Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

تميز ميكروبيومي ديناميات – التدفق الخلوي على أساس مهام سير العمل من ثقافات نقية للمجتمعات الطبيعية

Published: July 12, 2018 doi: 10.3791/58033
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Environmental Microbiology, Helmholtz Centre for Environmental Research - UFZ

Summary

وقد ثبت تحليل تدفق سيتوميتريك قيماً للتحقيق في ثقافات نقية ورصد ديناميات المجتمع الميكروبية. نحن نقدم ثلاث مهام سير العمل شاملة، من أخذ عينات لتحليل البيانات، نقية الثقافات والمجتمعات المعقدة في متوسطة واضحة كذلك كما هو الحال في المصفوفات صعبة، على التوالي.

Abstract

التحقيق في ثقافات نقية ورصد لديناميات المجتمع الميكروبي أمر حيوي لفهم والتحكم في النظم الإيكولوجية الطبيعية، والتطبيقات التقنية مدفوعا بالكائنات الحية الدقيقة. الجيل التالي تسلسل أساليب تستخدم على نطاق واسع لحل ميكروبيوميس، ولكنها عادة ما تكون الموارد والوقت المكثفة وتقديم معظم المعلومات النوعية. تحليل تدفق سيتوميتريك ميكروبيومي لا تعاني من تلك العيوب ويمكن أن توفر وفرة سوبكومونيتي النسبية والمطلقة أرقام خلية في سطر. على الرغم من أنه ليس توصيل المعلومات النشوء والتطور مباشرة، ويمكن أن يعزز بعمق التحليل والقرار من تسلسل النهج. في تناقض حاد مع التطبيقات الطبية في مجال البحث والإعدادات الروتينية، ما زالت لا على نطاق واسع يستخدم التدفق الخلوي لتحليل ميكروبيومي. المعلومات المفقودة في نموذج البيانات وإعداد تحليل خطوط الأنابيب قد خلق عائقا يحول دون دخول للباحثين تواجه تحديات تحليل ميكروبيومي غالباً ما تكون تطبيقات الخلوي تدفق الكتب المدرسية. هنا، نقدم ثلاث مهام سير العمل الشامل للثقافات نقية، واضحة المجتمعات المعقدة في المجتمعات المتوسطة والمعقدة في المصفوفات صعبة، على التوالي. وصف إجراءات أخذ العينات وتثبيت الفردية، والأمثل تلطيخ البروتوكولات لمجموعات كل منها عينة. علينا وضع تحليل سيتوميتريك مع بحث معقدة محورها وجهاز أعلى هيئة مركزة تطبيق ووصف الخلية الفرز الداخلي وتشير إلى حزم تحليل البيانات. وعلاوة على ذلك نحن اقتراح ضوابط تجريبية هامة وتطبيق عرض مهام سير العمل إلى مجموعات كل منها عينة.

Introduction

الكائنات الحية الدقيقة تلعب دوراً حيويا في العديد من جوانب الإنسان يعيش. فهي العوامل الحيوية الرئيسية للكواكب الكربون والنيتروجين والفوسفور والكبريت دورات1وقانون اللاإنسانية2،3 ، فضلا عن توليف4 المواد البيولوجية الحفازة في مختلف الصناعات، مثل معالجة المياه المستعملة 6- 5 أو التكنولوجيا الحيوية بل أنها تشكل ميكروبيومي البشري، الذي هو التأثير مباشرة على صحة الإنسان والايض7،8. ولذلك، المعلومات المتعلقة بالهيكل والوظيفة والسلوك الديناميكي للكائنات المجهرية، في الاستجابة لبيئتهم المباشرة، أمر ضروري إذا نحن نهدف إلى فهم والتعامل مع هذه النظم. الجيل التالي التسلسل (خ ع) هي التكنولوجيا المتبعة لحل ميكروبيومي هيكل ووظيفة9. ومع ذلك، بتحليل وتقييم البيانات خ ع لا يمكن أن تسفر عن معلومات كمية، وهي لا تزال باهظة التكاليف وتستغرق وقتاً طويلاً ومستعدة لا حال من الأحوال تقديم النتائج في الموقع داخل ممرات الأداء. عرض بعض أنواع البكتيريا مرات جيل أدناه ح 1 والسبب في تغير مستمر الهياكل المجتمعية في بعض البيئات10. عقب هذه الديناميات، استخدام نهج التسلسل سوف تتجاوز القدرة المالية والقوى العاملة من مختبرات علمية أكثر.

على النقيض من ذلك، يمكن أن توفر التدفق الخلوي بصمات الجماعة مشابهة للبيانات خ ع، مع الاحتفاظ كفاءة أعلى في الوقت والعمل والتكلفة. نقدم هنا، تدفق سيتوميتريك تقنيات قادرة على متابعة ديناميات المجتمع الميكروبي في الخط على مستوى الخلية الواحدة. على عكس خ ع، التدفق الخلوي لا توفر معلومات أو انتماء النشوء والتطور في الجينات الوظيفية، ولكن يسلم أرقام الخلية الكمية. استخدام التدفق الخلوي، يمكن حل المجتمعات الميكروبية في الطوائف مع مبعثر الخفيفة المتميزة وخصائص الفلورية (المبعثر إلى الأمام (FSC) والجانب مبعثر (SSC) توفر مؤشرات لحجم الخلية والتفاصيل، على التوالي). يستخدم نهج قدم الغالب حجم الخلية-ومبلغ الحمض النووي المعلومات ذات الصلة التي ترتبط ببعض أنواع الخلايا والدول الفسيولوجية (النمو). محتوى الحمض النووي هو كمياً باستخدام الأشعة فوق البنفسجية-منفعل 4 ', 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI) صبغ، الذي يربط المناطق الغنية A-T من الحمض النووي، وحتى يمكن حل اختلاف مستويات صبغية. من خلال الجمع بين DAPI الأسفار ومنتدى التعاون الأمني يمكن التمييز بين الطوائف أكثر من 50 ورصدها لتغيير وفرة أكثر من الساعة11. يمكن أن ترتبط الاختلافات وفرة سوبكومونيتي مع التغييرات في محيطة الصغير-البيئية، مثل درجة الحموضة والمنتج التتر12, مع معلمات العمومية، مثل ال13،الطقس14، أو في حالة القناة الهضمية أو اللعاب ميكروبيوميس مع بعض العلاجات الطبية15. وتكشف هذه الترابطات الطوائف الرئيسية المسؤولة عن وظائف معينة في الشبكة الأيضية للمجتمع ككل. الطوائف الرئيسية يمكن ثم على وجه التحديد الترويج أو قمعها بتغيير الصغرى-البيئات المحيطة بها، أو فرزها لتسلسل اللاحقة15 أو البروتين التحقيق16.

ومع ذلك، المجتمع الميكروبي التدفق الخلوي لم يتم بعد على نطاق واسع تأسيس نظراً لوجود عدد منخفض من تدفق سيتوميتريك أجهزة قادرة على حل السكان الميكروبية أو المجتمعات المحلية بشكل صحيح. وعلاوة على ذلك، الافتقار إلى الخبرة والمجتمع تحليل خطوط الأنابيب والتقييم الفعلي للبيانات قد تشكل عائقا يحول دون دخول للباحثين تحليل التحديات ميكروبيومي. قمنا بإنشاء مهام سير عمل شاملة لمعالجة هذه القضايا. ولإيضاح قابليتها للتطبيق العام، سوف نقدم لهم على ثلاث مجموعات عينة نموذجية (الملف التكميلي 1-S1)، إلا وهي أنا) ثقافة نقية (PC) لتطبيقات التكنولوجيا الحيوية التي نمت في المتوسط واضحة محددة (Pseudomonas putida كيلوطن 2440 في الجلوكوز)، ثانيا) مجتمع مختبر معقدة في متوسطة واضحة (المجتمع للحماه (ASC) في مياه الفضلات الاصطناعية)، والثالث) مجتمع معقد من البيئات الطبيعية في مصفوفة كثيفة (الغاز الحيوي في المجتمع (قبل الميلاد) في سيلاج الذرة).

وهناك عدة عوامل تؤثر على اختيار البروتوكول لكل من هاتين المجموعتين عينة. تجميد عميق فورجوس استخدام المواد الكيميائية السامة ولكن معظمها يقتصر على بيئات المعمل بسبب الاستخدام النتروجين السائل صقيع الصدمة. الاستقرار فورمالدهايد واللاحقة الإيثانول التثبيت تسمح العينات المجمعة دون الحاجة إلى إعداد الكوة وقد ثبت أن تكون مستقرة على مدى فترات طويلة. ومع ذلك، قد تكون عينات الغنية بالبروتين مثل اللعاب البشري15 إشكالية، فلكس البروتين، ديناتوريزيد من الفورمالديهايد، قد تسبب إشارة سلبية لنسب الضوضاء. تجفيف العينة سوف تتخذ معظم الوقت (حوالي 1 ح في المجموع) من الإجراءات في هذه المقارنة، ولكن يمكن إجراؤها على الموقع دون المواد الكيميائية السامة. غلة الكريات مستقرة في أنابيب، والتي يمكن شحنها بسهولة دون احتياطات الإخطار التبريد أو إضافية. بالإضافة إلى ذلك، تم الكثير من أساليب التثبيت البديل المقترح11. ونحن ننصح بشدة اختبار استقرار القرار وتثبيت بروتوكولات مختلفة عند عرض مجموعة نماذج جديدة.

كنا اثنين تدفق مختلفة سيتوميتيرس لتحليل المجموعات: ط) بحوث متطورة جداً وباهظة الثمن، محورها أرز الخلية والثاني) تطبيق ركزت مقاعد البدلاء أعلى محلل الذي يبدو أكثر ملاءمة للتطبيق في الموقع5. وتم قياس BC مع محلل أعلى مقاعد البدلاء، بينما قيست بجهاز الكمبيوتر والرابطة مع أرز الخلية. تحليل العينة المثالية ثلاث مجموعات الإجراءات المختلفة المطلوبة لإمكانية تكرار نتائج محسنة وعينه الاستقرار والراحة سير العمل. سيتم تحديد البروتوكول التالي المقاطع لثلاثة أنظمة مختلفة.

Protocol

1-أخذ العينات والتثبيت

  1. ثقافة نقية: العميق تجميد15،17
    1. أخذ 2 مل من تعليق خلية والطرد المركزي لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT) والعاشر 5,000 ز وتجاهل المادة طافية.
      ملاحظة: يرد تعليق خلية عينات في "الملف التكميلي" 1-S1.
    2. ريسوسبيند الخلايا الموجودة في 1 مل من المحلول الملحي الفوسفات مخزنة (برنامج تلفزيوني؛ 6 مم نا2هبو4مم 1.8 نة2بو4، 145 مم كلوريد الصوديوم مع ثنائية المقطر ح2س، الرقم الهيدروجيني 7.2) بالإضافة إلى ذلك تتضمن والغليسيرول 15% (v/v) كعامل كريوبروتيكتيفي.
    3. احتضان لمدة 10 دقائق على تجميد الجليد وصدمة في النتروجين السائل لتخزين اللاحقة في-80 درجة مئوية.
      ملاحظة: يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول هنا. العينات التي مستقرة لمدة شهر واحد على الأقل.
  2. تنشيط المجتمع الحمأة: الاستقرار فورمالدهايد + الإيثانول التثبيت5،،من1018
    1. 4 مل تعليق خلية، أجهزة الطرد المركزي لمدة 20 دقيقة في 15 درجة مئوية و 3,200 س ز وتجاهل المادة طافية.
      ملاحظة: يرد تعليق خلية عينات في "الملف التكميلي" 1-S1.
    2. إضافة 4 مل من 2% فورمالدهايد في برنامج تلفزيوني واحتضان لمدة 30 دقيقة في الرايت
      1. إعداد 8% فورمالدهايد حل الأسهم من بارافورمالدهيد لتجنب الميثانول المضافة الحفاظ إضافة إلى فورمالدهايد شحنها في شكل سائل. إضافة 4 غرام بارافورمالدهيد إلى 50 مل من برنامج تلفزيوني في 70 درجة مئوية. إضافة حوالي 125 ميليلتر من حل هيدروكسيد الصوديوم 10 أمتار. يقلب حتى بارافورمالدهيد قد حلت تماما والسماح لها ثم يبرد إلى الرايت ضبط قيمة pH 7.0 مع حوالي 100 ميليلتر 37% HCl. تجميد الحل والفورمالديهايد في 15 مل مختبرين للتخزين. لا تستخدم مختبرين مطلق أكثر من 10 أيام.
        تنبيه: فورمالدهايد تحتاج إلى التعامل معها والتخلص منها بعناية نظراً لخصائصها السمية ومطفره. دائماً ارتداء القفازات أثناء التعامل مع ذلك. استخدام غطاء عادم حين حل بارافورمالدهيد لمنع التعرض للأبخرة السامة.
    3. الطرد المركزي العينة لمدة 10 دقيقة في 15 درجة مئوية و 3,200 س ز وتجاهل المادة طافية.
    4. ريسوسبيند العينة في 4 مل إيثانول 70% ومخزن في-20 درجة مئوية.
      ملاحظة: يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول هنا. العينات التي مستقرة لمدة شهرين على الأقل. اعتماداً على خصائص العينة، يمكن أيضا إجراء خطوة الطرد المركزي في 1.2.1 لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية لتوفير الوقت.
  3. المجتمع الأحيائي: التجفيف
    1. استخدام تلميح ماصة ميليلتر 1,000 المقطوعة للعينة 200 ميليلتر من ديجيستاتي لزج في أنبوب 2 مل.
    2. إضافة 1,700 ميليلتر من المخزن المؤقت لبرنامج تلفزيوني ومزيج دقيق.
    3. ضع الأنابيب في حمام الموجات فوق الصوتية في 35 كيلو هرتز وطاقة إخراج فعالة ث 80 لمدة 1 دقيقة تفكيك خلية كبيرة المجاميع وفصل الخلايا الشائكة إلى مصنع المخلفات الخلية.
    4. خلط العينة جيدا وتصفية العينة من خلال عامل تصفية شبكة 50 ميليلتر وتقسم فيلتراتي إلى مختبرين الأربعة من حوالي 400 ميليلتر.
      ملاحظة: إعداد مختبرين في هذه المرحلة توفر اثنين من المزايا الرئيسية. كميات أصغر، والأولى أسهل وأسرع ديواتير ميكانيكيا (الطرد المركزي) وحراريا (التجفيف)، ولكن أخذ العينات من كميات صغيرة من عادة حماة سميكة الغاز الحيوي يمكن أن تكون صعبة للغاية. ويمكن استخدام عينات إضافية، والثاني للخلية اللاحقة الفرز، قياسات النسخ الاحتياطي أو عناصر التحكم.
    5. الطرد المركزي في مختبرين مرتين لمدة 10 دقيقة في 10 درجة مئوية و 4,000 س ز وتجاهل المادة طافية تماما في كل مرة ميكانيكيا ديواتير العينة دقة قدر الإمكان.
    6. الجاف للعينات في أجهزة الطرد مركزي فراغ ساخنة لمدة 40 دقيقة على 35 درجة مئوية والجيش الشعبي الكوري-97 حوالي س 2,500 ز لإنشاء مستقرة الكريات. تخزين الكريات في 4 درجات مئوية في الظلام.
      ملاحظة: يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول هنا. الكريات مستقرة لمدة 6 أشهر على الأقل.

2-تلوين

ملاحظة: تلطيخ DAPI ثبت لتسليم قطع نقطة عالية الدقة وهو ذا فائدة خاصة عند تحليل المجتمعات. أن تركيز DAPI في الحل المصبوغة يحتاج إلى أن يكون الأمثل لضمان كثافة fluorescence بوابة خلية أعلى مستوى الضوضاء ولكن أقل من الخرز. الأمثل يتوقف على اختيار الصك حساسية وحبه ويمكن أن تختلف بين مجموعات العينة بسبب محتوى G/C من الكائنات الدقيقة الواردة، وعموما ينبغي اختبار لمجموعات عينة أدخلت حديثا. اختبار تركيزات بين 0.24 ميكرومتر DAPI و 1 ميكرومتر ينصح DAPI للإعداد المعروضة. قد يتم استخدام الأصباغ الأخرى لتطبيقات محددة. الاستخدام "أخضر سيبر" أنا تلطيخ البروتوكول ينصح عند الخلية المطلقة عد الدقة هو الأولوية على أخذ البصمات6،التحليل (الملف التكميلي 1-S1)15. وتتضمن خطوات المعالجة والطرد المركزي عينة أقل وقابلاً للتطبيق مع الخلايا الثابتة والحيوية على حد سواء. كذلك يقلل من خطوات التعامل مع عينة من تخطي التثبيت استخدام الخلايا الحيوية ويتطلب الطرد المركزي واحد فقط ومن ثم لحصاد الخلية. وهذا يقلل من احتمال فقدان الخلية وخطأ القياس المنتظم وبالتالي. يجب تصفية برنامج تلفزيوني، permeabilization المخزن المؤقت وتلطيخ الحل المستخدمة خلال جميع الخطوات التالية من خلال 0.2 ميكرومتر حقنه المرشحات لتقليل تحميل إضافية الجسيمات في العينة. تلوين عينة واحدة تحتوي على BL21 الإشريكيّة القولونية (DE3) كما ينصح بمعيار بيولوجية مع كل تجمع العينة.

  1. ثقافة نقية
    1. تذويب العينات، أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في الرايت و 5,000 x ز وتجاهل المادة طافية.
    2. ريسوسبيند بيليه الخلية في برنامج تلفزيوني الجليد الباردة من بيبيتينج المتكررة وضبط OD700nm إلى 0.035 (طول المسارومبومو = 0.5 سم).
    3. إعداد الخلايا لتلطيخ.
      1. الطرد المركزي 1 مل تعليق خلية المعدل لمدة 5 دقائق في الرايت و 5,000 x ز وتجاهل المادة طافية.
      2. ريسوسبيند الخلايا الموجودة في 1 مل من بيرميبيليزيشن المخزن المؤقت الذي يحتوي على حمض الستريك 0.3 M و 4.1 ملم Tween20 ومزيج دقيق.
      3. احتضان العينة لمدة 10 دقيقة على الجليد لإنشاء نفاذية أغشية الخلايا لتلطيخ اللاحقة.
      4. الطرد المركزي العينة لمدة 5 دقائق في الرايت و 5,000 x ز وتجاهل المادة طافية.
    4. أضف 1 مل من تلطيخ محلول يحتوي على مكم 0.68 DAPI في المخزن المؤقت 417 مم نا2هبو4/NaH2ص4 (289 مم نا2هبو4، 128 ملم نة2بو4 مع ثنائية المقطر ح2س، الأس الهيدروجيني 7)، وخلط و احتضان لمدة 15 دقيقة على الأقل في RT في الظلام.
      ملاحظة: تعديل OD دقيقة أمر حاسم لضمان قياسات قابلة للمقارنة للأسفار DAPI سوف تختلف مع كثافة الخلية إذا كان تركيز DAPI تظل ثابتة. وينبغي إزالة المادة طافية بعناية نظراً لبيليه هشة عموما لمنع فقدان الخلية.
      تنبيه: تعامل مع والتصرف DAPI مع الرعاية بسبب خصائصه مطفرة.
  2. المجتمع للحماه
    1. خلط العينة ثابتة تماما ونقل مل 0.6 في أنبوب زجاج. إضافة مل 1.4 من برنامج تلفزيوني و sonicate لمدة 10 دقائق في الرايت كما هو موضح في الخطوة 1.3.3. الطرد المركزي العينة لمدة 10 دقيقة على 4 درجة مئوية و 3,200 س ز وإزالة المادة طافية. إضافة 2 مل من برنامج تلفزيوني ومزيج دقيق. Sonicate لمدة 5 دقائق.
    2. ضبط OD700nm إلى 0.035 (طول المسارومبومو = 0.5 سم) مع برنامج تلفزيوني.
    3. إعداد الخلايا لتلطيخ.
      1. الطرد المركزي العينة لمدة 10 دقيقة على 4 درجة مئوية و 3,200 س ز وإزالة المادة طافية.
      2. ريسوسبيند الخلايا الموجودة في 1 مل من بيرميبيليزيشن المخزن المؤقت الذي يحتوي على حمض الستريك 0.11 م و 4.1 ملم Tween20 ومزيج دقيق.
      3. احتضان لمدة 20 دقيقة في RT لإنشاء نفاذية أغشية الخلايا لتلطيخ اللاحقة.
      4. الطرد المركزي العينة مرة أخرى لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية و 3,200 س ز وإزالة المادة طافية.
    4. إضافة 2 مل من محلول المصبوغة التي تتضمن 0.68 ميكرومتر DAPI و 417 مم نا2هبو4/NaH2بو4 المخزن المؤقت، ومزيج دقيق واحتضان 60 دقيقة على الأقل في RT في الظلام.
      ملاحظة: استخدام أنابيب زجاجية ينصح، كما أن بعض الكائنات المجهرية تميل إلى التمسك بجدران أنبوب من البلاستيك، وقد يتم فقدان أثناء العملية. حضانة بين عشية وضحاها ومن المحتمل أيضا، وعادة ما يبسط إجراءات المختبر.
      تنبيه: DAPI يحتاج إلى التعامل معها والتخلص منها مع الرعاية بسبب خصائصه مطفرة.
  3. المجتمع الأحيائي
    1. تعليق بيليه خلية المجففة في برنامج تلفزيوني.
      1. إضافة 800 ميليلتر من برنامج تلفزيوني، ومزيج دقيق واسمحوا بيليه ينقع لمدة 15 دقيقة.
      2. نضح الطور السائل مع ماصة ميليلتر 1,000 ونقل بيليه غارقة إلى القسم أسطواني جدار الأنبوبة بطرف ماصة. ينبغي أن عصا هناك.
      3. نقل طرف الماصة في حركة دائرية الاسكواش بيليه على طول جدران الأنبوب.
      4. أغسل الطين الناجمة عن ذلك خارج جدران الأنبوبة بالاستغناء عن الطور السائل من طرف الماصة على طول جدار الأنبوبة.
      5. تحرض التعليق يسفط وتعليق عليه إلى ماصة ثلاث مرات.
    2. تغسل العينة مع برنامج تلفزيوني مرتين.
      1. الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 10 درجة مئوية و 4,000 س ز وتجاهل المادة طافية.
      2. إضافة 1,500 ميليلتر من برنامج تلفزيوني ومزيج دقيق.
      3. كرر الخطوتين أعلاه مرة واحدة.
    3. ضع الأنابيب في حمام الموجات فوق الصوتية لمدة 1 دقيقة كما هو موضح في الخطوة 1.3.3، وفي وقت لاحق، تصفية كل عينة من خلال عامل تصفية شبكة 50 ميليلتر في أنبوب زجاج فردية.
    4. تمييع 2 مل العينة للتطوير التنظيمي700nm 0.035 (طول المسارومبومو = 0.5 سم) مع برنامج تلفزيوني.
    5. إعداد الخلايا لتلطيخ كما هو موضح في الخطوة 2.2.3 أعلاه.
    6. إضافة 2 مل من محلول المصبوغة التي تتضمن ميكرومتر 0.24 DAPI و 417 مم نا2هبو4/NaH2بو4 العازلة، مزيج دقيق واحتضانها طوال الليل في RT في الظلام.
      تنبيه: DAPI يحتاج إلى التعامل معها والتخلص منها مع الرعاية بسبب خصائصه مطفرة.

3-قياس

ملاحظة: تم تحليل مجموعات عينة نموذجية مع اثنين تدفق مختلفة سيتوميتيرس. تم تحليل الكمبيوتر والرابطة مع أرز الخليوي تركزت بحوث أكثر تعقيداً وعالية قابلة للتعديل وقابلة للتخصيص بسهولة،. لتحليل الكمبيوتر، هذا الجهاز مجهز بليزر تعيين يصل كما هو موضح في السابق نشر16، وباختصار أزرق (488 نانومتر، 400 ميغاواط) والأشعة فوق البنفسجية (334 – 364 نيوتن متر، 100 ميغاواط) ليزر أيون الأرجون. لتحليل ASC، أحدث الأزرق (488 نانومتر، 400 ميغاواط) والأشعة فوق البنفسجية (355 نانومتر، 150 ميغاواط) تم تركيب ليزر أشباه الموصلات. وفي كلتا الحالتين، فعل الليزر الأزرق منتدى التعاون الأمني (ممر الموجه مرشح 488 نانومتر ± 5 نانومتر، كثافة محايد تصفية 1.9) والتعاون بين بلدان الجنوب (ممر الموجه مرشح 488 نانومتر ± 5 نانومتر، وكثافة محايد تصفية 1.9، الزناد). ترتبط هذه الخصائص البصرية لحجم الخلية وكثافة الخلية، على التوالي. الليزر الأشعة فوق البنفسجية متحمس DAPI fluorescence (ممر الموجه تصفية 450 نانومتر ± 32.5 شمال البحر الأبيض المتوسط) للتحديد الكمي لمحتوى الحمض الخلوي. تم تشغيل النظام فلويديك في 56 رطل/بوصة مربعة (بار 3.86) مع وسيلة عينة في هذه المبادرة 0.3 كحد أقصى وفوهة 70 ميكرومتر. وسجلت جميع المعلمات كمرتفعات الذروة بدلاً من مناطق الذروة تحسين دقة القياس. وأجرى رصد طويل الأجل للمجتمع الأحيائي مع أقل تعقيداً، تدفق ومبومو، محلل أعلى هيئة. ليزر أشباه الموصلات الأشعة فوق البنفسجية (355 نانومتر، 50 ميغاواط) واستخدمت لحمل منتدى التعاون الأمني (ممر الموجه تصفية 355 نانومتر ± 5 نانومتر) والتعاون بين بلدان الجنوب (ممر الموجه مرشح 355 نانومتر ± 5 نانومتر، الزناد) إشارات وتثير DAPI fluorescence (ممر الموجه مرشح 455 نانومتر ج). المياه المستخدمة للمخزن المؤقت غمد لكلا الجهازين كان المقطر ثنائية و 0.1 ميكرومتر التي تمت تصفيتها. يجب تصفية برنامج تلفزيوني يستخدم لتمييع عينة من خلال 0.2 ميكرون حقنه مرشحات للحد من الضوضاء الجسيمات في القياسات بقدر الإمكان.

  1. ثقافة نقية والمجتمع للحماه
    1. بدء تشغيل أداة والليزر والكمبيوتر والبرمجيات والتحضير لتحليل العينات.
      1. التبديل على الليزر وتشغيلها لمدة 15 دقيقة للوصول إلى درجة حرارة التشغيل وضمان الاستقرار شعاع.
      2. ملء الخزان غمد مع 10 × غمد المخزن المؤقت (19 مم خ2ص4، 38 مم بوكل، 166 ملم Na2هبو4، كلوريد الصوديوم م 1.39 مع ثنائية المقطر ح2س) المخفف المقطر ثنائية ح2س إلى 0.2 x حل عملي (لفرز الخلايا: 0.5 x حل العامل).
      3. رئيس الوزراء النظام فلويديك مع 56 هذه المبادرة أكثر من الضغط وخزان النفايات مع حوالي 6 psi الفراغ.
      4. تشغيل الأداة للحد الأدنى 15 دقيقة في وضع باكفلوش شطف ميناء العينة والأنابيب وفوهة.
    2. معايرة مع الخرز القياسية.
      1. إعداد يمزج حبة للمعايرة في خطي (1 ميكرومتر ميكرومترات الأزرق + 2 الأصفر والأخضر الفلوريسنت) ونطاق لوغاريتمي (0.5 ميكرومتر ونيون زرقاء 1 ميكرومتر). تمييع تعليق حبة من المعلقات المخزون الأصلي لتحقيق تركيزات متساوية.
      2. باستمرار قياس هذا المزيج الخطي حبة وتناسب قمم حبة لقالب معايرة مسبقاً عن طريق التلاعب الفوهة ومواقف البصريات لمعايرة قبل الصك في مجموعة خطية بالليزر.
      3. قم بالتبديل إلى نطاق لوغاريتمي واستمرار لقياس هذا المزيج حبة لوغاريتمي. تناسب على قمم حبة على قالب المعايرة مسبقاً لتهذيب أجهزة الصك. إجراء التسويات النهائية لموقف حبة استخدام الإعداد مكسب من أنابيب ضوئي (بمتس).
      4. التحقق من موقف الضوضاء مفيدة وربما تعديلها لتناسب القالب المعايرة.
        ملاحظة: قالب ثابت معايرة لموقف الخرز يحتاج أن يكون مستعدا قبل مشروع قياس ولا يمكن تغييره (انظر "الملف التكميلي" 1-S4)! يمكن أن يكون الناجمة عن الجسيمات في العينة أو الضوضاء الإلكترونية بمتس الضوضاء مفيدة وستسجل دائماً إلى حد ما. من غير المستحسن لإخفاء الضوضاء تماما يقابلها مكسب التكيف أو المؤامرة. وفرة والموقف من أحداث الضجيج يمكن أن تكون مصدرا قيماً للمعلومات وذلك ينبغي أن ترد في البيانات الخام. عينات مكثفة جداً من الجسيمات قد يستلزم إزالة الضوضاء لأسباب تحليل التآمر والبيانات اللاحقة. التحكم في المعايرة في فترات منتظمة خلال يوم قياس ضمان استقرار الصك وعينه وبالتالي قابليتها للمقارنة.
    3. قياس عينة تحتوي على المعيار البيولوجي كما هو موضح في 2.1.4 (DAPI الملون BL21 الإشريكيّة القولونية (DE3)، أخذ عينات وثابتة أثناء مرحلة ثابتة (ح 16) وفقا للبروتوكول ASC، المذكورة في 1، 2). التحقق من موقف الذروة فيما يتعلق قالب المعايرة مسبقاً (انظر الملف التكميلي 1-S5).
      ملاحظة: تلطيخ الروتينية وقياس مستوى البيولوجية مع كل تجمع العينات سيكون أيضا بمثابة رقابة داخلية للإجراء المصبوغة. إذا كان الجهاز هو معايرة باستخدام الخرز والمعيار البيولوجي لا يصلح لها قالب المعايرة مسبقاً، ربما يحتاج الإجراء المصبوغة أن يتكرر.
    4. الحصول على عينة.
      1. قم بتشغيل الحل المصبوغة لمدة 10 دقيقة شطف الميناء عينة وأنبوب وضمان الاستقرار للأسفار DAPI في العينات اللاحقة.
      2. تصفية النموذج الملون مع عامل تصفية شبكة 50 ميكرومتر قبل القياس إلى الحيلولة دون انسداد فوهة سيتوميتير أو تدفق الشعرية.
      3. إضافة خليط اللوغاريتمي حبة للعينة لرصد استقرار الصك وتوفير إمكانية لفحص معايرة أثر رجعي. ينبغي أن تتضمن العينات بين 1000 و 2,500 الأحداث في كل من بوابات حبة اثنين.
      4. إنشاء بوابة خلية في البرنامج الصك خلال القياسات التجريبية الأولى مجموعة نماذج جديدة. يجب أن تحتوي على خلايا الملون هذه البوابة واستبعاد الضجيج والخرز.
      5. خلط العينات وقياس بأقصى سرعة الأحداث 3,000 s-1 حتى يتم الكشف عن خلايا 250,000 (المجتمعات المحلية) أو خلايا 50,000 (مستنبت نقي) داخل بوابة الخلية.
        ملاحظة: يتم اختيار هذه التهم الخلية استناداً إلى التجربة مع مجموعات العينة. يمكن استخدام أرقام مختلفة للتحول المفاضلة بين كفاءة القياس والكشف عن الطوائف وفرة منخفضة في أي من الاتجاهين.
        استكشاف الأخطاء وإصلاحها: تحولات مفاجئة داخل مجال القياس من حبة وخلية موقف يمكن أن يكون سببها فقاعات الهواء محاصرين في الفوهة. وهذا يستلزم الإزالة وتنظيف الفوهة والشطف النظام فلويديك مع غمد المخزن المؤقت. الصك الذي يحتاج إلى تعديل بعد ريمونتينج على فوهة (بدء مع الخطوة 3.1.2).
      6. باكفلوش صك شامل مع غمد المخزن المؤقت قبل إيقاف التشغيل والتبديل بين العينات.
  2. المجتمع الأحيائي
    1. بدء إعداد صك والليزر، والكمبيوتر والبرمجيات للتحضير لتحليل العينات.
      1. باكفلوش على الأقل 6 مل من غمد المخزن المؤقت (bi المقطر ح2س) عن طريق الأنابيب وميناء العينة في أنبوب مرفقة فضفاضة استخدام وظيفة "رئيس الوزراء السوائل غمد" البرمجيات الصك.
      2. قياس المقطر ثنائية ح2س في 5 ميليلتر s-1 شطف النظام فلويديك حتى يتم الكشف عن أحداث أقل من 200 s-1 معدل التدفق المنتظم من 0.5 ميليلتر s-1.
    2. معايرة النظام.
      1. إعداد مزيج حبة (0.5 ميكرومتر ونيون زرقاء 1 ميكرومتر). تمييع تعليق حبة من الحلول المخزون الأصلي لتحقيق تركيزات متساوية.
      2. استمرار قياس هذا المزيج حبة في نطاق4 سجل وتناسب قمم حبة على قالب المعايرة مسبقاً عن طريق التلاعب في تدفق ومبومو والليزر مواقف الألياف البصرية. إجراء التسويات النهائية لموقف حبة مع الإعداد الحصول بمتس.
    3. التحكم في معايرة باستخدام المعيار البيولوجي كما هو موضح في الخطوة 3.1.3.
    4. الحصول على عينة.
      1. تمييع 400 ميليلتر من عينة الملون في 1,600 ميليلتر من برنامج تلفزيوني، وقياس ورصد عدد الأحداث إجراء اختبار تركيز.
        ملاحظة: قد تكون معدلات إضعاف المعدل الضروري لمصادر عينة أخرى. لا يزيد عدد الأحداث الأحداث 1,200 s-1 في عينات الجسيمات الغنية لمنع فقدان القرار في المبعثر إلى الأمام (مثال سلبي في "الملف التكميلي" 1-S2). ويمكن قياس ثقافات نقية مع الأحداث تصل إلى 2,000 s-1.
      2. إنشاء بوابة خلية في البرنامج الصك خلال هذه القياسات للمحاكمة الأولى. يجب أن تحتوي على خلايا الملون هذه البوابة واستبعاد الضجيج والخرز.
      3. تمييع العينة وفقا لنتائج اختبار تركيز لتشغيل في الحد الأقصى الأحداث الإجمالية 1,200 s-1 وإضافة مزيج حبة للعينة لرصد صك الاستقرار وتوفير إمكانية لفحص معايرة أثر رجعي. ينبغي أن تتضمن العينات بين 1000 و 2,500 الأحداث في كل من بوابات حبة اثنين.
      4. خلط وقياس العينة حتى يتم الكشف عن خلايا 250,000 (المجتمعات المحلية) أو خلايا 50,000 (مستنبت نقي) داخل بوابة الخلية.
      5. شطف الصك جيدا بثنائية المقطر ح2س قبل إيقاف التشغيل والتبديل بين العينات.

4-الخلية الفرز

ملاحظة: الخلية الفرز الداخلي يتطلب إعداد الصك الإضافي وتتم وفقا للبروتوكولات المنشورة12.

  1. بدء تشغيل ومعايرة الصك كما هو موضح في الخطوات 3.1.1-3.1.3، ولكن استخدام 0.5 x حل عملي من المخزن المؤقت غمد.
  2. تعيين DD التردد والسعة DD للعثور على الحبرية توقف.
  3. تحميل لوحات انحراف، وتوجيه الاتهام لهم وتقرر عن 2-4-طريقة أو وضع الفرز.
  4. إجراء المعايرة تأخير إسقاط الداخلية مع 2 ميكرومتر الخرز الأصفر والأخضر لتحديد الفترة الزمنية التي تحيط الجسيمات أو خلية للسفر من الاستجواب نقطة (خلية يضرب الليزر) حتى آخر قطره المرفقة إلى الدفق.
  5. فرز حبات 20 6 مرات على شريحة زجاجية وحسابها مجهر للتأكد من معايرة تأخير الإسقاط.
  6. إعداد قالب بوابة الفرز.
  7. استخدام "وضع واحد وقطره واحدة: أعلى نقاء 99%" بمعدل لا يزيد عن 2,500 مجموع الأحداث s-1 لفرز الخلايا 500,000 في البوابات 4 كحد أقصى في وقت واحد (4-طريقة فرز الوضع).
  8. حصاد الخلايا بالطرد المركزي (20,000 س ز، 6 درجة مئوية، 25 دقيقة) وتجميد بيليه في-20 درجة مئوية لعزل الحمض النووي لاحقاً وتسلسلها.
    ملاحظة: تجنب فرز الخلايا في البوابات مع أقل من 5% الوفرة النسبية، كوقت الفرز يتناسب تناسبا عكسيا إلى الوفرة النسبية. الخطوات الفردية التي ترد بالتفصيل في الدليل فارز الخلية. أرقام الخلية المطلوبة تعتمد اعتماداً كبيرا على حالات الاستخدام الخاصة بكل منها والبروتوكولات الاستخراج. وقد طبقت العديد من الأساليب: دبكر (الخلايا 1,00017،،19)، 16S المتاشب أو مكرى أمبليكون التسلسل (10،،من6خلايا 500,00015) والبروتينات (ما يصل إلى 1.1 × 107 خلايا 16،17). الخلية الفرز سيكون مفيداً خاصة عندما تقترن باتباع نهج ميتاجينوميكس بسبب انخفاض التنوع في الطوائف تم فرزها.
    تنبيه: لا تلمس لوحات منحرف أثناء إجراءات الفرز بسبب ارتفاع الفولتية.

5-بيانات التحليل

ملاحظة: قياس سيتوميتريك غلة "التدفق الخلوي القياسية" ملفات البيانات.fcs مع بنية بيانات عامة موحدة. ومع ذلك، سيتوميتير مختلف الشركات المصنعة استخدام الإصدارات المعدلة قليلاً والصكوك القديمة قد تسبق 2010 مقدمة من السفح الأخير 3.1 القياسية. يمكن أن يؤدي هذا إلى الأرض دوت رفع القضايا، التي تحول دون إجراء مقارنة مباشرة للنتائج التي تم جمعها مع مختلف الصكوك. ومع ذلك، نقاط البيانات الفردية دائماً مخزنة في خطوط مصفوفة، مع كل منها مبعثر وقيم الكثافة fluorescence في أعمدة مختلفة. استخدام خطوط الأنابيب ميكروبيومي قدم تحليل حجم الخلية المميزة ومحتوى الحمض النووي لوصف الطوائف الميكروبية. ترتبط هذه المعلمات إلى منتدى التعاون الأمني و DAPI fluorescence كثافات قناة (أرز الخلية: فلوريدا-4، محلل: فلوريدا-1) والنتيجة في مجموعات سوبكومونيتي عندما تصور في مؤامرات الأسفار منتدى التعاون الأمني مقابل DAPI ثنائي الأبعاد. هذه المؤامرات دوت تسمح بتفسير وتحليل بيانات التدفق الخلوي ويتم قياسها عادة لها. يمكن عرض من ملفات.fcs باستخدام حلول البرمجيات أو طرف ثالث سيتوميتير الملكية، وهي الأساس للألى (سيتوميتريك الرسم البياني الصورة المقارنة، شيك) وشبه الآلي (سيتوميتريك المتوازية، سيبار) تحليل المجتمع.

  1. مقارنة الرسم البياني سيتوميتريك الصور
    ملاحظة: التعليمات البرمجية ووثائق مفصلة ودليل لهذه الحزمة متوفرة في http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/flowCHIC.html. كذلك فقد نشرت20.
    1. تثبيت وتحميل الحزمة R وتعيين دليل العمل الذي يحتوي على ملفات.fcs وقم بإعداد قائمة بملفات المنفذة:
      > مصدر ("https://bioconductor.org/biocLite.R")
      > biocLite("flowCHIC")
      > library(flowCHIC)
      > # تعيين دليل العمل إلى المسار حيث توجد الملفات FCS
      > # اكتب المسار في علامات اقتباس
      > setwd("")
      > # الحصول على قائمة بأسماء الملفات من السفح الملفات الموجودة في دليل العمل الخاص بك
      > ملفات <--list.files(getwd(),full=TRUE,pattern="*.fcs")
      > # الحصول على قائمة بأسماء الملفات FCS الملفات المضمنة في الحزمة
      > ملفات <--list.files(system.file("extdata",package="flowCHIC")،
      + = TRUE، كامل نمط = "*.fcs")
      > # قراءة الملف FCS الأولى فلووفرامي
      > الإطار <--القراءة. FCS(files[1],alter.names=TRUE,transformation=FALSE)
      > # الحصول على قائمة بأسماء المعلمات/قناة
      > unname(frame@parameters@data$name)
    2. إنشاء صور للبيانات الخام سيتوميتريك بتنفيذ الدالة مجموعة "fcs_to_img":
      > # إنشاء الصور الرسم البياني باستخدام المعلمات الافتراضية
      > fcs_to_img(files)
    3. تعريف مجموعات فرعية الصور الرسم البياني بتنفيذ الدالة مجموعة "img_sub":
      > # إنشاء الرسم البياني الصورة مجموعات فرعية باستخدام المعلمات الافتراضية
      > img_sub (ملفات، ch1 = "خ. Log",ch2="FL.4.Log ")
    4. حساب القيم التداخل و XOR لإجراء تحليل الصورة بتنفيذ الدالة مجموعة "calculate_overlaps_xor":
      > # حفظ أسماء كل مجموعة فرعية الصور كقائمة
      > مجموعات فرعية <--list.files(path=paste(getwd(),"chic_subset",sep="/"),full=TRUE,pattern="*.png")
      > # حساب التداخل والصور XOR وكتابة القيم إلى اثنين من الملفات الجديدة
      > نتائج <-calculate_overlaps_xor(subsets)
    5. إنشاء غير متري مؤامرات التحجيم متعددة الأبعاد (المقبول) لتحليل التشابه بتنفيذ الدالة مجموعة "plot_nmds":
      > إظهار # مؤامرة المقبول من العينات
      > plot_nmds(results$overlap,results$xor)
  2. سيتوميتريك المتوازية
    ملاحظة: التعليمات البرمجية ووثائق مفصلة ودليل لهذه الحزمة متوفرة في http://www.bioconductor.org/packages/devel/bioc/html/flowCyBar.html. كذلك فقد نشرت11،12.
    1. وضع قالب بوابة رئيسية للاستخدام في جميع العينات.
      1. تحميل الملفات.fcs في برامج التحليل استخدام وظيفة السحب والإفلات.
      2. انقر نقراً مزدوجاً فوق قياس واختيار المعلمات المحور س والمحور ص من القوائم المنسدلة الخاصة بكل منها لفتح مؤامرة الأسفار منتدى التعاون الأمني مقابل DAPI.
      3. استخدام أداة رسم المضلع إعادة إنشاء بوابة الخلية المستخدمة سابقا السيطرة على عدد الخلايا تم تحليلها في خطوات 3.1.4.5 و 3.2.4.4 وتسميته تبعاً لذلك. اسحب دخول بوابة الخلية في قائمة نماذج في كل فريق العينات لتجمع عليه.
      4. انقر نقراً مزدوجاً فوق بوابة الخلية وتصحيح الواجب المحور على تصور أحداث بوابة الخلية.
      5. تعريف الطوائف انتشارا في مجموعة العينات باستخدام أداة اهليلجية غيتس اتباع المبادئ التوجيهية المنشورة12 واستخدام المسح الضوئي لمحكمة أمن الدولة أو المعلمة الثالثة آخر21 لضمان سلامة القالب البوابة. تجميع ومراقبة وضبط توزيع سوبكومونيتي في العينات الأخرى.
    2. تصدير وفرة سوبكومونيتي النسبي إلى ملف.txt لاستخدامها في البرنامج النصي للبحث والتطوير.
      1. فتح محرر الجدول مع علامة التبويب تحرير.
      2. إضافة أعمدة لكل سوبكومونيتي التي تم تعريفها في الخطوة 5.2.1.5 وتعيين الإحصائيات الإخراج إلى "تردد أصل" وتسميتها.
      3. قم بإنشاء الجدول في محرر "الجدول" بعد اختيار حفظ الشكل والوجهة.
        ملاحظة: يوفر البرنامج التحليل مباشرة وفرة سوبكومونيتي النسبية. أنها يمكن أيضا الحصول على من خلال تقسيم عدد الأحداث في بوابة سوبكومونيتي الفردية بعدد الأحداث في بوابة الخلية. وقد القيم ليتم حفظها في مصفوفة محدد بعلامة جدولة في ملف.txt لا يمكن أن تحتوي على أية حقول n.a. ويحتاج لتلبية بعض الاحتياجات الإضافية قراءتها بواسطة التعليمات البرمجية R (انظر دليل وأسئلة وأجوبة للحصول على إرشادات محددة).
    3. تثبيت وتحميل الحزمة R وتحميل البيانات المنفذة:
      > مصدر ("https://bioconductor.org/biocLite.R")
      > biocLite("flowCyBar")
      > # اكتب المسار في علامات اقتباس
      > setwd("")
      > # تحميل dataset
      > data(Cell_number_sample)
      > # إظهار البيانات
      > Cell_number_sample [،-1]
    4. تطبيع وفرة نسبية بتنفيذ الدالة حزمة "تطبيع":
      # تطبيع البيانات، وطباعة الأرقام 2
      normalize(Cell_number_sample[,-1],digits=2)
    5. إنشاء كود شريطي من تم تسويتها و boxplot من وفرة نسبية الأصلي قبل تنفيذ الدالة مجموعة "cybar_plot":
      Normalized_mean <-normalize(Cell_number_sample[,-1],digits=2)
      Normalized_mean <--data.frame (data.matrix (Normalized_mean))
      # مؤامرة مع المعلمات الافتراضية
      cybar_plot(Normalized_mean,Cell_number_sample[,-1])
    6. إنشاء مؤامرة المقبول من وفرة نسبية الأصلي.
      > Normalized_mean <-normalize(Cell_number_sample[,-1],digits=2)
      > Normalized_mean <--data.frame (data.matrix (Normalized_mean))
      > # المقبول مؤامرة من أرقام cel تطبيع
      > nmds(Normalized_mean)
    7. إنشاء تحليل الارتباط وفرة نسبية طبيعية والمعلمات الأخرى بتنفيذ الدالة حزمة "الارتباط":
      > # تحميل dataset
      > data(Corr_data_sample)
      > # إظهار ارتباط القيم
      > Corr_data_sample [،-1]
      > # تشغيل تحليل الارتباط
      > correlation(Corr_data_sample[,-1])
      ملاحظة: شيك وسيبار تعتمد على وفرة نسبية. ومع ذلك، يمكن أيضا تحديد التدفق الخلوي أرقام الخلية المطلقة، التي قد تكون ذات فائدة كبيرة لتطبيقات التكنولوجيا الحيوية. لتحديد عدد الخلايا المطلقة، هو عدد الخلايا في بوابة الفائدة مقسوماً على حجم عينة تم تحليلها. يمكن تحديد حجم عينة تم تحليلها بواسطة إضافة تعليق حبة مع تركيز معلوم في العينة (الصيغة في "الملف التكميلي" 1-S7). بالإضافة إلى ذلك محلل أعلى مقاعد البدلاء مزودة بميزة عد حجمي حقيقية التي يوضحها مباشرة وحدة التخزين في أنبوب العينة أثناء أخذ القياس. ينصح باستخدام "أخضر سيبر" أنا تلطيخ البروتوكول لخلية العد.

Representative Results

التأكيد على ضرورة replicates النتائج التمثيلية التالية وتجسد تقنيات التحليل والتصور بيانات مختلفة في كل مجموعة من مجموعات العينة ثلاثة. أنها تظهر نتائج البيانات ممكن تقييم خطوط الأنابيب مناسبة للإجابة عن أسئلة البحث القياسية حول مجموعة كل منها. ومع ذلك، التقنيات المقدمة لا تقتصر على مجموعة العينات التي ترد مع. قياس تدفق البيانات الخام متاحة علنا مع معرف فلووريبوسيتوري FR-FCM-ZY46. السابق الذي تم تحميله ASC البيانات غير متوفرة تحت معرف FR-FCM-ZYD7.

Replicates البيولوجية والتقنية المتخذة، وأعدت وتحليلها وفقا للبروتوكولات المنشورة11. Replicates البيولوجية من الكمبيوتر والرابطة أخذت من ثلاثة قوارير موازية. واتخذت replicates البيولوجية قبل الميلاد كثلاث عينات اللاحقة في موقع واحد في مصنع لنطاق تجريبي. كانت مختبرين ثلاثة من عينة واحدة ثابتة والملون وتحليلها للتأكد من إمكانية تكرار نتائج التقنية. تم تقييم إمكانية تكرار الأساليب نتائج وفقا للإجراءات المنشورة سابقا11. واستخدمت قالب بوابة لجميع العينات من مجموعة عينة واحدة (الملف التكميلي 1-S6) لحساب الانحراف المعياري (%) كل بوابة.

على جهاز الكمبيوتر، وكان الانحراف المعياري الحد الأقصى للوفرة النسبية 3.44 في المائة، في حين كان متوسط الانحراف المعياري 2.13 في المائة (الشكل 1). للرابطة وقبل الميلاد، كانت الانحرافات المعيارية الحد الأقصى من وفرة نسبية 1.27% و 0.88 في المائة، بينما كانت متوسطات للانحرافات المعيارية 2.13 في المائة و 0.21 في المائة (الملف التكميلي 1-S8).

وهو إجراء موحد، عند التحقيق في ثقافة سلالة نقية، إعداد منحنى النمو لتحليل المرحلة الفاصلة ومرات جيل وكثافة الخلية تحت شروط معينة. ونحن الجمع بين هذا الإجراء مع التحليل سيتوميتريك تدفق سير العمل لتحقيق فهم أعمق للنظام (الشكل 2). منتدى التعاون الأمني مقابل DAPI fluorescence مؤامرات تكشف الدول دورة الخلية للثقافة في نقاط مختلفة من ثقافة المجموعة. أنشئ قالب بوابة رئيسية (ملف تكميلي 1-S6) لقياس نسبة الخلايا مع أحد (c1n)، هما (c2n) والصبغيات متعددة (ككسن، الشكل 2). وكان الغالب نسبة الخلايا الملقحين كروموسوم واحد فقط (93.7 في المائة في ح 0). وهذا تغير تغيرا جذريا خلال النمو الأسى، حيث ما يقرب من جميع الخلايا يتضمن أكثر من واحدة (99.6%، ح 4) وما يزيد على نصف السكان (53.1%) الواردة حتى اثنين أو أكثر من الكروموسومات. وهذا يوضح P. putidas القدرة على إجراء نسخ متماثل لها الكروموسومات أسرع من وقتها الجيل.

وقد ثبت تحليل تدفق سيتوميتريك مفيدة جداً لرصد تطور المجتمعات الميكروبية. فإنه يمكن تتبع ديناميات المجتمع أقرب بكثير من أكثر الموارد المكثفة الأساليب الجزيئية5،10. أبرز هذه الديناميات في فيلم، واكتسبت لمحة عامة عن تحولات المجتمع للحماه مع مرور الوقت. يظهر الإطار ثانية واحدة كل قطعة الأسفار منتدى التعاون الأمني مقابل DAPI نقطة عينة (2 ملف تكميلي). وأعقب تحولاً متميزة جداً بين 0 وعيد 4 إنشاء مجتمع الأساسية بعد يوم 7. خرجت الطوائف إضافية في يوم 21. قمنا بإنشاء قالب بوابة رئيسية (ملف تكميلي 1-S6) التي تم تمكين تقييم ديناميات الميكروبية على مستوى سوبكومونيتي. كانت الطوائف المهيمنة في مراحل مختلفة من هذه التجربة بوضوح باستخدام أداة سيبار (الشكل 3). الجمع بينها وبين توزيع الترددات وفرة نسبية سوبكومونيتي ساعد على تحديد البوابات التي مثيرة للاهتمام (تغيير كبير في وفرة في نقطة الزمنية رئيسية) وقابلة للتطبيق (5% على مدى الوفرة النسبية) للفرز والمزيد تحليل22.

يمكن أن تواجه تطبيقات النطاق الصناعي مفاعل حيوي التغاير المكانية المحتملة بسبب قيود الانفعالات. وكثيراً ما يتعرضون لتغيير معلمات التشغيل، مثل التغييرات في نوعية ركائز غير الاصطناعية. ويمثل هذا نظام قبل الميلاد وتم أخذ عينات من مختلف المحليات في مفاعل تدفق توصيل مدفوعة بشكل حيوي. منتدى التعاون الأمني مقابل DAPI fluorescence قطع (الشكل 4) نقطة العينة المثالية إظهار التغايرية الزمانية المكانية قليلاً فقط، ولكن واضح. كان مزيدا من التحقيق قبل الميلاد استخدام كليهما، شيك الآلي السريع وقالب البوابة الرئيسية أكثر تعمقاً على أساس نهج سيبار.

طبيعته التلقائية وسريعة وغير منحازة، يجعل شيك مثيرة للاهتمام لا سيما للتحكم في الموقع من بيوبروسيسيس في بيئة صناعية. فإنه يقارن البيانات الخام.fcs لجميع العينات المتوفرة. يتم عرض اثنين من هذه المقارنات في الشكل 5. تأكيد قيم الاختلاف الناتجة عن الملاحظات السابقة فيما يتعلق بالتباين المكاني والزماني. كذلك المقبول المؤامرات التي تم إنشاؤها بشكل مصفوفة الاختلاف أدوات شيك (الشكل 6) تؤيد هذه النتيجة ويتصور أنه تبعاً لذلك.

وبالإضافة إلى ذلك، قمنا بحساب وفرة نسبية من الطوائف 23 قبل الميلاد باستخدام قالب بوابة رئيسية (ملف تكميلي 1-S6). أجرى تحليل ارتباط من 48 عينات من فترة سنة واحدة لفهم العلاقات الوظيفية في المجتمع الميكروبية. وهذا يمكن أن يساعد على تحديد غيتس اهتمام لإجراء مزيد من التحقيق (4 الخلية الفرز). الارتباطات الإيجابية أو السلبية القوية مع معلمات اللاأحيائية مثل المنتج التتر يمكن أن تساعد على فهم وتحسين النظم الإيكولوجية والعمليات الحيوية. معدل التحميل العضوي المدرجة في هذا الارتباط (الشكل 7) تجسد معلمة اللاأحيائية. G5, G4 و G10 يحمل الارتباطات الإيجابية القوية وربما يمكن أن تتضمن الأنواع معفن، بينما قد تلميح الارتباط السلبي في مجموعة ال 8 صوب العتيقات مولده للميثان.

Figure 1
رقم 1: إمكانية تكرار نتائج التحليل سيتوميتريك لثقافة نقية. منتدى التعاون الأمني مقابل DAPI fluorescence المؤامرات مع الخرز التحكم (أ وب) وبار قطعا من وفرة سوبكومونيتي 3 [%] مع أشرطة الخطأ تمثل ± انحراف معياري واحد (ج، د). وتحددت وفرة نسبية مع قالب بوابة سيظهر في "الملف التكميلي" 1-S6. Replicates البيولوجية ثلاثة ألف وباء وجيم واتخذت منحنى النمو في ح 4 وثلاثة replicates التقنية P1، P2، P3 كانت مستعدة من عينة أ وقياس ثلاث مرات على التوالي: M1, M2, M3، وتعطي مع هذه الانحرافات المعيارية الخاصة بكل منها. وسجلت أحداث 50,000 في بوابة الخلية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: تحليل دورة الخلية من ثقافة نقية المتخذة خلال منحنى نمو تجربة ما يزيد على 12 حاء (A)- منتدى التعاون الأمني مقابل DAPI الأسفار المؤامرات لأخذ عينات نصف ساعة أن المعرض تحولاً من محتوى الحمض النووي أثناء مرحلة النمو المتسارع. لا تتضمن هذه السلسلة قياس الخرز (انظر "الملف التكميلي" 1-S3). (ب). منحنى النمو القائم على كثافة الضوئية مع أشرطة الخطأ تمثل ± انحراف معياري واحد، ووفرة نسبية في الطوائف على مر الزمن. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: تطور هيكل المجتمع للحماه أكثر من 24 يوما- المقابلة لها لون (A) فلووسيبار مع يتراكب تردد توزيعات تصور في بوكسبلوتس لبوابات الفردية التي يتم ترتيبها حسب تشابهها مع الاتجاهات، مفتاح (ب) وإجراء تحليل تشابه في خفة دم الأرض المقبول R < 0.001 ( ج)-تظهر المؤامرات الكامنة في تسلسل الفيلم في التكميلية الملف 2. وتحددت وفرة نسبية باستخدام قالب بوابة في ملف 1-S6 التكميلية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: عدم تجانس بنية المجتمع الميكروبي في نطاق صناعي المكانية والزمانية لسد تدفق الغاز الحيوي مفاعل. أخذ العينات (A) مقارنة هيكل المجتمع الميكروبي من الأربعة منافذ من الأول إلى الرابع في اليوم 223. (ب) مقارنة الاختلافات هيكل المجتمع يتوقف الوقت من اليوم 0 يوم 384 في الميناء الثاني. الضوضاء قد قطع متأخراً لتعزيز التصور. وقيست الأحداث 250,000 في بوابة الخلية (ملف تكميلي 1-S6). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الرقم 5: مقارنة الصور الرسم البياني سيتوميتريك – شيك- ويتمثل مبدأ الخوارزمية شيك بمقارنة عينتين يمثل التباين المكاني والزماني، على التوالي. (ط) يتم إنشاء الصور شيك من الملفات.fcs بعد تحديد معلمتين من معلمات لعرض (FSC مقابل DAPI الأسفار). رموز اللون الرمادي (0-255) عدد الأحداث في بكسل. (ثانيا) يتم إنشاء مجموعات فرعية شيك بعد تحديد المنطقة التي تحتوي على خلايا (هنا: 200 < < 4000، 200 × < y < 2200). (ثالثا) يتم إنشاء صورة تركيبة XOR بمقارنة بكسل بين المجموعات. لا يوجد فرق يساوي 0 ويتم عرضها باللون الأسود. الحد الأقصى للفرق يساوي 200 ويتم عرضها باللون الأبيض. يتم حساب القيمة XOR المقابلة بإضافة قيم مقياس الرمادية لكل بكسل في الصورة XOR. (رابعا) يتم إنشاء صورة تركيبة تراكب بإضافة قيم بكسل لمجموعات فرعية اللون الرمادي. يتم حساب قيمة تراكب المقابلة عن طريق العد بكسل صورة تراكب التي لا تساوي الصفر وذلك تحتوي على معلومات. (v) يتم حساب القيم الاختلاف بقسمة قيم XOR وتراكب. هذه هي الأساس لهذه المؤامرة المقبول في الشكل 6. كل قيم الاختلاف وإظهار الأرض المقبول تذكر المكانية-وعدم تجانس مجتمع الزمانية وضوحاً. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 6
رقم 6: شيك على أساس التشابه تحليل عينات المجتمع الأحيائي- تم استبعاد العينة 0 أيام من هذه المحاولة بسبب هيكلها مختلف للغاية المجتمع تشوه التحليل (الملف التكميلي 1-S11). يؤكد المؤامرة المقبول الافتراض حول منخفض المكانية-والتغاير الزماني أعلى باستخدام أداة شيك، وهو موضح في الشكل 5. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 7
رقم 7: تحليل الارتباط في المجتمع الأحيائي- كانت محسوبة باستخدام معامل سبيرمان لترتيب رتبة المصفوفة ويستند على وفرة نسبية من الطوائف 23 التي تم تحديدها مع قالب البوابة الرئيسية في "الملف التكميلي" 1-S6. أنهم قد يرتبط بمعدل التحميل العضوي (تمثلت) لعينات 48 من فترة سنة واحدة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 8
الشكل 8: تحليل تشابه العوالق (P) وحماه على أساس المجتمعات المحلية (S) في مياه الصرف الصحي- تم أخذ عينات من انارات الأولية (PCL)، تنشيط الحمأة حوض (عليه السلام) وخزان هضم (DT) محطة معالجة مياه واسعة النطاق (مؤامرات دوت في "الملف التكميلي" 1-S10). وتحددت وفرة نسبية باستخدام قالب بوابة سيظهر في "الملف التكميلي" 1-S6. تم تحليل هذه وفرة سوبكومونيتي أيضا باستخدام أداة فلووسيبار لإنشاء سيبار (الملف التكميلي 1-S10) والمقبول الأرض (R < 0.01). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 9
الشكل 9: تثبيت الاستقرار ثقافة نقية. تم تخزين العينات المستمدة من تجربة منحنى النمو المتخذة في ح 0 أكثر من 28 يوما في-80 درجة مئوية بعد التثبيت في والغليسيرول 15%. منتدى التعاون الأمني مقابل DAPI fluorescence المؤامرات مع عنصر التحكم تظهر حبات. لا تتضمن سلسلة قياس الخرز (الملف التكميلي 1-S3). وسجلت أحداث 50,000 في بوابة الخلية (ملف تكميلي 1-S6). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الملف 1 من التكميلية: اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

ملف تكميلي 2: اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

Discussion

يتطلب إجراء تحليل ناجحة وجماعات السكان الميكروبية سيتوميتيرس ضبطها جيدا وخيارا ملائماً لمعلمات الخلية وسير عمل موثوق بها من أخذ العينات وتثبيت نحو تقييم البيانات والقياس. يجب أن يتعيشن المعلمات الخلية المحددة مع أطوال موجية الإثارة المتوفرة. ونحن نستخدم ويوصي DAPI، وحساسة للغاية بتركيزات منخفضة؛ لكن يجب أن يكون متحمس بالأشعة فوق البنفسجية-ليزر، التي عادة ما تتألف ليس في الهياكل سيتوميتير القياسية. صبغات أخرى، مثل سيبر الأخضر أنا، أيضا وصمة عار شعوب بأكملها أو المجتمعات ولكن عموما تقديم قرارات أقل شأنا. لا نوصي باستخدام إجراءات الأسماك أو اختبارات السلامة في المجتمعات الميكروبية. هذه النهج من المستحيل للتحديد الكمي والتحقق منها والتحكم بسبب آثارها على الأنواع الفردية في المجتمع غير مؤكد. لا يمكن موثوق بها اختبار، طالما أن نسبة كبيرة من المجتمعات التقليدية لا تزال غير متوفرة كثقافة نقية.

وتشمل الخطوات الحاسمة في البروتوكول إجراءات أخذ العينات والتثبيت، فضلا عن فرز الخلايا. يمكن معقدة أخذ العينات بنزوع بعض نقية الثقافات والمجتمعات الميكروبية تجميع إلى فلكس أو التمسك بالجزيئات مصفوفة عينة. من الضروري تبديد هذه المجاميع، وفصل الخلايا في عينة قبل إدخالها لتحليل تدفق سيتوميتريك لضمان نتائج موثوقة. كانت الأمثل البروتوكولين المتعلقين بإعداد عرض لتمكين تحليل خلية مفردة. ويتم ترشيح نهائي 50 ميكرومتر قبل القياس إلى إزالة أي مجاميع المتبقية وتمنع انسداد فوهة ميكرومتر 70 من فارز الخلية وومبومو تدفق من المحلل. فلكس الخلية من محطات معالجة مياه الصرف الصحي خاصة وفيرة وقوية وحيوية لوظيفة النظام. نحن التحقيق العوالق والرواسب على أساس المجتمعات الميكروبية في خزانات مختلفة من محطة لمعالجة المياه العادمة واسعة النطاق، لاختبار البروتوكول المعمول. وظلت مستقرة الحمأة تشكيل خلية وضوح تبدد المجاميع وتكوين المجتمع. وعلاوة على ذلك، أظهرت المجتمعات العوالق والمستندة إلى حماة الرائعة التشابه بينهما في جميع عينات ثلاث دبابات (الرقم 8، "الملف التكميلي" 1-S10). تم التحقق من هذه النتائج بالتسلسل amplicon المتاشب 16S النسبية الطازجة-، فورمالدهايد-المعالجة، تركز اهتمامها فورمالدهايد والإيثانول-، و عينة مفروزة10. ومع ذلك، تحديا غير عادي العينات البيئية، مثل الأغشية الحيوية القوية أو البكتيريا التي تنمو في سلاسل اتصال محكم، ويمكن أن تكون مستحيلة لتبديد. عينات التربة يمكن أن يكون إشكالياً، كما يظهر في الرسم البياني الجسيمات في كل مكان ويمكن أن تحجب الخلايا بوفرة محض. في مثل هذه الحالات، يلزم التسلسل التقليدي أساليب تطبيقها.

وينبغي اختبار استقرار التثبيت لكل نموذج مجموعة جديدة قبل تصميم التجربة لضمان صحة النتيجة. كما تمكن حسن تثبيت الاستقرار تلطيخ المجمعة والقياس من نقاط متعددة في الوقت عينة في يوم واحد. وعلاوة على ذلك تمكن القياسات النسخ المتماثل وخلية استعادية الفرز من النقاط الزمنية الحاسمة بعد إبرام والتقييم النهائي للتجربة. تم التحقق من تثبيت الاستقرار في ثقافة نقية أكثر من 28 يوما (الشكل 9). للتجارب في الموقع بما في ذلك نموذج النقل، ينبغي اختبار تثبيت الاستقرار على مدى فترات أطول (في هذه الحالة، 60 يوما بالنسبة للمجتمع للحماه، 195 يوما للمجتمع الغاز الحيوي، و "الملف التكميلي" 1-S9).

تلطيخ عادة ليست إشكالية ولكن يلزم التحكم مع معيار بيولوجية للسماح بتطبيق أدوات التقييم بيوينفورماتيك. قمنا باستخدام سلالة صورية BL21 كولاي (DE3)، التي كانت تركز اهتمامها ووفقا لبروتوكول ASC وتخزينها للاستخدام في كل دفعي المصبوغة.

وبصرف النظر عن DAPI، "الأخضر سيبر" أنا طبقت بنجاح حل المجتمعات الميكروبية لعدة سنوات14،،من2324،،من2526. الأخضر سيبر يتمكن من حل المجتمعات إلى مجموعات فرعية عالية ومنخفضة من الحمض النووي (حنا و LNA) باستخدام خلايا حية في طريقة على إنترنت. DAPI، ومع ذلك، أكثر تحديداً في الملزمة بالحمض النووي ويتيح تمييز الطوائف ما يزيد على 50 في مجموعة عينة واحدة لكن يتطلب خطوة تثبيت قبل تلوين.

الخلية الفرز هو سمة بارزة لهذا النهج، ويمكن تطبيقها إذا كانت بعض الطوائف من المزيد من الاهتمام. من الضروري التأكيد على أن لا منهاج عمل بيجين-(أداء لمدة 30 دقيقة فقط) ولا العلاج الإيثانول أو DAPI تلطيخ10 كان له تأثير سلبي على تسلسل amplicon 16S اللاحقة. التأثيرات المحتملة للتثبيت وتلطيخ الإجراءات المتعلقة ميتاجينومي سوبكومونيتي التحليلات لا تزال بحاجة إلى اختبار.

كثير من المعلومات عن وظائف المجتمع وديناميات الاتجاه يمكن الحصول عليها مستقلة عن النهج الفرز عندما تشمل الأدوات المعلوماتية الحيوية التي حل ميزات المجتمع على مستوى خلية بخلية افتراضية والاتصال هذه الميزات مع اللاأحيائية معلمات.

في الآونة الأخيرة، عددا من جديد أدوات التقييم المعلوماتية الحيوية، كلها مفيدة لكلا سيبر الأخضر الأول والنهج DAPI، قد وضعت لحل سيتوميتريك أنماط المجتمع. هذه هي فلووفب27، العبوات المستخدمة في هذه الدراسة (فلووتشيك20، فلووسيبار28)، نموذج deconvolution أنشئت مع مجتمعات المياه العذبة29 وأداة تستخدم لتميز سلالات وفقا لما الفسيولوجية 30من الخصائص. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يكون التنوع سيتوميتريك العزم25 والاستقرار حتى خصائص المجتمعات الميكروبية يمكن أن يتبع الآن مع أداة على إنترنت10.

وهكذا يكون تحليل تدفق سيتوميتريك ميزة كبيرة عندما يتعلق الأمر للتقييم السريع للمجتمعات الميكروبية والارتباطات المعلمة اللاأحيائية الممكنة. ومع ذلك، لا تزال هناك قيود للأسلوب. فإنه لا يمكن تطبيق حقاً على الإنترنت باستخدام أداة فلووسيبار، بسبب إجراءات إعداد بوابة استناداً إلى الخبرة. وعلاوة على ذلك، ستعزز تنمية سيتوميتيرس تدفق مصنوعة خصيصا، وسهلة الاستخدام إلى حد كبير انتشار نهج التحليل ميكروبيومي سيتوميتريك تدفق. الخطوات الأولى في هذا الاتجاه هي التي تعهدت بها28.

يمكن تصور التطبيقات المستقبلية لقياس تدفق الميكروبية في الإيكولوجيا الميكروبية، كما أنها تتيح رصد عالية التردد داخل نطاق مرات جيل البكتيرية وقد ثبت أن نماذج بيئية قابلة للتطبيق إلى البيانات سيتوميتريك5 ،10. الأسلوب مفيد جداً للفحوصات الروتينية للبيئات الطبيعية مثل ضوابط إلزامية من مياه الشرب في سويسرا31. فإنه يمكن أيضا أداة قيمة للتطبيقات الطبية مثل15 من البشرية أو الحيوانية32 ميكروبيومي الفحص. وبالإضافة إلى ذلك، قد تمكن آخر التطورات في المعلوماتية الحيوية الميكروبية التدفق الخلوي يكون جهاز استشعار لا يتجزأ في الضوابط العملية للنظم الميكروبية المدارة. كما يوفر المجتمع الميكروبي الخلوي أداة فرز لفرز الخلايا، تتيح دقة أعلى التحقيقات الجينوم لمجموعات فرعية محددة من المجتمع.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
 

Acknowledgments

ونعترف مع الامتنان يان مايكل وقوة يوتينج لتوفير الإجراءات ومجموعات بيانات ثقافة نقية والمجتمع للحماه، على التوالي. ونشكر كذلك كاترين Mörters لتحليل عينات المجتمع الغاز الحيوي. تم تمويل هذا العمل من هاء حمايتهما ناتشواتشسيندي فاتشاجينتور V. (FNR، مشروع الغاز الحيوي-بصمة Nr. 22008313) بالنيابة عن الوزارة الاتحادية الألمانية للأغذية والزراعة (بميل)، "برنامج الابتكار المركزية" "المؤسسات الصغيرة والمتوسطة" (زيمبابوي) من الوزارة الاتحادية الشؤون الاقتصادية والطاقة (بموي) (وآينار-أبوس، 16KN043222)، Deutsche Bundesstiftung Umwelt (الدنمركي، اللغات عند الطلب المشروع فون Phosphatdünger أسترالي ريستستوفين فون براويري und Kläranlage 33960/01-32)، قامت الوزارة الاتحادية الألمانية للتعليم و البحوث (الألمانية) (فزك 03XP0041G)، وتوجها نحو برنامج تمويل "الرابطة هلمهولتز" (POF R31 الثالث الموضوع 3 الطاقة الحيوية).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Milli-Q system Synthesis A10 Merck, Darmstadt, (GER)
BioPak Ultrafiltration Cartridge Merck, Darmstadt, (GER) CDUF BI0 01
MoFlo Legacy cell sorter Beckman-Coulter, Brea, California (USA)
Innova 90C Coherent, Inc , Santa Clara (USA) 334 nm - 364 nm, 100 mW
Innova 70C  Coherent, Inc , Santa Clara (USA) 488 nm, 400 mW
Genesis MX488-500 STM OPS Coherent, Inc , Santa Clara (USA) 488 nm, 400 mW
Xcyte CY-355-150 Lumentum, Milpitas, California, USA 355 nm, 150 mW
Photomultiplier tubes R928 and R3896 Hamamatsu Photonics, Hamamatsu City (Japan)
Summit 4.3 software Beckman-Coulter, Brea, California (USA)
1 µm  FluoSpheres Molecular Probes, Eugene, Oregon (USA) F8815 350/440 blue fluorescent
2 μm YG FluoSpheres Molecular Probes, Eugene, Oregon (USA) F-8827 505/515 yellow-green fluorescent beads 
0.5 μm Fluoresbrite BB Carboxylate microspheres PolyScience, Niles, Illinois (USA) 18339 360/407
1 μm Fluoresbrite BB Carboxylate microspheres PolyScience, Niles, Illinois (USA) 17458 360/407 blue fluorescent
1 µmYG FluoSpheres Molecular Probes, Eugene, Oregon (USA) F-13081 505/515 yellow-green fluorescent beads 
KH2PO4 Sigma-Aldrich, St. Louis (USA) CAS no. 7778-77-0
KCl Sigma-Aldrich, St. Louis (USA) CAS no. 7447-40-7
Cyflow Space  Sysmex Corporation, Kobe (Japan)
UV Laser Genesis CX, Coherent, Inc , Santa Clara (USA) 355 nm, 150 mW
H6779-32 series PMTs Hamamatsu Photonics, Hamamatsu City (Japan)
FloMax software Sysmex Partec GmbH, Görlitz, (GER)
all optical filters Carl Zeiss, Jena (GER)
KH2PO4 Sigma-Aldrich, St. Louis (USA) CAS no. 7778-77-0
KCl Carl Roth, Karlsruhe (GER) 6781.3
FlowJo 10.0.8r1 FlowJo, LLC, Ashland, Oregon (USA) Build number: 42398
R-software v.3.4.3 R Core Team
flowCHIC http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/flowCHIC.html
flowCyBar http://www.bioconductor.org/packages/devel/bioc/html/flowCyBar.html

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Xu, X., Hui, D., King, A. W., Song, X., Thornton, P. E., Zhang, L. Convergence of microbial assimilations of soil carbon, nitrogen, phosphorus, and sulfur in terrestrial ecosystems. Scientific Reports. 5 (1), 17445 (2015).
  2. Fathepure, B. Z. Recent studies in microbial degradation of petroleum hydrocarbons in hypersaline environments. Frontiers in Microbiology. 5, 173 (2014).
  3. Alshehrei, F. Biodegradation of Synthetic and Natural Plastic by Microorganisms. Journal of Applied & Environmental Microbiology. 5 (1), 8-19 (2017).
  4. Sarria, S., Kruyer, N. S., Peralta-Yahya, P. Microbial Synthesis of medium-chain chemicals from renewables. Nature Biotechnology. 35 (12), 1158-1166 (2017).
  5. Günther, S., Faust, K., Schumann, J., Harms, H., Raes, J., Müller, S. Species-sorting and mass-transfer paradigms control managed natural metacommunities: Species-sorting and mass-transfer paradigms in metacommunities. Environmental Microbiology. 18 (12), 4862-4877 (2016).
  6. Lambrecht, J., Cichocki, N., Hübschmann, T., Koch, C., Harms, H., Müller, S. Flow cytometric quantification, sorting and sequencing of methanogenic archaea based on F420 autofluorescence. Microbial Cell Factories. 16 (1), 180 (2017).
  7. Huttenhower, C., et al. Structure, function and diversity of the healthy human microbiome. Nature. 486 (7402), 207-214 (2012).
  8. Lloyd-Price, J., et al. Strains, functions and dynamics in the expanded Human Microbiome Project. Nature. 550, 61-66 (2017).
  9. Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies. Nature Reviews Genetics. 17 (6), 333-351 (2016).
  10. Liu, Z., et al. Ecological Stability Properties of Microbial Communities Assessed by Flow Cytometry. mSphere. 3 (1), e00564-e00517 (2018).
  11. Koch, C., Günther, S., Desta, A. F., Hübschmann, T., Müller, S. Cytometric fingerprinting for analyzing microbial intracommunity structure variation and identifying subcommunity function. Nature Protocols. 8 (1), 190-202 (2013).
  12. Koch, C., Fetzer, I., Schmidt, T., Harms, H., Müller, S. Monitoring Functions in Managed Microbial Systems by Cytometric Bar Coding. Environmental Science & Technology. 47 (3), 1753-1760 (2013).
  13. Lefort, T., Gasol, J. M. Short-time scale coupling of picoplankton community structure and single-cell heterotrophic activity in winter in coastal NW Mediterranean Sea waters. Journal of Plankton Research. 36 (1), 243-258 (2014).
  14. Besmer, M. D., Epting, J., Page, R. M., Sigrist, J. A., Huggenberger, P., Hammes, F. Online flow cytometry reveals microbial dynamics influenced by concurrent natural and operational events in groundwater used for drinking water treatment. Scientific Reports. 6, 38462 (2016).
  15. van Gelder, S., et al. A cytometric approach to follow variation and dynamics of the salivary microbiota. Methods. 134, 67-79 (2018).
  16. Jehmlich, N., et al. Advanced tool for characterization of microbial cultures by combining cytomics and proteomics. Applied Microbiology and Biotechnology. 88 (2), 575-584 (2010).
  17. Jahn, M., et al. Accurate Determination of Plasmid Copy Number of Flow-Sorted Cells using Droplet Digital PCR. Analytical Chemistry. 86 (12), 5969-5976 (2014).
  18. Koch, C., Müller, S. Personalized microbiome dynamics - Cytometric fingerprints for routine diagnostics. Molecular Aspects of Medicine. 59, 123-134 (2018).
  19. Jahn, M., Vorpahl, C., Hübschmann, T., Harms, H., Müller, S. Copy number variability of expression plasmids determined by cell sorting and Droplet Digital PCR. Microbial Cell Factories. 15 (1), 211 (2016).
  20. Koch, C., Fetzer, I., Harms, H., Müller, S. CHIC-an automated approach for the detection of dynamic variations in complex microbial communities. Cytometry Part A. 83 (6), 561-567 (2013).
  21. Günther, S., Müller, S. Facilitated gate setting by sequential dot plot scanning: Facilitated Gate Setting by Sequential Dot Plot Scanning. Cytometry Part A. 87 (7), 661-664 (2015).
  22. Guo, Y., Baumgart, S., Stärk, H. -J., Harms, H., Müller, S. Mass Cytometry for Detection of Silver at the Bacterial Single Cell Level. Frontiers in Microbiology. 8, 1326 (2017).
  23. Gasol, J. M., Del Giorgio, P. A. Using flow cytometry for counting natural planktonic bacteria and understanding the structure of planktonic bacterial communities. Scientia Marina. 64 (2), 197-224 (2000).
  24. Gasol, J. M., Morán, X. A. G. Flow Cytometric Determination of Microbial Abundances and Its Use to Obtain Indices of Community Structure and Relative Activity. Hydrocarbon and Lipid Microbiology Protocols. , 159-187 (2016).
  25. Props, R., Monsieurs, P., Mysara, M., Clement, L., Boon, N. Measuring the biodiversity of microbial communities by flow cytometry. Methods in Ecology and Evolution. 7 (11), 1376-1385 (2016).
  26. Kinet, R., et al. Flow cytometry community fingerprinting and amplicon sequencing for the assessment of landfill leachate cellulolytic bioaugmentation. Bioresource Technology. 214, 450-459 (2016).
  27. De Roy, K., Clement, L., Thas, O., Wang, Y., Boon, N. Flow cytometry for fast microbial community fingerprinting. Water Research. 46 (3), 907-919 (2012).
  28. Koch, C., Harnisch, F., Schröder, U., Müller, S. Cytometric fingerprints: evaluation of new tools for analyzing microbial community dynamics. Frontiers in Microbiology. 5, 273 (2014).
  29. Amalfitano, S., Fazi, S., Ejarque, E., Freixa, A., Romaní, A. M., Butturini, A. Deconvolution model to resolve cytometric microbial community patterns in flowing waters: Deconvolving Cytometric Microbial Subgroups. Cytometry Part A. 93 (2), 194-200 (2017).
  30. Buysschaert, B., Kerckhof, F. -M., Vandamme, P., De Baets, B., Boon, N. Flow cytometric fingerprinting for microbial strain discrimination and physiological characterization: Flow Cytometric Fingerprinting. Cytometry Part A. 93 (2), 201-212 (2017).
  31. Besmer, M. D., et al. Laboratory-Scale Simulation and Real-Time Tracking of a Microbial Contamination Event and Subsequent Shock-Chlorination in Drinking Water. Frontiers in Microbiology. 8 (1900), (2017).
  32. Zimmermann, J., et al. High-resolution microbiota flow cytometry reveals dynamic colitis-associated changes in fecal bacterial composition: Technical comment. European Journal of Immunology. 46 (5), 1300-1303 (2016).

Tags

العلوم البيئية، 137 قضية، التدفق الخلوي، وتحليلات خلية مفردة، وديناميات المجتمع الميكروبي، ميكروبيومي، ونموذج إعداد التدفق الخلوي، المراقبة البيولوجية، رصد ديناميات الخلية، تحليل البيانات سيتوميتريك، فلووتشيك، فلووسيبار
تميز ميكروبيومي ديناميات – التدفق الخلوي على أساس مهام سير العمل من ثقافات نقية للمجتمعات الطبيعية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lambrecht, J., Schattenberg, F.,… More

Lambrecht, J., Schattenberg, F., Harms, H., Mueller, S. Characterizing Microbiome Dynamics – Flow Cytometry Based Workflows from Pure Cultures to Natural Communities. J. Vis. Exp. (137), e58033, doi:10.3791/58033 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter