Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Environment

אפיון Microbiome Dynamics – Cytometry זרימה מבוסס זרימות עבודה מתרבויות טהור לקהילות טבעי

doi: 10.3791/58033 Published: July 12, 2018

Summary

ניתוח תזרים cytometric הוכיח יקר עבור חוקרים תרבויות טהור וניטור dynamics הקהילה מיקרוביאלי. אנו מציגים שלוש זרימות עבודה מקיפה, מן הדגימה כדי ניתוח נתונים, עבור טהור תרבויות וקהילות מורכבים כמו גם ברורה בינוני כמו מטריצות מאתגר, בהתאמה.

Abstract

החקירה של תרבויות טהור וניטור של הקהילה מיקרוביאלי dynamics חיוני להבין ולשלוט הטבעיות ויישומים טכניים מונע על ידי מיקרואורגניזמים. הדור הבא רצפי שיטות מנוצלים נרחב לפתרון microbiomes, אך הם בדרך כלל משאבים וזמן אינטנסיבית ולספק בעיקר מידע איכותי. ניתוח תזרים cytometric microbiome לא סובל את החסרונות האלה, מספקים abundances subcommunity יחסית ולא אבסולוטית תא מספרים ב- line. למרות שזה אינו להעביר מידע פילוגנטי ישירה, זה יכול לשפר את עומק ניתוח והרזולוציה של רצף גישות. בניגוד חריף ליישומים רפואיים מחקר והן הגדרות שגרתית, cytometry זרימה עדיין לא משמש עבור ניתוח microbiome. מידע חסר בצינורות ניתוח והכנה נתונים לדוגמה עלולים ליצור מחסום כניסה של החוקרים בפני אתגרים ניתוח microbiome זה יהיה לעיתים קרובות יישומים cytometry זרימה לפי הספר. כאן, אנו מציגים שלוש זרימות עבודה מקיפה על תרבויות טהור, מורכבות הקהילות נקה הקהילות בינוני ומורכבות מאתגרת מטריצות, בהתאמה. אנו מתארים דגימה בודדת ושגרות קיבוע, אופטימיזציה מכתים פרוטוקולים עבור ערכות מדגם בהתאמה. עלינו להרחיב את ניתוח cytometric עם מחקר מורכבות ממורכז, התקן העליון של ספסל ממוקד יישומים, לתאר את התא מיון הליך, מציע חבילות ניתוח נתונים. יתר על כן מציע פקדי ניסיוני חשוב ואנו חלות זרימות עבודה הציג את ערכות מדגם בהתאמה.

Introduction

מיקרואורגניזמים ממלאים תפקיד חיוני בהיבטים רבים של אדם חי. הם המניעים העיקריים-ביוטי של כוכבי הלכת פחמן, חנקן, זרחן, גופרית מחזורים1, מעשה משפיל2,3 , וכן סינתזה biocatalysts4 בתעשיות שונות, כגון טיפול בשפכים 5 או ביוטכנולוגיה6. הם גם מהווים את microbiome האנושית, אשר ישירות המשפיעים על בריאות האדם ואת חילוף החומרים7,8. לכן, המידע על מבנה, תפקוד, התנהגות דינמית של מיקרואורגניזמים, בתגובה סביבתם הקרובה, היא הכרחית, אם אנו שואפים להבין ולטפל מערכות אלו באופן מלא. הדור הבא רצף (הגדרות) היא טכנולוגיה הוקמה ליישוב מבנה ותפקוד microbiome9. עם זאת, ניתוח והערכה של הגדרות נתונים לא יכולה להניב מידע כמותי, הוא עדיין יקר, זמן רב, בהחלט לא מוכנה לספק תוצאות באתר בתוך מסדרונות ביצועים. חיידקים מסוימים מציגים דור פעמים להלן 1 h ולגרום ללא הרף הקהילה מבנים מסוימים סביבות10. בעקבות דינמיקה כזאת, שימוש בגישות רצף עולה על הקיבולת פיננסי, כוח העבודה של מעבדות ביותר.

לעומת זאת, cytometry זרימה יכול לספק טביעות הקהילה דומים לנתוני המיתרים, תוך שמירה על יעילות גבוהה יותר של הזמן-, העבודה - ועלות. כאן, אנו מציגים את הזרימה cytometric טכניקות מצליח לעקוב הקהילה מיקרוביאלי דינמיקה ב- line על רמת תא בודד. בניגוד המיתרים, cytometry זרימה אינו מספק פילוגנטי השתייכות או מידע על גנים פונקציונלי, אך מספק מספרי הטלפון הנייד כמותית. באמצעות cytometry זרימה, ניתן לפתור קהילות חיידקים לתוך subcommunities עם פיזור אור שונות ומאפייני קרינה פלואורסצנטית (פיזור קדמי (FSC) ופיזור צד (האס) לספק אינדיקציות של גודל תא, צפיפות, בהתאמה). הגישה הציג מנצל בעיקר גודל התא -, DNA כמות מידע קשור הקשורות סוגי תאים מסוימים, מצבים פיזיולוגיים (צמיחה). תוכן ה-DNA הוא לכמת באמצעות UV-טמפרמנט 4', 6-diamidino-2'-phenylindole (דאפי) צבע, אשר נקשר לאזורים עשירים A-T של ה-DNA, ניתן לפתור אפילו רמות כרומוזומליות שונות. על-ידי שילוב קרינה פלואורסצנטית דאפי FSC subcommunities יותר מ-50 יכול להיות מכובד, פיקוח על שינוי abundances זמן11. הווריאציות שפע subcommunity ישויך עם שינויים בסביבה מיקרו-סביבתי, כגון pH והמוצר titers12, עם פרמטרים הכללית, כגון מזג אוויר13,14, או במקרה של הבטן או רוק microbiomes עם טיפולים רפואיים מסוימים15. מתאמים אלה חושפים אחראי לתפקודים מסוים ברשת מטבולית של הקהילה כל מפתח subcommunities. Subcommunities מפתח שניתן ואז במיוחד קידום או ודוכאה על-ידי שינוי המיקרו-בסביבה או מיינת לשם רצף עוקבות15 או פרוטיאומיה מבנית החקירה16.

עם זאת, הקהילה מיקרוביאלי cytometry זרימה לא עדיין נרחב נוסדה במספר נמוכות למדי זרימת cytometric התקנים היכולים לפתרון אוכלוסיות חיידקים או קהילות כראוי. יתר על כן, חוסר ניסיון, הקהילה צינורות ניתוח והערכה נתונים יעיל עלולה להוות מכשול כניסה לחוקרים מול אתגרים ניתוח microbiome. הקמנו זרימות עבודה מקיפה כדי להתמודד עם בעיות אלה. כדי להמחיש את תחולת כללי, נביא אותם על שלוש קבוצות דוגמה למופת (קובץ משלים 1-S1), כלומר אני) תרבות טהור (PC) ליישומים ביוטכנולוגי גדל מוגדרים ברורים בינוני (Pseudomonas putida KT 2440- גלוקוז), ii) קהילה מעבדה מורכבים ברור בינוני (בוצה מופעל בקהילה (ASC) בשפכים סינתטי) ו- iii) קהילה המורכבים של סביבות טבעיות במטריצה צפוף (ביוגז בקהילה (לפנה ס) תחמיץ תירס).

מספר גורמים להשפיע על בחירת פרוטוקול עבור כל אחד ערכות דוגמת אלה. הקפאה עמוקה forgoes את השימוש בכימיקלים רעילים אבל בעיקר מוגבל סביבות מעבדה עקב השימוש של חנקן נוזלי עבור ציפוי הלם. אתנול עוקבות וייצוב פורמלדהיד קיבוע מאפשר נפח דגימה ללא צורך הכנה aliquot, הוכיחה להיות יציב לאורך זמן.. עם זאת, דגימות עשירים בחלבון כמו רוק אנושי15 ייתכן בעייתי, כי חלבון flocs, denaturized מאת הפורמלדהיד, עלול לגרום שלילי אות רעש יחסי. ייבוש מדגם יקח הזמן הרב ביותר (כ 1 ח סה כ) של ההליכים בהשוואה זו, אך ניתן לבצע באתר ללא כימיקלים רעילים. זה מניב כדורי יציב צינורות, אשר ניתן לשלוח בקלות ללא קירור או נוספים הזהירות הזארד. בנוסף, היו המון שיטות קיבוע חלופי המוצע11. אנו ממליצים לבחון את יציבות קיבוע של רזולוציה של פרוטוקולים שונים כאשר מציגים סט מדגם חדש.

. היינו שני cytometers זרימה שונים כדי לנתח את ערכות: i) מחקר מאוד מתוחכמת ויקרה, ממורכז סדרן התא ו- ii) של היישום התמקד ספסל העליון מנתח אשר מופיע מתאים יותר עבור יישום באתר5. ה לפנה ס נמדדה עם מנתח העליון הספסל, בעוד המחשב ואת ASC נמדדו עם סדרן התא. הניתוח של המדגם למופת שלוש הגדרת ההליכים שונים הנדרשים עבור אופטימיזציה הפארמצבטית, דוגמת יציבות ונוחות זרימת העבודה. פרוטוקול הבאים יציינו את המקטעים עבור שלוש מערכות שונות.

