Denne protokol viser den kontrollerbare Nukleering af kavitation i gel phantoms, gennem samtidig eksponering for både nær-infrarødt pulserende laser lys og høj intensitet fokuseret ultralyd (HIFU). Kavitation aktivitet kan derefter bruges til at styrke billedbehandling og/eller terapeutiske anvendelser af HIFU.
I denne undersøgelse, var plasmonic guld nanopartikler samtidig udsat for pulserende nær-infrarød laser lys og høj intensitet fokuseret ultralyd (HIFU) for kavitation i væv-efterligne gel phantoms kontrollerbare Nukleering. Denne in vitro- protokol blev udviklet for at bevise gennemførligheden af denne fremgangsmåde, for både forbedring af imaging og terapeutiske applikationer til kræft. Samme apparatur kan bruges til både billedbehandling og terapeutiske anvendelser af varierende eksponeringsvarighed HIFU system. For kortvarige eksponeringer (10 µs), blev bredbånd akustiske emissioner genereret gennem den kontrollerede Nukleering af inertial kavitation omkring den guld nanopartikler. Disse emissioner giver direkte lokalisering af nanopartikler. For fremtidige ansøgninger, disse partikler kan være functionalized med Molekylær målretning antistoffer (f.eks. anti-HER2 for brystkræft) og kan give præcise lokalisering af kræft regioner, som supplerer rutine diagnostisk ultralyd imaging. For kontinuert bølge (CW) engagementer, blev kavitation aktivitet brugt til at øge den lokaliserede varme fra HIFU engagementer resulterer i større termisk skade i gel spøgelser. De akustiske emissioner fra inertial kavitation aktivitet under disse CW engagementer var overvåges ved hjælp af en passiv kavitation detektionssystem (PCD) for at give feedback kavitation aktivitet. Øget lokaliserede varme var kun opnås gennem en unik kombination af nanopartikler, laserlys og HIFU. Yderligere validering af denne teknik i prækliniske modeller af kræft er nødvendige.
Høj intensitet fokuseret ultralyd (HIFU), eller fokuseret ultralyd kirurgi (FUS), er en ikke-ioniserende og ikke-invasiv teknik, der bruges til den termiske ablation af subkutane væv1. HIFU primære anvendelse er i behandling af blødt væv tumorer2, men det begyndt at blive brugt til andre programmer, såsom behandling af knogle tumorer3 eller neurologiske tilstande4. Der er to hovedfaktorer, der begrænser den udbredte brug af HIFU i klinikken: for det første vanskeligheder med behandling vejledning og for det andet, lang behandling gange5. Kombinationen af HIFU, pulserende laser belysning og plasmonic guld nanorods beskrevet ved denne metode kunne give en måde at overvinde de nuværende begrænsninger for HIFU6.
Under HIFU eksponeringer er den dominerende mekanisme af væv ablation termisk skade. Kavitation aktivitet kan imidlertid også spille en rolle8. Kavitation aktivitet, der opstår under HIFU engagementer kan bestå af både mekanisk og/eller termisk medieret kavitation. Mekanisk medieret kavitation er generelt omtales som akustisk kavitation7, som er yderligere subcategorized som bobler gennemgår enten ikke-inerti eller inertial9 adfærd. Termisk medieret kavitation er fra dannelsen af gas lommer, gennem ex-løsning eller fordampning, og er almindeligvis omtales som «kogning’10. Kavitation aktivitet, mest almindeligt inertial kavitation, har vist sig at øge den termiske varme satser opnås gennem HIFU engagementer11 og således hjælpe adresse, en af dens centrale begrænsninger. Dannelse og aktivitet af kavitation under HIFU eksponeringer kan være uforudsigelig, og føre til negative virkninger såsom behandling over regioner, eller asymmetrisk termisk ablation12. For at kontrollere kavitation aktivitet under HIFU engagementer, er indførelsen af eksterne kerner blevet undersøgt. Disse kan tage form af mikrobobler13, faseskift nanoemulsions14 eller plasmonic nanopartikler15. Både mikrobobler og nanoemulsions har vist sig at forbedre signal-støj til billedbehandling og forbedrede termiske ablations. Dog betyder deres forbigående natur, at de har begrænset funktionalitet over gentagne HIFU engagementer. Overvågning af kavitation aktivitet under HIFU engagementer er gjort ved hjælp af enten aktivt eller passivt kavitation påvisning (ACD eller PCD, henholdsvis). PCD er en yndet teknik til kavitation påvisning, da det kan udføres samtidig med HIFU engagementer og giver spektrale oplysninger om indhold. Denne spektrale indhold kan derefter analyseres yderligere for at identificere typen kavitation aktivitet forekommer16. Bredbånd akustiske emissioner anvendes, da disse emissioner er unikke for tilstedeværelsen af inertial kavitation10 og er forbundet med øget HIFU varme11.
Photoacoustic imaging (PAI) er en spirende kliniske imaging teknik17, som kombinerer pulserende laser excitation spektrale selektivitet med den høje opløsning på ultrasound imaging18. Det har tidligere været brugt til at guide HIFU engagementer19, men denne billeddannelse teknik er begrænset af indtrængningsdybde af laserlys. Plasmonic guld nanopartikler kan bruges til at fungere som ‘kontrastmidler» øge den lokale absorption af laserlys og efterfølgende amplitude af photoacoustic emissioner20. For tilstrækkelig høj laser præge er det muligt at forårsage generation af mikroskopiske vapor bobler, der kan bruges til meget lokaliseret billedbehandling21. Men disse eksponeringsniveauer typisk overskrider den maksimalt tilladte eksponering for brug af laserlys i mennesker22, og dermed har begrænset anvendelse. Metoden anvendt i denne undersøgelse har tidligere vist, at ved samtidig udsætter den plasmonic nanopartikler til begge laser belysning og HIFU, laser fluens og akustisk pres skulle samme disse lille vapor bobler er dramatisk reduceret, og signal-støj-forholdet for billedbehandling er øget23. En metode er beskrevet her til at kombinere plasmonic nanopartikler med både laser og HIFU engagementer for en meget styrbar teknik for Nukleering og aktivitet af vapor bobler.
Denne protokol er opdelt i fire separate sektioner, der beskriver fremstilling af væv-efterligne phantom gennem CW engagementer i dem til at producere termisk genererede denaturering. Denne denaturering af phantoms simulerer termisk genererede koagulation nekrose opleves af blødt væv udsat for HIFU1. I deres fremstilling er det vigtigt at sikre, at forholdet mellem APS og TEMED er sådan, at processen ikke katalysere for hurtigt. Da denne proces er eksoterme, jo hurtigere denne sats, jo højere temperaturen nåede25 og således kunne denaturere BSA proteiner inden eksponering. Forholdet mellem APS til TEMED i denne protokol er blevet indstillet, så det ikke bør forekomme, men formene kunne placeres i isvand under polymeriserende af gel til yderligere minimere denne mulighed.
Da denne protokol fokuserer på Nukleering af kavitation gennem kombinerer nanopartikler, laser Illuminationer og HIFU eksponering, er et kritisk skridt i fremstilling af gel phantoms at degas dem under vakuum i mindst 30 min. Når udsat for HIFU (især CW engagementer), selvom en termisk læsion ikke var til stede, er det vigtigt at målrette en frisk placering i gel phantoms at undgå forudbestående kerner. Når flytter phantom bruger computeren styres oversættelsessystem er det vigtigt at sikre, at dybden af HIFU fokus (og dermed tilpasset regionen) holdes konsekvent. Dette sikrer, at HIFU pres og laser fluens niveauer er ens for hver parameter for specifikke eksponering. Til denne protokol og efter den oprindelige placering af phantom indehaveren, er det så kun oversat i den lodrette akse.
