Summary
כאן, אנו מתארים שיטה חדשה המאפשרת טיפוח לטווח ארוך אנאירובית של שורות תאים הוקמה. הזמן המרבי הישרדות שבו נבדקה הוא 17 ימים. שיטה זו מתאימה בדיקה של סוכנים ציטוטוקסיות, חקר הפיזיולוגיה של anoxically שכפול התאים.
Abstract
ביותר הרירית משטחים יחד עם האמצע בין גידולים בתאי גזע נישות הם אזורים גיאוגרפיים של הגוף שאינן אנאוקסיים. מחקרים קודמים מראים כי הדגירה ב- normoxic (5% CO2 באוויר) או מחוסר חמצן (רמות חמצן נמוכות) תנאים ואחריו תוצאות אנאוקסיים דגירה (היעדרות של חמצן חופשי) ב מוגבלת הכדאיות (2-3 ימים). מתודולוגיה הרומן פותחה המאפשרת של הטיפוח סלולריים אנאוקסיים (עבור פחות 17 ימים; משך הזמן המרבי נבדק). ההיבט הקריטי ביותר של מתודולוגיה זו היא להבטיח כי אין חמצן הוא הציג לתוך המערכת. זה מתקבל על ידי degassing של התקשורת, ועל ידי צינורות שטיפה, מאכלים, מבחנות, פיפטות עם תערובת גז אנאירובית (H2, CO2, N2) ואחריו המתיר את החומרים כדי equilibrate לסביבה (ללא חמצן) אנאוקסיים לפני השימוש. טיפול נוספים החייבים אימון בעת רכישת photomicrographs על מנת להבטיח כי micrographs שהושגו אינם מכילים ממצאים. בהעדר חמצן, מורפולוגיה תאים זה שינו באופן משמעותי. שני morphotypes נפרדים מצוינים עבור כל התאים תוצרת anaerobically. ניתן להחיל את היכולת לגדול ולתחזק בתרבית של תאים, בהעדר חמצן לניתוח של פיזיולוגיה של התא polymicrobial אינטראקציות, אפיון biosynthetic הוחלף נגזר מסלולים עבור פיתוח תרופות הסרטן הרומן.
Introduction
קיימים תאים של גידולים מוצקים, נישות תאי גזע אלה המצפים את המשטחים הרירית בסביבות חווים רמות חמצן מופחתת, כולל אנוקסיה1,2,3,4. בארצות הפיזיולוגיות נורמלי, חמצון משתנה מעבר לזה של היפוקסיה אנוקסיה (העדר מוחלט של חמצן)5,6. ההבנה כי חמצן אטמוספרי משפיע לרעה על שכפול בתרבית של תאים, את צמיחת תאים במבחנה ניתן למטב בתנאים חמצן מדולדל דווח בשנות השבעים המוקדמות. . ריכטר ואח 7 הראה כי רמות החמצן (היפוקסיה)-1-3% משופרת ציפוי יעילות לעומת חמצן אטמוספרי (20%). תוחלת החיים של האדם תא דיפלואידי נמתח גם התנאים תרבות ובשפתיים8.
In vivo, תנאים ובשפתיים להתרחש כאשר חנויות חמצן מדולדל (למשל, במהלך פעילות גופנית אינטנסיבית), שבו ייצור ATP הוא החליף בשריר השלד של נשימה אירובית כדי התסיסה (נשימה אנאירובית) עם המוצר הסופי של חומצה לקטית9. פתולוגית, בגידולים סרטניים, הפנים של הגידול בנפח גדול הוא ובשפתיים כדי אנאוקסיים בשל עניים vascularization10. השפעת זלוף מוגבלת על הגידול פנים תאומת באופן עצמאי על-ידי הגידול פנים בידי אווירני anaerobes1. Mechanistically, גידול התא הישרדות היפוקסיה נחשב להיות תלויים אך ורק הביטוי של הגן גורם היפוקסיה-inducible 1-אלפא (HIF1-alpha), וזו התגובה הספונטנית הראשונית היפוקסיה4,11 , 12. HIF1-אלפא הנגרמת מחוסר חמצן בתנאים על ידי חלבוני הלם חום לאגד את HIF1-מקדם אלפא ו upregulate שעתוק גנים12. אלו חלבונים הלם חום הם האמינו כדי לסייע אינדוקציה של פנוטיפים שונים אצל microenvironment שתקבעו הגידול. אלה פנוטיפים התערוכה ביטוי מוגבר של קרום התא הגלוקוז למעליות, הקצב של גליקוליזה (אפקט ורבורג)13. התוצאה היא מתג מ מיטוכונדריאלי זרחון חמצוני כדי לקטט תסיסה.
הישרדות אנאוקסיים יכולים לנצל גם חלופות גלוקוז כדי לתמוך את התופעה14,של הישרדות15. הדוגמה יונקים למד בצורה הטובה ביותר היא העכברוש השומה, אשר יכול לשרוד במשך כמעט 20 דקות בלי חמצן דרך מסלול מונחה פרוקטוז תסיסה glycolytic14. עיבוד חלופיות מתרחשת אצל דגים מסוימים (למשל, קרפיון [קרסיוס sp.], אשר יכול לשרוד באופן משמעותי יותר פרקי זמן שימוש גליקוליזה עם אתנול תוצר לוואי מסוף)15. בשני המקרים, תסיסה מניע את חילוף החומרים הפעלת הישרדות בהיעדר חמצן. ההשערה הנוכחי להישרדות אנאוקסיים זה כל כך הרבה זמן כמו HIF1-אלפא מופעל במהלך היפוקסיה, נשימה מיטוכונדריאלי, ללא צורך חמצן, מתרחשת תחת תנאים אנאירוביים16. יתר על כן, זה הוא שמהווה השימוש שביל fermentative להישרדות ובשפתיים/אנאוקסיים משפר הישרדות הגידול מאז התאים למנוע סטרס חמצוני, אשר יכול להוכיח להיות מזיקה הישרדות תא17. אקסיומת זה נתמך על ידי מחקר שנערך לאחרונה, אשר מראה כי בעוד cardiomyocytes, היפוקסיה מפחית את הלחץ חמצוני על ה תא הגידול17.
עד כה, מהות חיוני שביל fermentative להישרדות אנאוקסיים בתרבית של תאים יש כבר טבוע עמוק בספרות, בשל, במידה רבה, עד לחוסר בתאים בתרבית של תרבות העדר מוחלט של חמצן במשך יותר מ- 3 ימים. עם זאת, אלטרנטיבה גליקוליזה למען הישרדות אנאירובית מתרחשת אצל חיידקים. בחיידקים מסוימים, חנקן או סולפט (בין תרכובות אחרות) יכול לשמש acceptors אלקטרון מסוף עבור מערכת ציטוכרום אוקסידאז בהיעדר חמצן18. למרות ההתפתחות בקטריאליים ו האיקריוטים התרחשה במקביל מאז מתפצל מן האב נפוצות הקדמון, ההערכה היא כי המיטוכונדריה שאתם מספקים אנרגיה לתאים 1.542 מיליון שנה לפני חמצון של האוקיינוסים19 . מאז חוקרים יש הראו כי המיטוכונדריה מבודד יכול לייצר ATP בהעדר חמצן, עם חנקיתי כמו מקבל אלקטרון מסוף, סביר להניח כי תאים שיכלה לשמש לפרקי זמן ארוכים יותר מ-3 ימים בהיעדר חמצן 20 , 21 , 22 , 23. המתודולוגיה המתוארים במחקר זה יש כלי הגידול אנאירובית בתרבית של תאים של שורות תאים רבים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. מכינים את המדיה לתרבות אנאירובית של קווי בתרבית של תאים שונים
-
להפוך את המדיום PS-74656 מלאה עבור התרבות תאים אנאוקסיים25.
- להפוך את הפתרון מניות חנקיתי סטרילי (5 מ'; 100 x) על ידי המסת 17.25 גר' חנקיתי ב 50 מ של מים מזוקקים יונים, ואז לסנן לחטא זה.
- להוסיף 0.5 מ"ל של הפתרון מניות חנקיתי לכל 50 מ של גלוקוז נמוך DMEM (1 g/L של גלוקוז) עם 110 מ ג/ליטר של L-גלוטמין, 584 mg/L של נתרן פירובט, סרום שור עוברית 10% (FBS; לא פעיל-חום).
הערה: השימוש FBS ריכוזים הגדול מ- 10% הם רעילים. ראוי לציין, סרטן התא בשורה אחת נבדק היו רגישות נמוכה עבור מדיה עם חנקיתי (מד א-MB-231, השד סרטן תאים בטור) והוא, לפיכך, גדל, בהעדר חנקיתי. בנוסף, למרות PS-74656 בינוני נתמך הגידול של כל הקווים תא שנבדקו (n = 9), וודאי שורות תאים (למשל, תאים Vero) הציג ריכוז גבוה של התא ואת הכדאיות גבוה יותר ב- PS-74656 עם גלוקוז גבוהות (4.5 g/L) DMEM 25. - מקום 20 מ"ל של מדיום שפופרת צנטרפוגה חרוט סטרילי 50 מ. אין לחזק את הכובע; זה צריך להיות חופשי.
- דה-גז המדיום על-ידי הצבת את הצינורית בתוך צנצנת ואקום-כ 45 ° זווית, להגדיל את שטח הפנים בינוני.
- החל ואקום באמצעות משאבת ואקום או שווה ערך, בטמפרטורת החדר. לשמור על שואב האבק עד בועות הם כבר לא נצפו (24-48 שעות).
- להסיר את הצינור מצנצנת וסגור מיד את הכיפה, איטום צינור כדי למזער את המבוא של אוויר לתוך האמצעי.
- מקם את הצינור בבית הבליעה אנאירובית מסחרי.
- שחרר את הצינורית ולאפשר את האווירה בצינור כדי equilibrate עם זה של תערובת הדלק אנאירובית בבית הבליעה לפחות 24 שעות.
הערה: המדיום צריכים להישאר בחדר עד שהוא משמש. להאצת התהליך, סומק הצינור לפחות 3 x עם תערובת גז אנאוקסיים באמצעות פיפטה העברה סטרילי מלא גז אנאוקסיים, אשר מורכב של H2, CO2ו- N2- - דגה לכל הצינורות (10-15 דקות) ממוקמים בבית הבליעה אנאירובית כמתואר לעיל לפני איטום הצינור והצבת בבית הבליעה. לפני השימוש, לשטוף את זה עם תערובת גז אנאירובית באמצעות פיפטות העברה 1.5 – 2 מ"ל או טיפים פיפטה כי יש כבר סמוקות עם אנאוקסיים גז לפחות 3 x.
- בעוד בבית הבליעה אנאירובית, הוצא 100 µL של המדיום לרכבת התחתית מיקרו-צנטריפוגה degassed סטרילי ובדוק זה עבור החמצן המומס באמצעות בדיקה של חמצן בתוך החדר.
הערה: האלקטרודה חמצן מכויל לכל פרוטוקול של היצרן לפני השימוש. קריאות של התקשורת תערובת גז אנאירובית כראוי degassed ו equilibrated הם 0.
התראה: אם הקריאות מעל 0.3 ppm של חמצן, להמשיך דגירה התקשורת בבית הבליעה אנאירובית מאז נדרש יותר זמן equilibrate של המדיום.
2. אנאוקסיים טיפוח של קווים בתרבית של תאים שונים
-
ביום המיועד-1
- לגדול תאים (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2) בבקבוקון T150 90% זרימה עבור הפקד תרבות אנאוקסיים ו- normoxic לספק מספר מספיק של תאים עבור 24-ובכן שלושה לוחות (80% זרימה).
הערה: במחקר זה, תאים הלה 229 ו- Vero שימשו. פרוטוקול זה היה גם נבדק, עלתה יפה הצמיחה ותחזוקה של שבעה אחרים תא שורות25. - להסיר את המדיום של הבקבוק על ידי השאיפה, לשטוף אותו עם 10 מ"ל של HBSS.
- החלף את המדיום עם 5 מ של טריפסין. להתסיס את הבקבוק עד התאים נובע באופן חזותי הפלסטיק. תשאף רוב טריפסין, ולאחר מכן הקש את הבקבוקון מכך התאים חסיד. להוסיף 10 – 15 מ של גלוקוז גבוהה DMEM (4.5 g/L של גלוקוז, 110 מ ג/ליטר של L-גלוטמין, 10% FBS, 50 µg/mL של גנטמיצין) כדי להשבית את טריפסין.
- Triturate התאים באמצעות פיפטה 25 מ ל עד כל תא גושים הם שיבשו.
- לספור את התאים ולקבוע את הכדאיות באמצעות את hemocytometer הרגיל, שיטת הדרה trypan צבע כחול או המקבילה אוטומטית.
- להשעות התאים גלוקוזה גבוהה DMEM כאמור לעיל את צפיפות התאים של 2.24 x 105 תאים למ"ל.
- להוסיף 1 מ"ל של התליה תא הבארות של צלחת 24-ובכן תרביות רקמה (2.24 x 105 תאים/טוב; 80% זרימה). צלחת זרע 1 עבור התרבות אנאוקסיים ואחר עבור פקד normoxic תרבות.
- דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס בתנאים normoxic (5% CO2) במשך 24 שעות ביממה.
הערה: יכול להיות מצופה התאים בתוך צלחות היטב בגדלים שונים. עם זאת, זריעת תאי לצמיחה אנאוקסיים ב מבחנות מסתכנת המבוא של חמצן למערכת, אלא אם כן טיפול וננקט לחשוף לחלוטין גז באטמוספירה.
- לגדול תאים (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2) בבקבוקון T150 90% זרימה עבור הפקד תרבות אנאוקסיים ו- normoxic לספק מספר מספיק של תאים עבור 24-ובכן שלושה לוחות (80% זרימה).
-
יום המיועד 0
- לאחר 24 שעות של normoxic הדגירה, למקם את הצלחות לצמיחה אנאוקסיים תא אנארובי (תא אנארובי מסחרי; איור 1).
- מיד לשנות את המדיום לבינונית תרופתיים נודף דה-גז PS-74656 אשר יש כבר שאמבטיה במשך 24 שעות ביממה אל התא אנאירובית. מקם את הצלחת במיכל עם מגבת, באופן רופף לסגור אותו כדי לשמור על הלחות.
הערה: הלוחות לצמיחה normoxic מטופלים באופן זהה עם היוצא מן הכלל אשר כל הטיפולים נעשים תחת תנאים אטמוספיריים.
-
ביום המיועד 1
- יום 1 של הדגירה אנאירובית מתחיל לאחר 24 שעות של הדגירה בבית הבליעה אנאירובית מסחרי אשר מכיל תערובת גז אנאירובית סטנדרטי של 10% H2, 10% CO2ו- 80% N2.
- תקופת דגירה התאים בפרקי זמן שונים.
- נטר אמצעי אנאירובית עבור שינוי הצבע לאורך זמן.
הערה: שינוי צבע של אדום כתום מגנטה אותות הזמן לשנות את המדיום. זה יכול לקחת עד שבועיים להתרחש. שינוי צבע במדיום של אדום כתום לצהוב מעיד על קיומם של זיהום חיידקי. - כאשר המדיום משתנה מאדום מגנטה, להסיר את התאים runagate על ידי השאיפה.
- המקום התקשורת בילה aspirated עם תאי runagate degassed ואנאירוביים גז equilibrated microfuge צינורות, קרוב הצינורות תוך הקפדה כי החותם הוא מאובטח, ואז centrifuge אותם (326 x g; בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות). מיד להחליף את המדיה aspirated בבאר 1 מ"ל של מדיום חדש PS-74656 degassed.
- מקם את הצינור microfuge עם תאים מגורען בבית הבליעה אנאירובית לפני פתיחתה. האחות המדיום בילה ולהחליפו טריים בינוניים PS-74656 degassed הנפח הכולל של 1 מ"ל בצינור microfuge.
- להחזיר את התאים מהצינור באר בצלחת תרביות רקמה 24-. טוב.
3. הערכה של התא פנוטיפי בידול באמצעות מיקרוסקופ של תאים בתרבית Anaerobically
-
בעוד בבית הבליעה אנאירובית, למקם את הצלחת בקופסה לסגירה חוזרת סמוקות עם תערובת גז אנאירובית ולסגור את תיבת.
הערה: תיבת להכיל במגבת נייר לחה כדי לספק לחות ולמנוע את הצלחת ממנו להתייבש. מיקרוסקופ, בשקיות סנדוויץ עובד הכי טוב מאז שהם דקים.- כדי לבחון את התאים במיקרוסקופ, לחלוטין לסגור את התיק, להסיר אותו מן החדר.
- בזהירות למתוח את שקית הניילון יניף, בוחנים תאים באמצעות מיקרוסקופ לעומת זאת שלב הפוך עם הקובץ המצורף מצלמה ולקחת photomicrographs-הגדלה שונות.
- להחזיר את הצלחת בשקית אטומה לתא ולהמשיך הדגירה כפי שמתואר בשלב 2.3.3.
- כדי לנתח בנפרד התאים runagate הם ההשעיה, בצע את השלבים המתוארים שלב 2.3.5.
הערה: תאים אלה יכולים לשמש לאחר מכן לבדיקה אירובי או שאפשר יהיה להחזיר את תא אנארובי לבדיקה של אוכלוסייה מסוימת זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הכוח של פרוטוקול זה שקרים תמיכתה תוחלת החיים וגידול של שורות תאים מרובים, ההכרה כי יש שינוי מעמיק עם סטייה מורפולוגיה תא25. האלמנט הקריטי ביותר של מחקר זה היא העברת תחזוקת התאים תחת anaerobiosis קפדנית. פעולה זו דורשת תא אנארובי מאורגנת על מנת למקסם את הפרוטוקול (איור 1) ו הבטחת כי התאים הוסר או מיקרוסקופ או בדיקות אחרות נשמרים בסביבה אטומה. עד כה, הטווח של הישרדות אנאוקסיים היה 15-17 ימים עבור סרטן בן אלמוות שורות תאים והפך את 17 ימים עבור שורות תאים (מוקרן לצמיחה אנאוקסיים קווים 9 תאים). הרמות של התאים קיימא, ברגע תאים אלה הועברו תנאים אנאוקסיים, ירדו לפחות 10%, למקסימום של 90%, לפני שהם התייצב. כל הקווים תא חזר הפנוטיפים כפול (קשורה ו runagate) עם היחס של תאים ההשעיה הגדלת לאורך זמן. אפילו לאחר דגירה ממושכת של מספר שבועות, עדיין היו כמה תאים קשור, אבל הרוב המכריע של התאים היו המורפולוגיה מעוגל runagate (איור 2). כפי שדווח, תאים runagate אלה הם קיימא והמשכתי דרך מחזור התא שלהם. יצוין, כי המשתנים שיש צורך להתאימם כוללים את רמות הגלוקוז וריכוז חנקיתי. אמר, ניסוחים מעל 60 מדיה שונים שנבדקו על יכולתם לתמוך הן normoxic והן אנאוקסיים דגירה, המדיום PS-74656 היה מסוגל לתמוך את הישרדות, שכפול של כמעט כל הקווים תא נבדק.
התבוננות חיוני היה הבידול של תאים אנאוקסיים, ללא קשר לתא נבדק, לתוך שני פנוטיפים שונים, קשורה, runagate (איור 2). התאים קשור מקביל התאים טפט normoxic, חוברו הפלסטיק תרביות רקמה. אולם, הקובץ המצורף היה חלש יותר, קל יותר trypsinize או לסלק על-ידי גירוד, מאשר הקובץ המצורף שהתרחשו בתנאים normoxic. בנוסף, המורפולוגיה תא היה קטן יותר עם הרחבות יותר של פלך (דנדריטים)26. Morphotype הסלולר השנייה שנצפו היו תאים ההשעיה (כלומר, תאים runagate). תאים אלה באופן ספונטני שהוסב לתא בודד לתרשים המתלים בנוכחות תרביות רקמה שטופלו פלסטיק, אשר היו מעוגלים עם גודל תא קטן יותר ופחות הציטופלסמה. הם שונה מזו ההשעיה קלאסית התרבות התאים, אשר בדרך כלל דורשים עיבוד אנזימטי צומחים אגרגטים, דורשים מכולות שאינם תרביות רקמה-מטופלים, הם גדולים יותר מאשר עמיתיהם שלהם normoxic27. לאורך זמן, האוכלוסיות תא אנאוקסיים יכול להיות שנצפו לנוע מ טפט בעיקר קשור לזה של התאים runagate ההשעיה. תאים אלה ההשעיה היו קיימא שכפול; לפיכך, הטיפול היה סדרניות יש להסיר את תגובת שיקוע. גם, לשים לב הוא כי המדיום לא מחייבים משתנה לאורך תקופת הדגירה אנאירובית כולו. מחוון pH בינוני תחת הדגירה אנאוקסיים, בניגוד שליטתה normoxic, היה גם ללא שינוי (קרי, נשאר אדום). צריך החוקר רוצה לקצור את התאים runagate, או לשנות את המדיום, התאים ניתן להשיג באמצעות אנאירובית סמוקות גז מיקרו-צנטריפוגה צינורות סגורות בחוזקה בתוך תא אנארובי. עבור התא שטיפה של תאים רתום, ההליך יש גם לבצע בבית הבליעה לחסל כל חשיפה חמצן.
הכדאיות תא הסופי לטיפוח לטווח ארוך היה, במידה רבה, תלויים התא בשימוש לבין המפגש שאליו הבארות או את הבקבוקון היובתחילה הזריעה (דמויות 3 ו- 4). עם זאת, נקודת התחלה טובה היא 80%, אשר היה את הסיכוי הגדול ביותר של האופטימלית צמיחה. בנוסף, קו תלוית תא הפסד של 10% עד 60% של הכדאיות יכול להתרחש בימים 2-4 הראשונית. עם זאת, במהלך ביצוע הניסוי הזה, התאים הנותרים רכב על אופניים דרך מחזור התא ומשוכפלים28. ניתן לראות את ההשפעה הנהרות זריעה על תוחלת החיים של טיפוח תא דמויות 3 ו- 4. הלה 229 והן Vero התאים היו נזרע ב- 24-ובכן צלחות 40%, 60% ו- 80% למפגש הראשוני (100% זרימה = 2.8 x תאים5 10/טוב...) ולאחר מכן מודגרות בהיעדר חמצן למשך 17 ימים. הגידול אנאוקסיים של התא הלה 229 היה מותאם-מקום המפגש זריעה הראשונית של 80%. לעומת זאת, התאים Vero אופטימלית זריעה הנהרות היה 60%. זה מדגים את הצורך בתחילה לייעל את הצפיפות זריעה התלויים על הקו תא בשימוש.
איור 1 : דגם של תא אנארובי הגדרת לתרבות של תאי יונקים. החומרים מינימלי נדרש לכלול תרביות רקמה צלחות, העברת עקר pipets, שקיות חומרים מסוכנים, מדיה בטל נודף גז, צינור עבור השלכת של מדיה או נוזלים אחרים, ולא שקיות לסגירה חוזרת להעברת הלוחות אל המיקרוסקופ תוך שמירה תנאים אנאירוביים.
איור 2: הלה אנאוקסיים תאים בידול מורפולוגיות. (א) לוח זה מראה את מיקרוסקופ ניגוד שלב של הפקדים הלה תא normoxic 4 ימים לאחר חיסון, עם 20 X הגדלה. (B) לוח זה מראה את התאים הלה אנאוקסיים 17 ימים לאחר חיסון (עם שינוי יום 1 PS-74656 בינוני, 80% נזרע זרימה, של 20 X הגדלה). (C) לוח זה מראה חפצים מיקרוסקופיה של טיפות מים על הפנים של שקית ניילון אטום המכיל צלחת 24-טוב אנאוקסיים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: היחס בין אנאוקסיים ל normoxic הלה 229 קיימא תאים פוסט-17 ימים דגירה. לוח זה מראה את השפעת צפיפות זריעה על הכדאיות התא הלה 229 במדיום PS-74656 לעומת הפקד normoxic. התוצאות יוצגו גם זאת אומרת ± ב- SEM.
איור 4: היחס בין אנאוקסיים ל normoxic ורו קיימא תאי הדגירה לאחר 17 ימים. לוח זה מראה את השפעת צפיפות זריעה על הכדאיות תא Vero במדיום PS-74656 לעומת הפקד normoxic. התוצאות יוצגו גם זאת אומרת ± ב- SEM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שיטה זו מייצגת בפעם הראשונה בתרבית של תאים היו תרבותי לתקופות ממושכות של זמן בהעדר חמצן. על סמך תצפיות הנוכחי, הצמיחה אנאוקסיים יכולת דרך שביל fermentative נראה אוניברסלי בין תאים בתרבית של שורות28, שבו הגידול אנאירובית, גרמו פנוטיפ גאוס. זה נצפתה עבור כל השורות תא נבדק. עם טיפוח אנאירובית, הגדלת הפרופורציות של התאים הפך מעוגל פיתח אוכלוסיה כמו השעיה, הצליחו לשכפל. סוג התא משני נשאר קשור המצע; עם זאת, המורפולוגיה תא להחזירה לצורת ציר (דנדריטים). ממצאים אלה מצביעים שגיאה נפוצה ב ניתוחים ותצפיות לגבי טיפוח תרביות רקמה אנאוקסיים. זה מקובל כי כאשר תאים בתרבית של גדל בתנאים normoxic (5% CO2) לאסוף ולנתק, הם מתים. היפוכו של דבר נראה כנכון עבור תאים גדל, בהעדר חמצן, בכל מקרה, התאים יש מעוגל למעלה, מנותק, פשוט subpopulation תא מורפולוגית מתבדרת.
אופטימיזציה של תנאי הגידול אנאוקסיים הוא שורת התאים התלויים. בינוני נ. ב- 74656 הנתמכים באופן כללי הצמיחה של תאים כל קווי תחת normoxic ותנאי גידול אנאוקסיים, למעט מד א-MB-231, קו תא סרטן השד אשר העדיפו צמיחת בהיעדר חנקיתי. התבוננות מעודד הוא כי אפילו עם die-off 98% של תאים לכל טוב, השארית משכפל, וכתוצאה מכך אוכלוסיה במיוחד. הפעולה קריטית היא כדי לשמור על תרבויות גם כאשר רק כמה תאים ישירות שנצפו על ידי מיקרוסקופ. לכן, טיפול החייבים אימון כדי להבטיח כי התאים מנותקת מת, trypan צבע כחול הדרה או באמצעות שיטת זיהוי הכדאיות תא חלופי. יצוין, כי כזה ירידה גדולה במספר מספרי הטלפון הנייד, בארות מספיק חייב להיות נזרע נאותה בתא סכום מספרי לניסויים הבאים. ההפסד הצפוי של התאים קיימא הוא שורת התאים והן זריעה הנהרות תלויים; לפיכך, מספרי הטלפון הנייד אופטימלית, לאורך זמן, צריכה להיקבע ניסיוניים, לא יכול להיות אומדן של ממצאים עם שורות תאים אחרים. עם זאת, נקודת התחלה טובה היא זרימה 80%, אשר יש את הסיכוי הגדול ביותר של האופטימלית צמיחה. יש לציין כי כל חשיפה לחמצן במהלך השלבים אנאירובית בשגרה, לא משנה כמה קצר, תסכן את הממצאים בשל דיווח ספונטנית הסלולר HIF-1-אלפא תגובה11,12.
עבור הליך זה, השלב הקריטי ביותר הוא זה של בטל ההמתה של המדיום, צינורות, כל שאר מנגנוני ואת החומרים שנעשה בהם שימוש. המבוא של רמות אפילו מאוד נמוכות של חמצן יכול לעצור המעבר חילוף החומרים תסיסה נשימה אנאירובית. לחלופין, זה יכול להאריך את חילוף החומרים fermentative כך כל הניסויים להוביל המדידה של היפוקסיה, לא אנוקסיה. השימוש בהליך זה הרומן למדוד cytotoxicity ופעילות כימותרפיות יכול לעזור להסביר סמים כשל בטיפול של גידולים מוצקים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
המחברים מודים לבנק אוניברסיטת Office של מחקר ותוכניות במימון על תמיכתם.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Whitney A35 anaerobic chamber | Don Whitley Scientific | Microbiology International | The ability to remove the front of the chamber makes it easy to put instruments inside without concern about getting them through the portals. |
| CO2 incubator | Fisher Scientific | 3531 | |
| Tissue Culture Hood | Labconco | DO55735 | |
| pipet aid | Drummond | 4-000-100 | |
| sterile transfer pipets | Santa Cruz | sc-358867 | |
| 50 cc sterile conical centrifuge tubes | DOT | 451-PG | |
| vaccum jar | Nalgene 111410862889 | BTA-Mall 5311-0250 | |
| DMEM high glucose (4.5 g/L) | CellGro | 10-017-CM | |
| DMEM low glucose (1 g/L) | CellGro | 10-014-CV | |
| FBS | VWR | 1500-500 | |
| HBSS | VWR | 20-021-CV | |
| trypsin | VWR | 25-052-CI | |
| gentamicin | Gibco | 15750-060 | |
| sterile pipets | CellTreat | 229210B, 229205B | |
| Tissue culture flask (T75 or T150) | Santa Cruz | sc-200263, sc-200264 | |
| 24 well tissue culture treated dishes | DOT | 667124 | |
| glad ziplock sandwich bags | Ziploc | Costco | |
| inverted phase microscope (10, 20 40x objectives with camera mont) | Nikon Eclipse | TS100 | |
| trypan blue | Invitrogen | T10282 | |
| hemocytometer | Invitrogen | C10283 | |
| Countess Automated Cell Counter | Life Technologies | AMQAF1000 | |
| Rainin microtiter pipets | Mettler Toledo | Rainin Classic Pipette PR-100 | |
| microtiter tips | Santa Cruz Biotechnology | sc-213233 & sc-201717 | |
| test tube rack (50cc tubes) | The Lab Depot | HS29050A | |
| sodium nitrite | Sigma | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigald/237213?lang=en®ion=US | |
| clear boxes with lids | Rosti Mepal | Rubber maid | |
| paper towels | In House | ||
| cell scraper | CellTreat | 229310 | |
| PBS | In house prepared | ||
| 70% Ethanol | Fisher Scientific | 64-17-5 | |
| microcentrifuge tubes sterile | Santa Cruz | sc-200273 | |
| biohazard bags with holder (desktop) | Heathrow Scientific | HS10320 | |
| Nitrile Gloves | VWR | 89428 | |
| oxygen electrode | eDAQ | EPO354 | |
| pH meter | Jenway | 3510 | |
| pH paper/ pHydrion | Sigma Aldich | Z111813 |
References
- Cummins, J., Tangney, M. Bacteria and tumours: causative agents or opportunistic inhabitants? Infectious Agents and Cancer. 8 (1), 11 (2013).
- Liao, J., et al. Enhanced efficiency of generating induced pluripotent stem (iPS) cells from human somatic cells by a combination of six transcription factors. Cell Research. 18 (5), 600-603 (2008).
- Park, I. H., Lerou, P. H., Zhao, R., Huo, H., Daley, G. Q. Generation of human-induced pluripotent stem cells. Nature Protocols. 3 (7), 1180-1186 (2008).
- Semenza, G. L. HIF-1: mediator of physiological and pathophysiological responses to hypoxia. Journal of Applied Physiology. 88 (4), 1474-1480 (2000).
- Biedermann, L., Rogler, G. The intestinal microbiota: its role in health and disease. European Journal of Pediatrics. 174 (2), 151-167 (2015).
- Cui, X. Y., et al. Hypoxia influences stem cell-like properties in multidrug resistant K562 leukemic cells. Blood Cells, Molecules, and Diseases. 51 (3), 177-184 (2013).
- Richter, A., Sanford, K. K., Evans, V. J. Influence of Oxygen and Culture Media on Plating Efficiency of Some Mammalian Tissue Cells. JNCI: Journal of the National Cancer Institute. 49 (6), 1705-1712 (1972).
- Packer, L., Fuehr, K. Low oxygen concentration extends the lifespan of cultured human diploid cells. Nature. 267, 423 (1977).
- Warburg, O. On the origin of cancer. Science. 123 (3191), 309-314 (1956).
- Döme, B., Hendrix, M. J. C., Paku, S., Tóvári, J., Tímár, J. Alternative Vascularization Mechanisms in Cancer. The American Journal of Pathology. 170 (1), 1-15 (2007).
- Jewell, U. R., et al. Induction of HIF-1α in response to hypoxia is instantaneous. The FASEB Journal. 15 (7), 1312-1314 (2001).
- Lee, J. W., Bae, S. H., Jeong, J. W., Kim, S. H., Kim, K. W. Hypoxia-inducible factor (HIF-1)alpha: its protein stability and biological functions. Experimental & Molecular Medicine. 36 (1), 1-12 (2004).
- Pagoulatos, D., Pharmakakis, N., Lakoumentas, J., Assimakopoulou, M. Etaypoxia-inducible factor-1alpha, von Hippel-Lindau protein, and heat shock protein expression in ophthalmic pterygium and normal conjunctiva. Molecular Vision. 20, 441-457 (2014).
- Park, T. J., et al. Fructose-driven glycolysis supports anoxia resistance in the naked mole-rat. Science. 356 (6335), 307 (2017).
- Johnston, I. A., Bernard, L. M. Utilization of the Ethanol Pathway in Carp Following Exposure to Anoxia. Journal of Experimental Biology. 104 (1), 73 (1983).
- Takahashi, E., Sato, M. Anaerobic respiration sustains mitochondrial membrane potential in a prolyl hydroxylase pathway-activated cancer cell line in a hypoxic microenvironment. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 306 (4), C334-C342 (2014).
- Mandziuk, S., et al. Effect of hypoxia on toxicity induced by anticancer agents in cardiomyocyte culture. Medycyna Weterynaryjna. 70 (5), 287-291 (2014).
- Arai, H., Kodama, T., Igarashi, Y. The role of the nirQOP genes in energy conservation during anaerobic growth of Pseudomonas aeruginosa. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 62 (10), 1995-1999 (1998).
- Müller, M., et al. Biochemistry and Evolution of Anaerobic Energy Metabolism in Eukaryotes. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 76 (2), 444-495 (2012).
- Gupta, K. J., Igamberdiev, A. U. The anoxic plant mitochondrion as a nitrite: NO reductase. Mitochondrion. 11 (4), 537-543 (2011).
- Gupta, K. J., Igamberdiev, A. U. Reactive Nitrogen Species in Mitochondria and Their Implications in Plant Energy Status and Hypoxic Stress Tolerance. Frontiers in Plant Science. 7 (369), (2016).
- Kozlov, A. V., Staniek, K., Nohl, H. Nitrite reductase activity is a novel function of mammalian mitochondria. FEBS letters. 454 (1-2), 127-130 (1999).
- Nohl, H., Staniek, K., Kozlov, A. V. The existence and significance of a mitochondrial nitrite reductase. Redox Report. 10 (6), 281-286 (2005).
- Lawson, J. C., Blatch, G. L., Edkins, A. L. Cancer stem cells in breast cancer and metastasis. Breast Cancer Research and Treatment. 118 (2), 241-254 (2009).
- Plotkin, B. J., et al. A method for the long-term cultivation of mammalian cells in the absence of oxygen: Characterization of cell replication, hypoxia-inducible factor expression and reactive oxygen species production. Tissue and Cell. 50 (Supplement C), 59-68 (2018).
- Sarmento, B., et al. Cell-based in vitro models for predicting drug permeability. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 8 (5), 607-621 (2012).
- Collins, S. J., Gallo, R. C., Gallagher, R. E. Continuous growth and differentiation of human myeloid leukaemic cells in suspension culture. Nature. 270 (5635), 347-349 (1977).
- Plotkin, B. J., et al. A method for the long-term cultivation of mammalian cells in the absence of oxygen: Characterization of cell replication, hypoxia-inducible factor expression and reactive oxygen species production. Tissue and Cell. 50, 59-68 (2018).