Protocol

1. דגימה של קיבעון

  1. תרבות טהור: עמוק הקפאה15,17
    1. לקחת 2 מ"ל של התא ההשעיה, צנטריפוגה למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT) 5,000 x g וזורקים את תגובת שיקוע.
      הערה: התליה תא שנדגמו המתואר הקבצים המשלימים 1-S1.
    2. Resuspend תאי 1 מ"ל תמיסת פוספט buffered (PBS; 6 מ מ נה2HPO4, 1.8 מ"מ NaH2PO4, 145 מ"מ NaCl עם מזוקק bi H2O, pH 7.2) בנוסף המכיל 15% (v/v) גליצרול כסוכן cryoprotective.
    3. תקופת דגירה של 10 דקות על הקפאת קרח and הלם של חנקן נוזלי לאחסון הבאים ב- 80 ° c
      הערה: הפרוטוקול אפשר לעצור כאן. הדגימות יציבים למשך חודש אחד לפחות.
  2. הופעל בוצה הקהילה: פורמלדהיד מייצב + אתנול קיבוע5,10,18
    1. לקחת 4 מ"ל של התליה תא, צנטריפוגה במשך 20 דקות-15 ° C ו- 3,200 x g וזורקים את תגובת שיקוע.
      הערה: התליה תא שנדגמו המתואר הקבצים המשלימים 1-S1.
    2. מוסיפים 4 מיליליטר 2% פורמלדהיד PBS, תקופת דגירה של 30 דקות ב- RT.
      1. להכין פתרון מניות פורמלדהיד 8% מ paraformaldehyde כדי למנוע את מתנול מוספים conserving הוסיף פורמלדהיד שנשלחו בצורת נוזל. להוסיף 4 גר' paraformaldehyde 50 מ של PBS ב- 70 מעלות צלזיוס. להוסיף כ- 125 µL של פתרון NaOH 10 מ'. ומערבבים עד paraformaldehyde יש התפרקה לחלוטין, תן לזה ואז לקרר את RT. התאם ערך ה-pH 7.0 כ-100 µL 37% HCl. להקפיא הפתרון פורמלדהיד ב aliquots 15 mL לאחסון. אל תשתמש מופשר aliquots יותר מ- 10 ימים.
        התראה: פורמלדהיד צריך להיות מטופל והשמדתי בקפידה בשל תכונותיו רעילים, מוטגן. תמיד ללבוש כפפות בעת טיפול זה. שימוש של הוד פליטה בעת המסת את paraformaldehyde כדי למנוע חשיפה לאדים הרעילים.
    3. Centrifuge המדגם 10 דקות-15 ° C ו- 3,200 x g וזורקים את תגובת שיקוע.
    4. Resuspend המדגם ב מ 4 ל-70% אתנול וביו -חנות ב-20 ° C.
      הערה: הפרוטוקול אפשר לעצור כאן. הדגימות יציבים במשך לפחות חודשיים. בהתאם לתכונות לדוגמה, הצעד צנטריפוגה 1.2.1 גם ניתן לבצע 10 דקות ב 4 ° C כדי לחסוך זמן.
  3. ביוגז הקהילה: ייבוש
    1. השתמש טיפ 1,000 µL החתוכים פיפטה מדגם µL 200 של digestate צמיגה לתוך צינור 2 מ"ל.
    2. מוסיפים µL 1,700 PBS מאגר ומערבבים היטב.
    3. למקם את הצינורות באמבט אולטרא 35 kHz ו W 80 פלט אפקטיבית כוח 1 דקות לפרק תא גדול אגרגטים ולנתק תאים נדבקות לשתול שאריות תאים.
    4. לערבב את הדגימה ביסודיות, לסנן את הדגימה דרך מסנן רשת 50 µL, לחלק את פילטרט של ארבע aliquots של µL כ-400.
      הערה: הכנת aliquots בשלב זה מספק שני יתרונות חשובים. אמצעי האחסון הראשון, קטנים יותר הם ומזרז את dewater מכנית (צנטריפוגה), תרמית (ייבוש), אבל דגימה של אמצעי אחסון קטן מבדרך כלל בוצה ביוגז עבה יכולה להיות מאוד מאתגרת. השני, תוספת דוגמאות עשוי לשמש עבור תא עוקבות מיון, מדידות גיבוי או פקדים.
    5. Centrifuge את aliquots פעמיים במשך 10 דקות-10 ° C ו- x 4,000 גרם ולמחוק את תגובת שיקוע לחלוטין בשתי הפעמים כדי מכנית dewater המדגם יסודי ככל האפשר.
    6. יבש את הדגימות ומפרידה ואקום מחוממת למשך 40 דקות ב- 35 ° C, כ-97 kPa ו- 2,500 x גרם ליצירת כדורי יציב. אחסן את כדורי ב 4 ° C בחושך.
      הערה: הפרוטוקול אפשר לעצור כאן. כדורי יציבים במשך לפחות 6 חודשים.

2. צביעת

הערה: דאפי מכתים הוכיח את עצמו לספק מגרשים dot רזולוציה גבוהה ולכן יתרון מיוחד בעת ניתוח קהילות. ריכוז דאפי בפתרון מכתימים צריך להיות מותאם כדי להבטיח של התא שער פלורסצנטיות בעוצמה מעל רמת הרעש אך מתחת את החרוזים. אופטימום תלוי בכלי הבחירה רגישות, חרוז, יכול להשתנות בין מדגם ערכות עקב G/C התוכן של מיקרואורגניזמים כלולות, צריך להיבדק באופן כללי עבור ערכות לדוגמה שהוצג לאחרונה. בדיקות ריכוזי בין 0.24 מיקרומטר דאפי 1 מיקרומטר דאפי מומלצת עבור הגדרת שהוצגו. צבעים אחרים עשויים לשמש ליישומים מוגדרים. השימוש של ירוק SYBR אני מכתימה פרוטוקול מומלץ כאשר תאים מוחלטות סופר דיוק תקבל עדיפות גבוהה מעל ה6,טביעות אצבע ניתוח (קובץ משלים 1-S1)15. זה כולל טיפול המדגם פחות שלבים צנטריפוגה והוא ישים עם תאים קבוע וחיוני. השימוש של תאים חיוניים נוספים מפחית את הדגימה טיפול צעדים על-ידי דילוג את הקיבעון ודורש ומכאן צנטריפוגה אחד בלבד עבור קציר תאים. פעולה זו ממזערת אובדן תא פוטנציאלי, שגיאה מדידה שיטתית כתוצאה מכך. יש לסנן את PBS, מאגר permeabilization, צביעת פתרון בשימוש במהלך כל השלבים הבאים דרך 0.2 µm סביבונים להפחית עומס נוסף של חלקיקים במדגם. ההכתמה של דוגמא אחת המכילה Escherichia coli BL21 (DE3) כמו תקן ביולוגי עם כל בריכה מדגם מומלץ.

  1. תרבות טהור
    1. מפשירים את הדגימות, צנטריפוגה למשך 5 דקות ב RT ו- 5,000 x g וזורקים את תגובת שיקוע.
    2. Resuspend בגדר תא ב- PBS קר כקרח מאת pipetting חוזרות והתאם את יתר700nm כדי 0.035 (אורך הנתיבcuvette = 0.5 ס מ).
    3. היכונו מכתימה את התאים.
      1. צנטריפוגה 1 מ"ל של התא מנוכי עונתיות השעיה למשך 5 דקות ב RT ו- 5,000 x g וזורקים את תגובת שיקוע.
      2. Resuspend תאי 1 מ"ל permeabilization מאגר המכיל חומצה ציטרית 0.3 M ו 4.1 מ"מ Tween20 ומערבבים היטב.
      3. דגירה המדגם למשך 10 דקות על קרח כדי ליצור קרום התא חדיר עבור צביעת עוקבות.
      4. Centrifuge לדוגמה עבור 5 דקות ב RT ו- 5,000 x g וזורקים את תגובת שיקוע.
    4. להוסיף 1 מ"ל של צביעת המכילה 0.68 מיקרומטר דאפי במאגר ממ 417 נה2HPO4/NaH2PO4 (289 מ מ נה2HPO4, 128 מ"מ NaH2PO4 עם מזוקק bi H2O, pH 7), לערבב, תקופת דגירה של פחות 15 דקות ב RT בחושך.
      הערה: ההתאמה OD מדויק חיוני להבטיח מדידות דומות מפני קרינה פלואורסצנטית דאפי תשתנה בהתאם לצפיפות תא אם ריכוז דאפי נשמר קבוע. יש להסיר את תגובת שיקוע בקפידה בשל גלולה שביר בדרך כלל כדי למנוע איבוד תאים.
      התראה: לטפל ולחסל דאפי עם טיפול בעקבות תכונותיו מוטגניות.
  2. הקהילה בוצה מופעל
    1. לערבב את הדגימה קבוע ביסודיות, להעביר 0.6 מ"ל לתוך שפופרת זכוכית. הוסף mL 1.4 ל- PBS, sonicate 10 דקות ב RT כפי שמתואר בשלב 1.3.3. Centrifuge המדגם 10 דקות ב 4 ° C ו- 3,200 x g ולהסיר את תגובת שיקוע. מוסיפים 2 מ של PBS ומערבבים היטב. Sonicate במשך 5 דקות.
    2. התאם את יתר700nm כדי 0.035 (אורך הנתיבcuvette = 0.5 ס מ) עם PBS.
    3. היכונו מכתימה את התאים.
      1. Centrifuge המדגם 10 דקות ב 4 ° C ו- 3,200 x g ולהסיר את תגובת שיקוע.
      2. Resuspend תאי 1 מ"ל permeabilization מאגר המכיל חומצה ציטרית 0.11 מ' ו- 4.1 מ מ Tween20 ומערבבים היטב.
      3. תקופת דגירה של 20 דקות ב RT ליצירת קרום התא חדיר עבור צביעת עוקבות.
      4. Centrifuge המדגם שוב במשך 10 דקות ב 4 ° C ו- 3,200 x g ולהסיר את תגובת שיקוע.
    4. להוסיף 2 מיליליטר מכתימים לאודנום 0.68 מיקרומטר דאפי של ממ 417 נה2HPO4/NaH2PO4 מאגר, לערבב ביסודיות, דגירה לפחות 60 דקות ב RT בחושך.
      הערה: השימוש של צינורות זכוכית, כיוון שלעתים מיקרואורגניזמים מסוימים נוטים לדבוק הקירות צינור פלסטיק, עלול ללכת לאיבוד בתהליך. המקננת בן לילה הוא גם אפשרי ומפשטת בדרך כלל תהליכי מעבדה.
      התראה: דאפי צריך להיות מטופל והשמדתי עם טיפול בעקבות תכונותיו מוטגניות.
  3. ביוגז הקהילה
    1. להשעות בגדר תאים יבשים ב- PBS.
      1. להוסיף µL 800 ל- PBS, לערבב היטב ולתת בגדר משרים למשך 15 דקות.
      2. וארוקן את שלב נוזלי עם פיפטה µL 1,000 ולהעביר בגדר רטוב למקטע גלילי של שפופרת קיר עם קצה פיפטה. זה אמור להחזיק מעמד שם
      3. הזז את הטיפ פיפטה בתנועה סיבובית למעוך בגדר לאורך הקירות שפופרת.
      4. לשטוף את slurry וכתוצאה מכך מהקירות צינור על ידי מחלק את שלב נוזלי מהקצה פיפטה לאורך הקיר שפופרת.
      5. להתסיס התליה על ידי כ רפה בעברית ו להשעות אותו לתוך פיפטה שלוש פעמים.
    2. לשטוף את הדגימה עם PBS פעמיים.
      1. צנטריפוגה למשך 5 דקות-10 ° C ו- x 4,000 גרם וזורקים את תגובת שיקוע.
      2. מוסיפים µL 1,500 ל- PBS ומערבבים היטב.
      3. חזור על שני השלבים לעיל פעם אחת.
    3. למקם את הצינורות באמבט אולטרא עבור 1 דקות כפי שמתואר בשלב 1.3.3 ולסנן, לאחר מכן, כל דגימה באמצעות מסנן רשת 50 µL לתוך מבחנה בודדים.
    4. למהול 2 מ"ל לדוגמה כדי OD700nm 0.035 (אורך הנתיבcuvette = 0.5 ס מ) עם PBS.
    5. להכין את התאים מכתים כמוסבר בשלב 2.2.3 לעיל.
    6. להוסיף 2 מ של 0.24 מיקרומטר דאפי, לאודנום מכתימים של ממ 417 נה2HPO4/NaH2PO מאגר4 , לערבב ביסודיות, דגירה במשך הלילה ב RT בחושך.
      התראה: דאפי צריך להיות מטופל והשמדתי עם טיפול בעקבות תכונותיו מוטגניות.

3. מדידה

הערה: ערכות דוגמה מופתית נותחו עם שני cytometers זרימה שונים. המחשב והתקן את ASC נותחו עם סדרן התא ממורכז מורכבים יותר, במיוחד מתכוונן בקלות להתאמה אישית, מחקר. על הניתוח PC, מכשיר זה היה מצויד עם לייזר להגדיר עד כפי שמתואר הקודם הפרסום16, בקיצור כחולה (488 ננומטר, 400 mW) ולא של אולטרה סגול (334 – 364 nm, 100 mW) יון ללייזר. על הניתוח עולה, כחול חדש יותר (488 ננומטר, 400 mW) וסגול (355 nm, 150 mW) לייזרים מוליכים למחצה הותקנו. בשני המקרים, לייזר כחול המושרה על FSC (bandpass מסנן 488 ננומטר ± 5 nm, דחיסות נייטרלית מסנן 1.9), האס (bandpass מסנן 488 ננומטר ± 5 nm, דחיסות נייטרלית מסנן 1.9, טריגר). מאפיינים אופטיים אלו קשורים גודל תא וצפיפות תא, בהתאמה. לייזרים UV מתרגש קרינה פלואורסצנטית את דאפי (bandpass לסנן 450 nm ± 32.5 ננומטר) עבור כימות של תכנים סלולריים הדנ א. מערכת fluidic הופעלה בבית 56 psi (3.86 בר) עם overpressure מדגם בבית המרבי psi 0.3 ו זרבובית μm 70. כל הפרמטרים נרשמו בתור פסגת הגולן במקום שיא אזורים כדי לשפר את רזולוציית מדידה. בקרה לטווח ארוך של הקהילה ביוגז נערך עם cuvette זרימה פחות מורכב, מבוסס, מנתח העליון ספסל. לייזר אולטרה סגול מוליכים למחצה (355 nm, 50 mW) שימש כדי לעודד את FSC (bandpass לסנן 355 nm ± 5 ננומטר) האס (bandpass מסנן 355 nm ± 5 nm, טריגר) אותות, לרגש את פלורסצנטיות דאפי (ננומטר מסנן 455 bandpass C). המים המשמשים עבור מאגר מעטפת של שני ההתקנים היה מזוקק bi ו- 0.1 מיקרומטר מסונן. יש לסנן את PBS משמש דוגמה דילול דרך 0.2 µm סביבונים כדי להפחית את הרעש של חלקיקים במידות ככל האפשר.

  1. טהור תרבות וקהילה בוצה מופעל
    1. הפעלת המכשיר, לייזר, המחשב והתוכנה ולהתכונן דגימת.
      1. . הפעילי את הלייזרים ולהפעיל למשך 15 דקות להגיע טמפרטורת ההפעלה ולהבטיח קרן היציבות.
      2. למלא את מיכל הנרתיק 10 x מאגר נדן (19 מ מ ח'2PO4, 38 מ מ אשלגן כלורי, 166 מ מ נה2HPO4, NaCl 1.39 מ' ב- bi מזוקק H2O) מדולל עם מזוקק bi H2O 0.2 x הפתרון עובד (למיון תא: 0.5 x הפתרון עובד).
      3. ראש המערכת fluidic עם 56 psi מעל הלחץ, מיכל פסולת כ 6 psi ואקום.
      4. להפעיל את המכשיר עבור מינימום 15 דקות במצב Backflush לשטוף מדגם מהנמל, אבובים, זרבובית.
    2. כיילו עם חרוזים רגילים.
      1. להכין את תערובות חרוז הכיול ב ליניארית (1 μm μm כחול + 2 צהוב ירוק פלורסנט) ואת טווח לוגריתמי (0.5 μm and μm 1 כחול פלורסנט). לדלל את המתלים חרוז מ המתלים מניות המקורי כדי להשיג שוויון ריכוזים.
      2. ללא הרף למדוד את התמהיל חרוז ליניארי להתאים הפסגות חרוז לתבנית כיול מראש על-ידי מניפולציה הזרבובית, בלייזר אופטיקה עמדות כדי מראש לכייל את המכשיר בטווח ליניארי.
      3. עבור טווח לוגריתמי ולאחר למדוד באופן רציף את התמהיל חרוז לוגריתמי. התאם את הפסגות חרוז לתבנית שלהם כיול מראש ' כדי לכוונן את החומרה של המכשיר. התאמות סופיות למיקום חרוז באמצעות הגדרת רווח של הצינורות האופטיקה (PMTs).
      4. לבדוק את המיקום של הרעש פלייבק ולהתאים ואולי זה כדי להתאים את התבנית כיול.
        הערה: תבנית קבועה כיול עבור המיקום של החרוזים צריך להיות מוכנים לפני פרוייקט מדידה ולא ניתן לשנותה (ראה קובץ משלים 1-S4)! רעש אינסטרומנטלית יכולה להיגרם על ידי חלקיקים המדגם או רעש חשמלי של PMTs, תמיד יירשמו במידה מסוימת. לא מומלץ להסתיר את הרעש לחלוטין על ידי קיזוז רווח התאמה או מגרש. שפע והמיקום של האירועים רעש יכול להיות מקור חשוב של מידע, ולכן צריך להיות כלול בתוכו הנתונים הגולמיים. דגימות אינטנסיבית חלקיק מאוד ייתכן מחייבים עוקבות הסרת הרעש מסיבות ניתוח נתונים וארגון. לשלוט הכיול במרווחים קבועים במהלך יום מדידה כדי להבטיח יציבות המכשיר ולטעום ולכן comparability.
    3. למדוד מדגם המכיל את תקן הביולוגי כפי שמתואר 2.1.4 (דאפי צבעונית Escherichia coli BL21 (DE3), שנדגמו ו קבוע במהלך שלב נייח (16 שעות) לפי הפרוטוקול עולה שמתואר 1.2). בדוק את מיקומה השיא שלהם תבנית מוגדרת מראש כיול (ראה קובץ משלים 1-S5).
      הערה: שגרתית מכתים ומדידה של תקן ביולוגי עם כל בריכה של דגימות יכהן גם פקד פנימי עבור ההליך מוכתמים. אם ההתקן מכויל באמצעות חרוזים תקן ביולוגי אינו מתאים תבנית מוגדרת מראש כיול שלה, הפרוצדורה מכתימים צריך כנראה להיות חוזרות ונשנות.
    4. רכישת המדגם.
      1. הפעל את הפתרון מכתימים 10 דקות יש לשטוף את הדגימה ויציאת צינור ולהבטיח את יציבות ידי קרינה פלואורסצנטית דאפי דגימות עוקבות.
      2. לסנן את הדגימה ויטראז'ים עם מסנן רשת 50 μm לפני המדידה כדי למנוע סתימת הצינור cytometer או זרימה נימי.
      3. להוסיף את תערובת חרוז לוגריתמי הדגימה כדי לנטר את יציבות המכשיר לספק האפשרות בדיקת כיול רטרוספקטיבי. הדגימות צריכה להכיל בין 1,000 ל 2,500 האירועים בכל השערים חרוז שני.
      4. יצירת שער תא בתוכנה כלי במהלך המדידות הניסיון הראשון של קבוצת מדגם חדש. שער זה צריכה להכיל את התאים מוכתם ולהשמיט את הרעש, חרוזים.
      5. לערבב את הדגימות ומדידת במהירות מקסימלית של אירועים 3,000 s-1 עד 250,000 תאים (קהילות) או 50,000 תאים (תרבויות טהור) מזוהים בתוך השער התא.
        הערה: סעיפים אלו תאים נבחרים על פי החוויה עם קבוצות המדגם. מספרים שונות עשוי לשמש כדי להעביר עסקת החליפין בין היעילות מדידה הגילוי של שפע נמוך subcommunities בשני הכיוונים.
        פתרון בעיות: מדידה "אינטרה" פתאומית משמרות של החרוז, מיקום התא יכול להיגרם על ידי בועות אוויר לכוד בתוך הצינור. זה מחייבת הסרת וניקוי של הצינור ושטיפה של המערכת fluidic באמצעות מאגר נדן. המכשיר צריך להיות והשתלב לאחר remounting הצינור (התחל עם צעד 3.1.2).
      6. Backflush המכשיר ביסודיות עם נדן מאגר לפני כיבוי ו מיתוג דגימות.
  2. ביוגז הקהילה
    1. הפעלת המכשיר, לייזר, המחשב והתוכנה כדי להתכונן דגימת.
      1. Backflush לפחות 6 מ ל מאגר נדן (bi-מזוקק H2O) דרך צינורות ויציאה מדגם לתוך צינור באופן רופף המצורף באמצעות הפונקציה "ראש הממשלה נוזל הנרתיק" של התוכנה כלי נגינה.
      2. למדוד מזוקק bi H2O ב- 5 s µL-1 כדי לשטוף את מערכת fluidic עד אירועים פחות מ-200 s-1 מזוהים בקצב זרם קבוע של s µL 0.5-1.
    2. לכייל את המערכת.
      1. מכינים את תערובת חרוז (0.5 μm and μm 1 כחול פלורסנט). לדלל את המתלים חרוז מן הפתרונות מניות המקורי כדי להשיג שוויון ריכוזים.
      2. ללא הרף למדוד את התמהיל חרוז בטווח4 יומן ובכושר הפסגות חרוז שלהם בתבנית כיול מראש על-ידי מניפולציה של זרימה אופטיים cuvette ולייזר העמדות. התאמות סופיות למיקום חרוז עם הגדרת רווח PMTs.
    3. לשלוט הכיול עם תקן הביולוגי כפי שמתואר בשלב 3.1.3.
    4. רכישת המדגם.
      1. לדלל µL 400 של מדגם מוכתמים µL 1,600 ל- PBS, למדוד את זה ונטר את ספירת האירועים כדי לבצע בדיקת ריכוז.
        הערה: המחירים דילול מנוכי עונתיות ייתכן שיהיה צורך עוד מקורות הדגימה. הרוזן אירוע לא יעלה 1,200 s אירועים-1 בדגימות עשיר חלקיקים, כדי למנוע הפסד הרזולוציה הפיזור קדמי (דוגמה שלילית בתוך הקבצים המשלימים 1-S2). תרבויות טהור ניתן למדוד עם אירועים עד אלפיים s-1.
      2. יצירת שער תא בתוכנה כלי במהלך המידות במשפט הראשון. שער זה צריכה להכיל את התאים מוכתם ולהשמיט רעש וחרוזים.
      3. לדלל את הדגימה על פי ממצאי הבדיקה ריכוז עולה כ 1,200 אירועים הכולל המרבי s-1 ולהוסיף את התמהיל חרוז הדגימה כדי לפקח על יציבות המכשיר לספק את האפשרות בדיקת כיול רטרוספקטיבי. הדגימות צריכה להכיל בין 1,000 ל 2,500 האירועים בכל השערים חרוז שני.
      4. לערבב, למדוד את הדגימה עד 250,000 תאים (קהילות) או 50,000 תאים (תרבויות טהור) מזוהים בתוך השער התא.
      5. לשטוף את המכשיר ביסודיות עם מזוקק bi H2O לפני כיבוי ודוגמאות מיתוג.

4. תא מיון

הערה: התא מיון הליך דורש כלי נגינה נוספים להגדיר את, מבוצע על פי פרוטוקולים שפורסמו12.

  1. נתחיל לכייל את המכשיר כפי שמתואר 3.1.1-3.1.3 צעדים, אבל להשתמש של 0.5 x הפתרון עובד המאגר נדן.
  2. הגדר את תדירות DD ואת DD משרעת למצוא את יישום ה-ההפסקה-off ' droplet '.
  3. הר הלוחות סטיה, לגבות מהם ולהחליט עבור 2-4-דרך או מצב מיון.
  4. לבצע את הכיול עיכוב שחרור פנימי עם 2 μm חרוזים צהוב ירוק כדי להגדיר את משך הזמן שלוקח חלקיק או תא לנסוע מ החקירה הצבע (לייזר להיטים תא) עד הטיפה האחרונה צמוד לנחל.
  5. מיין פי 6 חרוזים 20 על משטח זכוכית וכן לספור אותם עם מיקרוסקופ כדי לאמת את הכיול עיכוב המסירה.
  6. מכינים את התבנית שער מיון.
  7. שימוש "יחיד ומצב אחד-שחרור: טוהר הגבוהה 99%" במחיר לא גבוה מ 2,500 סה כ s אירועים-1 כדי למיין 500,000 בתאים המרבי 4 שערים בכל פעם (מצב מיון 4-Way).
  8. לקצור את התאים על ידי צנטריפוגה (x 20,000 g, 6 ° C, 25 דקות) ומקפיאים בגדר ב-20 ° C עבור בידוד ה-DNA מאוחר יותר ורצף.
    הערה: להימנע מיון תאים בתוך השערים עם פחות מ- 5% שפע יחסית, כמו הפעם המיון הוא התרחבותם השפע היחסי. השלבים בודדים מתוארים בפירוט בספר ההדרכה סדרן התא. המספרים תא הנדרשים הם תלויות מאוד מקרי שימוש בהתאמה והפרוטוקולים החילוץ. שיטות רבות יושמו: ddPCR (תאים 1,00017,19), מטוסי אף-16 rDNA או רצף אמפליקון mcrA (תאים 500,0006,10,15) ואת פרוטאומיקס (עד 1.1 x7 10 תאים 16,17). תא המיון יהיה יתרון מיוחד בשילוב עם גישה metagenomics בגלל המגוון נמוך ב subcommunities ממוינים.
    התראה: אל תיגע הלוחות מטה הטיה במהלך ההליך מיון עקב מתח גבוה.

5. ניתוח נתונים

הערה: המדידה cytometric מניב "לזרום cytometry סטנדרטי".fcs קבצי נתונים בעלי מבנה נתונים בדרך כלל אחיד. עם זאת, יצרנים שונים cytometer להשתמש בגירסאות מעט מותאם, מכשירים ישנים יותר עשויים קדמה 2010 השקת FCS האחרונה רגיל 3.1. זה יכול להוביל מגרש נקודה דרוג הבעיות, למנוע את ההשוואה הישירה של התוצאות שנאספו עם מכשירים שונים. עם זאת, לנקודות נתונים בודדות תמיד מאוחסנים השורות של מטריצה, עם פיזור המתאימים, קרינה פלואורסצנטית ערכי העוצמה בעמודות שונות. הצינורות ניתוח microbiome הציג להשתמש את גודל התא הייחודי והתוכן דנ א כדי לתאר subcommunities מיקרוביאלי. פרמטרים אלה נמצאים בקורלציה עוצמות ערוץ פלורסצנטיות FSC ודאפי (סדרן התא: פל-4, מנתח: פל-1) והתוצאה subcommunity אשכולות כאשר visualized במימדי FSC לעומת דאפי פלורסצנטיות חלקות. חלקות נקודה אלה מאפשרים את פרשנות וניתוח של נתונים cytometry זרימה, גדלים בדרך כלל נתונים שעברו טרנספורמציה לוגריתמית. הם יכולים להיות מוצגים מקבצים .fcs cytometer קניינית של פתרונות תוכנה או צד שלישי, הם הבסיס עבור אוטומטית (Cytometric ההיסטוגרמה התמונה ההשוואה, שיק), חצי אוטומטיות (Cytometric Barcoding, CyBar) ניתוח הקהילה.

  1. השוואה תמונה היסטוגרמה Cytometric
    הערה: את הקוד, תיעוד מפורט, מדריך למשתמש עבור חבילה זו עומדים לרשותכם http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/flowCHIC.html. הם גם היוו שפורסמו20.
    1. להתקין, לטעון את החבילה R, הגדרת ספריית העבודה המכילה את קבצי .fcs, להגדיר רשימת קבצים על ידי הפעלת:
      > מקור ("https://bioconductor.org/biocLite.R")
      > biocLite("flowCHIC")
      > library(flowCHIC)
      > # הגדרת ספריית העבודה לנתיב שבו ממוקמים הקבצים FCS שלך
      > # להקליד את הנתיב הצעות המחיר
      > setwd("")
      > # לקבל רשימה של שמות קבצים של הקבצים FCS ממוקם ספריית העבודה שלך
      > קבצים <-list.files(getwd(),full=TRUE,pattern="*.fcs")
      > # לקבל רשימה של שמות קבצים של FCS הקבצים הכלולות על החבילה
      > קבצים <-list.files(system.file("extdata",package="flowCHIC"),
      + מלא = אמת, דפוס = "*.fcs")
      > # לקרוא את קובץ ה-FCS הראשון בתור flowFrame
      > מסגרת < - לקרוא. FCS(files[1],alter.names=TRUE,transformation=FALSE)
      > # לקבל רשימה של שמות פרמטר/ערוץ
      > unname(frame@parameters@data$name)
    2. ליצור תמונות עבור הנתונים הגולמיים cytometric על ידי הפעלת הפונקציה חבילת "fcs_to_img":
      > # ליצור תמונות היסטוגרמה באמצעות פרמטרים ברירת מחדל
      > fcs_to_img(files)
    3. הגדרת קבוצות משנה של תמונות היסטוגרמה על ידי הפעלת הפונקציה חבילת "img_sub":
      > # ליצור ההיסטוגרמה התמונה קבוצות משנה באמצעות פרמטרים ברירת מחדל
      > img_sub (קבצים, ch1 = "FS. Log",ch2="FL.4.Log")
    4. לחשב את ערכי חפיפה ו- XOR לערוך ניתוח התמונה על ידי הפעלת הפונקציה חבילת "calculate_overlaps_xor":
      > # לשמור את השמות של כל התמונות ערכה רשימה
      > קבוצות משנה <-list.files(path=paste(getwd(),"chic_subset",sep="/"),full=TRUE,pattern="*.png")
      > # לחשב חפיפה ותמונות XOR ולכתוב ערכים לשני קבצים חדשים
      > תוצאות <-calculate_overlaps_xor(subsets)
    5. צור לא מטרי שקנה רב-ממדי (NMDS) מתווה לניתוח דמיון על ידי הפעלת הפונקציה חבילת "plot_nmds":
      > # להראות חלקת NMDS הדגימות
      > plot_nmds(results$overlap,results$xor)
  2. Cytometric Barcoding
    הערה: את הקוד, תיעוד מפורט, מדריך למשתמש עבור חבילה זו עומדים לרשותכם http://www.bioconductor.org/packages/devel/bioc/html/flowCyBar.html. הם גם היוו שפורסמו11,12.
    1. לפתח תבנית שער הבסיס לשימוש על כל הדגימות.
      1. לטעון את הקבצים .fcs לתוך התוכנה ניתוח שימוש בפונקציונליות גרור ושחרר.
      2. לחיצה כפולה מדידה ובחרו את ציר x ו- y פרמטרים מתוך הרשימות הנפתח המתאים כדי לפתוח את מגרש פלורסצנטיות FSC לעומת דאפי.
      3. השתמש המצולע כלי לציור כדי לשכפל את השער תא השתמשת קודם לכן כדי לשלוט על מספר התאים שנותחה בשלבים 3.1.4.5 ו- 3.2.4.4 ולכנותו בהתאם. גרור את ערך שער תא ברשימה מדגם הקבוצה דגימות כל מאגר זה.
      4. לחץ פעמיים על השער תא ולתקן את ההקצאה ציר כדי להמחיש את האירועים שער תא.
      5. להגדיר את subcommunities נפוץ יותר קבוצת הדגימה בעזרת הכלי אליפטית שערים בעקבות הנחיות שפורסמו12 ולהשתמש סריקה של האס או עוד פרמטר שלישי21 כדי להבטיח את השלמות של התבנית שער. בריכה, לשלוט ולהתאים את הקצאת subcommunity על הדגימות אחרים.
    2. לייצא את abundances subcommunity יחסית לתוך קובץ. txt לשימוש בקובץ ה-script R.
      1. לפתוח את עורך טבלה עם הכרטיסיה עריכה.
      2. להוסיף עמודות עבור כל subcommunity היה שהוגדרו בשלב 5.2.1.5 ולהגדיר את סטטיסטיקת פלט לתדר"הורה", לתת להם שמות.
      3. ליצור את הטבלה "עורך שולחן" לאחר בחירת שמירת תבנית והיעד.
        הערה: התוכנה ניתוח מספק ישירות abundances subcommunity היחסי. הם גם ניתן למצוא דרך החלוקה של הרוזן אירוע בשער subcommunity בודדים על ידי הרוזן אירוע בשער תא. הערכים צריך להציל במטריצה מופרד בטאבים בתוך קובץ. txt אשר אינם יכולים לכלול את כל השדות נ. א צריך לפגוש כמה דרישות נוספות כדי לקרוא את הקוד R (ראה מדריך ו שאלות נפוצות לקבלת הוראות ספציפיות).
    3. להתקין, לטעון את החבילה R, לטעון את הנתונים על ידי הפעלת:
      > מקור ("https://bioconductor.org/biocLite.R")
      > biocLite("flowCyBar")
      > # להקליד את הנתיב הצעות המחיר
      > setwd("")
      > # עומס הנתונים (dataset)
      > data(Cell_number_sample)
      > # הצג נתונים
      > Cell_number_sample [,-1]
    4. לנרמל את abundances יחסית על ידי הפעלת הפונקציה חבילת "לנרמל":
      # לנרמל את הנתונים, להדפיס 2 ספרות
      normalize(Cell_number_sample[,-1],digits=2)
    5. ליצור ברקוד של המנורמל של boxplot של abundances היחסי המקורי על ידי הפעלת הפונקציה חבילת "cybar_plot":
      Normalized_mean <-normalize(Cell_number_sample[,-1],digits=2)
      Normalized_mean <-data.frame (data.matrix (Normalized_mean))
      # עלילה עם פרמטרים ברירת מחדל
      cybar_plot(Normalized_mean,Cell_number_sample[,-1])
    6. ליצור של חלקת NMDS abundances היחסי המקורי.
      > Normalized_mean <-normalize(Cell_number_sample[,-1],digits=2)
      > Normalized_mean <-data.frame (data.matrix (Normalized_mean))
      > # עלילה NMDS של cel מנורמל מספרים
      > nmds(Normalized_mean)
    7. ליצור ניתוח המתאם את abundances היחסי מנורמל ופרמטרים אחרים על ידי הפעלת הפונקציה חבילת "מתאם":
      > # עומס הנתונים (dataset)
      > data(Corr_data_sample)
      > # הצג ערכי המתאם
      > Corr_data_sample [,-1]
      > # ניתוח המתאם בניהול
      > correlation(Corr_data_sample[,-1])
      הערה: שיק, CyBar להסתמך על abundances היחסי. עם זאת, cytometry זרימה באפשרותך גם לקבוע מספרים תא מוחלטת, אשר עשוי להיות עניין רב עבור יישומים הביו-טכנולוגיה. כדי לקבוע את מספר תאים מוחלטות, מספר התאים בשער של ריבית מחולקת על ידי אמצעי האחסון מדגם שנותחה. אמצעי האחסון מדגם שנותחה יכול להיקבע על-ידי הוספת חרוז הבולם עם ריכוז ידוע לתוך המדגם (נוסחת בתוך הקבצים המשלימים 1-S7). במנתח העליון ספסל מצויד בנוסף נכון נפח ספירה תכונה ישירות מכמת את עוצמת הקול בצינור מדגם במהלך המדידה. מומלץ להשתמש ירוקה SYBR אני מכתימה פרוטוקול לספירת תאים.

Representative Results

התוצאות הבאות נציג מדגישים את הצורך משכפל, להדגים טכניקות הדמיה וניתוח נתונים שונים על כל אחד שלוש ערכות הדגימה. הם מראים את התוצאות של צינורות הערכת הנתונים האפשריים מתאים לענות על שאלות מחקר רגיל אודות ערכת בהתאמה. עם זאת, טכניקות שהוצגו אינם בלעדיים על קבוצת מדגם שבו הם מוצגים עם. הנתונים הגולמיים של cytometry זרימה היה זמין בפומבי עם FlowRepository מזהה FR-FCM-ZY46. בעבר ASC הנתונים שהועלה זמין תחת מזהה FR-FCM-ZYD7.

ביולוגי, טכני משכפל היו לקחו, מוכן, נותחו על פי פרוטוקולים שפורסמו11. משכפל ביולוגי מן המחשב עולה לקוחים שלוש מבחנות מקבילים. משכפל הביולוגי של ה לפנה ס נלקחו בתור שלושה הבאים samplings במיקום אחד במפעל טייס סולם. Aliquots 3 מדגם אחד היו קבועים, צבעונית וניתח כדי להבטיח הפארמצבטית טכני. שיטות הפארמצבטית הוערך על-פי הנהלים שפורסמו בעבר11. תבנית שער עבור כל דוגמאות של קבוצת הדגימה אחד (קובץ משלים 1-S6) שימש לחישוב סטיית התקן (%) לפי שער.

עבור ה-PC, סטיית התקן מרבי של שפע היחסי היה 3.44%, בעוד סטיית התקן הממוצע היה 2.13% (איור 1). את עולה, ה לפנה ס, סטיות תקן מרבי של abundances היחסית היו 1.27% ו- 0.88%, בעוד הממוצעים של סטיות תקן היו 2.13% ו- 0.21% (קובץ משלים 1-S8).

הליך סטנדרטי, כאשר חוקר תרבות זן טהור, הוא הכנת עקומת גדילה לנתח שלב ההשהיה, דור פעמים וצפיפות תא תחת תנאים מסוימים. שילבנו בין הליך זה עם זרימה cytometric ניתוח זרימת העבודה כדי להשיג הבנה עמוקה יותר של המערכת (איור 2). FSC לעומת דאפי פלורסצנטיות חלקות חושפים הברית מחזור התא של התרבות בנקודות שונות של התרבות אצווה. שער בסיס תבנית (קובץ משלים 1-S6) הוקמה כדי לכמת את הפרופורציה של תאים עם אחד (c1n), שני (c2n) ואת מספר כרומוזומים (cXn, איור 2B). היחס הדומיננטית של תאים חוסנו היה כרומוזום אחד בלבד (93.7% ב- 0 h). זה השתנה באופן דרסטי במהלך צמיחה אקספוננציאלית, שבו כמעט כל התאים הכיל יותר מפעם אחת (99.6%, 4 שעות) ו מעל חצי מהאוכלוסייה (53.1%) מכילה אפילו יותר משני כרומוזומים. זה מדגים putida פs היכולת לשכפל כרומוזומים שלה מהר יותר מאשר הזמן הדור שלה.

ניתוח תזרים cytometric הוכיח שימושי מאוד למעקב אחר ההתפתחות של קהילות מיקרוביאלי. זה יכול לעקוב אחר קהילה dynamics יותר יותר משאבים בשיטות מולקולריות אינטנסיבית5,10קרוב. אנו מודגש הדינמיקות האלה בסרט, זכתה סקירה כללית של המשמרות הקהילה בוצה מופעל לאורך זמן. כל אחת מהמסגרות שניה אחת מציגה את חלקת פלורסצנטיות FSC לעומת דאפי נקודת דגימה (2 הקבצים המשלימים). משמרת מאוד ברורים בין ביום 0 וביום 4 בעקבות הקמת קהילה לאחר יום 7. Subcommunities נוספים עלה ביום 21. הקמנו תבנית שער הבסיס (קובץ משלים 1-S6) שאיפשרה את ההערכה של דינמיקה מיקרוביאלי ברמה subcommunity. Subcommunities דומיננטי בשלבים שונים של הניסוי זוהו בבירור באמצעות הכלי CyBar (איור 3). שילוב עם חלוקת תדר abundances subcommunity יחסית עזרתי כדי לבחור שערים כי הם מעניינים (שינוי משמעותי בשפע מופעלות בנקודת הזמן מפתח) בר -קיימא (מעל 5% יחסית שפע) לצורך מיון נוסף ניתוח22.

יישומים ביוריאקטור בקנה מידה תעשייתי יכולה להתמודד עם פוטנציאל heterogeneities המרחבי בשל מגבלות עצבנות. הם נחשפים לעתים קרובות גם שינוי פרמטרים מבצעיים, כמו מסעה באיכות סינתטיים שאינם סובסטרטים. ה לפנה ס מייצג מערכת כזו, בדקנו בין יישובים שונים כור זרימה הכנס מונע באופן דינמי. FSC לעומת דאפי קרינה פלואורסצנטית (איור 4) של הצבע לנקודות הדגימה למופת מראים רק קצת המרחבי, אך בולטת הטרוגניות טמפורלית. ה לפנה ס נחקר עוד יותר באמצעות שניהם, את שיק אוטומטי מהיר ובתבנית שער בסיס מעמיק יותר מבוסס גישה CyBar.

טבעו אוטומטי מהיר, לא משוחד, הופך את שיק מעניין במיוחד לשליטה באתר של bioprocesses בסביבה תעשייתית. זה משווה raw .fcs הנתונים של כל הדגימות זמינים. שתי השוואות אלה מוצגים באיור5. הערכים dissimilarity הנוצרים אשר התצפיות הקודמות בדבר יכולות הטרוגניות. את טופס חלקות שנוצר NMDS המטריקס dissimilarity כלים שיק (איור 6) נוסף ממחיש תוצאה זו, מדמיין אותו בהתאם.

בנוסף, אנו לחשב את abundances היחסית של 23 subcommunities של ה לפנה ס באמצעות תבנית שער הבסיס (הקבצים המשלימים S6-1). ניתוח המתאם של 48 דגימות תקופה שנה נערך להבין יחסים פונקציונליים בקהילה מיקרוביאלי. זה יכול לעזור לזהות את שערי הריבית עבור חקירה נוספת (מיון תא 4). מתאמים חיוביים או שליליים חזק עם פרמטרים והאביוטיים כמו מוצר titers יכול לעזור כדי להבין ולמטב את מערכות אקולוגיות ותהליכים הביו-טכנולוגיה. קצב הטעינה אורגנית כלול המתאם הזה (איור 7) מדגימה כזו פרמטר והאביוטיים. G5, G4 ו- G10 התערוכה מתאמים חיוביים חזק, עלולים להכיל ואולי מינים fermentative, ואילו קורלציה שלילית ב- G8 אולי רמז לכיוון methanogenic ארכאונים.

Figure 1
איור 1: הפארמצבטית של ניתוח cytometric של התרבות טהור. קרינה פלואורסצנטית FSC לעומת דאפי חלקות עם חרוזים שליטה (A, B) ובר חלקות abundances 3 subcommunity [%] עם קווי שגיאה המייצג ± סטיית תקן אחת (C, D). Abundances יחסית היו נחושים עם התבנית שער שמוצג הקבצים המשלימים 1-S6. שלושה משכפל ביולוגי A, B ו- C צולמו של עקומת גדילה-4 שעות שלושה טכני ושכפול של P1, P2, P3 מוכנים מדגם א ומדד שלוש פעמים, בהתאמה: M1, M2, M3, ניתנות עם סטיות תקן המתאימים שלהם. אירועים 50,000 נרשמו בשער התא. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: ניתוח מחזור התא של התרבות טהור שצולמו במהלך עקומת גדילה הניסוי מעל 12 ה (א). קרינה פלואורסצנטית FSC לעומת דאפי חלקות של samplings bi-מדי שעה כי התערוכה משמרת של תוכן ה-DNA במהלך שלב הגידול המעריכי. סדרה זו המידה אינו כולל חרוזים (ראה קובץ משלים 1-S3). (B). עקומת צמיחה מבוססי צפיפות אופטית עם קווי שגיאה המייצגים ± סטיית תקן אחת abundances יחסית ב subcommunities לאורך זמן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: האבולוציה של המבנה הקהילתי בוצה מופעל במשך 24 ימים. (א) flowCyBar עם בשכבת-על הפצות תדירות דמיינו ב boxplots על השערים בודדים המסודרים לפי דמיון של המגמות, המתאימה צבע מפתח (B) וניתוח דמיון של שנינות העלילה NMDS R < 0.001 ( C). החלקות כבסיס מוצגים ברצף הסרטים 2 הקבצים המשלימים. Abundances יחסית היו נחושים באמצעות התבנית שער ב קובץ משלים 1 - S6. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: הטרוגניות יכולות של מבנה הקהילה מיקרוביאלי בקנה מידה תעשייתי חבר זרימה ביוגז הכור. דגימה (א') ההשוואה של המבנה הקהילתי מיקרוביאלית של הארבע יציאות I-IV ביום 223. II (B) ההשוואה הקהילה תלוי זמן מבנה וריאציות מיום 0 ליום 384 בנמל. הרעש הופסק במיומנותו כדי לשפר את הפריט החזותי. אירועים 250,000 נמדדו בשער תא (הקבצים המשלימים S6-1). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5: השוואה תמונה היסטוגרמה Cytometric — שיק- העיקרון של האלגוריתם שיק הוא דוגמה על-ידי השוואת שני המדגמים המייצגים את יכולות הטרוגניות, בהתאמה. (i) תמונות שיק נוצרים מקבצים .fcs לאחר בחירת שני פרמטרים כדי להציג (FSC לעומת דאפי זריחה). סולם גוני אפור (0-255) קודים הרוזן אירוע פיקסל. (ii) שיק קבוצות משנה נוצרים לאחר ציון אזור המכיל תאים (כאן: 200 < x < 4000, 200 < < 2200 y). (iii) XOR שילוב התמונה נוצר על-ידי השוואת פיקסלים בין קבוצות משנה. אין הבדל שווה ל- 0 ומוצגת כשחור. ההפרש המרבי שווה 200 ומוצגת לבן. ערך XOR המתאים מחושבת על-ידי הוספת הערכים גווני אפור של כל הפיקסלים בתמונה XOR. (iv) שכבת-על שילוב התמונה נוצר על-ידי הוספת הערכים סולם גוני אפור של הפיקסלים של ערכות המשנה. ערך כיסוי המתאים מחושבת על ידי ספירת הפיקסלים של התמונה כיסוי לא להיות שווה לאפס, ולכן מכילים מידע. (v) dissimilarity ערכים מחושבים על-ידי חלוקת XOR וערכי שכבת-. אלה הם הבסיס העלילה NMDS איור6. הערכים dissimilarity והן את המופע מגרש NMDS זניח מרחבית- והטרוגניות בולטת קהילה טמפורלית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 6
איור 6: שיק המבוסס על דמיון ניתוח של הדגימות הקהילה ביוגז. המדגם 0-יום לא נכללו זו עלילה בשל מבנהו שונה מאוד הקהילה לעוות את הניתוח (הקבצים המשלימים S11-1). העלילה NMDS מאשרת את ההנחה על מרחבי נמוך- והטרוגניות גבוהה יותר טמפורלית עשה שימוש בכלי שיק והסביר באיור5. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 7
איור 7: ניתוח המתאם על הקהילה ביוגז. המטריקס מחושב באמצעות מקדם ספירמן נמצא מנת לדרג והיא מבוססת על abundances היחסית של subcommunities 23 שנקבעו עם התבנית שער הבסיס של קובץ משלים 1-S6. הם היו בקורלציה עם קצב הטעינה אורגני (OLR) עבור דגימות 48 מתוך תקופה של שנה אחת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 8
איור 8: ניתוח דמיון פלנקטוניים (P) ובוצות המבוסס על הקהילות (S) בשפכים. הדגימות נלקחו מן הראשית clarifier (PCL), הופעל בוצה באגן (AS) digester טנק (DT) של צמח טיפול בשפכים בהיקף מלא (נקודה מגרשים הקבצים המשלימים 1-S10). Abundances יחסית היו נחושים באמצעות התבנית שער שמוצג הקבצים המשלימים 1-S6. Abundances subcommunity אלה נותחו גם בעזרת הכלי flowCyBar מנת ליצור CyBar (קובץ משלים 1-S10) NMDS עלילה (R < 0.01). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 9
איור 9: יציבות קיבוע של התרבות טהור. דגימות הניסוי עקומת גדילה שצולמו או אוחסנו במשך 28 ימים ב- 80 ° C לאחר קיבוע גליצרול 15%. קרינה פלואורסצנטית FSC לעומת דאפי חלקות עם שליטה חרוזים מוצגים. סדרת מדידות אינו כולל חרוזים (קובץ משלים 1-S3). אירועים 50,000 נרשמו בשער תא (הקבצים המשלימים S6-1). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

קובץ משלים 1: אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

קובץ משלים 2: אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

Discussion

ניתוח מוצלח של אוכלוסיות חיידקים וקהילות דורש cytometers היטב, הבחירה המתאימה של התא בפרמטרים של זרימת עבודה אמינים הדגימה, קיבוע לכיוון להערכה מדידה ונתונים. הפרמטרים התא שנבחר חייבים להתרועע עם אורכי הגל עירור זמינים. אנחנו משתמשים וממליצים דאפי, אשר הוא מאוד רגיש בריכוזים נמוכים; אבל צריך להיות נרגש UV-לייזר, אשר לא מורכבת בדרך כלל ב- set-ups cytometer רגיל. צבעים אחרים, כגון SYBR ירוק אני, גם אוכלוסיות כל כתם או קהילות אבל בדרך כלל לספק החלטות נחות. לא מומלץ להשתמש דגים הליכים או בדיקות הכדאיות בקהילות מיקרוביאלי. הגישות הללו הן בלתי אפשרי לכמת, ודא ולשלוט בגלל השפעתם על מינים בודדים בקהילה אינו ברור. הם לא אמינה להיבדק, כל עוד חלק ניכר של הקהילות טיפוסי הוא עדיין לא זמין כתרבות טהור.

שלבים קריטיים בפרוטוקול כוללים שגרות דגימה וקיבוע, כמו גם מיון תא. יכול להיות מסובך הדגימה הנטייה של מסוימים טהור תרבויות וקהילות מיקרוביאלי צבירה כדי flocs או לדבוק חלקיקים של המטריקס מדגם. זה חיוני כדי להפיג אלה אגרגטים ולהפריד את התאים במדגם לפני להם היכרות עם ניתוח תזרים cytometric כדי להבטיח תוצאות אמינות. הפרוטוקולים הכנה הציג אופטימציה כדי לאפשר ניתוח תא בודד. סינון סופי 50 מיקרומטר מבוצע לפני המדידה כדי להסיר את כל אגרגטים שיורית ולמנוע הזרבובית מיקרומטר 70 של סדרן התא, cuvette את הזרימה של מנתח וסותם. תא flocs של שפכים הן שופע במיוחד, עמיד וחיוני לתפקוד של המערכת. . חקרנו את יצורי ומבוססות בוצה קהילות מיקרוביאלי במיכלים שונים של צמח טיפול בשפכים בהיקף מלא, כדי לבדוק את פרוטוקול הוקמה. את כל הטינופת ויוצרים תא אגרגטים היו בבירור התפוגג, הרכב הקהילה נותר יציב. יתר על כן, קהילות פלנקטוניים מבוססי בוצה הפגינו דמיון ראוי לציון ביניהם כל שלושה טנקים שנדגמו (איור 8, הקבצים המשלימים 1-S10). תוצאות אלה אומתו על ידי מטוסי אף-16 השוואתי rDNA אמפליקון רצף של טרי-, פורמלדהיד שטופלו-, הפורמלדהיד והאתנול מקובע-, ו מדגם ממוינים10. בכל זאת, באופן יוצא דופן מאתגר דגימות סביבתיים, כגון biofilms חזק או חיידקים הגדלים רשתות מחוברות בחוזקה, יכול להיות אפשרי להתפוגג. דגימות. אדמה יכול להיות בעייתי במיוחד, כפי החלקיקים בכל מקום מופיעים ההיסטוגרמה, ניתן להסתיר את התאים על ידי השפע העצום. במקרים כאלה, שיטות מסורתיות רצף צריכים להיות מיושמים.

היציבות קיבוע של כל ערכה מדגם חדש צריך להיבדק לפני שתעצב את הניסוי כדי להבטיח תוצאה תוקפו. קיבוע טוב יציבות גם מאפשר את במאגר מכתים ומדידה של נקודות זמן דגימה מרובות ביום אחד. הוא מאפשר יתרה מזאת שכפול ומדידות, מיון תא רטרוספקטיבה של נקודות זמן מכריע לאחר סיכום והערכה הסופי של הניסוי. היציבות קיבוע של התרבות טהור אומתה במשך 28 ימים (איור 9). לניסויים באתר כולל הובלה מדגם, יציבות קיבוע צריך להיבדק על פני תקופות ארוכות יותר (במקרה זה, 60 ימים עבור הקהילה בוצה מופעל, 195 ימים עבור הקהילה ביוגז, הקבצים המשלימים 1-S9).

ההכתמה היא בדרך כלל לא בעייתית אבל צריך להיות נשלט עם תקן ביולוגי כדי לאפשר יישום של כלי הערכה של bioinformatic. השתמשנו המתח מדומה e. coli BL21 (DE3), אשר היה מקובעים לפי הפרוטוקול עולה, ואמצעי לשימוש אצוה מוכתמים.

מלבד דאפי, SYBR Green אני יושם בהצלחה כדי לפתור קהילות חיידקים במשך מספר שנים14,23,24,25,26. SYBR Green יכול לפתור קהילות לערכות חומצת גרעין - גבוה ונמוך (HNA ומגבר קדם) באמצעות תאים חיים ב מודוס באינטרנט. דאפי, אולם באופן שלה מחייב דנ א ספציפי יותר, מאפשר את ההבחנה subcommunities מעל 50 בערכת דוגמא אחת אלא דורש שלב קיבוע לפני צביעת.

מיון תא תכונה יוצאת דופן של גישה זו, יכול להיות מיושם אם subcommunities מסוימים אינם עניין נוסף. זה צריך להדגיש כי גם מחברים-(מתבצעות רק 30 דקות) ולא טיפול אתנול או דאפי מכתים10 היה השפעה שלילית על הרצף אמפליקון 16 עוקבות. פוטנציאל ההשפעות של הקיבעון, צביעת הליכים אודות subcommunity metagenome ניתוחים עדיין צריך להיבדק.

הרבה מידע על פונקציות הקהילה ואת הדינמיקה המגמה ניתן להשיג עצמאית מן הגישה מיון כאשר מעורבים ושפור לפתור תכונות קהילתיות ברמת התא על-ידי התא וירטואלי, להתחבר תכונות אלה עם והאביוטיים פרמטרים.

לאחרונה, מספר של ביואינפורמטיקה הערכה כלים חדשים, כל שימושי עבור שניהם SYBR ירוק, ואני את הגישות דאפי, פותחו כדי לפתור תבניות הקהילה cytometric. . אלו FlowFP27, החבילות השתמשו במחקר זה (flowCHIC20, flowCyBar28), מודל deconvolution הקים עם מים מתוקים קהילות29 , כלי המשמש להפלות זנים על פי שלהם פיזיולוגיים מאפייני30. בנוסף, גיוון cytometric יכול להיות נחוש25 , יציבות אפילו מאפיינים של קהילות חיידקים יכולים לבוא עכשיו עם כלי מקוון10.

לפיכך, הזרימה cytometric ניתוחים יש יתרון עצום כשמדובר ראפיד הערכה של קהילות מיקרוביאלי, מתאמים פרמטר והאביוטיים אפשרי. עם זאת, קיימות עדיין מגבלות לשיטה. זה אין אפשרות להחיל באמת באינטרנט באמצעות הכלי flowCyBar, בשל ההליך הגדרת שער בסיס מנוסים. יתר על כן, הפיתוח של זרימה מחוייט, קל לשימוש cytometers במידה רבה מראש ההתפשטות של הגישה ניתוח זרימת microbiome cytometric. צעדים ראשונים בכיוון זה הם להתבצע28.

יישומים עתידיים של cytometry זרימה חיידקים יכולים להיות שנחזה ב אקולוגיה מיקרוביאלית, זה מאפשר בתדירות גבוהה ניטור בטווח של דור חיידקי פעמים, הוכח כי פרדיגמות אקולוגית הינם ישימים לנתונים cytometric5 ,10. השיטה היא מאוד שימושי עבור הקרנות שגרתית של סביבות טבעיות כמו הפקדים חובה שתיית מים שוויץ31. זה גם יכול להיות כלי רב ערך עבור יישומים רפואיים כמו האדם15 או בעלי חיים32 microbiome ההקרנה. בנוסף, ההתפתחויות האחרונות בביואינפורמטיקה עשוי לאפשר cytometry זרימה מיקרוביאלי להיות בחיישני אינטגרלי בפקדים תהליך של מערכות מיקרוביאלי מנוהלים. הקהילה מיקרוביאלי cytometry מספק גם כלי סינון למיון התא, אשר מאפשר רזולוציה גבוהה יותר חקירות גנומית של קהילה ספציפי קבוצות משנה.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.
 

Acknowledgments

אנו להכיר בהכרת תודה מייקל, פרי יוטינג גואו למתן את ההליך ואת datasets טהור התרבות והקהילה בוצה מופעל, בהתאמה. אנו מודים נוספים קתרין Mörters לניתוח הדגימות הקהילה ביוגז. עבודה זו מומן על ידי אי Fachagentur Nachwachsende Rohstoffe נ' (FNR, פרוייקט ביוגז-טביעות אצבעות Nr. 22008313) מטעם המשרד הפדרלי הגרמני עבור מזון, חקלאות (BMEL), התכנית חדשנות מרכזי עבור חברות קטנות ובינוניות (צים) של המשרד הפדרלי בכלכלה ואנרגיה (BMWi) (INAR-ABOS, 16KN043222), דויטשה Bundesstiftung Umwelt (DBU, פרוייקט לפי דרישה הפקה פון Phosphatdünger שעון Reststoffen פון Brauerei und Kläranlage 33960/01-32), המשרד הפדרלי הגרמני לחינוך, (BMBF) (FZK 03XP0041G), ומחקר של העמותה הלמהולץ מונחה תוכנית מימון (POF השלישי R31 נושא 3 Bioenergy).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Milli-Q system Synthesis A10 Merck, Darmstadt, (GER)
BioPak Ultrafiltration Cartridge Merck, Darmstadt, (GER) CDUF BI0 01
MoFlo Legacy cell sorter Beckman-Coulter, Brea, California (USA)
Innova 90C Coherent, Inc , Santa Clara (USA) 334 nm - 364 nm, 100 mW
Innova 70C  Coherent, Inc , Santa Clara (USA) 488 nm, 400 mW
Genesis MX488-500 STM OPS Coherent, Inc , Santa Clara (USA) 488 nm, 400 mW
Xcyte CY-355-150 Lumentum, Milpitas, California, USA 355 nm, 150 mW
Photomultiplier tubes R928 and R3896 Hamamatsu Photonics, Hamamatsu City (Japan)
Summit 4.3 software Beckman-Coulter, Brea, California (USA)
1 µm  FluoSpheres Molecular Probes, Eugene, Oregon (USA) F8815 350/440 blue fluorescent
2 μm YG FluoSpheres Molecular Probes, Eugene, Oregon (USA) F-8827 505/515 yellow-green fluorescent beads 
0.5 μm Fluoresbrite BB Carboxylate microspheres PolyScience, Niles, Illinois (USA) 18339 360/407
1 μm Fluoresbrite BB Carboxylate microspheres PolyScience, Niles, Illinois (USA) 17458 360/407 blue fluorescent
1 µmYG FluoSpheres Molecular Probes, Eugene, Oregon (USA) F-13081 505/515 yellow-green fluorescent beads 
KH2PO4 Sigma-Aldrich, St. Louis (USA) CAS no. 7778-77-0
KCl Sigma-Aldrich, St. Louis (USA) CAS no. 7447-40-7
Cyflow Space  Sysmex Corporation, Kobe (Japan)
UV Laser Genesis CX, Coherent, Inc , Santa Clara (USA) 355 nm, 150 mW
H6779-32 series PMTs Hamamatsu Photonics, Hamamatsu City (Japan)
FloMax software Sysmex Partec GmbH, Görlitz, (GER)
all optical filters Carl Zeiss, Jena (GER)
KH2PO4 Sigma-Aldrich, St. Louis (USA) CAS no. 7778-77-0
KCl Carl Roth, Karlsruhe (GER) 6781.3
FlowJo 10.0.8r1 FlowJo, LLC, Ashland, Oregon (USA) Build number: 42398
R-software v.3.4.3 R Core Team
flowCHIC http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/flowCHIC.html
flowCyBar http://www.bioconductor.org/packages/devel/bioc/html/flowCyBar.html

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Xu, X., Hui, D., King, A. W., Song, X., Thornton, P. E., Zhang, L. Convergence of microbial assimilations of soil carbon, nitrogen, phosphorus, and sulfur in terrestrial ecosystems. Scientific Reports. 5, (1), 17445 (2015).
  2. Fathepure, B. Z. Recent studies in microbial degradation of petroleum hydrocarbons in hypersaline environments. Frontiers in Microbiology. 5, 173 (2014).
  3. Alshehrei, F. Biodegradation of Synthetic and Natural Plastic by Microorganisms. Journal of Applied & Environmental Microbiology. 5, (1), 8-19 (2017).
  4. Sarria, S., Kruyer, N. S., Peralta-Yahya, P. Microbial Synthesis of medium-chain chemicals from renewables. Nature Biotechnology. 35, (12), 1158-1166 (2017).
  5. Günther, S., Faust, K., Schumann, J., Harms, H., Raes, J., Müller, S. Species-sorting and mass-transfer paradigms control managed natural metacommunities: Species-sorting and mass-transfer paradigms in metacommunities. Environmental Microbiology. 18, (12), 4862-4877 (2016).
  6. Lambrecht, J., Cichocki, N., Hübschmann, T., Koch, C., Harms, H., Müller, S. Flow cytometric quantification, sorting and sequencing of methanogenic archaea based on F420 autofluorescence. Microbial Cell Factories. 16, (1), 180 (2017).
  7. Huttenhower, C., et al. Structure, function and diversity of the healthy human microbiome. Nature. 486, (7402), 207-214 (2012).
  8. Lloyd-Price, J., et al. Strains, functions and dynamics in the expanded Human Microbiome Project. Nature. 550, 61-66 (2017).
  9. Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies. Nature Reviews Genetics. 17, (6), 333-351 (2016).
  10. Liu, Z., et al. Ecological Stability Properties of Microbial Communities Assessed by Flow Cytometry. mSphere. 3, (1), e00564-e00517 (2018).
  11. Koch, C., Günther, S., Desta, A. F., Hübschmann, T., Müller, S. Cytometric fingerprinting for analyzing microbial intracommunity structure variation and identifying subcommunity function. Nature Protocols. 8, (1), 190-202 (2013).
  12. Koch, C., Fetzer, I., Schmidt, T., Harms, H., Müller, S. Monitoring Functions in Managed Microbial Systems by Cytometric Bar Coding. Environmental Science & Technology. 47, (3), 1753-1760 (2013).
  13. Lefort, T., Gasol, J. M. Short-time scale coupling of picoplankton community structure and single-cell heterotrophic activity in winter in coastal NW Mediterranean Sea waters. Journal of Plankton Research. 36, (1), 243-258 (2014).
  14. Besmer, M. D., Epting, J., Page, R. M., Sigrist, J. A., Huggenberger, P., Hammes, F. Online flow cytometry reveals microbial dynamics influenced by concurrent natural and operational events in groundwater used for drinking water treatment. Scientific Reports. 6, 38462 (2016).
  15. van Gelder, S., et al. A cytometric approach to follow variation and dynamics of the salivary microbiota. Methods. 134, 67-79 (2018).
  16. Jehmlich, N., et al. Advanced tool for characterization of microbial cultures by combining cytomics and proteomics. Applied Microbiology and Biotechnology. 88, (2), 575-584 (2010).
  17. Jahn, M., et al. Accurate Determination of Plasmid Copy Number of Flow-Sorted Cells using Droplet Digital PCR. Analytical Chemistry. 86, (12), 5969-5976 (2014).
  18. Koch, C., Müller, S. Personalized microbiome dynamics - Cytometric fingerprints for routine diagnostics. Molecular Aspects of Medicine. 59, 123-134 (2018).
  19. Jahn, M., Vorpahl, C., Hübschmann, T., Harms, H., Müller, S. Copy number variability of expression plasmids determined by cell sorting and Droplet Digital PCR. Microbial Cell Factories. 15, (1), 211 (2016).
  20. Koch, C., Fetzer, I., Harms, H., Müller, S. CHIC-an automated approach for the detection of dynamic variations in complex microbial communities. Cytometry Part A. 83, (6), 561-567 (2013).
  21. Günther, S., Müller, S. Facilitated gate setting by sequential dot plot scanning: Facilitated Gate Setting by Sequential Dot Plot Scanning. Cytometry Part A. 87, (7), 661-664 (2015).
  22. Guo, Y., Baumgart, S., Stärk, H. -J., Harms, H., Müller, S. Mass Cytometry for Detection of Silver at the Bacterial Single Cell Level. Frontiers in Microbiology. 8, 1326 (2017).
  23. Gasol, J. M., Del Giorgio, P. A. Using flow cytometry for counting natural planktonic bacteria and understanding the structure of planktonic bacterial communities. Scientia Marina. 64, (2), 197-224 (2000).
  24. Gasol, J. M., Morán, X. A. G. Flow Cytometric Determination of Microbial Abundances and Its Use to Obtain Indices of Community Structure and Relative Activity. Hydrocarbon and Lipid Microbiology Protocols. 159-187 (2016).
  25. Props, R., Monsieurs, P., Mysara, M., Clement, L., Boon, N. Measuring the biodiversity of microbial communities by flow cytometry. Methods in Ecology and Evolution. 7, (11), 1376-1385 (2016).
  26. Kinet, R., et al. Flow cytometry community fingerprinting and amplicon sequencing for the assessment of landfill leachate cellulolytic bioaugmentation. Bioresource Technology. 214, 450-459 (2016).
  27. De Roy, K., Clement, L., Thas, O., Wang, Y., Boon, N. Flow cytometry for fast microbial community fingerprinting. Water Research. 46, (3), 907-919 (2012).
  28. Koch, C., Harnisch, F., Schröder, U., Müller, S. Cytometric fingerprints: evaluation of new tools for analyzing microbial community dynamics. Frontiers in Microbiology. 5, 273 (2014).
  29. Amalfitano, S., Fazi, S., Ejarque, E., Freixa, A., Romaní, A. M., Butturini, A. Deconvolution model to resolve cytometric microbial community patterns in flowing waters: Deconvolving Cytometric Microbial Subgroups. Cytometry Part A. 93, (2), 194-200 (2017).
  30. Buysschaert, B., Kerckhof, F. -M., Vandamme, P., De Baets, B., Boon, N. Flow cytometric fingerprinting for microbial strain discrimination and physiological characterization: Flow Cytometric Fingerprinting. Cytometry Part A. 93, (2), 201-212 (2017).
  31. Besmer, M. D., et al. Laboratory-Scale Simulation and Real-Time Tracking of a Microbial Contamination Event and Subsequent Shock-Chlorination in Drinking Water. Frontiers in Microbiology. 8, (1900), (2017).
  32. Zimmermann, J., et al. High-resolution microbiota flow cytometry reveals dynamic colitis-associated changes in fecal bacterial composition: Technical comment. European Journal of Immunology. 46, (5), 1300-1303 (2016).
אפיון Microbiome Dynamics – Cytometry זרימה מבוסס זרימות עבודה מתרבויות טהור לקהילות טבעי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lambrecht, J., Schattenberg, F., Harms, H., Mueller, S. Characterizing Microbiome Dynamics – Flow Cytometry Based Workflows from Pure Cultures to Natural Communities. J. Vis. Exp. (137), e58033, doi:10.3791/58033 (2018).More

Lambrecht, J., Schattenberg, F., Harms, H., Mueller, S. Characterizing Microbiome Dynamics – Flow Cytometry Based Workflows from Pure Cultures to Natural Communities. J. Vis. Exp. (137), e58033, doi:10.3791/58033 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter