disminución y un aumento en la distancia a la fuente del olor, respectivamente. Atracción hacia la fuente del olor puede ser descrito por un ajuste lineal (r2= 0.98). (B) suministro de agua no modifica la distancia a la fuente de olor. Renacuajos (C) responden a la aplicación de una solución de 160 μM de aminoácidos según lo revelado por un ajuste lineal (r2= 0.96). (D) los renacuajos con ambos nervios olfativos transversalmente no responden a los aminoácidos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7 : Criterios de inclusión para el ensayo de comportamiento olfativo guiada. (A) algunos renacuajos muestran un resonante movimiento. Este comportamiento es revelado por el exitoso ajuste de una función sinusoidal a la parcela de la distancia Euclídea a la fuente de olor. Renacuajos de mostrar esta actividad deben ser excluidos de la prueba. (B, C) Una manera de reducir la variabilidad en la respuesta temporal promedio de aceites (figura 6) es mediante la exclusión de animales a un máximo (B) o (C) euclidiano distancia mínima en el inicio de la estimulación. Rojo las líneas de puntos indican el valor de umbral (30 mm y 5 mm). La distancia euclidiana antes del inicio de la estimulación (flecha, parcelas a la izquierda) se establece en "0" Informe atractivo o repulsivo comportamiento como negativo o positivo los valores (derecho parcelas), respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
1 Video complementario: comportamiento olfativo guiado por entrega de una solución de aminoácidos. La película muestra un renacuajo nadando libremente en un 35 mm bien. La elipse azul indica la posición del inyector de la entrega de la solución de olor. El inicio y el final de la estimulación se indican con puntos verdes y rojos, respectivamente. La figura 4 muestra el análisis del comportamiento observado. Por favor haga clic aquí para ver este video. (Clic derecho para descargar)
Video complementario 2: motilidad renacuajo durante la entrega de agua. La película muestra un renacuajo nadando libremente en un 35 mm bien. La elipse azul indica la posición de la boquilla soltando agua MQ. El inicio y el final del suministro de agua están indicados por puntos verdes y rojos, respectivamente. Por favor haga clic aquí para ver este video. (Clic derecho para descargar)
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Discussion
Este documento describe técnicas que son útiles para investigar la funcionalidad de las vías olfatorias en la vida de los renacuajos de Xenopus . El protocolo actual es particularmente útil para aquellos laboratorios que trabajan o tienen acceso a Xenopus; sin embargo, también es interesante para aquellos investigadores que estudian las bases celulares y moleculares de la regeneración neuronal y reparación. Resultados obtenidos en Xenopus pueden combinarse con datos recogidos en otros modelos vertebrados para identificar mecanismos conservados. Los métodos descritos se beneficiarán con el desarrollo de transgénicos Xenopus18,22,23 y son aplicables a los modelos experimentales de enfermedades del sistema nervioso en los renacuajos24, 25.
Para obtener datos reproducibles de in vivo, es clave para criar correctamente a los renacuajos de Xenopus . En particular, X.tropicalis es muy sensible a las condiciones de vivienda pobres. Por ejemplo, que no toleran temperaturas inferiores a 20 ° C y deben conservarse en depósitos o sistemas de agua en el rango de 24 a 28 ° C. También es importante no aumentar la densidad de animales por encima de límites establecidos, regularmente alimentación de renacuajos y mantener una calidad óptima del agua del13. Gestión de colonias animales siguiendo condiciones estandarizadas es absolutamente necesaria para obtener reproducibilidad de los experimentos en vivo.
El método descrito de la proyección de imagen de calcio es útil para detectar una correcta transducción olfativa de ORNs en vivo. Carga de ORNs con dextrano de calcio green-1 se consigue mediante permeabilización transitoria de la membrana del plasma con una concentración baja de Tritón X-100, como previamente divulgados17. La principal ventaja de este método de carga es la simplicidad, ya que sólo requiere un microinyector. Una desventaja importante es que Tritón X-100 provoca la eliminación transitoria de olfativas cilios y microvellosidades. El epitelio olfatorio del pez cebra regenera dentro de 48 h después del tratamiento17. Regeneración en los renacuajos de Xenopus podría ser aún más rápido ya que las respuestas a olores pueden observarse 1 día después tinte carga (figura 2D). Sin embargo, un análisis morfológico detallado es necesario para estimar con precisión el tiempo de regeneración del epitelio olfatorio después del tratamiento de Triton X-100.
Etiquetado ORNs con dextrano de green-1 calcio sólo es efectivo en una población de neuronas, permitiendo la visualización de las terminales presinápticas con un alto cociente signal-to-noise (figura 2B y 2C). La casi completa ausencia de fondo es una ventaja si se compara con la carga del bulbo olfativo todo con formas de éster de AM de tintes de calcio. El número de fluorescentes ORNs difiere de animal a animal. Por lo tanto es necesario utilizar un amplio estímulo olfativo de varios aminoácidos. Hemos obtenido resultados exitosos con una solución de metionina, leucina, histidina, arginina y lisina. Otras combinaciones de diferentes aminoácidos también podrían ser eficaces. Un método alternativo para cargar ORNs con indicadores de calcio es electroporación26, que es ampliamente utilizado para expresar reporteros fluorescentes genéticamente codificados en renacuajo neuronas27. La electroporación se puede hacer usando equipos comerciales o a medida y permite la visualización de estructuras neuronales con una excelente relación señal a ruido28. De manera similar a lo descrito, las poblaciones de la célula con la etiqueta son heterogéneas y difieren de animal a animal. Transgénesis es deseable si el objetivo es investigar una población definida de neuronas22. Por ejemplo, conducir la expresión de indicadores genético codificados calcio como GCaMPs en un grupo restringido de ORNs, podría ser muy útil para investigar la respuesta de un conjunto definido de los terminales presinápticos a olores.
El método descrito con calcio amarillo-verde 1 dextrano informa función terminal presináptica en vivo. La observación de aumento del calcio intracelular es indicativa de una correcta transducción olfativa y la liberación de glutamato a nivel de los glomérulos. Sin embargo, análisis cuantitativo de los cambios en la fluorescencia es limitada. Estimulación de los terminales presinápticos aumenta los niveles de calcio intracelular en el rango micromolar y saturación de un indicador de calcio de alta afinidad como calcio verde debe tenerse en cuenta. Se obtienen los resultados ilustrados en la figura 2 mediante microscopía de campo amplio. Este es el enfoque más sencillo y puede ser implementado en la mayoría de los laboratorios. Mejora mediante el uso de microscopía de dos fotones o reporteros fluorescentes genéticamente codificados podrían permitir obtener más estimaciones cuantitativas de la función presináptica.
Vivo imagen de respuestas de calcio, es fundamental que no hay posicionamiento apropiado del tubo capilar entregando la solución de olor. Debe estar situado por encima de la cápsula nasal y evitar siempre el contacto directo con el tejido. Tanto la entrega correcta de la solución de olor y el flujo de la perfusión deben comprobarse antes de colocar el renacuajo al microscopio. Todos los tubos utilizados para la perfusión deben ser inspeccionados por las burbujas de aire. Cambios del flujo de la solución de aminoácido deban responder inmediatamente a sucesiva apertura y cierre de la válvula de solenoide. Los retrasos son indicativos de la presencia de aire. También es conveniente para comprobar si el volumen correcto aumenta o disminuye de la solución entregada después de cambiar el horario, es decir., de 0,1 s a 1 s o viceversa. Utilice una baja intensidad de luz mientras ajusta los parámetros experimentales (paso 4.6) con el fin de minimizar el fotoblanqueo.
Aunque la importancia del olfato en la biología de los renacuajos es bien establecida29, hay una falta de pruebas de evaluación directamente de comportamiento olfativo guiado en larvas de Xenopus . El método descrito en este documento es una prueba simple que permite la detección de una respuesta a un estímulo de olor en una gran población de animales. La reciente Descripción de la sensibilidad olfativa de los renacuajos de Rana catesbeiana de la presencia de productos químicos en el agua ilustra los mecanismos complejos del olfato de acoplamiento a comportamiento motor30. El ensayo descrito en este documento toma en cuenta la variabilidad intrínseca del comportamiento olfativo guiado en renacuajos. El uso de un plato de 6 pozos en lugar de pozos solo aumenta el rendimiento experimental. Factores que contribuyen a la variabilidad tal motilidad basal, posición relativa a la entrada de la perfusión y plumas generadas por la solución de olor se superan promediando muchos renacuajos. Se requieren aproximadamente 40 mediciones independientes para describir la respuesta atractiva de control para los aminoácidos.
Proponemos dos tipos de análisis para la prueba de olfato. El primer método cuantifica el tiempo de permanencia cerca de la fuente de olor durante un período definido. Está particularmente bien adaptado para el análisis estadístico. El segundo enfoque se basa en la parcela promedio de distancias euclidianas de la fuente de olor y es útil para describir la respuesta temporal a los olores. Ambos tipos de análisis son complementarios y ven generados por los mismos datos. La interpretación es binaria y permite distinguir los animales ese sentido olores de los que lo hacen no10.
