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특성화 미생물 역학-Cytometry 워크플로 순수 문화에서 자연 커뮤니티를 기반으로

doi: 10.3791/58033 Published: July 12, 2018

Summary

흐름 cytometric 분석은 순수 문화 조사 및 미생물 지역 사회 역학을 모니터링 귀중 한 입증 했다. 우리는 순수한 문화 및 도전 행렬에서 명확한 매체 뿐만 아니라 복잡 한 사회에 대 한 데이터 분석, 샘플링에서 세 개의 포괄적인 워크플로 각각 제시.

Abstract

순수한 문화 조사 및 미생물 지역 사회 역동성의 모니터링은 이해 하 고 자연 생태계와 기술 응용 미생물에 의해 구동 제어 중요 합니다. 차세대 시퀀싱 메서드는 널리 활용 해결 microbiomes, 하지만 그들은 일반적으로 리소스와 시간을 집중 하 고 주로 질적 정보를 제공. 흐름 cytometric 미생물 분석 그 단점에서 고통을 하지 않습니다 및 상대 subcommunity 나타났는데 및 절대 제공할 수 있는 셀 번호 줄에. 직접 계통 발생 정보를 제공 하지 않습니다, 비록 그것 분석 깊이 접근을 시퀀싱의 해상도 강화할 수 있다. 의료 응용 프로그램 연구 및 일상적인 설정에 예리한 대조, cytometry 미생물 분석 하지 널리 사용 됩니다. 샘플 준비 및 데이터 분석 파이프라인에 대 한 누락 된 정보는 종종 교과서 교류 cytometry 응용 프로그램 것 미생물 분석도 전에 직면 하는 연구원에 대 한 진입 장벽을 만들 수 있습니다. 여기, 선물이 순수 문화에 대 한 세 개의 포괄적인 워크플로, 복잡 한 사회에서 분명 도전 행렬에 중간과 복잡 한 사회 각각. 우리는 개별 샘플링 및 고정 절차를 설명 하 고 각각 샘플 집합에 대 한 프로토콜을 얼룩이 지 최적화. 우리는 cytometric 분석 중심으로 복잡 한 연구와 응용 프로그램 집중된 벤치 톱 장치 셀 정렬 절차를 설명 하 고, 데이터 분석 패키지를 제안. 우리는 또한 중요 한 실험 제어를 제안 하 고 각각 샘플 세트를 제시 워크플로 적용 합니다.

Introduction

미생물 라이브 인간의 여러 측면에서 중요 한 역할을 담당할. 그들은 행성 탄소, 질소, 인 및 유황 사이클12,3 저하 뿐만 아니라 폐수 처리 등 다양 한 산업에서4 biocatalysts 합성 법의 주요 생물 드라이버 5 또는 생명 공학6. 그들은 심지어는 직접에 영향을 미치는 인간의 건강과 신진 대사7,8인간 microbiome 구성. 따라서, 구조, 기능 및 미생물, 그들의 즉시 환경에 대 한 응답에서의 동적 행동에 정보는 우리가 완전히 이해 하 고 이러한 시스템을 조작 하고자 하는 경우에, 필요 합니다. 차세대 시퀀싱 (NGS)는 미생물의 구조와 기능9를 해결 하기 위한 설립된 기술. 그러나, 분석과 NGS 데이터의 평가 양적 정보를 얻을 수 없습니다 이며 여전히 비싼, 시간이 걸리는 절대로 성능 복도 내에서 현장 결과 제공 하기 위해 준비. 일부 박테리아 생성 시간 1 시간 그리고 끊임없이 변화 하는 사회 구조에서 특정 환경10원인 아래 표시 됩니다. 이러한 역학에 따라 시퀀싱 방법을 사용 하 여 가장 과학적인 실험실의 재정 및 인력 용량을 초과 것입니다.

대조적으로, cytometry 높은 시간, 노동 및 비용 효율성을 유지 하면서 커뮤니티 지문 비슷한 NGS 데이터를 제공할 수 있습니다. 여기, 우리가 현재 흐름 cytometric 기술을 단일 셀 수준에 미생물 지역 사회 역학에서 라인을 따라 할 수 있습니다. NGS, 달리 cytometry 기능 유전자 계통 발생 제휴 또는 정보를 제공 하지 않습니다 하지만 양적 세포 수를 제공 합니다. Cytometry 사용 하 여, 미생물 커뮤니티 subcommunities 별개 가벼운 살포와 형광 속성 (앞으로 산포 (FSC) 및 측면 살포 (SSC) 셀 크기와 단위의 각각 제공)으로 해결할 수 있습니다. 제시 방식을 주로 활용 셀 크기-그리고 DNA 금액 특정 세포 유형 및 생리 (성장) 상태에 관련 된 관련된 정보. DNA 콘텐츠 UV-고르기 4', DNA의 A T 풍부한 지역에 바인딩하고 다른 염색체 수준 해결도 수는 6-diamidino-2'-phenylindole (DAPI) 염료를 사용 하 여 정량 이다. DAPI 형광 및 FSC 결합 하 여 50 이상 subcommunities 구별 고 시간11에 나타났는데 변경 모니터링 될 수 있습니다. Subcommunity 풍부 유사 변화 pH 및 제품 titers12, 글로벌 매개 변수, 날씨13,14또는 창 자 또는 타 액과 같은 마이크로 환경 주변에 상관 될 수 있습니다. 특정 치료15microbiomes입니다. 이러한 상관 관계 공개 키 subcommunities 전체 공동체의 대사 네트워크의 특정 기능에 대 한 책임. 키 subcommunities 수 다음 수 특히 승진 주변 마이크로-환경, 변경 하 여 억제 또는 후속 시퀀싱15 또는 proteomic 조사16정렬.

그러나, 미생물 커뮤니티 cytometry 하지 아직 널리 설립 흐름 cytometric 장치 미생물 인구 또는 지역 사회를 제대로 해결 능력의 다소 낮은 수 또한, 경험, 커뮤니티 분석 파이프라인 및 효과적인 데이터 평가의 부족 연구원 미생물 분석도 전에 직면에 대 한 진입 장벽을 포즈 수 있습니다. 우리는 이러한 문제를 해결 하기 위해 포괄적인 워크플로 설립 했다. 그들의 일반적인 적용을 설명 하기 위해 우리 3 모범 샘플 세트 (보조 파일 1-S1), 즉 나에 그들을 발표할 예정 이다) 정의 된 명확한 매체 (슈 도모 나 스 putida KT 2440에에서 성장 하는 바이오 응용 프로그램에 대 한 순수한 문화 (PC) 포도 당), ii) 복잡 한 실험실 커뮤니티 명확한 매체 (활성된 슬러지 커뮤니티 (ASC) 합성 폐수) 및 iii에) 고밀도 매트릭스 (biogas 커뮤니티 (BC) 옥수수 목초)에서 자연적인 환경에서 복잡 한 사회.

여러 가지 요인이 이러한 샘플 세트의 각각에 대 한 프로토콜 선택 영향. 깊은 동결 싶고 독성 화학 물질의 사용 하지만 주로 충격 설탕 프로 스 팅에 대 한 액체 질소의 사용으로 인해 실험실 환경에 제한 됩니다. 포 름 알 데히드 안정화 및 후속 에탄올 고정 aliquot 준비를 위한 필요 없이 대량 샘플링을 허용 하 고 오랜 기간 동안 안정적인 것을 입증 했다. 그러나, 인간 침15 등 단백질이 풍부한 샘플 단백질 flocs, 포 름 알 데히드에 의해 denaturized 불리 한 신호 잡음 비율을 발생할 수 있습니다 때문에 문제가 될 수 있습니다. 이 비교에서 절차의 대부분의 시간 (총에서 약 1 시간) 소요 됩니다 샘플 건조 하지만 독성 화학 물질 없이 사이트에 수행할 수 있습니다. 그것은 튜브, 냉각 또는 추가 위험 예방 조치 없이 쉽게 전달할 수 있는 안정 된 펠 릿을 생성 합니다. 또한, 많은 대체 고정 방법이 제안된11되었습니다. 우리는 강력히 새로운 샘플 세트를 소개 하는 경우 다른 프로토콜의 해상도 고정 안정성 테스트 권장 합니다.

우리는 세트를 분석 하 두 개의 서로 다른 흐름 cytometers 사용: i)는 매우 정교 하 고 비싼, 연구 중심 셀 정렬 및 현장 응용 프로그램5에 대 한 더 적절 한 나타나는 ii)는 응용 프로그램 집중 벤치 가기 분석기. PC와 ASC 셀 정렬와 함께 측정 하는 동안 BC 벤치 가기 분석기로 측정 되었다. 3 모범 샘플의 분석 최적화 재현성, 샘플 안정성과 워크플로 필요한 다른 절차를 설정합니다. 다음 프로토콜은 세 가지 다른 시스템에 대 한 섹션을 지정 합니다.

