Summary
遺伝子および調節配列の物理的な相互作用の同定が困難な染色体構造をキャプチャする方法によって促進されています。これは 4 C seq プロトコルを修正は PCR テンプレートが過大に増幅を最小限に抑えることによって PCR バイアスを軽減、追加制限の酵素のダイジェスト ステップを組み込むことによって読み取りの mappability を最大化します。
Abstract
指定されたターゲット遺伝子の調節配列の同定は、ターゲット遺伝子に規制要素の位置決めと効果サイズの変動により重要な技術的な挑戦をポーズします。存在の bioinformatic 予測と節約されたトランスクリプション要因結合サイトを用いた活性遺伝子発現に関連する近位のエピジェネティックな修飾の機能はいくつかの進歩をしました。クロマチン構造キャプチャ研究シーケンスの間、全体のゲノムの内であっても物理的なクロマチン連絡先を発見する我々 の能力をもたらしました。次世代シーケンス (seq 4 C) と相まって円形クロマチン構造キャプチャは特に、ターゲット遺伝子や規制などの興味 (視点) の指定されたシーケンスのすべての可能な物理的なクロマチンの相互作用を発見する設計エンハンサー。現在 4 C seq 戦略が直接みた内からシーケンスが、多数を必要として制服の技術的な課題を避けるために同時にシーケンスする多様な観点からベース次世代シーケンシング プラットフォーム (画像) を呼び出します。この実験は、多くの実験室の実用的なできない場合があります。ここで、追加の制限の酵素のダイジェストと多様なシーケンス リードの大きいキャプチャを容易にするための潜在性を軽減するために設計されている qPCR ベースの増幅の手順の両方を組み込んだ 4 C seq プロトコルに変更されたアプローチを報告します。PCR バイアス、それぞれ。私たちの修正 4 C 法はクロマチンのアーキテクチャを評価するための標準的な分子生物学研究室に従う義務があります。
Introduction
遺伝子発現の調節配列の同定は、人間のゲノムの1,2の 80% の機能活動を包括的に注釈百科事典の DNA 要素 (エンコード) プロジェクトによって促進されています。個々 の細胞のタイプの DNA メチル化の修正とエピジェネティックなヒストン DNaseI の過敏症、生体内の転写因子結合部位の同定舗装候補の規制の機能解析の方法ターゲット遺伝子の表現のための要素。これらの知見を武器に、私たちは規制要素と遺伝子の機能的な相互接続性の決定への挑戦に直面されます。具体的には、指定されたターゲット遺伝子とその enhancer(s) との関係は?クロマチン構造のキャプチャ (3 C) メソッド直接関心領域と固定クロマチン3 でキャプチャしたイベントを使用してシーケンスを操作する候補の識別物理的、および可能性があります機能、相互作用によってこの質問に対応します。.クロマチンの相互作用への理解が増すにつれ、しかし、それは事前に選択された候補遺伝子座の調査は遺伝子エンハンサーの相互作用の完全な理解を提供するために不十分である明らかです。たとえば、エンコードは人間のゲノム (1%、パイロット 44 座の設定) のごく一部を調べる高スループット染色体構造キャプチャ カーボン コピー (5 C) 方法を使用し、軌跡の複雑な相互接続性を報告しました。遺伝子と特定された相互作用の増強物多かった線形空間4で離れて kilobases の何百も、2-4 複数の相互作用パートナーの平均。さらに、李ら。対終了タグのシーケンス (嘉ペット) によるクロマチン相互作用解析を使用して全ゲノム プロモーターの相互作用を分析し、RNA ポリメラーゼ II 結合部位の 65% がクロマチンの相互作用に関与していたことを発見します。これらの相互作用のいくつかで起因した大きい、多遺伝子複合体のゲノムの距離、平均を含んでいる kilobases の何百ものスパニング 8 9 遺伝子各5。一緒に、これらの調査結果は、公平なの全ゲノムは染色質相互作用を尋問法の必要性を強調表示します。これらのメソッドのいくつかは、シュミットらで審査されます。6。
最近クロマチン構造キャプチャ研究法と相まって次世代シーケンス (やあ-C と 4 C seq) 有効にする関心6の領域と相互作用する未知のシーケンスの発見。具体的には、次世代シーケンス (seq 4 C) の円の染色体構造のキャプチャは遺伝子座のキャプチャされたクロマチンに近位から DNA の配列によって公平に7に興味のシーケンスとの相互作用を識別するために開発された、3 D 空間に関心の領域。簡単に言えば、クロマチンは、制限の酵素と裂かれ、相互作用する遺伝子座 (図 1) の生物学的関連性の高い「もつれ」をキャプチャする希釈条件下で結紮後そのネイティブ蛋白質 DNA の相互作用を維持するために固定されています。相互リンクは、このように 2 番目の制限の酵素と追加胸の谷間の DNA を残して、タンパク質を削除に逆です。最終的な結紮は、相互作用する遺伝子座の小さい円を生成します。興味のシーケンスにプライマーは、下流の次世代シーケンシングに続いて円形のフラグメントから未知のシーケンスの増幅されたライブラリを生成する使用されます。
既存 4 C seq メソッド8,9,10、11,12に 2 つの主要な変化を試料に焦点を当てて、ここでは、提示されたプロトコルになります。まず、qPCR ベースのメソッドを使用して、経験的判断増幅の最適数 4 C seq ライブラリの準備手順のサイクルし、このようにライブラリが過大に増幅から生じる PCR バイアスの可能性を軽減します。第二に、それはシーケンス装置による正確な基本通話を妨げるし、したがって、それぞれの読み取りにユニークな有益なシーケンスを最大化する知られていた「餌」シーケンスの均一性を減らすための努力で、追加の制限のダイジェスト ステップを使用します。他のプロトコルは、異なる餌シーケンスおよび/または制限のサイト、他の所で達成可能ではないかもしれない実験の量を多く (12-15)8 4 C seq ライブラリをプールすることによってこの問題を回避します。ここに示す変更許可少数の実験のサンプル、および/またはインデックスし、1 車線にプールにレプリケートされます。
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Protocol
1 制限酵素の選択
- 関心領域を識別 (e.g。、一塩基多型 (SNP) 遺伝子プロモーター、エンハンサー) と生物工学情報 (NCBI) のための国立センターなどのリポジトリから DNA 配列を取得。
- 最初制限酵素消化 (RE1) 後消化、再粘着末端 (オーバー ハングとテルミニ DNA) をプロデュースする、興味のシーケンス内で、カットしないとその活動は阻害されなかった候補者制限の酵素 (解像度) を識別します。CpG メチル化。
注: データの解像度は、RE1 によって決定されます。6 塩基対 (bp) 認識シーケンスを持つ酵素を生成する平均の長さの断片約 4 kilobases (kb) 4 bp 認識シーケンスをもつ酵素を作り出すより正確が可能な長さの断片約 250 bp 間相互作用シーケンスの id。 - 興味の地域または近隣地域を含む長い「観点」制限のフラグメント、少なくとも 500 bp を生成するステップ 1.2 で識別された候補者酵素から、RE1 を選択します。
注: 選択した酵素はプライマーに従う必要があります設計 (手順 2 を参照)。 - 2 つ目の消化消化、CpG メチル化によってその活動を阻害されない、それは制限内カット再後粘着末端 (オーバー ハングとテルミニ DNA) を生成する 4 bp 認識シーケンスを制限酵素 (RE2) を特定します。250 – 500 bp ベイト フラグメント (図 1) を生成する RE1 によって生成されたフラグメント。
注: 選択した酵素はプライマーに従う必要があります設計 (手順 2 を参照)。
2 設計およびテスト反対 PCR と消化効率 qPCR 用プライマー
-
Primer3 などのプライマー設計ツールを使用して、餌のフラグメントの端に向かって外側に指示される逆プライマーを設計する (http://primer3.ut.ee) (すなわち、5' プライマーは"逆"プライマー 3' プライマーはプラス鎖と相補的、」。転送"マイナス鎖に相補的なプライマー) と非報知的な餌の拡大を最小限に抑えるため可能な限り制限のサイトのシーケンスし、PCR 効率 (図 2 a) に近い。
注: プライマー PCR 予測インシリコによる予測、genomic DNA から最小限の非特異的増幅をしている必要がありする必要がありますと合っていない他の場所で目的のターゲット以外のゲノムの以上 16/18 アイデンティティ9。逆のプライマー シーケンス アダプターされていません、プライマー結合のサイトは他の 4 C の準備方法でより柔軟です50 以内にプライマーがアニール最適対応する制限サイトの最後の bp。- 浄化された DNA (gDNA) をテンプレートとして使用して増幅して逆 PCR のプライマーの特異性を確認します。
- 最適なプライマーでは、gDNA をテンプレートとして使用する場合、いくつかの製品を得られるはず (ステップ 11.2 を期待の 4 C 製品の説明を参照)。GDNA から大幅な増幅が発生した場合は、新しいプライマーを設計します。許容プライマー セットを識別できない場合、ステップ 1 に戻り、新しい制限の酵素を選択して新しい餌を選択します。
-
QPCR 制限消化効率 (図 2 b) を監視する、長さ 70-200 塩基 (nt) フラグメントを増幅するプライマーを設計します。
- 餌の順序を定義する (手順 1 で選択) 各制限サイト全体を増幅するプライマーの 1 つのペアを設計します。両方の RE1 のプライマーを設計 (手順 6.5.6 参照) と RE2 サイト (ステップ 9.2 を参照してください)。
- RE1 と RE2 (また見なさいステップ 6.5.6) の正規化コントロール (ノーカット DNA) としていずれかの制限の酵素のサイトを含まない領域を増幅するプライマー セットを設計します。
3. セルのコレクション
- ティッシュか細胞培養に適したメソッドを使用して、単一細胞懸濁液を得る。200 x gで 5 分間細胞のペレット、上澄みを廃棄し、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 10 の7セルごと x 1 の 500 μ L でペレットを再懸濁します。
4. ホルムアルデヒドはクロマチンの相互作用を維持するために細胞の架橋
- 10 の7セルあたり 1% 電子顕微鏡検査 (EM) の 9.5 mL を追加-(メタノール フリー) PBS でホルムアルデヒド等級し、インキュベート、ロッカーにタンブリング (または類似の) 中、室温 (RT、18-22 ° C) で 10 分。
注: セル タイプごとに最適化する固定条件があります。マウス細胞の前の出版された仕事は、その最適な固定マップリード平均大きさで分類された染色体のテロメア非地域を想定してみた9を含む染色体への位置合わせの少なくとも 40% の結果報告。 - 氷し、冷たい 1 M のグリシンを加える 0.125 M (1.425 mL) 架橋反応を抑制するための最終的な集中に反応管を転送します。穏やかなインバージョンによるミックスします。
- 200 x g、4 ° C で 5 分間遠心し、すべての上澄みを慎重に取り外します。-80 ° c 細胞ペレットを格納またはセル換散に進んでください。
5. セル換散
- 500 μ L 5 mM エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) を洗浄するのに手順 4.3 から細胞ペレットを再懸濁します。上清 200 x g RT。 破棄で 5 分間遠心します。
- 5 mM EDTA 0.5% ドデシル硫酸ナトリウム (SDS) の 125 μ L の細胞ペレットと 1 x プロテアーゼ阻害剤、100 x 10 mg/mL ペプスタチン a.、10 mg/mL leupeptin 10 mg/mL ヒトデ 5 mg/mL 質を含むカクテルなどを再懸濁します
注: セル タイプごとに最適化する洗剤濃度があります。不十分な洗剤の濃度は、不完全なセル換散、クロマチンを制限酵素にアクセスできないままになります。制限の消化力は永続的ステップ 6.5.6 の低され、酵素の活動が確認されている、その他洗剤が必要な可能性があります。0.1% 単位で SDS の濃度を増やします。 - 10 分間氷の上細胞懸濁液を孵化させなさい。
注: プライマリ ヒト角の最適な換散達成された撹拌 (900 rpm) で振動加熱ブロックで 37 ° C 一晩インキュベート続いて 65 ° C で 10 分間インキュベーションを使用します。 -
そのセル換散は完全なを確認します。
- ミックス 6 μ L 細胞のスライドおよび観察とカバーのトリパン ブルーの 6 μ L。顕微鏡下で見る。
注意: 成功した溶解時に細胞の内部が表示されます青と非分離セルを白に表示されます。 - セル換散は不十分な表示され、200 x gで 5 分で細胞のペレット、上清を保存します。ペレットを再懸濁します、手順 5.2-5.4 および/またはまた異なる培養温度 (ステップ 5.3 の注を参照)。
- 保存した上清を分離再ペレットを結合し、進みます。
注: 目視検査は十分な換散を保証するものではありません。6.5.6 のステップのように客観的に消化効率決定してください。
- ミックス 6 μ L 細胞のスライドおよび観察とカバーのトリパン ブルーの 6 μ L。顕微鏡下で見る。
6. 最初の制限の消化力
- 制限酵素バッファー (製造業者によって指定) x 10 の 30 μ L と 20% の 27 μ L を追加ステップ 5.4 の懸濁液にトリトン X-100 (最終的な 1.8%)。総容積をもたらす 300 μ L H2o.