¿Cómo podrían los métodos descritos ser útil a la comunidad de Xenopus ? Aunque los métodos son esencialmente ilustrados para animales de tipo silvestre, debe tenerse en cuenta que las posibilidades genéticas se están expandiendo continuamente en el campo de Xenopus . El estudio combinado de las respuestas ORN en vivo y la presencia de comportamiento olfativo guiado también pueden ser muy útiles para investigar el procesamiento correcto de la información olfativa en Xenopus mutantes creados por avanzar o retroceder pantallas genéticas 11. puede combinar la información proporcionada por la proyección de imagen del calcio y el ensayo conductual. Por ejemplo, una mutación que afecta selectivamente a células del gránulo del bulbo olfativo no modificaría la respuesta presináptica de ORNs pero deterioraría probablemente olfativa guiada por comportamiento.
Métodos de asociar las respuestas celulares y de comportamiento in vivo son particularmente relevantes para la disección genética de los circuitos neuronales. La interpretación de los resultados puede ser ayudada por los trabajos morfológicos anteriores, que han proporcionado un mapa anatómico de la capa glomerular en renacuajos31. Información obtenida de rodajas del bulbo olfatorio de los renacuajos de Xenopus 32 también es muy valioso. Proyección de imagen de calcio de las células mitral/tufted en rodajas del bulbo olfatorio ha puesto de manifiesto las características fundamentales de procesamiento olfativo en los renacuajos de Xenopus , como por ejemplo la sensibilidad de ORNs diferentes aminoácidos33 o la relevancia de latencias de respuesta en la codificación de la información olfativa7. Sin embargo, rebanadas de cerebro muestran una limitada capacidad para reproducir los complejos mecanismos integrados asociar diferentes circuitos neuronales por el seccionamiento de numerosas proyecciones neuronales. Además, una caracterización de las propiedades de las unidades individuales glomerulares es esquiva con la excepción de la γ-glomérulo34. La cuestión de si unidades glomerulares determinan comportamientos específicos en los renacuajos sólo se responderán mediante la combinación de herramientas genéticas, en vivo de enfoques y análisis conductuales.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por becas del Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO; SAF2015-63568-R) cofinanciado por Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER), con premios de investigación competitiva de la M. G. F. Fuortes Memorial Fellowship, del fondo de becas de Stephen W. Kuffler, Laura y Arturo Colwin verano investigación beca Fondo , la beca de Fischbach y el gran fondo de generación del laboratorio biológico marino y el nacional Xenopus recursos RRID:SCR_013731 (Woods Hole, MA) donde se llevó a cabo una parte de este trabajo. También agradecemos a CERCA programa / Generalitat de Catalunya para apoyo institucional. A.L. es Serra Húnter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Salts for aquariums (Instant Ocean Salt) | Tecniplast | XPSIO25R | |
| Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| Tweezers #5 (tip 0.025 x 0.005 mm) | World Precision Instruments | 501985 | |
| Vannas Scissors (tip 0.015 x 0.015) | World Precision Instruments | 501778 | |
| Whatman qualitative filter paper | Fisher Scientific | WH3030917 | |
| X. laevis tubb2-GFP | National Xenopus Resource (NXR), RRID:SCR_013731 | NXR_0.0035 | |
| X.tropicalis NBT-GFP | European Xenopus Resource Center (EXRC) RRID:SCR_007164 | ||
| CellTracker CM-DiI | ThermoFisher Scientific | C-7001 | |
| Calcium Green dextran, Potassium Salt, 10,000 MW, Anionic | ThermoFisher Scientific | C-3713 | |
| Borosilicate capillaries for microinjection | Sutter Instrument | B100-75-10 | O.D.=1.0 mm., I.D.=0.75 mm. |
| Puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Microinjector | Parker Instruments | Picospritzer III | |
| Sylgard-184 | Sigma-Aldrich | 761028-5EA | |
| Microfil micropipettes | World Precision Instruments | MF28G-5 | |
| Upright microscope | Zeiss | AxioImager-A1 | |
| Master-8 stimulator | A.M.P.I. | ||
| CCD Camera | Hamamatsu | Image EM | |
| Solenoid valves | Warner Instruments | VC-6 Six Channel system | |
| Dow Corning High Vacuum Grease | VWR Scientific | 636082B | |
| Tubocurarine hydrochloride | Sigma-Aldrich | T2379 | |
| CCD Camera | Zeiss | MRC-5 Camera | Controlled by Zen software |
| camera lens | Thorlabs | MVL8ML3 | There are multiple possibilities that should be adapted to the camera model used |
| Epoxy resin | RS Components | ||
| Manifold | Warner Instruments | MP-6 perfusion manifold | |
| Micromanipulator for local delivery of solutions | Narishige | MN-153 | |
| Mini magnetic clamps | Warner Instruments | MAG-7, MAG-6 | |
| Polyethylene tubing | Warner Instruments | 64-0755 | O.D.=1.57 mm., I.D.=1.14 mm. |
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