Temperatur-følsomme væv-efterligne geler anvendes bredt af HIFU forskning EF25, da de giver en visuel mekanisme til overvågning af dannelsen af en termisk læsion. Denne undersøgelse var det første eksempel kombinere dem med nanopartikler og ekstraudstyr til læsion dannelse gennem kontrolleret kavitation aktivitet. Selv om de er klassificeret som væv-efterligne for deres reaktion på temperatur, er både deres optisk og akustisk dæmpning dog ikke. På grund af nødvendigheden af at visualisere læsion dannelse i geler, er phantoms nær gennemsigtig med en lille gul tint. Som laser fluens er justeret til konto til dette, betyder det, at laserlys lysende regionen mål er kollimeres snarere end diffuserende, som ville være for normale væv. Således at give mulighed for klinisk oversættelse flere belysning kilder ville være nødvendige for at sikre nok fluens på overfladen. I øjeblikket overholder dette arbejde retningslinjerne22 for sikker brug af lasere, når de udsættes for at huden. Det ville begrænse den maksimale laser fluens opnåeligt på dybde; således, denne teknik ville oprindeligt være velegnet til behandling af overfladiske kræftformer såsom bryst, eller hoved og hals. Derudover kunne plasmonic nanopartikler målrettet mod overfladen receptorer for disse typer af kræft give øget selektivitet i behandlinger. Men selv om dette er et meget aktivt område for forskning, ingen sådanne partikler i øjeblikket er godkendt til klinisk brug.
Den akustisk dæmpning af spøgelser med nanopartikler blev målt til at være 0.7±0.2 dB/cm6, og sammenlignet med værdien for blødt væv af 3-4 dB/cm, det er betydeligt lavere. Varme fra HIFU engagementer i disse gels ville således være lavere end ville blive overholdt i blødt væv. Det er blevet påvist, at tilsætning af glasperler til gel øger dæmpning niveauer svarende til bløddele25. I denne ansøgning er denne fremgangsmåde imidlertid ikke muligt som disse perler ville handle en Nukleering kilder for kavitation aktivitet selv i mangel af nanopartikler, og dermed fordreje kavitation tærskel. Når man sammenligner varmeeffekt for med resultater fra undersøgelsen af Choi et al. (2013) 25, termisk læsioner blev genereret på peak tryk intervaller af 14-23 MPa (det hedder ikke hvis dette var peak positivt eller negativt tryk). Da dette var udført på 1,1 MHz, var dæmpning i phantoms lavere end anvendes i denne undersøgelse. Ikke desto mindre var nanopartikel-nukleeret tilgang i denne undersøgelse i stand til at generere termisk læsioner i disse spøgelser på pres lige fra 1.19 3.19 MPA, således demonstrere en øget effektivitet over nuværende metoder.
Fremtidige test for denne metode bør foretages på en i vivo model til at inkorporere tumor reduktion, væv perfusion, Molekylær målretning af nanopartikler og relevante akustisk dæmpning parametre.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af EPSRC give EP/J021156/1. Forfatteren vil gerne anerkende støtte fra en tidlig karriere Leverhulme fellowship (ECF-2013-247).
Single Element HIFU transducer | Sonic Concepts | H-102 | |
55dB Power Amplifier | E&I | A300 | |
Function Generator | Keysight Technologies | 33250A | |
Differential Membrane Hydrophone | Precision Acoustics Ltd | ||
TTL Pulse Generator | Quantum Composers | 9524 | |
Nd:YAG Pulse Laser | Continuum | Surelite I-10 | |
OPO Plus | Continuum | Surelite | |
Fibre Bundle | Thorlabs Inc | BF20LSMA01 | |
Energy Sensor | Thorlabs Inc | ES145C | |
Nanorods | Nanopartz | A12-40-850 | |
Broadband detector | Sonic Concepts | Y-102 | |
5 MHz high pass filter | Allen Avionics | ||
40dB preamplifier | Spectrum GmbH | SPA.1411 | |
14-bit data acquisition card | Spectrum GmbH | M4i.4420×8 | |
Deionised Filtered Water | MilliQ | ||
Acrylamide/Bis-acrylamide solution | Sigma Aldrich | A9927 | |
1 mol/L TRIS Buffer | Sigma Aldrich | T2694 | |
Ammonium Persulfate | Sigma Aldrich | A3678 | |
Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A7906 | |
TEMED | Sigma Aldrich | T9281 | |
3D printer | CEL-UK | Robox | |
3-axis positioning system | Zolix | ||
Digital Microscope | Dino-lite | AM4113TL | |
Water Tank | Muji | Acrylic Tank | |
Optical Components | Thorlabs Inc | Various | |
Optomechanical Components | Thorlabs Inc | Various | |
BNC Cables | RS | ||
Desktop PC | Custom Made | ||
Hotplate Stirrer | Fisher | ||
SBench6 | Spectrum GmbH | Measurement software |