注: 制限酵素バッファーの組成は、ステップ 1 で選択した日時に依存します。 - 「未消化制御」と 4 ° C でストアとして 15 μ L 分注を削除します。
- 残りの反応混合物を 200 U RE1 を追加し、攪拌 (900 rpm) と振動加熱ブロックで酵素に適切な温度で一晩インキュベートします。次の日は、追加 200 U RE1 を追加し、一晩培養を続けます。
- 「消化のコントロール」として割り切れる 15 μ L を外し、4 ° C で保存
-
消化効率を決定します。
- 手順 6.2 6.4 から 15 μ L のサンプルを 10 mM トリス塩酸 pH 7.5 の 82.5 μ L を追加します。プロティナーゼ K の 2.5 μ L (20 mg/mL) を追加し、65 ° C で 1 時間インキュベート
- フェノール-クロロホルムの 100 μ L を加え、残留蛋白質の汚染を削除する逆解析による積極的に混ぜます。16,100 x g室温で 5 分間遠心します。
- 水相を新しいチューブに転送します。6.66 μ L の 3 M ナトリウム酢酸 pH 5.2、20 mg/mL グリコーゲンの 1 μ L と 100% エタノール (エタノール) の 300 μ L を追加します。ゆっくり反転して-80 ° C 1 時間でミックス。
- 4 ° C で 16,100 x gで 20 分間遠心上澄みを除去、室温 16,100 x gで 70 %etoh、5 分間遠心する 500 μ L を追加
- 上澄みを除去し、2 分は、ヌクレアーゼ フリー H の 50 μ L でペレットを再懸濁しますの室温でペレットを乾燥2o.
- QPCR13,14 ∆∆Ct メソッドを使用してダイジェスト効率を決定します。制限サイトのない側面を設定プライマーを使用 (手順 2.2.2 参照) 正規化コントロールとして。消化効率が場合を続行 > 85%。それ以外の場合、セルをペレット、手順 5.2-6.5、ステップ 5.3 65 ° C に加温を省略する.
7. 最初の結紮
- 熱-65 ° C で 20 分の孵化によって制限酵素を不活性化します。また、酵素が不活化熱をすることができない場合フェノール-クロロホルム抽出し、エタノール沈殿物サンプル。
注: いくつかの制限の酵素の推奨より高い不活化温度は、クロマチンの蛋白質を変化し、サンプルの質に悪影響をこの可能性があります。さらに、それはサンプルの損失の結果として、フェノール: クロロホルム抽出は理想的ではないです。 - 50 mL の円錐管に移し、ヌクレアーゼ フリー H の 6 mL を加えて 50 U T4 DNA リガーゼ、リガーゼ バッファー (660 mM トリス塩酸 pH 7.5、50 mM 塩化マグネシウム (MgCl2) 10 mM ジチオトレイトール (DTT) 10 mM アデノシン三リン酸 (ATP)) x 10 の 700 μ L2O。旋回で穏やかに混合および 16 ° C で一晩インキュベート
- 「結紮制御」としてサンプルの 100 μ 因数を削除します。
-
ライゲーション効率を決定します。
- プロティナーゼ K (20 mg/mL) の 2.5 μ L を追加し、65 ° C で 1 時間インキュベート
- インバージョンによるフェノール-クロロホルムとミックスの 100 μ L を積極的に追加します。16,100 x g室温、5 分間遠心
- 水相を新しいチューブに転送します。3 M ナトリウム酢酸 pH 5.2、グリコーゲンの 1 μ L と 100% の 300 μ L の 6.66 μ l 添加エタノール。ゆっくり反転して-80 ° C 約 1 h でミックス。
- 4 ° C で 16,100 x gで 20 分間遠心上澄みを除去、4 ° C で 16,100 x gで 70 %etoh、5 分間遠心する 500 μ L を追加
- 上澄みを除去し、室温でペレットを乾燥します。20 μ L の水でペレットを再懸濁し、ステップ 6.5 から「消化のコントロール」の横にある 0.6% の agarose のゲルにロードします。
メモ: よく結紮のサンプルは比較的タイトな高分子量バンド (図 3) として表示されます。 - 結紮で十分な場合は、ステップ 8 に進みます。それ以外の場合、新鮮な ATP (最終濃度が 1 mM) および新しいリガーゼ; を追加します。16 ° C で一晩インキュベートし、7.3 – 7.4 の手順を繰り返します。
8. 逆に架橋とクロマチンを分離
- プロティナーゼ K (20 mg/mL) の 15 μ L を追加し、架橋を逆に 65 ° C で一晩インキュベートします。
- RNase A (10 mg/mL) の 30 μ L を追加し、37 ° C で 45 分を孵化させなさい
- インバージョンによるフェノール-クロロホルムとミックスの 7 mL を積極的に追加します。遠心 15 分、3,300 x gで RT。
- 新しい 50 mL のチューブに水相を移し、ヌクレアーゼ フリー H の 7.5 mL を加えなさい2O (DNA の沈殿物をリガーゼ バッファー内の DTT をうすめる)、3 M ナトリウム酢酸 pH 5.6、グリコーゲン (20 mg/mL) の 7 μ の 1 mL、と 100% の 35 mL EtOH。混合し、-80 ° C 1 時間で孵化させなさい。
- 遠心分離機の 4 ° C で 3,900 × g 20 分上澄みを除去 (ペレットは見えにくい可能性があります)、氷 70 の 10 mL の餌を洗浄 %etoh と遠心 15 分、4 ° C で 3,300 × g
- 上澄みを除去し、簡単に右ディゾルブ 37 ° C で 10 mM トリス塩酸 pH 7.5 の 150 μ L のペレットでペレットを乾燥-20 ° C で保存か、ステップ 9 に進みます。
9 つ目の制限の消化力: トリミング円
注: この手順は、下流増幅の手順で PCR バイアスにより小さいキャプチャされたフラグメントの overrepresentation を最小化すると小さい円を作成します。
- 手順 8.6 からサンプル、制限酵素バッファー (製造業者によって指定) x 10 の 50 μ L を追加 300 μ L のヌクレアーゼ フリー H2O、および 50 U 制限酵素 RE2。選ばれた酵素の適切な温度で一晩インキュベートします。
- 「消化のコントロール」としてサンプルの 15 μ 因数を削除します。ステップ 6.5 で説明されているように消化効率を決定します。
10 2 番目の結紮と DNA 精製
- 製造業者によって推薦されるように制限酵素を不活性化します。酵素は熱不活化することができない場合は、列に基づく精製キットを使用して酵素を削除します。
注: これはサンプルの損失の結果により, カラム精製は適していません。 - 50 mL のチューブにサンプルを転送し、ヌクレアーゼ フリー H の 12.1 の mL を追加し2O、結紮バッファー (660 mM トリス-HCl、pH 7.5; 50 mM MgCl2; 10 mM DTT; 10 mM ATP) x 10 の 1.4 mL、100 U T4 DNA リガーゼ。16 ° C で一晩インキュベートします。
- 467 μ L の 3 M ナトリウム酢酸 pH 5.6、ヌクレアーゼ フリー 233 μ L を追加 H2O, 7 μ L グリコーゲン (20 mg/mL)、および 35 mL 100% エタノール。よく混合し、-80 ° c 1 時間孵化させなさい。
- 遠心分離機の 45 分、4 ° C で 3,900 x g上澄みを除去、冷たい 70 の 10 mL を追加 %etoh と遠心 15 分、4 ° C で 3,300 × g
- 上澄みを除去し、簡単に室温でペレットを乾燥します。10 mM トリス塩酸 pH 7.5 の 150 μ L を追加し、ペレットを溶解する 37 ° C で孵化させなさい。
- シリカ カラムベースの PCR 精製キット、製造元の指示に従ってサンプルを浄化します。3 x 10 の6セル、セル数の初期値に基づくあたり 1 列を使用します。10 mm トリス-HCl、pH 7.5 50 μ L で列を溶出し、サンプルのプールします。
- /蛍光定量または 260 で吸光度を用いた吸光光度法による濃度の測定 nm。4 C テンプレートは、逆 PCR の準備が整いました。-20 ° C で保存したり、直接手順 11 に進みます。
11. PCR 増幅逆 PCR による未知の相互作用のシーケンス
- 12.5、25、50、および 100 ng 4 C テンプレートのテンプレートの希釈液を使用して PCR を行い、増幅器の線形の範囲を決定します。必要な場合は、非特異的増幅を識別するために製品を直接比較する並行 gDNA から増幅します。PCR 反応初期変性 94 ° C で 2分; を実行します。30 サイクル 10 94 ° C で変性のステップから成る s、55 ° c 1 分、アニーリング ・ ステップ、3 分; 68 ° C で拡張ステップ5 分の 68 の ° C で最終的な拡張子。
- リニア増幅を確認し、テンプレートの品質 (図 4) を評価する 1.5% の agarose のゲルの各 PCR の製品の 15 μ L を区切ります。4 C テンプレートから増幅 DNA の低濃度と高濃度時のスミアで離散バンディングを得られるはず。塗抹標本の存在は、増幅の 4 C の複雑さの増加を示します。
-
生成される逆の PCR の製品の量と質に満足して、セットアップ、qPCR 増幅に使用するサイクルの最適な数を決定します。
- 反応混合物を使用して表 2サイバーと ROX の染料を含む反応を設定します。ない限り、増幅ですステップ 11.2、反応あたりテンプレートの使用 100 ng の高濃度で線形。
注: ロックスの添加は、井戸からもとサイクル蛍光信号の正規化を促進します。 - 94 ° C で 2分; 初期変性を用いた PCR の反作用を実行します。40 サイクル 10 94 ° C で変性のステップから成る s、55 ° c 1 分、アニーリング ・ ステップ、3 分; 68 ° C で拡張ステップ5 分の 68 の ° C で最終的な拡張子。
- 増幅のプロットを使用して反応のピーク (エンドポイント) 蛍光性を決定します。反応を蛍光ピーク (図 5) の 25% に達するサイクルを決定します。
注: これは (ステップ 11.4 を参照) 4 C ライブラリを増幅に使用するサイクル数です。
- 反応混合物を使用して表 2サイバーと ROX の染料を含む反応を設定します。ない限り、増幅ですステップ 11.2、反応あたりテンプレートの使用 100 ng の高濃度で線形。
- 4 C テンプレートから餌に結紮未知のシーケンスを増幅する逆の表 3のように PCR を設定します。実行する前に 50 μ L の 16 の反応に分割します。PCR 反応を用いた初期変性 94 ° C で 2 分と 10 94 ° C で変性のステップからなるサイクルを実行 s、55 ° c 1 分ステップ アニール処理と 68 ° c で 3 分間拡張ステップ ステップ 11.3.3 で決定した回数を使用します。
- 収集し、反応をプールします。シリカ カラムベースの PCR 精製キットを使用して浄化します。16 反応あたり少なくとも 2 つの列を使用します。精製 PCR 産物をプールします。
- 吸光光度法によるサンプル量と純度を決定します。典型的な収穫は、A260/A280 〜 1.85 と 10 〜 20 μ g の間です。吸収率が最適なら、再シーケンス処理中に問題を防ぐために浄化します。
- 300 を分離することによってライブラリの複雑さを評価する 1.5% の agarose のゲル精製 PCR の製品の ng。
注: 増幅産物ようになります手順 11.2 から。
12 番目の制限の消化力: シーケンスの餌を切り落とす
注: この手順は、下流シーケンスの手順で有益なキャプチャ シーケンスを最大化する逆の PCR の製品から非報知的な餌のシーケンスを削除します。ダイジェストの効率を監視するには、「ダイジェスト モニター」15は同等の DNA や酵素の濃度を使用して並列に消化されます。RE1 と RE2 に同時消化に互換性がない場合たとえば、異なる最適な培養温度や反応バッファーのためこれ行う必要があります (これは理想的ではない) シーケンシャル ダイジェストとして。
- 日時ダイジェスト モニターを取得し、50 μ L 反応で消化をテストします。
注: これは日時サイトが含まれている (たとえば、プラスミド、PCR 増幅、または合成 DNA) dsDNA の分子です。唯一の要件は、それが agarose のゲルのノーカットのモニターからカットを区別する簡単なはずです。最適化再モニター質量と酵素濃度は必要な場合。 - ステップ 11.6 からと並行して、ステップ 12.1 から日時モニター精製の逆 PCR の製品のダイジェスト 1 μ g。
注: DNA 酵素濃度と培養時間、する必要があります手順 12.1 逆の PCR プロダクトの両方のためにテスト ダイジェストとモニター ダイジェストと同じ。必要に応じて反応のボリュームを調整します。 - モニター再予想されるフラグメントの適切な濃度の agarose のゲルで、消化を実行します。場合、消化は十分ある < DNA の 10% のままノーカット (図 6)。
- シリカ列に基づく DNA 精製キットの消化の逆 PCR の製品を浄化します。シーケンシャルのダイジェストが必要な場合は、2 つ目の酵素で 12.1-12.4 手順を繰り返します。
13. シーケンス ライブラリの準備
-
それぞれ次世代シーケンシング プラットフォームと互換性のあるアダプターを縛る。
- 各 RE1 と RE2 のアダプターを設計するようにする、oligos をアニール後各日時アダプターがあるそれぞれ 1 つのサイド オーバー ハング。
注: たとえば、HindIII を使用する場合焼なましアダプター含める必要があります 5' リン酸化 agct 2008 年「7」オーバー ハング。また、標準 T オーバー ハング アダプターを使用する場合 end-修理と A 尾アダプター結紮前にライブラリ。 - それぞれのアダプター日時 oligos をアニールします。アニーリング バッファー (10 mM トリス、pH 7.5、50 mM 塩化ナトリウム (NaCl)、1 mM EDTA) で oligos を再懸濁します、50 μ M、95 ° c の熱に等モル量混合および 25 ° C にゆっくりと冷却すること
- Ligation の反作用を実行します。合計 5 〜 10 倍モルの過剰焼なましアダプター (ステップ 13.1.2; 使用各日時アダプターの 50: 50 の比率) をリガーゼ バッファー x 1 再消化 4 C ライブラリをミックスし、6U DNA リガーゼを追加します。製造元の指示に従って、インキュベートします。
- 低溶出シリカ系カラムのキットを使用して浄化することによって余分なアダプターを削除します。
- 各 RE1 と RE2 のアダプターを設計するようにする、oligos をアニール後各日時アダプターがあるそれぞれ 1 つのサイド オーバー ハング。
-
サイズ選択します。
注: サイズの選択はビーズに基づくクリーンアップ キットを使用して行うことが、カラム精製後も推奨されます。- 注ぐ前に非 UV 染色を追加する高解像度の agarose を使用して 2% アガロースゲルをキャストします。前にボトルやフラスコを加熱し、質量の喪失を回復する水を追加した後計量で加熱蒸発により失われた水を置き換えることを確認します。
- サンプル間の空の車線を残して、ゲルでアダプター結紮ライブラリを実行します。
- きれいなメスまたはかみそりの刃を使用して 1 kb にサイズ範囲 150 bp に対応するゲルのスライスを切除します。
- ゲル抽出キットを使用してゲルからライブラリを浄化します。DNA の回復に GC バイアスを最小限に抑えるために回転を室温でゲルのスライスを溶解します。
- QPCR表 4に反応混合物を使用して pcr のサイクル数を決定します。2 分の 98 ° C で初期変性を用いた PCR 反応を実行し、変性から成る 40 サイクル ステップ 10 98 ° C で s、60 ° c 1 分、アニーリング ・ ステップ、72 ° C、3 分で拡張ステップ。
注: 蛍光が最大値の 25% に到達するサイクルは、増幅ステップ 11.3 と同様に、ライブラリに使用するサイクル数です。 - 表 5に反応混合物を使用してライブラリを増幅します。PCR 反応を用いた初期変性 98 ° C で 2 分と 10 98 ° C で変性のステップからなるサイクルを実行 s、60 ° c 1 分、アニーリング ・ ステップ、72 ° C、3 分で拡張ステップ。各ライブラリのための拡大のサイクルの数はステップ 13.3 で定められました。
- 低溶出シリカ系カラムのキットを使用して増幅されたライブラリを浄化します。
14. シーケンスとシーケンス データ解析
- 蛍光アッセイを使用して増幅されたライブラリの濃度を決定します。配列 (シーケンス サービスまたは、推奨事項をコアにチェック) するための適切な濃度にライブラリを希釈します。
- マイクロ流体核酸解析プラットフォームを使用してライブラリの品質を決定します。
注: ライブラリのサイズのプロファイルはステップ 13.2 でサイズ選択ゲルで見たをミラーする必要があります、このステップで決定したサンプルの濃度がシーケンスに使用します。 - プールは、サンプルあたり少なくとも 300 万読み取り (少なくとも 50 bp を読む; シングル [1 X 50] またはペア終了 [2 × 50]) を取得するライブラリをインデックス付き。高品質ライブラリに少なくとも 100 万マップ読み取り9、しかしマッピング中にいくつかの消耗がある必要があります。たとえば、レーン当たり約 1 億 5000 万読み取りを生成シーケンス処理プラットフォームは、シングル レーンで最大 50 サンプルを収容できます。
15. シーケンス データの解析
- インデックス シーケンスを使用して読み取りを適切なサンプルに割り当てることによってデータをデマルチプレックスします。
メモ: 理解度に応じてユーザー可能性があります実行基本的なコマンド ライン インターフェイスまたは、web ベースの使いやすい Galaxy グラフィカル ユーザー インターフェイス (GUI)16を使用して raw の FASTA/FASTQ シーケンス ファイルの下流の計算解析. - トリムのアダプター シーケンス、たとえば消化手順 12 で再不完全から生じる、高速 X ツールキット (http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/) を使用して任意の餌のシーケンス。
- デマルチプレクスされた読み取り関心の適切なゲノムにマップ (e.g。、UCSC mm10、hg19) 巣穴輪アライナ (BWA)17またはサムの結果他アライメント ソフトウェアを使って出力ファイル。必要な場合、BAM に samtools18を介して SAM ファイルを変換 (15.4 手順を参照してください)。
- FourSig22 FourCSeq21, や 4 C カー20Basic4Cseq19など 4 C seq 解析パイプラインを使用して、データを分析し、相互作用を特定します。
注: 選択したソフトウェア パッケージのリファレンス ・ マニュアルによるとにデータ解析とその品質の評価を実施しなければなりません。パッケージは、特に明記されている場合を除きベッド出力ファイルを生成します。簡単に言えば、Basic4CSeq19は (txt、tiff、ベッド、およびかつら出力ファイル) の相互作用を視覚化する入力の SAM ファイル (手順 15.3) を使用し、ヴァン ・ デ ・ Werkenらの基準に基づくデータの品質を評価します。9 4 C カー20 (入力トリム ステップ 15.2 FASTQ) FourCSeq21 (入力 BAM、ステップ 15.3) 識別条件間の差分の相互作用と。fourSig22 (入力 SAM) はまた重要な相互作用を識別し、再現される可能性のあるそれらの優先順位。ゲノム規制強化の注釈ツール (偉大な)23、またはエンコード データ セットとの統合などのツールも 4 C シーケンスによって発見された相互作用の生物学的機能を予測する使えます
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Representative Results
プライマリ ヒト角 2-3 捨てられた新生児包皮から分離した、プール、および補足 KSFM で培養した 30 μ g/ml ウシ脳下垂体抽出物、0.26 ng/mL 組換えひと上皮成長因子、0.09 mM 塩化カルシウム (CaCl2) 37 ° c、5% 炭酸ガス。セルに分割された 2 つのフラスコと 1 つのフラスコ増殖から 1.2 mM 72 h 107セルのための最終的な集中に CaCl2の付加によって区別された人口の 1% に固定されたケラチノ サイトの分化室温で 10 分間のホルムアルデヒド。別に、K562 細胞は 37 ° c、5% 炭酸ガス 10% 牛胎児血清添加 RPMI で栽培されました。10 の7セルは、室温で 10 分間の 1% のホルムアルデヒドで修正されました。
細胞を溶解し, と固定のクロマチンは HindIII で消化され、前述の結紮します。クロスリンクを反転させたと DNA の精製し CviQI を消化します。DNA は結紮、逆 pcr のテンプレートとして使用されます。プライマー使用された: 5'-GATCAGGAGGGACTGGAACTTG/5 '-CCTCCCTTCACATCTTAGAATG。225 と並行して、CviQI で精製した逆 PCR 製品の 1 μ g は一晩消化された日時の ng モニターを消化し、カラム精製します。精製した DNA は、消化された一晩 HindIII で 125 と並行して RE の ng モニターを消化し、カラム精製します。250 精製した二重消化逆 PCR 製品の ng は、ライブラリの準備のため使用されました。簡単に言えば、両端は、5'-リン酸化への変換と鈍端とそれに続く DNA 列浄化修復されました。両端で 1 U Taq ポリメラーゼと 200 μ M dATP 50 μ L 反応 72 ° C 20 分を A 尾、カラム精製します。互換性のあるアダプターは、T4 DNA リガーゼを使用して、30 の 10:1 (アダプター: DNA) 比で結紮したライブラリの準備をシーケンス μ L 反応室温 15 分と DNA の列-精製。ライブラリを実行した 2% の agarose のゲルのゲルのスライスは 120 からカットされたアダプター、およびライブラリを削除するはしごの一番上に bp を精製しました。各ライブラリの 200 pg は最適な PCR 増幅サイクルを決定するインデックスのプライマーを含んでいる 10 の μ L qPCR 反応で評価しました。QPCR によって決定され、HiSeq2500 でシーケンス処理サイクル数を使用して 1 × 50 の読み取りを取得するインデックスを追加するライブラリが増幅されました。
読み取りは、反多重送信され、トリミングします。まず、シーケンス アダプターが削除されました。その後、制限サイト各プライマーの先頭から順にトリミングされました。これにより、ライブラリの準備の前に完全に消化されたない逆の PCR の製品のマッピング。重要なは、プライマー結合部位と制限サイト間のシーケンスを含む - 具体的には増幅される非 PCR の製品のマッピングを防止します。Hg38 にマップされているトリミングされた読み取り BWA を使用します。図7 は、視点の周囲領域にマッピングを読み取ります。
図 1: 4 C シーケンシャル ワークフローのスケマティック。クロマチンは、蛋白質 DNA の連絡先を維持するために架橋が RE1、消化され、相互作用する遺伝子座をリンクする結紮します。クロスリンクを逆にして DNA は RE2 と消化され、結紮します。未知の相互作用のシーケンスは、関心の領域にバインドのプライマーを用いて増幅され、PCR の製品が知られていたシーケンスをトリミングするには、RE1 と RE2 消化します。不明なシーケンスの増幅された DNA は、アダプターを結紮し、ライブラリが PCR 増幅し、シーケンス シーケンス ライブラリ準備で使用されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: プライマー設計の概略図。(A) バインディングの逆 PCR のプライマーのサイトします。プライマーが「外側」向き (すなわち。 5' プライマーは"逆"プライマー、3' プライマー中、プラスの繊維に補足は「進む」プライマー、マイナス鎖に相補的な) 50 内のバインドと bp (赤で示される各制限サイトのシェーディング)。(B) バインドの制限の酵素のダイジェストの効率を決定するための qPCR プライマーのサイトします。1 つのプライマーは側面ごとの制限の酵素のサイトです。コントロール入門セットは、いずれかの酵素のサイトが含まれていないし、DNA 入力の Ct 値を正規化するため、シーケンスを増幅します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: RE1 消化クロマチンのライゲーション効率を評価するために Agarose ゲル電気泳動。フェノール: クロロホルム抽出、エタノール沈殿との再懸濁の H2O を精製した DNA は 0.6% の agarose のゲルのバンドにより可視化された実行された、ノーカットで結紮、HindIII 消化サンプルされたプロティナーゼ K と扱われ、架橋を逆に加熱エチジウム ブロマイド染色 1 kb とはしごとの比較。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4:4 テンプレート滴定逆 PCR 。シリアル希薄された 4 C テンプレート、逆の PCR の反作用で使用されます。PCR の製品の 1.5% の agarose のゲルを実行、エチジウム ブロマイド染色 1 kb とはしごの横で可視化しました。NTC は no テンプレート コントロールの反応を示します。テンプレートの濃度の増加と増幅の相関増加に注意してください。この代表的な増幅を行った HindIII として RE1 と RE2、として CviQI 切断クロマチンと逆 pcr 用プライマー シーケンスされた 5'-GATCAGGAGGGACTGGAACTTG/5 '-CCTCCCTTCACATCTTAGAATG。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: 逆 PCR のテンプレートの増幅に必要な増幅サイクルの qPCR による定量します。4 C テンプレート SYBR グリーン x 1 および 1 を含む反応で増幅されたリアルタイムたちの x ROX。蛍光ピークとピーク蛍光の 1/4 に達するに必要なサイクルの数を求めた。この回数は、逆 PCR 4 C テンプレートを増幅する使用されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6: の Agarose のゲルの電気泳動は十分な消化を示すモニター再消化します。ダイジェスト再モニターはプライマー f: 5'-TCCTATCCCTGGTCTGTCTTAT と r: 5'-CCACATTGGTCCTTCTAGTCTTC を使用して人間の genomic DNA からの増幅、浄化されます。225 モニターの ng は 25 ° C で 50 μ L 反応が一晩で 15 U CviQI で消化され、1 kb プラスはしごと一緒に 1.5% の agarose のゲルを実行します。バンドは、エチジウム ブロマイド染色で視覚化しました。ノーカットのモニターは 2515 bp;フラグメント サイズは、132、343、488, 539, 1013 跪く期待この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 7: 読み取り範囲 5 kb の視点地域の代表的なゲノム トラック。トリミングとにマップされた hg38 は、BWA を使用していたを読み取ります。読み取り (青い山) の大半は、期待どおりに、HindIII サイトに隣接する同一または CviQI サイトで合わせます。視点の領域は、赤色でハイライトされます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| 1 x のボリューム | |
| 10 倍長いテンプレートのバッファー 1 を展開します。 | 2.5 Μ L |
| dNTPs (10 mM) | 0.5 Μ L |
| 前方のプライマー | 35 pmol |
| 逆プライマー | 35 pmol |
| 長いテンプレートのポリメラーゼを展開 (5 U/μ L) | 0.35 Μ L |
| DNA | |
| ヌクレアーゼ フリー水 | 25 μ L を |
表 1: PCR 反応混合物の 4 C テンプレート (ステップ 11.1) の増幅。
| 1 x のボリューム | |
| 10 倍長いテンプレートのバッファー 1 を展開します。 | 1.5 Μ L |
| dNTPs (10 mM) | 0.3 Μ L |
| 前方のプライマー | 21 pmol |
| 逆プライマー | 21 pmol |
| 100 x サイバー グリーンします。 | 0.15 Μ L |
| 50 x ROX | 0.3 Μ L |
| 長いテンプレートのポリメラーゼを展開 (5 U/μ L) | 0.21 Μ L |
| DNA | 100 ng |
| ヌクレアーゼ フリー水 | 25 μ L を |
表 2: 増幅数の決定の qPCR 反応混合物は逆 PCR (11.3.1 ステップ) のサイクルです。
| 1 x のボリューム | |
| 10 倍長いテンプレートのバッファー 1 を展開します。 | 80 Μ L |
| dNTPs (10 mM) | 16 Μ L |
| 前方のプライマー | 1.12 nmol |
| 逆プライマー | 1.12 nmol |
| 長いテンプレートのポリメラーゼを展開 (5 U/μ L) | 11.2 Μ L |
| DNA | 3.2 μ g |
| ヌクレアーゼ フリー水 | 800 μ L に |
表 3。4 C テンプレート (ステップ 11.4) の最終的な逆 PCR 増幅のため PCR 反応混合物。
| 1 x のボリューム | |
| Phusion HF バッファー x 5 | 2 Μ L |
| dNTPs (10 mM) | 0.2 Μ L |
| Miltiplexing 入門 1.0 | 5 pmol |
| Miltiplexing プライマー 2.0 | 0.1 pmol |
| インデックス プライマー | 5 pmol |
| 100 x サイバー グリーンします。 | 0.1 Μ L |
| 50 x ROX | 0.2 Μ L |
| ポリメラーゼ Phusion | 0.1 Μ L |
| DNA | 2 Μ L |
| ヌクレアーゼ フリー水 | 10 μ L に |
表 4: 増幅数の決定の qPCR 反応混合物はライブラリの準備 (ステップ 13.3) のシーケンス処理サイクルします。
| 1 x のボリューム | |
| Phusion HF バッファー x 5 | 10 Μ L |
| dNTPs (10 mM) | 1 Μ L |
| Miltiplexing 入門 1.0 | 25 pmol |
| Miltiplexing プライマー 2.0 | 0.5 pmol |
| インデックス プライマー | 25 pmol |
| ポリメラーゼ Phusion | 0.5 Μ L |
| DNA | 10 Μ L |
| ヌクレアーゼ フリー水 | 50 μ L に |
表 5: PCR 反応混合物 (ステップ 13.4) のシーケンス処理ライブラリの拡大のため。
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Discussion
4 C の結果規制以前に未知の要素を識別できるクロマチンの相互作用および/特定の生物学的文脈の24,25,26に重要な標的遺伝子を明らかにする可能性があります。ただし、技術的なハードルは、これらの実験から得られたデータを制限可能性があります。4 C のプロトコル テンプレートが過大に増幅から生じる PCR バイアスがあります。このプロトコルは、客観的にサイクルの増幅の最適な数を決定する qPCR を利用してこの問題を解決します。さらに、制限のダイジェストによって増幅逆 PCR 産物から餌のシーケンスの除去は、2 つの理由クロマチンの相互作用の同定を実現できます。まず、シーケンスする材料から非報知的な (餌) 塩基対の長さが短くなります。第二に、そしてその結果としてより多くの読み取りは多様なシーケンス (正確な基本通話に必要なプロパティ) から生成される、従ってより有益な相互作用シーケンスをマップできる可能性が高まります。他のプロトコルは異なる餌シーケンスおよび/または制限の酵素を使用して多くのライブラリのプールを必要とするまたは正確な基本通話用シーケンスの均一性の問題を回避するためにシーケンスされたサンプル phiX 濃度が増加が必要があります。このメソッドは、余分な phiX 貴重なシーケンス容量を占めないで単一シーケンス車線にプールする同じ餌シーケンスに複数のサンプルをできます。
セル固定換散は、重要な初期ステップ、どちらの特定の細胞のタイプの最適化があります。定着不足は、関心領域とノイズによって支配される uninformative データを降伏、その相互作用シーケンスの特定の連絡先を維持するために失敗します。対照的に、過剰固定少ない有益な結紮イベントの結果、クロマチンを切断する制限酵素の能力が低下します。この変数を最適化するためには、定着性濃度と培養時間の両方を変更できます。同様に、不十分なセル換散はクロマチン、再び有益な結紮イベントの数を減らすことに制限の酵素へのアクセスを低減します。私たちの手で人間プライマリ ケラチノ サイトは、低張性条件と洗剤の組み合わせを使用して最も効果的に分離。他の細胞型が異なる溶解条件は、経験的に決定する必要があります。効率的な換散は、トリパン ブルー染色など顕微鏡色素排除法によって識別できます。
4 C のメソッドの 1 つの制限は、結果が人口平均を表すことができますだけです。異種細胞の生物学的変動によるノイズ対真の相互作用を決定する困難なことです。明確な信号を生成する細胞または均一な細胞集団を生成するセルの並べ替えの使用を予測すると、個々 の細胞間の変動はまだノイズの可能性のあるソース。単一セルの配列の技術の最近の進歩には、この問題を克服する可能性があります。さらに、単一細胞レベルでこれらの結果が反映されますを決定するデジタル液滴 PCR や魚などの方法を使用して人口ベース 4 C の結果の検証が行われます。
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Disclosures
著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。
Acknowledgments
この作品は、NIAMS (R01AR065523) によって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HindIII | NEB | R0104S | |
| CviQI | NEB | R0639S | |
| DNA oligonucleotide primers | IDT | To be designed by the reader | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 06-443-19 | |
| 1.7 mL microcentrifuge tubes | MidSci | AVSS1700 | |
| Phosphate buffered saline | Thermo Fisher | 14190-136 | |
| Formaldehyde, methanol free | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Nutator | VWR | 15172-203 | |
| Glycine | JT Baker | 4059-00 | |
| Benchtop centrifuge | |||
| Refrigerated microcentrifuge | |||
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | ED2SS | |
| 20% SDS solution | Sigma-Aldrich | 05030 | |
| Trypan Blue | Thermo Fisher | 15250061 | |
| Glass slides | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
| Cover slips | VWR | 16004-094 | |
| Light microscope | |||
| Triton X-100 | Alfa Aesar | A16046 | |
| Shaking heat block | |||
| 2 M Tris-HCl | Quality Biological | 351-048-101 | |
| Proteinase K | NEB | P8107S | |
| Phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1) | Sigma-Aldrich | P2069 | |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | M5661 | |
| 20 mg/mL glycogen | Thermo Fisher | R0561 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | 04-355-223 | |
| Nuclease-free water | Fisher Scientific | MT-46-000-CM | |
| qPCR cycler | Thermo Fisher | 4453536 | |
| qPCR plates | Thermo Fisher | 4309849 | |
| Thermocycler | Thermo Fisher | 4375786 | |
| PCR strip tubes | MidSci | AVSST-FL | |
| 1 M Magnesium chloride | Quality Biological | 351-033-721 | |
| Dithiothreotol | Sigma-Aldrich | 43815 | |
| Adenosine triphosphate | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A6013 | |
| RNase A | Thermo Fisher | EN0531 | |
| Qiaquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| MinElute PCR Purification kit | Qiagen | 28004 | |
| Spectrophotometer | |||
| Expand Long Template PCR System | Sigma-Aldrich | 11681834001 | |
| dNTP mix | Thermo Fisher | R0191 | |
| SYBR Green I | Sigma-Aldrich | S9430 | |
| ROX | BioRad | 172-5858 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| End-It DNA End-Repair Kit | Lucigen | ER0720 | |
| LigaFast Rapid DNA Ligation System | Promega | M8221 | |
| SYBR Safe | Thermo Fisher | S33102 | |
| Taq Polymerase | NEB | M0267S | |
| UltraSieve Agarose | IBI Scientific | IB70054 | |
| Qiaquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 |
References
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