Protocol

1. 샘플링 및 고정

  1. 순수한 문화: 깊은 동결15,17
    1. 세포 현 탁 액, 실 온 (RT)에서 5 분 동안 원심 분리기 및 5000 x g 2 mL를가지고 고는 상쾌한 삭제.
      참고: 샘플된 세포 현 탁 액 보충 파일 1-s 1에 설명 되어 있습니다.
    2. 또한 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS, 6 m m 나2HPO4, 1.8 m m NaH24, 145 mM NaCl 이중 증 류 H2O, pH 7.2)의 1 mL에 셀 resuspend cryoprotective 대리인으로 15% (v/v) 글리세롤을 포함.
    3. 이후 스토리지-80 ° c.에 대 한 액체 질소에 얼음과 충격 동결에 10 분 동안 품 어
      참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기. 예제는 적어도 한 달 동안 안정.
  2. 슬러지 커뮤니티 활성화: 포름알데히드 안정화 + 에탄올 고정5,,1018
    1. 세포 현 탁 액, 3200 x g 15 ° C에서 20 분 동안 원심 분리기의 4 mL를가지고 고는 상쾌한 삭제.
      참고: 샘플된 세포 현 탁 액 보충 파일 1-s 1에 설명 되어 있습니다.
    2. PBS에서 2% 포름알데히드의 4 mL를 추가 하 고 실시간에 30 분 동안 품 어
      1. 보존 첨가제 메탄올 액체 형태로 출하 하는 포름알데히드에 추가 하지 않으려면 paraformaldehyde에서 8% 포름알데히드 재고 솔루션을 준비 합니다. 70 ° c.에 50 mL PBS의 paraformaldehyde의 4 g 추가 약 125 µ L 10 M NaOH 솔루션을 추가 합니다. paraformaldehyde은 완전히 녹이 고 그것은 때까지 저 어 다음 실시간 조정 약 100 µ L 37%와 7.0 pH 값을 HCl. 동결 15 mL aliquots에서 포름알데히드 솔루션 저장소에 대 한 진정. 녹여 aliquots 10 일 이상 사용 하지 마십시오.
        주의: 포름알데히드 처리 하 여 주의 그것의 독성 및 돌연변이 속성 때문에 삭제 해야 합니다. 그것을 처리 하는 동안 항상 착용 장갑. paraformaldehyde 녹이는 동안 배기 후드를 사용 하 여 유독 가스에 노출 되지 않도록.
    3. 샘플 15 ° C와 3200 x g 에서 10 분 원심 하 고 삭제는 상쾌한.
    4. 70% 에탄올과-20 ° c.에 게 4 mL에 샘플 resuspend
      참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기. 예제는 2 개월 이상 안정. 샘플 속성에 따라 1.2.1에서 원심 분리 단계 또한 시간을 절약 하 4 ° C에서 10 분 동안 수행할 수 있습니다.
  3. Biogas 커뮤니티: 건조
    1. 2 mL 튜브에 점성 digestate의 샘플 200 µ L 잘린된 1000 µ L 피 펫 팁을 사용 합니다.
    2. PBS 버퍼의 1700 µ L을 추가 하 고 철저 하 게 혼합.
    3. 35 kHz와 80 W 효과적인 출력 1 분 동안 큰 셀 집계를 해산 하 고 식물 세포 잔류물에 집착 하는 세포를 분리 하는 초음파 목욕으로 튜브를 놓습니다.
    4. 샘플을 철저 하 게 혼합, 샘플 50 µ L 메쉬 필터를 통해 필터링 하 고 약 400 µ L의 4 aliquots는 filtrate 나눕니다.
      참고: 두 가지 주요 이점을 제공 합니다이 시점에서 aliquots을 준비. 첫째, 더 작은 볼륨은 기계적 탈수를 빠르고 쉽게 (원심 분리기)와 열 (건조), 하지만 두꺼운 biogas 슬러지에서 일반적으로 작은 볼륨의 샘플링은 매우 도전적 일 수 있다. 둘째, 추가 샘플 후속 셀 정렬, 백업 측정 또는 컨트롤에 사용할 수 있습니다.
    5. 10 ° C와 4000 x g 에서 10 분 동안 두 번 aliquots 원심 하 고 기계적으로 샘플을 최대한 철저 하 게 탈수 하는 상쾌한 완전히 두 번 삭제.
    6. 35 ° C, 약-97 kPa와 안정 된 펠 릿을 만드는 2500 x g 에서 40 분 동안 온수 진공 원심 분리기에서 샘플을 건조. 어둠 속에서 4 ° C에서 펠 릿을 저장 합니다.
      참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기. 알 약 6 개월 이상 안정 있습니다.

2. 얼룩

참고: DAPI 얼룩 고해상도 도트 플롯을 제공 하는 입증 하 고 따라서 사회를 분석할 때 특히 유리 하다. 얼룩 솔루션에 DAPI 농도 셀 게이트 형광 강도 잡음 레벨 이상 하지만 구슬 아래를 보장 하기 위해 최적화 해야 합니다. 최적 악기 감도 구슬 선택에 따라 달라 집니다, 그리고 샘플 세트 포함 된 미생물의 G/C 내용 때문에 사이 다를 수 있습니다 및 일반적으로 새로 도입된 된 샘플 집합에 대 한 테스트 해야 합니다. 0.24 μ M DAPI에서 1 사이의 농도 테스트 µ M DAPI 제시 설치 권장 됩니다. 특정 응용 프로그램에 다른 염료를 사용할 수 있습니다. 사용 SYBR 녹색의 프로토콜을 얼룩이 나 때 정확도 계산 하는 절대 세포 지문 분석 (보충 파일 1-S1)6,15통해 우선 좋습니다. 그것은 더 적은 샘플 처리 및 원심 분리 단계를 포함 하 고 고정 및 중요 한 셀에 적용 됩니다. 중요 한 세포를 사용 하 여 샘플 처리 단계 건너뛰는 고정을 줄여 더 하며 따라서 하나만 원심 분리 세포 수확에 대 한. 이 잠재적인 셀 손실 및 따라서 체계적인 측정 에러를 최소화합니다. PBS, permeabilization 버퍼 및 모든 다음 단계 동안 사용 되는 솔루션 얼룩 0.2 µ m 주사기 필터 샘플에 추가 입자 부하 감소를 통해 필터링 해야 합니다. 대장균 BL21 포함 한 샘플의 얼룩이 지기 (DE3) 모든 샘플 수영장 생물학 표준 권고.

  1. 순수한 문화
    1. 샘플, RT 및 5000 x g 에 5 분 동안 원심 분리기를 녹 인 다 고는 상쾌한 삭제.
    2. 반복 pipetting으로 얼음 차가운 PBS에 셀 펠 릿을 resuspend 하 고 0.035을 OD700nm 조정 (경로 길이 = 0.5 m).
    3. 얼룩에 대 한 셀을 준비 합니다.
      1. 조정된 세포 현 탁 액 RT 및 5000 x g 5 분의 1 mL를 원심 및 삭제는 상쾌한.
      2. 0.3 M 구 연산 및 4.1 mM Tween20 permeabilization 버퍼의 1 mL에 셀을 resuspend 하 고 철저 하 게 혼합.
      3. 다음 얼룩에 대 한 투과성 세포 막 만드는 얼음에 10 분에 대 한 샘플을 품 어.
      4. 원심 RT 및 5000 x g에 5 분에 대 한 샘플 하 고는 상쾌한 삭제.
    4. 0.68 µ M DAPI 417 m m 나2HPO4/NaH24 버퍼 (289 m m 나2HPO4, 128 m m NaH24 이중 증 류 H2O, pH 7)에 포함 된 솔루션을 얼룩이 지기의 1 mL을 추가, 혼합 및 어둠 속에서 RT에 적어도 15 분 동안 품 어.
      참고: 정확한 OD 조정은 DAPI 농도 일정 하 게 유지 하는 경우 셀 밀도와 DAPI 형광 달라 집니다 때문에 유사한 측정을 보장 하기 위해 중요 합니다. 상쾌한 세포 손실을 방지 하기 위해 일반적으로 깨지기 쉬운 펠 릿 때문에 신중 하 게 제거 되어야 한다.
      주의:을 변이 원 성 속성으로 인해 주의 DAPI를 처분.
  2. 활성된 슬러지 커뮤니티
    1. 고정된 샘플을 철저 하 게 혼합 하 고 0.6 mL 유리 튜브로 전송. 1.4 mL PBS의 추가 하 고 단계 1.3.3에서에서 설명 된 대로 RT에서 10 분 동안 sonicate. 샘플 4 ° C와 3200 x g에서 10 분 원심 하 고는 상쾌한을 제거 합니다. PBS의 2 개 mL를 추가 하 고 철저 하 게 혼합. 5 분 동안 sonicate.
    2. OD700nm 0.035을 조정 (경로 길이 = 0.5 cm) PBS와 함께.
    3. 얼룩에 대 한 셀을 준비 합니다.
      1. 샘플 4 ° C와 3200 x g 에서 10 분 원심 하 고는 상쾌한을 제거 합니다.
      2. Permeabilization 버퍼 0.11 M 구 연산 및 4.1 m Tween20 m의 1 mL에 셀을 resuspend 하 고 철저 하 게 혼합.
      3. RT 만드는 다음 얼룩에 대 한 투과성 세포 막에서 20 분 동안 품 어.
      4. 샘플 다시 4 ° C와 3200 x g 에서 10 분 원심 하 고는 상쾌한을 제거 합니다.
    4. 0.68 µ M DAPI 및 417 m 나2HPO4/NaH24 버퍼를 포함 하는 얼룩 솔루션의 2 개 mL를 추가 하 고 철저 하 게 혼합 적어도 60 분 RT 어둠 속에서 품 어.
      참고: 유리 튜브의 사용은 권고, 특정 미생물 플라스틱 튜브 벽에 고착 하는 경향이 하 고 과정에서 손실 될 수 있습니다. 잠복기 밤새는 것도 가능 하 고 일반적으로 실험실 절차를 단순화 합니다.
      주의: DAPI 처리 하 여 주의 돌연변이 속성 때문에 삭제 해야 합니다.
  3. Biogas 커뮤니티
    1. PBS에서 말린된 셀 펠 릿을 일시 중단 합니다.
      1. PBS의 800 µ L을 추가 하 고 철저 하 게 혼합 한 펠 렛 15 분 동안 담가 보자.
      2. 1000 µ L 피 펫과 액체 단계를 발음 하 고 젖은 펠 렛 피 펫 팁 튜브 벽의 원통형 섹션으로 이동. 그것은 거기에 충실 해야한다.
      3. 튜브 벽을 따라 펠 릿 스쿼시 원형 모션에서 피 펫 팁을 이동 합니다.
      4. 튜브 벽을 따라 피 펫 팁에서 액체 단계를 분배 하 여 관 벽에서 결과 슬러리를 세척.
      5. 발음을 피펫으로에 몇 번이 고 일시 정지를 교 반 하십시오.
    2. PBS와 샘플을 두 번 씻어.
      1. 4000 x g 10 ° C에서 5 분 동안 centrifuge 고는 상쾌한 삭제.
      2. PBS의 1500 µ L을 추가 하 고 철저 하 게 혼합.
      3. 한번 위의 두 단계를 반복 합니다.
    3. 튜브 1 분 동안 초음파 목욕으로 단계 1.3.3에서에서 설명 된 대로 놓고, 그 후, 개별 유리 튜브로 50 µ L 메쉬 필터를 통해 각 샘플을 필터링 합니다.
    4. OD700nm 0.035을 샘플의 2 개 mL를 희석 (경로 길이 = 0.5 cm) PBS와 함께.
    5. 2.2.3 위의 단계에서 설명한 대로 얼룩에 대 한 셀을 준비 합니다.
    6. 0.24 μ M DAPI를 포함 하는 얼룩 솔루션의 2 mL 및 417 m 나2HPO4/NaH24 버퍼, 철저 하 게 혼합을 추가 하 고 어둠 속에서 RT에서 밤새 품 어.
      주의: DAPI 처리 하 여 주의 돌연변이 속성 때문에 삭제 해야 합니다.

3입니다. 측정

참고: 모범 샘플 세트는 두 개의 서로 다른 흐름 cytometers로 분석 되었다. PC와 ASC, 매우 조절 더 복잡 하 고 쉽게 사용자 정의 연구 중심된 셀 정렬으로 분석 되었다. PC 분석에 대 한이 장치 설정에서 설명한 이전 게시16, 짧은 파란색 최대 레이저 장착 했다 (488 nm, 400 mW)와 자외선 (334-364 nm, 100 mW) 아르곤 이온 레이저. ASC 분석, 최신 블루 (488 nm, 400 mW) 및 자외선 (355 nm, 150 mW) 반도체 레이저를 설치 했다. 두 경우 모두, 블루 레이저 유도 (대역 통과 필터 488 nm ± 5 nm, 중립 밀도 필터 1.9) FSC 그리고 SSC (대역 통과 필터 488 nm ± 5 nm, 중립 밀도 필터 1.9, 트리거). 이러한 광학 특성 셀 크기와 세포 밀도, 각각 관련 됩니다. UV 레이저 흥분 DAPI 형광 (대역 통과 필터 450 nm ± 32.5 nm) 세포질 DNA 콘텐츠의 정량화에 대 한. 유체 시스템은 최대 0.3 psi에서 샘플 압력와 70 μ m 노즐 56 psi (3.86 바)에서 실행 되었습니다. 모든 매개 변수는 측정 해상도 개선 하기 위해 피크 넓이 대신 피크 높이로 기록 되었다. Biogas 커뮤니티의 장기 모니터링는 덜 복잡 한 흐름 베트, 벤치 가기 분석기와 함께 실시 했다. 자 외 반도체 레이저 (355 nm, 50 mW)는 FSC를 유도 하는 데 사용 되었다 (대역 통과 필터 355 nm ± 5 nm) 및 SSC (대역 통과 필터 355 nm ± 5 nm, 트리거) 신호 DAPI 형광을 흥분 (대역 통과 필터 455 nm C). 두 소자의 칼 집 버퍼에 대 한 사용 물 필터링 이중 증 류와 0.1 µ m 이었다. PBS 샘플 희석 사용 가능한 측정 입자 소음을 줄이기 위해 0.2 µ m 주사기 필터를 통해 필터링 해야 합니다.

  1. 순수한 문화 및 활성된 슬러지 커뮤니티
    1. 악기, 레이저, 컴퓨터 및 소프트웨어를 시작 하 고 샘플 분석에 대 한 준비.
      1. 레이저에 전환 하 고 15 분 작동 온도 도달 하 고 빔 안정성 보장을 실행 합니다.
      2. 이중 증 류 H2O 작업 솔루션 x 0.2 희석 칼 집 버퍼 (19 m m KH24, 38 m m KCl, 166 m m 나2HPO4, 이중 증 류 H2O 1.39 M NaCl) x 10 칼 탱크를 채우기 (셀 정렬: 0.5 x 작업 솔루션)입니다.
      3. 압력 및 대략 6 psi 진공 폐기물 탱크 56 psi 유체 시스템 프라임.
      4. 린스 샘플 포트, 튜브, 노즐 Backflush 모드에서 최소 15 분 동안 악기를 실행 합니다.
    2. 표준 구슬과 보정.
      1. 구슬 믹스는 선형 (1 μ m 블루 + 2 μ m 노란색-녹색 형광)에서 교정에 대 한 준비 및 로그 범위 (0.5 μ m, 1 μ m 블루 형광). 동등한 농도 달성 하기 위해 원래 재고 정지에서 구슬 정지 희석.
      2. 지속적으로 선형 구슬 믹스를 측정 하 고 노즐을 조작 하 여 미리 설정 된 교정 서식 구슬 봉우리를 맞는 레이저 광학 위치 미리 선형 범위에 악기를 보정 하.
      3. 스위치는 로그 범위를 지속적으로 측정 로그 구슬 믹스. 악기의 하드웨어를 미세 조정에 그들의 미리 교정 서식 구슬 봉우리에 맞게. 광 전 증폭 관 관 (Pmt)의 이득 설정을 사용 하 여 구슬 위치에 최종 조정을 합니다.
      4. 경 음악 잡음의 위치를 확인 하 고 교정 서식에 맞게 조정 가능.
        참고: 구슬의 위치에 대 한 고정된 교정 서식 파일 측정 프로젝트 전에 준비 하 고 (보조 파일 1-S4 참조) 변경할 수 없습니다! 경 음악 노이즈 샘플 또는 전자 잡음은 Pmt의 입자에 의해 유도 될 수 있다 그리고 항상 어느 정도 기록 될 것 이다. 이득 조정 또는 플롯 오프셋에 의해 소음을 완전히 숨길을 권장 하지 않습니다. 풍요로 움과 잡음 이벤트의 위치 정보의 귀중 한 소스 수 있으며 따라서 원시 데이터에 포함 되어야 합니다. 매우 입자 집중 샘플 플로팅 및 데이터 분석 이유로 잡음의 후속 제거 할 거 수 있습니다. 악기의 안정성을 보장 하 고 따라서 comparability을 측정 하루 동안 정기적으로에 교정을 제어 합니다.
    3. 2.1.4에 설명 된 대로 포함 하는 생물 학적 표준 샘플을 측정 (DAPI 스테인드 대장균 BL21 (DE3), 샘플링 및 단계에서 고정 (16 h) 1.2에서 설명 ASC 프로토콜에 따라 고정). 그들의 사전된 교정 템플릿 (참조 보조 파일 1-S5) 기준 피크 위치를 확인 하십시오.
      참고: 일상적인 얼룩 및 샘플의 모든 풀의 생물학 표준 측정 될 것입니다 또한 얼룩 절차에 대 한 내부 통제. 비즈를 사용 하 여 장치는 교정 생물학 표준 미리 교정 서식 파일 맞지 않는 경우에, 얼룩 절차는 아마 반복 해야 합니다.
    4. 샘플 취득입니다.
      1. 10 분 샘플 포트와 튜브를 헹 구 고 후속 샘플에 DAPI 형광의 안정성 보장 얼룩 솔루션을 실행 합니다.
      2. 얼룩진된 샘플 cytometer 노즐의 막힘 방지 또는 모 세관 흐름을 측정 하기 전에 50 μ m 메쉬 필터와 필터링.
      3. 악기 안정성 모니터링 회고전 교정 검사에 대 한 가능성을 제공 하는 샘플에 로그 구슬 믹스를 추가 합니다. 샘플은 두 개의 구슬 게이츠의 각 1000 및 2500 이벤트 사이 포함 되어야 합니다.
      4. 새로운 샘플 세트의 첫 번째 시험 측정 동안 악기 소프트웨어에서 셀 게이트를 만듭니다. 이 게이트는 스테인드 셀을 포함 하 고 소음 및 구슬 제외 해야 합니다.
      5. 샘플을 혼합 하 고 250000 셀 (커뮤니티) 또는 50, 000 셀 (순수한 문화) 셀 게이트 내에서 감지 될 때까지 3000 이벤트의-1 의 최대 속도에서 측정 한다.
        참고: 이러한 셀 수 샘플 세트와 경험에 따라 선택 됩니다. 다른 숫자는 측정 효율성과 낮은 풍부 subcommunities 어느 방향으로 감지 간의 거래와 교대로 사용할 수 있습니다.
        문제 해결: 갑자기 내부 측정 구슬의 그리고 세포 위치 갇혀 노즐에서 공기 방울에 의해 발생할 수 있습니다. 이 제거 하 고 칼 집 버퍼 유체 시스템의 세 정 노즐의 청소 필요로 합니다. 악기 (시작 단계 3.1.2) 노즐을 탑재 후 재조정 될 필요가 있다.
      6. Backflush 칼 집 종료 하 고 샘플을 전환 하기 전에 버퍼와 철저 하 게 악기.
  2. Biogas 커뮤니티
    1. 악기, 레이저, 컴퓨터 및 소프트웨어 샘플 분석에 대 한 준비를 시작 합니다.
      1. Backflush 적어도 6 mL 튜브 및 샘플 악기 소프트웨어의 "칼 집 액체 황금" 기능을 사용 하 여 느슨하게 연결 된 튜브로 포트를 통해 칼 집 버퍼 (이중 증 류 H2O).
      2. 이중 증 류 H2O에서 유체 시스템 미만 200 이벤트의-1 은 0.5 µ L s-1의 일반적인 흐름 속도로 감지 때까지 씻어 하 5 µ L s-1 를 측정 합니다.
    2. 시스템 보정.
      1. 구슬 믹스 (0.5 μ m, 1 μ m 블루 형광)를 준비 합니다. 동등한 농도 달성 하기 위해 원래 재고 솔루션에서 구슬 정지 희석.
      2. 지속적으로 로그4 범위에서 구슬 믹스를 측정 하 고 흐름 베트와 레이저 광섬유 위치를 조작 하 여 그들의 미리 설정 된 교정 서식 구슬 봉우리를 맞는. Pmt의 이득 설정으로 구슬 위치에 최종 조정을 합니다.
    3. 제어 생물 학적 표준 교정 단계 3.1.3에서에서 설명한 대로.
    4. 샘플 취득입니다.
      1. PBS의 1600 µ L에 얼룩진된 샘플의 400 µ L를 희석 하 고 그것을 측정 농도 테스트를 수행 하는 이벤트 수를 모니터링 합니다.
        참고: 조정 된 희석 속도 다른 샘플 소스에 대 한 필요할 수 있습니다. 이벤트 수 입자 앞으로 분산형 (보충 파일 1-s 2에 부정적인 예제)에서 해상도 손실을 방지 하기 위해 풍부한 샘플에서 1200 이벤트의-1 를 넘지 말아야 한다. 순수한 문화는 최대 2000 이벤트의-1을 측정할 수 있습니다.
      2. 이 첫 번째 시험 측정 동안 악기 소프트웨어에서 셀 게이트를 만듭니다. 이 게이트는 스테인드 셀을 포함 하 고 잡음과 비즈를 제외 해야 합니다.
      3. 최대 1200 총 이벤트의-1 에서 실행 하 고 추가 구슬 믹스 악기 안정성 모니터링 회고전 교정 검사에 대 한 가능성을 제공 하는 샘플 농도 테스트의 결과 따라 샘플을 희석. 샘플은 두 개의 구슬 게이츠의 각 1000 및 2500 이벤트 사이 포함 되어야 합니다.
      4. 혼합 하 고 250000 셀 (커뮤니티) 또는 50, 000 셀 (순수한 문화) 셀 게이트 내에서 감지 될 때까지 샘플을 측정 한다.
      5. 종료 및 스위칭 샘플 전에 철저 하 게 이중 증 류 H2O와 악기를 씻어.

4. 셀 정렬

참고: 셀 정렬 프로시저 추가 악기 설정 필요 하 고 게시 프로토콜12에 따라 수행 됩니다.

  1. 시작 단계 3.1.1-3.1.3에 설명 된 대로 악기를 보정 하지만 칼 집 버퍼의 작업 솔루션 x 0.5를 사용 하 여.
  2. DD 주파수 및 DD 진폭 드롭릿 휴식에서 찾을 수 설정 합니다.
  3. 편향도 격판덮개를 탑재 하 고 충전에 대 한 2-또는 4-방향 정렬 모드를 결정 합니다.
  4. 2 내부 드롭 지연 교정 수행 μ m 노란색-녹색 구슬 입자 또는 셀 심문에서 여행 하는 시간 범위를 정의 하는 스트림에 연결 된 마지막 한 방울 (레이저 안타 셀) 가리키도록.
  5. 6 회 20 구슬 유리 슬라이드에 정렬 하 고 드롭 지연 보정을 확인 하는 현미경으로 그들을 계산.
  6. 정렬 게이트 서식 파일을 준비 합니다.
  7. 사용은 "단일 및 한 놓기 모드: 가장 높은 순도 99%" 하지 2500 보다 높은 비율로 총 이벤트의-1 (4-방향 정렬 모드) 한 번에 최대 4 게이츠에 500000 셀 정렬.
  8. 원심 분리 (20000 x g, 6 ° C, 25 분)에 의해 세포를 수확 하 고 나중에 DNA 분리 및 시퀀싱에 대 한-20 ° C에서 펠 릿을 동결.
    참고: 방지 5% 미만으로 게이츠에서 셀 정렬 정렬 시간으로 관계 되는 풍부는 상대적 풍요에 반대로 비례. 개별 단계 셀 정렬 설명서에 자세히 설명 되어 있습니다. 필요한 셀 번호는 각 사용 사례 및 추출 프로토콜에 크게 의존. 수많은 방법이 적용 된: ddPCR (1000 셀17,19), 16S rDNA mcrA amplicon 시퀀싱 (500000 셀6,,1015)와 단백질 (최대 107 x 1.1 16,17). 셀 정렬 정렬된 subcommunities에서 낮은 다양성 때문에 metagenomics 접근법과 결합 될 때 특히 유리한 것입니다.
    주의: 높은 전압으로 인해 정렬 절차 동안 편향 접시를 만지지 마십시오.

5. 데이터 분석

참고: cytometric 측정 일반적으로 균일 한 데이터 구조와 "cytometry 표준".fcs 데이터 파일을 생성합니다. 그러나, 다른 cytometer 제조업체 약간 적응 시킨된 버전을 사용 하 고 오래 된 악기의 최신 FCS 표준 3.1 2010 소개 앞선 수 있습니다. 이 점 플롯 스케일링 문제, 다른 악기와 함께 모여 결과의 직접적인 비교를 방지 하는 발생할 수 있습니다. 그러나, 개별 데이터 요소 행렬, 각 분산형 및 다른 열에서 형광 강도 값의 라인에 항상 저장 됩니다. 제시 미생물 분석 파이프라인 미생물 subcommunities 위해 독특한 셀 크기와 DNA 콘텐츠를 사용 합니다. 이 매개 변수는 FSC와 DAPI 형광 채널 농도에 상관 (셀 정렬: 플로리다-4, 분석기: 플로리다-1) 및 subcommunity 클러스터 2 차원 FSC 대 DAPI 형광 플롯 시각 때의 결과. 이러한 점 플롯 해석과 흐름 cytometry 데이터의 분석을 허용 하 고는 일반적으로 로그 배율 조정. 그들은 독점 cytometer 소프트웨어 또는 타사 솔루션을 사용 하 여.fcs 파일에서 표시 될 수 있으며 자동된 (Cytometric 히스토그램 이미지 비교, 세련 된)에 대 한 기초 및 반자동된 (Cytometric 바코드, CyBar) 커뮤니티 분석.

  1. Cytometric 히스토그램 이미지 비교
    참고: 코드, 자세한 설명서와이 패키지에 대 한 설명서 http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/flowCHIC.html에서 사용할 수 있습니다. 그들은 또한 게시20되었습니다.
    1. 설치 및 R 패키지를 로드,.fcs 파일이 포함 된 작업 디렉터리를 설정 하 고 실행 하 여 파일 목록을 설정.
      > 소스 ("https://bioconductor.org/biocLite.R")
      > biocLite("flowCHIC")
      > library(flowCHIC)
      > # 설정 작업 디렉터리 경로를 FCS 파일 있는 위치
      > # 따옴표에 경로 입력 합니다.
      > setwd("")
      > # 작업 디렉토리에 있는 FCS 파일의 파일 이름 목록을 가져오려면
      > 파일 <-list.files(getwd(),full=TRUE,pattern="*.fcs")
      > # 패키지에 포함 된 FCS 파일의 파일 이름 목록을 가져오려면
      > 파일 <-list.files(system.file("extdata",package="flowCHIC"),
      전체 패턴을 TRUE, = + = "*.fcs")
      > # FlowFrame로 첫 번째 FCS 파일 읽기
      > 프레임 <-읽기. FCS(files[1],alter.names=TRUE,transformation=FALSE)
      > # 얻을 매개 변수/채널 이름 목록
      > unname(frame@parameters@data$name)
    2. "Fcs_to_img" 패키지 기능을 실행 하 여 cytometric 원시 데이터에 대 한 이미지를 만듭니다.
      > # 기본 매개 변수를 사용 하 여 히스토그램 이미지 만들기
      > fcs_to_img(files)
    3. "Img_sub" 패키지 기능을 실행 하 여 히스토그램 이미지의 하위 집합을 정의:
      > # 이미지 하위 집합 기본 매개 변수를 사용 하 여 히스토그램을 만들
      > img_sub (파일, ch1 = "FS. Log",ch2="FL.4.Log ")
    4. "Calculate_overlaps_xor" 패키지 기능을 실행 하 여 이미지 분석을 중복 및 XOR 값을 계산:
      > # 저장 모든 하위 집합 이미지의 이름을 목록으로
      > 하위 집합 <-list.files(path=paste(getwd(),"chic_subset",sep="/"),full=TRUE,pattern="*.png")
      > # 중복 및 XOR 이미지를 계산 하 고 값을 기록 하는 두 개의 새로운 파일을
      > 결과 <-calculate_overlaps_xor(subsets)
    5. 비 미터 다차원 스케일링 (NMD) "plot_nmds" 패키지 기능을 실행 하 여 유사성 분석에 대 한 플롯 만들기:
      > # 샘플 NMD 플롯 표시
      > plot_nmds(results$overlap,results$xor)
  2. Cytometric 바코드
    참고: 코드, 자세한 설명서와이 패키지에 대 한 설명서 http://www.bioconductor.org/packages/devel/bioc/html/flowCyBar.html에서 사용할 수 있습니다. 그들은 또한 게시11,12되었습니다.
    1. 모든 샘플에서 사용 하기 위해 마스터 게이트 템플릿을 개발할 수 있습니다.
      1. 드래그 앤 드롭 기능을 사용 하 여 분석 소프트웨어에.fcs 파일을 로드 합니다.
      2. 더블 클릭을 측정 하 고 FSC 대 DAPI 형광 음모를 열려면 해당 드롭다운 목록에서 x 축 및 y 축 매개 변수를 선택 합니다.
      3. 다각형 그리기 도구를 사용 하 여 이전 단계 3.1.4.5 3.2.4.4 분석 된 셀의 수를 제어 하 고 적절 하 게 이름을 하는 데 사용 하는 셀 게이트를 재현. 그것은 수영장을 모든 샘플 그룹에 샘플 목록에서 셀 게이트 항목을 끕니다.
      4. 셀 게이트 더블 클릭 하 고 셀 게이트 이벤트 시각화를 축 할당을 수정 합니다.
      5. 다음 게시 된 지침12 타원형 게이츠 도구로 subcommunities 샘플 세트에 정의 하 고 게이트 서식 파일의 무결성을 보장 하는 SSC 또는 다른 세 번째 매개 변수21 의 검색을 사용. 수영장, 제어 하 고 다른 샘플에서 subcommunity 할당을 조정 합니다.
    2. 상대 subcommunity 나타났는데 R 스크립트에 사용 하기 위해.txt 파일로 내보냅니다.
      1. 편집 탭 테이블 편집기를 엽니다.
      2. 모든 subcommunity 단계 5.2.1.5에서에서 정의 되었고 "부모의 주파수"로 출력 통계 설정에 대 한 열을 추가 하 고 그들의 이름을.
      3. 저장 형식 및 대상 선택 후 "테이블 편집기"에서 테이블을 만듭니다.
        참고: 분석 소프트웨어는 직접 상대 subcommunity 나타났는데를 제공합니다. 그들은 또한 셀 게이트에서 이벤트 수 개별 subcommunity 문에서 이벤트 수의 부서를 통해 얻을 수 있습니다. 값 없음 필드를 포함할 수 없습니다 (참조 설명서 및 특정 지침에 대 한 FAQ) R 코드에서 읽을 수 있도록 몇 가지 추가 요구 사항을 충족 하는.txt 파일에 탭 구분 매트릭스에 저장 해야 합니다.
    3. 설치 및 R 패키지를 로드 하 고 실행 하 여 데이터를 로드:
      > 소스 ("https://bioconductor.org/biocLite.R")
      > biocLite("flowCyBar")
      > # 따옴표에 경로 입력 합니다.
      > setwd("")
      > # 부하 데이터 집합
      > data(Cell_number_sample)
      > # 표시 데이터
      > Cell_number_sample [,-1]
    4. "표준화" 패키지 기능을 실행 하 여 상대 나타났는데 정상화:
      # 데이터를 정상화, 2 자리 숫자를 인쇄
      normalize(Cell_number_sample[,-1],digits=2)
    5. 만들고 바 코드는 정규화의 원래 상대 나타났는데 boxplot "cybar_plot" 패키지 기능을 실행 하 여:
      Normalized_mean <-normalize(Cell_number_sample[,-1],digits=2)
      Normalized_mean <-data.frame (data.matrix (Normalized_mean))
      # 기본 매개 변수가 있는 플롯
      cybar_plot(Normalized_mean,Cell_number_sample[,-1])
    6. 원래 상대 나타났는데 NMD 계획을 만듭니다.
      > Normalized_mean <-normalize(Cell_number_sample[,-1],digits=2)
      > Normalized_mean <-data.frame (data.matrix (Normalized_mean))
      > # NMD 플롯 정규화 cel 숫자의
      > nmds(Normalized_mean)
    7. "상관" 패키지 함수를 실행 하 여 상관 관계 분석을 정규화 된 상대 나타났는데 및 다른 매개 변수를 만듭니다.
      > # 부하 데이터 집합
      > data(Corr_data_sample)
      > # 상관 관계 값 표시
      > Corr_data_sample [,-1]
      > # 실행 상관 관계 분석
      > correlation(Corr_data_sample[,-1])
      참고: 칙 및 CyBar 상대 나타났는데에 의존. 그러나, cytometry 바이오 응용 프로그램에 대 한 큰 관심의 수도 절대 핸드폰 번호를 확인할 수도 있습니다. 절대 휴대폰 번호를 확인 하려면 셀의 게이트 수 분석된 샘플 볼륨으로 나눕니다. 분석된 샘플 볼륨 샘플 (보충 파일 1-S7에 수식)로 알려진된 농도와 구슬 정지를 추가 하 여 확인할 수 있습니다. 벤치 가기 분석기는 직접 측정 하는 동안 샘플 튜브에 볼륨을 단정 하는 진정한 체적 계산 기능 또한 갖추고 있습니다. 셀 계산에 대 한 프로토콜을 얼룩이 나 SYBR 녹색을 사용 하는 것이 좋습니다.

Representative Results

다음 대표 결과 복제의 필요성을 강조 하 고 3 개의 샘플 세트의 각각에 서로 다른 데이터 시각화 및 분석 기법을 예증. 그들은 각 집합에 대 한 표준 연구 질문에 대 한 적합 한 가능한 데이터 평가 파이프라인의 결과 보여줍니다. 그러나, 제시 기법으로 선물을 샘플 집합에 독점 하지 않습니다. 교류 cytometry 원시 데이터와 함께 FlowRepository ID FR-FCM-ZY46에 공개적으로 사용할 수 되었다. 이전 업로드 된 ASC 데이터는 ID FR FCM ZYD7에서 사용할 수 있습니다.

생물학과 기술적인 복제 했다 촬영, 준비 하 고 게시 프로토콜11에 따라 분석. PC와 ASC에서 생물학적 복제 3 병렬 플라스 크에서 촬영 됐다. BC의 생물 복제는 파일럿 규모의 공장에서 한 위치에 3 개의 후속 samplings로 촬영 했다. 한 샘플의 3 aliquots 고정, 스테인드 되었고 기술 재현성을 보장 하기 위해 분석. 방법 재현성11이전에 게시 절차 따라 평가 했다. 하나의 샘플 세트 (보조 파일 1-S6)의 모든 샘플에 대 한 게이트 템플릿 게이트 당 표준 편차 (%)를 계산에 사용 되었다.

PC를 위한 관계 되는 풍부의 최대 표준 편차 평균 표준 편차는 2.13% (그림 1) 동안 3.44%, 이었다. ASC와 BC, 상대 나타났는데 최대 표준 편차 표준 편차의 평균 2.13%와 0.21% (보충 파일 1-S8) 동안 1.27%, 0.88%, 이었다.

표준 절차, 순수한 긴장 문화를 조사할 때 지연 위상, 생성 시간 및 특정 조건 하에서 세포 밀도 분석 하는 성장 곡선의 준비 이다. 우리가이 절차 흐름 cytometric 분석 워크플로 (그림 2) 시스템의 더 깊은 이해를 달성 하기 위해 결합. DAPI 대 FSC 형광 플롯 배치 문화의 다른 지점에서 문화의 세포 주기 상태 공개. 마스터 게이트 템플릿 (보충 파일 1-S6) 하나 (c1n), 포함 된 셀의 비율을 측정 하기 위해 설립 되었다 2 (c2n)와 여러 개의 염색체 (cXn, 그림 2B). 접종된 세포의 우세 비율 하나의 염색체 (0 h에서 93.7%) 했다. 이 지 수 성장, 어디 거의 모든 셀 하나 이상의 (99.6%, 4 h)을 포함 하 고 이상 인구 (53.1%)의 절반도 포함 된 두 개 이상의 염색체 동안 대폭 변경. 이것의 생성 시간 보다 더 빨리 그것의 염색체를 복제 하는 P. putidas 능력을 보여줍니다.

흐름 cytometric 분석 미생물 커뮤니티의 진화를 모니터링을 위한 매우 유용한 입증 했다. 그것은 더 많은 자원을 집중 분자 방법5,10보다 가까이 지역 사회 역학을 따를 수 있습니다. 우리 영화에이 역동성을 강조 하 고 시간이 지남에 활성된 슬러지 사회 변화에 대 한 개요를 얻었다. 각 1 초 프레임 샘플 포인트 (보충 파일 2)의 FSC 대 DAPI 형광 줄거리를 보여 줍니다. 0 일과 4 일 사이 매우 뚜렷한 변화는 7 일 후 핵심 공동체의 설립에 선행 되었다. 추가 subcommunities 하루 21에서 했다. 우리는 subcommunity 수준에 미생물 역학의 평가 사용 하는 마스터 게이트 서식 파일 (보충 파일 1-S6) 설립. 실험의 다른 단계에 있는 지배적인 subcommunities 명확 하 게 CyBar 도구 (그림 3)를 사용 하 여 확인 되었다. 상대 subcommunity 나타났는데 도움이 흥미로운 (키 시간에 발생에 중요 한 변화) 빌 게이츠를 선택 하 고 가능한 주파수 분배와 (이상 5% 상대 풍부) 정렬 및 추가 분석22.

산업 규모 생물 응용 프로그램 동요 제한으로 인해 잠재적인 공간 heterogeneities를 직면할 수 있다. 그들은 또한 자주 운영 매개 변수, 교대 비 합성 기판의 품질에서 변화에 노출 됩니다. BC 이러한 시스템을 대표 하 고 동적으로 구동된 플러그 흐름 반응 기에서 다른 지역에서 샘플링. DAPI 대 FSC 형광 플롯 (그림 4) 모범 샘플 포인트의 표시만 작은 공간, 하지만 발음 임시이. BC는 둘 다를 사용 하 여 조사에 추가, 빠른 자동화 세련 및 자세한 마스터 게이트 템플릿 기반 CyBar 접근.

자동화, 신속 하 고 공평한 자연의 산업 환경에서 특히 bioprocesses의 현장 제어에 대 한 흥미는 세련 된 게. 그것은 모든 사용 가능한 샘플의 원시.fcs 데이터를 비교합니다. 이러한 비교의 두 그림 5에 표시 됩니다. 결과 서로 값에 관한 공간 및 시간이 이전 관측을 확인 합니다. NMD 플롯 생성 양식 세련 된 도구 호환성 매트릭스 (그림 6) 더이 결과 substantiates 하 고 그에 따라 그것을 시각화.

또한, 우리는 마스터 게이트 템플릿 (보충 파일 1-S6)를 사용 하 여 BC의 23 subcommunities의 상대 나타났는데 계산. 1 년 기간에서 48 샘플의 상관 관계 분석 기능 미생물 지역 사회 관계를 이해 하 실시 됐다. 이 추가 조사 (4 셀 정렬)에 대 한 관심의 식별 수 있습니다. Abiotic 매개 변수와 함께 강한 긍정적인 또는 부정적인 상관 관계 같은 제품 titers 이해 하 고 생태계 및 바이오 프로세스를 최적화 하는 데 도움이 수 있습니다. 이 상관 관계 (그림 7)에 포함 된 유기 로딩 속도 같은 비 생물 적인 매개 변수를 예로 보여주. G4, G5, g 10 강한 긍정적인 상관 관계를 전시 하 고 수 있는 가능 하 게 포함 되 고 발효 종, G8에 부정적인 상관 관계 methanogenic archaea을 향해 힌트 수 있습니다.

Figure 1
그림 1: 순수 문화의 cytometric 분석의 재현성. FSC 대 DAPI 형광 ± 1 표준 편차 (C, D)를 나타내는 오차 막대와 제어 구슬 (A, B) 및 바 3 subcommunity 나타났는데 [%]의 플롯을 플롯 합니다. 상대 나타났는데 보충 파일 1-s 6에 표시 된 게이트 템플릿을 결정 했다. A, B, C 4 h에서 성장 곡선의 찍은 3 생물 복제와 3 개의 기술 복제 P1, P2, P3 샘플 A에서 준비 되었고 몇 번이 고, 각각 측정: M1, M2, M3, 그들의 각각 표준 편차와 함께 부여 됩니다. 50000 이벤트 셀 게이트에 기록 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: 순수 문화 성장 곡선 중의 세포 주기 분석 실험 (A) 이상 12 헤. FSC 대 DAPI 형광의 지 수 성장 단계 동안 DNA 콘텐츠의 변화는 bi 시간당 samplings 플롯 합니다. 이 측정 시리즈 팬 들은 구슬 (보충 파일 1-S3 참조)의 정보를 포함 하지 않습니다. (B). ± 1 표준 편차와는 subcommunities에서 상대 나타났는데 시간이 지남에 나타내는 오차 막대를 가진 광학 밀도 기반 성장 곡선. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: 활성된 슬러지 커뮤니티 구조 24 일 동안의 진화. (A) 주파수 분배 동향의 유사성에 의해 정렬 된 개별 게이츠 boxplots 시각 overlaying와 flowCyBar, 해당 색상 키 (B)와 NMD 플롯 재치 R 유사성 분석 < 0.001 ( C). 기본 플롯 보충 파일 2에 필름 순서에 표시 됩니다. 상대 나타났는데 보충 파일 1-S6 게이트 서식 파일을 사용 하 여 결정 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4: 미생물 지역 사회 구조는 산업 규모에서의 공간과 일시적인이 플러그 흐름 biogas 반응 기. (A) 4의 미생물 지역 사회 구조의 비교 샘플링 포트 I-IV 날 223. (B) 하루 384 포트에서 시간 의존 사회 구조 변이 하루 0에서에서의 비교 II. 소음 뒤늦게 시각화를 향상 시키기 위해 차단 되어 있다. 250000 이벤트 셀 게이트 (보충 파일 1-S6)에 측정 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 5
그림 5: Cytometric 히스토그램 이미지 비교-세련 된. 세련 된 알고리즘의 원리는 공간 및 시간이 각각 대표 하는 두 개의 샘플을 비교 하 여 exemplified입니다. (i) 세련 된 이미지는 두 개의 매개 변수 (FSC 대 DAPI 형광) 표시를 선택한 후.fcs 파일에서 생성 됩니다. 그레이 스케일 (0-255) 코드는 픽셀에서 이벤트 수 있습니다. (ii) 세련 된 하위 포함 하는 셀 영역을 지정한 후 생성 (여기: 200 < < 4000, 200 x < y < 2200). (iii) XOR 조합 이미지 사이의 하위 픽셀을 비교 하 여 만들어집니다. 차이가 0을 검은색으로 표시 됩니다. 최대 차이 200 이며 흰색으로 표시 됩니다입니다. 해당 XOR 값 XOR 이미지의 모든 픽셀의 그레이 스케일 값을 추가 하 여 계산 됩니다. (iv) 오버레이 조합 이미지 하위 픽셀의 그레이 스케일 값을 추가 하 여 만들어집니다. 해당 오버레이 값을 0 및 그러므로 정보를 포함 하지 않는 오버레이 이미지의 픽셀을 계산 하 여 계산 됩니다. (v) 서로 값 XOR 및 오버레이 값을 분할 하 여 계산 됩니다. 다음은 그림 6에서 NMD 음모에 대 한 기초입니다. 모두는 서로 가치와 NMD 플롯 표시는 무시할 수 공간-그리고 발음된 일시적인 지역 사회가 성분. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 6
그림 6: 세련 된 기반 바이오 커뮤니티 샘플의 유사성 분석. 0-하루 샘플 분석 (보충 파일 1-S11)을 왜곡 하는 그것의 매우 다른 지역 사회 구조 때문이 음모에서 제외 했다. NMD 플롯 낮은 공간에 대 한 가설을 확인-및 높은 일시적인이 세련 된 도구를 사용 하 여 만든 고 그림 5에 설명 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 7
그림 7: 바이오 커뮤니티에 상관 관계 분석. 매트릭스는 Spearman의 등급 순서 계수를 사용 하 여 계산 하 고 보충 파일 1-S6에서 마스터 게이트 템플릿으로 결정 했다 23 subcommunities의 상대적인 나타났는데 기반. 그들은 1 년 기간에서 48 샘플에 대 한 유기 로딩 속도 (OLR)와 상관 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 8
그림 8: planktonic (P)와 슬러지의 유사성 분석 기반 폐수 지역 사회 (S). 샘플 기본 헤어 청 징 제 (PCL), 활성화 슬러지 분 지 (AS)와 본격적인 폐수 처리 공장 (보충 파일 1-S10에서 점 플롯)의 소화 탱크 (DT)에서 찍은. 상대 나타났는데 보충 파일 1-s 6에 표시 된 게이트 템플릿을 사용 하 여 결정 했다. 이러한 subcommunity 나타났는데도 CyBar (보조 파일 1-S10) 및 NMD를 만드는 flowCyBar 도구와 분석 되었다 음모 (R < 0.01). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 9
그림 9: 순수 문화 정착 안정성. 0 h에서 찍은 성장 곡선 실험에서 샘플 15% 글리세롤에 고정 후 28 일 동안-80 ° C에서 저장 되었다. FSC 대 DAPI 형광 구슬 표시 됩니다 컨트롤과 플롯 합니다. 측정 시리즈 팬 들은 구슬 (보충 파일 1-S3)의 정보를 포함 하지 않습니다. 50000 이벤트 셀 게이트 (보충 파일 1-S6)에 기록 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

미생물 인구 및 지역 사회에 대 한 성공적인 분석 잘 조정 된 cytometers, 세포 매개 변수의 적절 한 선택 및 샘플링, 측정 및 데이터 평가 쪽으로 고정에서 신뢰할 수 있는 워크플로 필요합니다. 선택한 셀 매개 변수는 사용할 수 있는 여기 파장 consort 해야 합니다. 우리가 사용 하 고 매우 낮은 농도;에서 민감한 DAPI 추천 하지만 일반적으로 하지 표준 cytometer 설정에 구성 된 UV 레이저에 의해 흥분 할 필요가 있다. SYBR 같은 다른 염료 나, 또한 얼룩 전체 인구 또는 지역 사회 녹색 하지만 일반적으로 열 등 한 해상도 제공 합니다. 우리는 미생물 지역 사회에서 물고기 절차 또는 생존 테스트를 사용 하 여 권장 하지 않습니다. 이러한 접근 방법은 계량, 확인 하 고 지역 사회에서 개별 종에 그들의 효과 불확실 때문에 제어할 수 없습니다. 그들은 수 없습니다 안정적으로 테스트, 일반적인 지역 사회의 상당한 비율은 여전히 순수한 문화로 사용할 수 없습니다.

프로토콜에 중요 한 단계는 샘플링 및 고정 절차로 셀 정렬 포함 됩니다. 샘플링 특정 순수한 문화와 flocs를 집계 하거나 샘플 매트릭스의 입자에 고착 미생물 커뮤니티의 추세에 의해 복잡 하 게 될 수 있습니다. 이러한 집계를 낭비 하 고 신뢰할 수 있는 결과 보장 하기 위해 흐름 cytometric 분석에 그들을 소개 하기 전에 샘플에서 세포를 분리 하는 필수적 이다. 발표 준비 프로토콜 단일 세포 분석 수 있도록 최적화 했다. 마지막 50 µ m 여과 어떤 잔여 집계를 제거 하 고 셀 정렬의 70 µ m 노즐 및 분석기의 흐름 베트 막힘 방지를 측정 하기 전에 수행 됩니다. 폐수 처리 공장에서 셀 flocs 특히 풍부 하 고, 강력 하 고 시스템의 기능에 중요 한 있습니다. 우리는 planktonic 조사 및 슬러지 기반 설립된 프로토콜을 테스트 하는 본격적인 폐수 처리 식물의 다른 탱크에 미생물 지역 사회. 집계 했다 명확 하 게 방출 하는 세포를 형성 하는 슬러지와 지역 사회 구성 안정 유지. 또한, planktonic 및 슬러지 기반 커뮤니티 그들 모든 3 개의 샘플된 탱크 (그림 8, 보조 파일 1-S10) 사이의 놀라운 유사성을 전시. 이러한 결과 포 름 알 데히드와 에탄올 집착의 신선한, 포름알데히드 처리-비교 16S rDNA amplicon 시퀀싱에 의해 확인 했다-, 그리고 정렬된 샘플10. 그럼에도 불구 하 고, 매우 강한 biofilms 또는 밀접 하 게 연결 된 체인에서 성장 하는 박테리아와 같은 환경 샘플을 도전 수 있습니다 수 없습니다 없앨 수 있습니다. 유비 쿼터 스 입자 히스토그램에 표시 되 고 투명 한 풍부에 의해 셀 리 수로 토양 샘플 특히 문제가 될 수 있습니다. 이러한 경우에 기존의 시퀀싱 방법 적용 될 필요가 있다.

모든 새로운 샘플 세트의 고정 안정성 결과 유효성을 보장 하기 위해 실험을 설계 하기 전에 테스트 되어야 합니다. 좋은 고정 안정성 풀링된 얼룩이 지 고 하루에 여러 샘플 시간 점의 측정 해줍니다. 또한 복제 측정 및 결론 및 실험의 최종 평가 후 결정적인 시간 포인트의 회고전 셀 정렬 수 있습니다. 순수한 문화 정착 안정성 28 일 동안 (그림 9) 확인 했습니다. 현장 실험 샘플 수송을 포함 하 여, (이 경우에는 활성된 슬러지 커뮤니티에 대 한 바이오 가스 커뮤니티, 보충 파일 1-S9 195 한 일)에 더 긴 기간 동안 고정 안정성을 테스트 해야 합니다.

얼룩 보통 문제가 아니다 그러나 bioinformatic 평가 도구 응용 프로그램을 허용 하는 생물학 표준으로 제어할 필요가 있다. 우리가 사용 하는 모의 변형 대장균 BL21 (DE3)는 ASC 프로토콜에 따라 집착 되었고 모든 얼룩 일괄 처리에 사용 하기 위해 비축.

DAPI, SYBR 녹색에서에서 떨어져 내가 성공적으로 적용 되었습니다 몇 년14,23,,2425,26미생물 커뮤니티를 해결 하기 위해. 높은-낮은 및 핵 산 하위 집합 (HNA 및 LNA)으로 지역 사회를 해결할 수 있습니다 SYBR 녹색 온라인 방법에서 라이브 셀을 사용 하 여. DAPI, dna 바인딩에 더 구체적인 고 한 샘플 세트에 50 개 이상의 subcommunities의 구별을 가능 하 게 그러나, 얼룩이 지기 전에 정착 단계를 요구 한다.

셀 정렬은이 접근의 뛰어난 기능 그리고 특정 subcommunities 더 관심의 경우에 적용 될 수 있다. 그것은 둘 다 PFA-(30 분만에 대 한 수행)도 에탄올 치료 또는 DAPI10 얼룩 했다 후속 16S amplicon 시퀀싱에 부정적인 영향을 강조 해야 합니다. 잠재력 정착의 영향과 subcommunity metagenome에 얼룩 분석 여전히 테스트 해야.

커뮤니티 기능 및 추세 역학에 대 한 정보를 많이 얻을 수 있습니다 정렬 방식에서 독립적인 생물 정보학 도구를 가상으로 셀 수준에서 커뮤니티 기능을 해결 하 고 abiotic 이러한 기능 연결을 포함 하는 경우 매개 변수입니다.

최근, 여러 가지 새로운 생물 정보학 평가 도구, 모든 유용 두 SYBR 녹색 나와 DAPI 접근, cytometric 커뮤니티 패턴을 해결 하기 위해 개발 되었습니다. 이들은 FlowFP27, 민물 지역 사회29 설립 deconvolution 모델 및 그들의 생리에 따라 긴장을 차별 하는 데 사용 하는 도구는 패키지 (flowCHIC20, flowCyBar28),이 연구에 사용 된 특성30. 또한, cytometric 다양성 결정된25 수 있으며 심지어 안정성 속성 미생물 커뮤니티의 온라인 도구10이제 지켜질 수 있다.

따라서, 흐름 cytometric 분석 미생물 지역 사회와 가능한 abiotic 매개 변수 상관 관계의 급속 한 평가 관해서 큰 장점이 있다. 그러나, 여전히 방법에 제한이 있습니다. 그것은 진정한 온라인 경험된 기반된 게이트 설정 절차로 인해 flowCyBar 도구를 적용할 수 없습니다. 또한, 주문 품, 사용 하기 쉬운 교류 cytometers의 개발 흐름 cytometric 미생물 분석 접근의 확산을 사전 크게 것 이다. 이 방향으로 첫 번째 단계는 착수28.

그것은 높은 주파수 세균 생성 시간 범위 내에서 모니터링 있으며 생태 패러다임 cytometric 데이터5에 적용 되는 표시 된 미생물 생태학, 미생물 cytometry의 미래 응용 프로그램을 구상 수 있습니다. ,10. 스위스31필수 식 수 컨트롤 같은 자연 환경의 일상적인 검 진 방법은 매우 유용합니다. 그것은 또한 인간의15 또는 동물32 미생물 검사 같은 의료 응용 프로그램에 대 한 유용한 도구가 될 수 있습니다. 또한, 생물 정보학의 최신 개발 될 관리 되는 미생물 시스템의 공정 제어에 필수적인 센서 미생물 cytometry를 사용 수 있습니다. 미생물 커뮤니티 cytometry는 또한 특정 커뮤니티 하위 집합의 게놈 조사 높은 해상도 수 있는 셀 정렬, 검사 도구를 제공 합니다.

Disclosures

저자는 공개 없다.
 

Acknowledgments

우리가 기꺼이 인정 마이클 Jahn Yuting Guo 절차 및 순수 문화 및 활성된 슬러지 커뮤니티의 데이터 집합을 각각 제공 합니다. 우리는 추가 biogas 커뮤니티 샘플을 분석 하기 위한 카트린 Mörters 감사 합니다. 이 작품 음식과 농업 (BMEL), 중소기업 (ZIM)를 위한 연방 내각의 중심 혁신 프로그램에 대 한 독일 연방 내각 대신 대 (FNR, 프로젝트 바이오 가스-지문 Nr. 22008313) Fachagentur Nachwachsende Rohstoffe e.에 의해 투자 되었다 경제와 에너지 (BMWi) (INAR-ABO, 16KN043222), 독일 Bundesstiftung Umwelt (DBU, 프로젝트 온 디맨드 프로덕션 폰 Phosphatdünger aus Reststoffen 폰 Brauerei und Kläranlage 33960/01-32), 교육에 대 한 독일 연방 내각 및 연구 (BMBF) (FZK 03XP0041G), 및 헬름홀츠 협회의 자금 프로그램 지향 (POF III R31 주제 3 Bioenergy).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Milli-Q system Synthesis A10 Merck, Darmstadt, (GER)
BioPak Ultrafiltration Cartridge Merck, Darmstadt, (GER) CDUF BI0 01
MoFlo Legacy cell sorter Beckman-Coulter, Brea, California (USA)
Innova 90C Coherent, Inc , Santa Clara (USA) 334 nm - 364 nm, 100 mW
Innova 70C  Coherent, Inc , Santa Clara (USA) 488 nm, 400 mW
Genesis MX488-500 STM OPS Coherent, Inc , Santa Clara (USA) 488 nm, 400 mW
Xcyte CY-355-150 Lumentum, Milpitas, California, USA 355 nm, 150 mW
Photomultiplier tubes R928 and R3896 Hamamatsu Photonics, Hamamatsu City (Japan)
Summit 4.3 software Beckman-Coulter, Brea, California (USA)
1 µm  FluoSpheres Molecular Probes, Eugene, Oregon (USA) F8815 350/440 blue fluorescent
2 μm YG FluoSpheres Molecular Probes, Eugene, Oregon (USA) F-8827 505/515 yellow-green fluorescent beads 
0.5 μm Fluoresbrite BB Carboxylate microspheres PolyScience, Niles, Illinois (USA) 18339 360/407
1 μm Fluoresbrite BB Carboxylate microspheres PolyScience, Niles, Illinois (USA) 17458 360/407 blue fluorescent
1 µmYG FluoSpheres Molecular Probes, Eugene, Oregon (USA) F-13081 505/515 yellow-green fluorescent beads 
KH2PO4 Sigma-Aldrich, St. Louis (USA) CAS no. 7778-77-0
KCl Sigma-Aldrich, St. Louis (USA) CAS no. 7447-40-7
Cyflow Space  Sysmex Corporation, Kobe (Japan)
UV Laser Genesis CX, Coherent, Inc , Santa Clara (USA) 355 nm, 150 mW
H6779-32 series PMTs Hamamatsu Photonics, Hamamatsu City (Japan)
FloMax software Sysmex Partec GmbH, Görlitz, (GER)
all optical filters Carl Zeiss, Jena (GER)
KH2PO4 Sigma-Aldrich, St. Louis (USA) CAS no. 7778-77-0
KCl Carl Roth, Karlsruhe (GER) 6781.3
FlowJo 10.0.8r1 FlowJo, LLC, Ashland, Oregon (USA) Build number: 42398
R-software v.3.4.3 R Core Team
flowCHIC http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/flowCHIC.html
flowCyBar http://www.bioconductor.org/packages/devel/bioc/html/flowCyBar.html

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References

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특성화 미생물 역학-Cytometry 워크플로 순수 문화에서 자연 커뮤니티를 기반으로
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Lambrecht, J., Schattenberg, F., Harms, H., Mueller, S. Characterizing Microbiome Dynamics – Flow Cytometry Based Workflows from Pure Cultures to Natural Communities. J. Vis. Exp. (137), e58033, doi:10.3791/58033 (2018).More

Lambrecht, J., Schattenberg, F., Harms, H., Mueller, S. Characterizing Microbiome Dynamics – Flow Cytometry Based Workflows from Pure Cultures to Natural Communities. J. Vis. Exp. (137), e58033, doi:10.3791/58033 (2018).

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