Summary
Hier beschrijven we een nieuwe methode waarmee de anaërobe op lange termijn teelt van bestaande cellijnen. De maximale overlevingstijd die werd getest is 17 dagen. Deze methode is geschikt voor het testen van cytotoxische agenten en het verkennen van de Fysiologie van de anoxically cellen te repliceren.
Abstract
Meest mucosal oppervlakken samen met de middelpunten in tumoren en stamcel niches zijn geografische gebieden van het lichaam die zuurstofvrije. Eerdere studies tonen aan dat de incubatie in normoxic (5% CO2 in lucht) of hypoxische (lage zuurstofniveaus) voorwaarden gevolgd door een zuurstofvrije incubatie (een ontbreken van vrije zuurstof) resulteert in beperkte levensvatbaarheid (2-3 dagen). Een nieuwe methodiek ontwikkeld waarmee een zuurstofvrije cel teelt (voor ten minste 17 dagen; de maximale tijd getest). Het meest kritieke aspect van deze methode is om ervoor te zorgen dat er geen zuurstof wordt ingevoerd in het systeem. Dit percentage wordt verkregen door het ontgassen van media, en door de afboekingsmethode buizen, gerechten, kolven en pipetten met een anaërobe gasmengsel (H2, CO2, N-2) gevolgd door toe te staan van het materiaal dat voor het milieu (niet-zuurstof) zuurstofvrije equilibreer voorafgaand aan gebruik. Extra zorg moet worden betracht bij het verwerven van photomicrographs om ervoor te zorgen dat de verkregen microfoto geen artefacten bevatten. Bij gebrek aan zuurstof, is de cel morfologie ingrijpend veranderd. Twee verschillende morphotypes worden vermeld voor alle anaëroob gekweekte cellen. De mogelijkheid om te groeien en te handhaven van zoogdiercellen in afwezigheid van zuurstof kan worden toegepast op de analyse van celfysiologie, polymicrobial interacties en de karakterisering van nieuwe kanker Geneesmiddelenontwikkeling biosynthetic opleidingstrajecten.
Introduction
Cellen van solide tumoren, stamcel niches en de voering van de mucosal oppervlakken bestaan in omgevingen die ervaring van verminderde zuurstofniveaus, met inbegrip van Anoxie1,,2,,3,4. In normale fysiologische staten varieert oxygenatie dan van hypoxie Anoxie (de volledige afwezigheid van zuurstof)5,6. Het besef dat atmosferische zuurstof beïnvloedt in negatieve zin zoogdiercellen replicatie en dat celgroei in vitro kan worden geoptimaliseerd verarmd zuurstof omstandigheden werd gemeld in de vroege jaren 1970. Richter et al. 7 bleek dat 1-3% van de zuurstofniveaus (hypoxie) verbeterde plating efficiëntie ten opzichte van de atmosferische zuurstof (20%). De levensduur van de menselijke diploïde cel wordt ook uitgebreid in de hypoxische cultuur voorwaarden8.
In vivo, hypoxische voorwaarden optreden als zuurstof winkels zijn verarmd (b.v.tijdens intense oefening), waarin de ATP productie is ingeschakeld de skeletspieren van aërobe ademhaling om gisting (anaërobe ademhaling) met de eindproduct van melkzuur9. Pathologisch, in kanker tumoren, het interieur van de tumor is massa hypoxische aan zuurstofvrije als gevolg van slechte vascularisatie10. Het effect van de beperkte perfusie op tumor interieurs is onafhankelijk gevalideerd door tumor interieurs gekoloniseerd door obligate sporenvormende anaerobe bacteriën1. Mechanistically, de overleving van de cel van de tumor in hypoxie wordt beschouwd als uitsluitend afhankelijk is van de expressie van het gen van hypoxie-afleidbare factor 1-alpha (HIF1-alpha), die is de eerste spontane reactie op hypoxie4,11 , 12. HIF1-alpha hypoxische voorwaarden wordt geïnduceerd door hitteschokprotëinen die de HIF1 binden-Alfa promotor en upregulate de gene transcriptie12. Deze hitteschokprotëinen worden verondersteld om te helpen bij de inductie van de verschillende fenotypes gezien in de tumor hypoxische communicatie. Deze fenotypen vertonen een grotere expressie van de celmembraan glucose vervoerders en het tempo van de glycolyse (het Warburg effect)13. Het resultaat is een overstap van Mitochondriale oxidatieve fosforylatie aan lactaat gisting.
Zuurstofvrije overleving kan ook gebruik maken van alternatieven voor glucose ter ondersteuning van de overleving fenomeen14,15. De best bestudeerde zoogdieren in het volgende voorbeeld is de mole-rat, die voor bijna 20 minuten zonder zuurstof tot en met een fructose-gedreven glycolytic gisting traject14kunnen overleven. Een alternatieve aanpassing treedt op in bepaalde soorten vis (bijvoorbeeldkarpers [Carassius sp.], die aanzienlijk langer kunnen overleven periodes glycolyse met ethanol als de terminal bijproduct)15. In beide gevallen drijft gisting de stofwisseling waardoor het voortbestaan in de afwezigheid van zuurstof. De huidige hypothese voor zuurstofvrije overleving is dat zo lang als HIF1-alpha is geactiveerd tijdens hypoxie, mitochondriale ademhaling, zonder de behoefte aan zuurstof, optreedt onder anaërobe omstandigheden16. Bovendien is het gepostuleerd dat het gebruik van een fermenterende traject voor hypoxische/zuurstofvrije overleving tumor overleving verbetert, aangezien de cellen voorkomen oxidatieve stress die blijken dat kan te zijn schadelijk voor de cel overleving17. Dit postulaat wordt ondersteund door een recente studie waaruit blijkt dat in cardiomyocytes, hypoxie de oxidatieve stress op de tumor cel17geplaatst vermindert.
Tot op heden, heeft het essentiële karakter van een fermenterende traject voor de overleving van de zuurstofvrije zoogdieren cel zijn ingebakken in de literatuur, gevolg, grotendeels, een onvermogen om cultuur cellen van zoogdieren in het volledig ontbreken van zuurstof voor meer dan 3 dagen. Echter, een alternatief voor voor de overleving van de anaërobe glycolyse gebeurt bij bacteriën. In bepaalde bacteriën, kan stikstof of sulfaat (onder andere verbindingen) dienen als terminal elektronen acceptoren voor het cytochroom oxidase-systeem in de afwezigheid van zuurstof18. Hoewel de bacteriële en eukaryote evolutie is opgetreden in parallel sinds afwijken van de laatste gemeenschappelijke voorouder van universele, geschat wordt dat mitochondriën energie naar cellen door 1.542 miljoen jaar voordat de oxygenatie van de oceanen19 voorzien waren . Omdat onderzoekers hebben aangetoond dat de geïsoleerde mitochondriën ATP in de afwezigheid van zuurstof, met nitriet als de terminal elektron acceptor produceren kunnen, is het redelijk te veronderstellen dat de cellen voor perioden langer dan 3 dagen in de afwezigheid van zuurstof functioneren kunnen 20 , 21 , 22 , 23. de methodologie beschreven in deze studie heeft een hulpprogramma voor de anaërobe zoogdieren celgroei van talrijke cellijnen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Prepareer Media anaërobe cultuur van verschillende zoogdieren cellijnen
-
Controleer het volledige PS-74656 medium voor een zuurstofvrije cel cultuur25.
- Maak de steriele nitriet-stockoplossing (5 M; 100 x) door ontbinding 17.25 g van nitriet in 50 mL gedestilleerd gedeïoniseerd water, dan filteren zodat u het steriliseren.
- Voeg 0,5 mL van de stockoplossing van nitriet per 50 mL lage glucose DMEM (1 g/L van glucose) met L-glutamine, 584 mg/L natrium pyruvaat, en 10% foetale runderserum 110 mg/L (FBS; warmte-geïnactiveerd).
Opmerking: Het gebruik van FBS concentraties groter is dan 10% giftig zijn. Van de nota, een kanker cellijn getest had van een lage tolerantie voor media met nitriet (MDA-MB-231, borst kanker cellijn) en, dus, bij gebrek aan nitriet werd gekweekt. Bovendien, hoewel PS-74656 medium ondersteund de groei van alle cellijnen die werden getest (n = 9), bepaalde cellijnen (b.v., Vero-cellen) tentoongesteld hogere concentraties van de cel en een hogere levensvatbaarheid in PS-74656 met hoge glucose (4.5 g/L) DMEM 25. - Breng 20 mL medium in een steriele 50 mL conische centrifugebuis. Niet het scherpen van het GLB; het moet los.
- Ambtshalve gas het medium door het plaatsen van de buis in een vacuum Stolp op een ongeveer hoek van 45 °, te maximaliseren de middellange oppervlakte.
- Toepassing van een vacuüm met behulp van een vacuümpomp of het equivalent daarvan, bij kamertemperatuur. Handhaven het vacuüm bubbels (24-48 h) niet meer in acht worden genomen.
- De buis uit de pot verwijderen en onmiddellijk sluit het GLB, het afdichten van de buis om te minimaliseren van de invoering van de lucht in het medium.
- Plaats de buis in de commerciële anaërobe zaal.
- Draai de dop van de tube en de atmosfeer in de buis te equilibreer met die van de anaërobe gasmengsel in de zaal gedurende ten minste 24 uur toestaan.
Opmerking: Het medium moet in de bedwelmingsruimte blijven totdat het is opgebruikt. Voor versnelling van het proces, flush de buis minstens 3 x met de zuurstofvrije gasmengsel met behulp van een precisiepipet steriele overdracht gevuld met zuurstofvrije gas, die uit het N, H2en CO2 bestaat2. - Ontgas alle buizen (10-15 min) geplaatst in de anaërobe kamer zoals hierboven beschreven voor het afdichten van de buis en plaatsen in de kamer. Vóór gebruik, het spoelen met de anaërobe gasmengsel met behulp van 1,5-2 mL overdracht pipetten of Pipetteer tips die hebben zijn gespoeld met zuurstofvrije gas ten minste 3 x.
- Terwijl in de anaërobe zaal, verwijdert u 100 µL van het medium aan een steriele ontgaste micro-centrifuge buis en testen voor het gehalte aan opgeloste zuurstof, met behulp van een sonde met zuurstof in de kamer.
Opmerking: De zuurstof-elektrode is gekalibreerd per protocol van de fabrikant vóór gebruik. Lezingen van de goed ontgaste en geëquilibreerd anaërobe gas mengsel media zijn 0.
Let op: Als de lezingen boven 0,3 ppm van zuurstof, blijven de media in de anaërobe zaal broeden aangezien meer tijd aan het medium equilibreer nodig is.
2. zuurstofvrije teelt van verschillende zoogdieren cellijnen
-
Aangewezen dag -1
- Het groeien van cellen (37 ° C, 5% CO2) in een maatkolf van T150 tot 90% samenkomst voor het besturingselement zuurstofvrije en normoxic cultuur om een voldoende aantal cellen voor drie 24-Wells-platen (samenvloeiing van 80%).
Opmerking: Deze studie HeLa 229 en Vero-cellen werden gebruikt. Dit protocol is ook getest en bewezen succesvol voor de groei en het onderhoud van zeven andere cel lijnen25. - Verwijder het medium van de kolf door aspiratie en wassen met 10 mL HBSS.
- Vervang het medium met 5 mL trypsine. De kolf doorroeren totdat de cellen visueel van het plastic loskoppelen. Allermeest naar de trypsine gecombineerd, dan tik op de kolf te verjagen de Adherente cellen. Voeg 10 à 15 mL hoge glucose DMEM (4.5 g/L van glucose, 110 mg/L van L-glutamine, 10% FBS, 50 µg/mL gentamicine) naar de inactivering van de trypsine.
- Triturate van de cellen met behulp van een precisiepipet 25 mL tot alle klontjes van de cel worden verstoord.
- Cellen tellen, en bepalen de levensvatbaarheid met de standaard hemocytometer en de trypan blauwe kleurstof uitsluiting methode of het geautomatiseerde equivalent.
- Opschorten van de cellen in de hoge glucose DMEM zoals hierboven vermeld naar een celdichtheid van 2.24 x 105 cellen/mL.
- 1 mL van de celsuspensie toevoegen aan de putjes van de plaat van een 24-well weefselkweek (2.24 x 105 cellen/well; 80% samenvloeiing). Zaad 1 plaat voor de zuurstofvrije cultuur en een andere voor een besturingselement normoxic cultuur.
- Incubeer de cellen bij 37 ° C in normoxic omstandigheden (5% CO2) gedurende 24 uur.
Opmerking: De cellen kunnen worden bekleed in verschillende goed formaat platen. Echter loopt zaaien van de cellen voor zuurstofvrije groei in maatkolven van het risico van de insleep van zuurstof in het systeem, tenzij zorgvuldigheid is betracht om volledig spoelen van atmosferische gas.
- Het groeien van cellen (37 ° C, 5% CO2) in een maatkolf van T150 tot 90% samenkomst voor het besturingselement zuurstofvrije en normoxic cultuur om een voldoende aantal cellen voor drie 24-Wells-platen (samenvloeiing van 80%).
-
Aangewezen dag 0
- Na 24 h van de normoxic-incubatie, plaatst u de platen voor de zuurstofvrije groei in de anaërobe kamer (een commerciële anaërobe kamer; Figuur 1).
- Onmiddellijk omzetten in het medium antibioticum-gratis-vergast PS-74656 medium dat gedurende 24 uur in de anaërobe zaal heeft zijn gewend. Plaats de plaat in een container met een vochtige handdoek en losjes sluiten om te houden van het vocht.
Opmerking: De platen voor normoxic groei worden afgehandeld identiek met de uitzondering die alle behandelingen worden gedaan onder atmosferische omstandigheden.
-
Aangewezen dag 1
- Dag 1 van de anaërobe incubatie begint na 24 h de incubatietijd in de commerciële anaërobe kamer die de standaard anaërobe gasmengsel van 80% N2, 10% H2en 10% CO2 bevat.
- Incubeer de cellen gedurende verschillende perioden.
- De anaërobe medium voor de kleur te veranderen na verloop van tijd te controleren.
Opmerking: Een verschuiving van de kleur van rood-oranje naar magenta signalen de tijd om te veranderen van het medium. Dit kan duren tot 2 weken optreden. Een kleurverandering in het medium van de rood-oranje naar geel duidt op de aanwezigheid van een bacteriële besmetting. - Wanneer het medium van rood in magenta verandert, verwijder de runagate cellen door aspiratie.
- Plaats de aanzuiging verbruikte media met de runagate cellen in ontgaste en anaërobe gas geëquilibreerd microfuge buizen, de buizen te sluiten terwijl het ervoor te zorgen dat het zegel beveiligd is en vervolgens Centrifugeer ze (326 x g; bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten). Onmiddellijk vervangen de aanzuiging media in de put met 1 mL van nieuwe ontgaste PS-74656 medium.
- Plaats de microfuge buis met Ingehuld cellen in de anaërobe kamer vóór het openen. Het gebruikte medium gecombineerd en vervangen door verse ontgaste PS-74656 middellange tot een totaal volume van 1 ml in de microfuge buis.
- De cellen van de buis aan een putje in de 24-well weefselkweek plaat retourneren.
3. beoordeling van de fenotypische celdifferentiatie door microscopie van anaëroob gekweekte cellen
-
Plaats de plaat in een hersluitbare doos gespoeld met de anaërobe gasmengsel terwijl in de anaërobe kamer, en sluit het.
Opmerking: Het vak moet bevatten een vochtige papieren handdoek om vocht en te voorkomen dat de plaat uitdrogen. Voor microscopie werken sandwich zakken het beste, omdat ze dun.- Om te zien hoe de cellen onder de Microscoop, volledig sluit de zak en verwijder deze uit de zaal.
- Zorgvuldig rekken van de plastic zak over de plaat, bestudeert van cellen met behulp van een omgekeerde fasecontrastmicroscoop met de camera-bijlage en neemt photomicrographs in verschillende vergrotingen.
- De plaat in de verzegelde zak terug naar de kamer, en blijven de incubatie zoals beschreven in stap 2.3.3.
- Volg de stappen zoals beschreven in stap 2.3.5 om afzonderlijk analyseren de runagate cellen die in suspensie.
Opmerking: Deze cellen kunnen vervolgens worden gebruikt voor het testen van de aërobe of kunnen worden teruggebracht naar de anaërobe zaal voor het testen van deze specifieke populatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De kracht van dit protocol ligt in haar steun voor de levensduur en de groei van meerdere cellijnen en in de erkenning dat er een diepgaande wijziging en divergentie in de cel morfologie-25. De meest kritische element van deze studie is de overdracht en het onderhoud van de cellen onder strikte anaerobiosis. Dit vereist een anaërobe kamer georganiseerd om te maximaliseren van het protocol (Figuur 1) en de verzekering dat de cellen verwijderd voor microscopie of andere tests worden bewaard in een afgesloten omgeving. Tot op heden, het bereik van zuurstofvrije overleven was 15-17 dagen voor onsterfelijke kanker cellijnen en omhoog tot 17 dagen voor getransformeerd cellijnen (negen cellijnen gescreend voor zuurstofvrije groei). Het aantal levensvatbare cellen, daalde zodra deze cellen werden verplaatst naar zuurstofvrije omstandigheden, ten minste 10%, tot een maximum van 90%, voordat ze gestabiliseerd. Alle cellijnen teruggekeerd naar de dual fenotypen (aangebonden en runagate) met het aantal cellen in de schorsing na verloop van tijd verhogen. Zelfs na een uitgebreide incubatie van enkele weken, er bleven sommige vastgebonden cellen, maar de meerderheid van de cellen waren in de morfologie van de afgeronde runagate (Figuur 2). Zoals gemeld, wordt deze runagate cellen zijn levensvatbare en ging via hun celcyclus. Opgemerkt moet worden dat de variabelen die mogelijk moeten worden bijgesteld de niveaus van de bloedglucose en de concentratie nitriet omvatten. Dat gezegd hebbende, uit de meer dan 60 verschillende media-formuleringen die werden getest op hun vermogen om zowel normoxic en zuurstofvrije incubatie te ondersteunen, kon het medium van de PS-74656 ondersteunen de overleving en replicatie van bijna alle de cellijnen getest.
Een essentiële observatie was de differentiatie van zuurstofvrije cellen, ongeacht de cel die is getest, in twee duidelijke fenotypen, vastgebonden en runagate (Figuur 2). Analoog aan de normoxic enkelgelaagde cellen, de vastgebonden cellen waren verbonden aan het plastic weefselkweek. De bijlage was echter zwakker, makkelijker te trypsinize of te verjagen door schrapen, dan de bijlage die hebben plaatsgevonden onder de voorwaarden van de normoxic. Daarnaast was de morfologie van de cel kleiner, met meer spindel (dendritische) extensies26. De tweede cellulaire morphotype waargenomen waren cellen in suspensie (dat wil zeggen, runagate cellen). Deze cellen spontaan omgezet in zwevende eencellige schorsingen in aanwezigheid van weefselkweek behandeld kunststof, die werden afgerond met een kleinere Celgrootte en minder cytoplasma. Zij verschilden van de klassieke schorsing cultuur cellen, die doorgaans voorschrijven dat een enzymatische, groeien in aggregaten vereisen niet-weefselkweek-behandelde containers en groter zijn dan hun tegenhangers normoxic27. Na verloop van tijd kon de zuurstofvrije cel populaties worden waargenomen om te verschuiven van een overwegend vastgebonden enkelgelaagde met die van de runagate cellen in suspensie. Deze cellen in suspensie waren levensvatbare en repliceren; dus zorg moest worden uitgeoefend moet het supernatant worden verwijderd. Ook te bemerken is dat het medium niet meer vereist veranderen de hele anaërobe incubatie periode. De middellange pH-indicator onder de zuurstofvrije incubatie, in tegenstelling tot haar normoxic control, was ook ongewijzigd (d.w.z., bleef rood). Indien de onderzoeker wenst te oogsten van de cellen van de runagate, of het wijzigen van het medium, kunnen de cellen worden verkregen met behulp van anaërobe gas afgeboekte micro-centrifuge buizen die gesloten zijn strak binnen de anaërobe kamer. Voor de cel wassen van vastgebonden cellen, moet de procedure ook worden uitgevoerd in de zaal te elimineren van eventuele blootstelling van zuurstof.
De levensvatbaarheid van de cellen van de laatste voor een lange termijn teelt was, voor een groot deel afhankelijk van de cel wordt gebruikt en de samenvloeiing waarnaar de putten of de kolf waren aanvankelijk geplaatste (figuren 3 en 4). Dat gezegd hebbende, een goed uitgangspunt is 80%, die had de grootste kans op optimale groei. Bovendien, kan een cel lijn-afhankelijke verlies van 10% tot 60% van levensvatbaarheid plaatsvinden in de eerste 2-4 dagen. Echter tijdens de uitvoering van dit experiment, de resterende cellen fietste door de celcyclus en28gerepliceerd. Het seeding samenvloeiing effect op de levensduur van de teelt van de cel kan worden gezien in de cijfers 3 en 4. HeLa 229 zowel Vero-cellen werden zaadjes in 24-Wells-platen tot 40%, 60% en 80% van de initiële samenvloeiing (100% samenvloeiing = 2.8 x 105 cellen/well) en vervolgens geïncubeerd bij gebrek aan zuurstof voor 17 dagen. De celgroei zuurstofvrije HeLa 229 werd geoptimaliseerd aan een eerste seeding samenvloeiing van 80%. In tegenstelling, de optimale zaaien samenvloeiing Vero-cellen was 60%. Dit toont de noodzaak te optimaliseren in eerste instantie de seeding dichtheid, afhankelijk van de gebruikte cellijn.
Figuur 1 : Model van anaërobe kamer set-up voor cultuur van zoogdiercellen. De minimaal benodigde materialen omvatten weefselkweek platen met steriele overdracht pipets, biohazard tassen, -vergast media, een buis voor het teruggooien van media of andere vloeistoffen en hersluitbare zakken voor de overdracht van de platen naar de microscoop met behoud van anaërobe omstandigheden.
Figuur 2: Zuurstofvrije HeLa cellen morfologische differentiatie. (A) dit paneel toont de fase contrast microscopie van de normoxic HeLa cel besturingselementen 4 dagen na inoculatie, met 20 X vergroting. (B) dit paneel toont de zuurstofvrije HeLa cellen 17 dagen na inoculatie (met de onveranderd van dag 1 PS-74656 medium, 80% ontpit samenvloeiing, en een 20 X vergroting). (C) dit paneel toont microscopie artefacten van waterdruppels op de binnenkant van een verzegelde plastic tas met een 24-well zuurstofvrije plaat. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: Verhouding van zuurstofvrije te normoxic HeLa 229 levensvatbare cellen post-17 dagen incubatie. Dit paneel toont het effect van de seeding dichtheid op de levensvatbaarheid van de cellen van HeLa 229 in het medium van de PS-74656 in vergelijking met de controle van de normoxic. De resultaten worden weergegeven als de gemiddelde ± SEM.
Figuur 4: Verhouding van zuurstofvrije te normoxic Vero levensvatbare cellen 17 dagen na incubatie. Dit paneel toont het effect van de seeding dichtheid op de levensvatbaarheid van de Vero-cellen in het medium van de PS-74656 in vergelijking met de controle van de normoxic. De resultaten worden weergegeven als de gemiddelde ± SEM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deze methode eerst zoogdieren cellen voorstelt die werden gekweekt voor langere tijd in de afwezigheid van zuurstof. Op basis van de huidige waarnemingen, lijkt de zuurstofvrije groei vermogen via een niet-fermenterende weg te zijn universele onder zoogdiercellen lijnen28, waar de anaërobe groei resulteerde in fenotype divergentie. Dit werd waargenomen voor alle cellijnen getest. Met de anaërobe teelt, verhoging van de verhoudingen van de cellen werd afgerond, ontwikkelde een schorsing-achtige bevolking en waren in staat om te repliceren. De secundaire celtype bleef verbonden aan de ondergrond; echter, de morfologie van de cel teruggekeerd naar een spindel (dendritische) vorm. Deze bevindingen wijzen op een gemeenschappelijke fout in analyses en opmerkingen met betrekking tot zuurstofvrije weefselkweek teelt. Het is algemeen aanvaard dat bij zoogdiercellen gegroeid onder normoxic omstandigheden (5% CO2) ronden en losmaken, ze sterven. Het tegendeel lijkt correct is voor cellen gekweekt in het gebrek aan zuurstof, in dat geval cellen die hebben afgerond en vrijstaand, zijn gewoon een morfologisch uiteenlopende cel populaties.
De optimalisatie van zuurstofvrije groei voorwaarden is cellijn afhankelijk. Middellange PS-74656 over het geheel genomen ondersteund de groei van alle cel lijnen onder normoxic en zuurstofvrije groei-omstandigheden, met uitzondering van MDA-MB-231, een borst kanker cellijn die de voorkeur van de groei in de afwezigheid van nitriet. Een bemoedigend observatie is dat zelfs met een 98% die-off van cellen per putje, de rest wordt gerepliceerd, wat resulteert in een zeer aangepaste bevolking. De kritieke actie is het handhaven van culturen, zelfs wanneer slechts een paar cellen rechtstreeks door microscopie waargenomen worden. Aldus, moet voorzichtigheid worden betracht om ervoor te zorgen dat de vrijstaande cellen dood, trypan blauwe kleurstof uitsluiting of door een alternatieve cel methode voor de detectie van de levensvatbaarheid. Opgemerkt moet worden dat met dergelijke een grote daling in cel nummers, voldoende putten om voldoende totale cel nummers voor latere experimenten moeten worden ontpit. Het verwachte verlies van levensvatbare cellen is zowel cellijn en zaaien samenvloeiing afhankelijk; optimale cel nummers, na verloop van tijd moet experimenteel worden bepaald en dus niet kan worden afgeleid uit de bevindingen met andere cellijnen. Dat gezegd hebbende, een goed uitgangspunt is een samenvloeiing van 80%, die de grootste kans op optimale groei heeft. Opgemerkt moet worden dat de eventuele blootstelling aan zuurstof tijdens de anaërobe stappen in de procedure, ongeacht hoe kort, de bevindingen als gevolg van de gerapporteerde spontane cellulaire HIF-1zal compromitteren-Alfa antwoord11,12.
Voor deze procedure is de meest kritische stap die van de-vergassing van het medium, buizen, en alle andere toestellen en materialen gebruikt. De invoering van zelfs zeer lage niveaus van zuurstof kon stoppen met de overgang van het metabolisme van de gisting aan de anaërobe ademhaling. Het kan als alternatief, de fermenterende metabolisme verlengen zodat alle experimenten leiden het meten van hypoxie, niet Anoxie tot. Het gebruik van deze nieuwe procedure voor het meten van de cytotoxiciteit en chemotherapeutische activiteit kan helpen verklaren van de mislukking van de drug in de behandeling van solide tumoren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs bedanken de Midwestern Universiteit Office of Research en gesponsorde programma's voor hun steun.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Whitney A35 anaerobic chamber | Don Whitley Scientific | Microbiology International | The ability to remove the front of the chamber makes it easy to put instruments inside without concern about getting them through the portals. |
| CO2 incubator | Fisher Scientific | 3531 | |
| Tissue Culture Hood | Labconco | DO55735 | |
| pipet aid | Drummond | 4-000-100 | |
| sterile transfer pipets | Santa Cruz | sc-358867 | |
| 50 cc sterile conical centrifuge tubes | DOT | 451-PG | |
| vaccum jar | Nalgene 111410862889 | BTA-Mall 5311-0250 | |
| DMEM high glucose (4.5 g/L) | CellGro | 10-017-CM | |
| DMEM low glucose (1 g/L) | CellGro | 10-014-CV | |
| FBS | VWR | 1500-500 | |
| HBSS | VWR | 20-021-CV | |
| trypsin | VWR | 25-052-CI | |
| gentamicin | Gibco | 15750-060 | |
| sterile pipets | CellTreat | 229210B, 229205B | |
| Tissue culture flask (T75 or T150) | Santa Cruz | sc-200263, sc-200264 | |
| 24 well tissue culture treated dishes | DOT | 667124 | |
| glad ziplock sandwich bags | Ziploc | Costco | |
| inverted phase microscope (10, 20 40x objectives with camera mont) | Nikon Eclipse | TS100 | |
| trypan blue | Invitrogen | T10282 | |
| hemocytometer | Invitrogen | C10283 | |
| Countess Automated Cell Counter | Life Technologies | AMQAF1000 | |
| Rainin microtiter pipets | Mettler Toledo | Rainin Classic Pipette PR-100 | |
| microtiter tips | Santa Cruz Biotechnology | sc-213233 & sc-201717 | |
| test tube rack (50cc tubes) | The Lab Depot | HS29050A | |
| sodium nitrite | Sigma | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigald/237213?lang=en®ion=US | |
| clear boxes with lids | Rosti Mepal | Rubber maid | |
| paper towels | In House | ||
| cell scraper | CellTreat | 229310 | |
| PBS | In house prepared | ||
| 70% Ethanol | Fisher Scientific | 64-17-5 | |
| microcentrifuge tubes sterile | Santa Cruz | sc-200273 | |
| biohazard bags with holder (desktop) | Heathrow Scientific | HS10320 | |
| Nitrile Gloves | VWR | 89428 | |
| oxygen electrode | eDAQ | EPO354 | |
| pH meter | Jenway | 3510 | |
| pH paper/ pHydrion | Sigma Aldich | Z111813 |
References
- Cummins, J., Tangney, M. Bacteria and tumours: causative agents or opportunistic inhabitants? Infectious Agents and Cancer. 8 (1), 11 (2013).
- Liao, J., et al. Enhanced efficiency of generating induced pluripotent stem (iPS) cells from human somatic cells by a combination of six transcription factors. Cell Research. 18 (5), 600-603 (2008).
- Park, I. H., Lerou, P. H., Zhao, R., Huo, H., Daley, G. Q. Generation of human-induced pluripotent stem cells. Nature Protocols. 3 (7), 1180-1186 (2008).
- Semenza, G. L. HIF-1: mediator of physiological and pathophysiological responses to hypoxia. Journal of Applied Physiology. 88 (4), 1474-1480 (2000).
- Biedermann, L., Rogler, G. The intestinal microbiota: its role in health and disease. European Journal of Pediatrics. 174 (2), 151-167 (2015).
- Cui, X. Y., et al. Hypoxia influences stem cell-like properties in multidrug resistant K562 leukemic cells. Blood Cells, Molecules, and Diseases. 51 (3), 177-184 (2013).
- Richter, A., Sanford, K. K., Evans, V. J. Influence of Oxygen and Culture Media on Plating Efficiency of Some Mammalian Tissue Cells. JNCI: Journal of the National Cancer Institute. 49 (6), 1705-1712 (1972).
- Packer, L., Fuehr, K. Low oxygen concentration extends the lifespan of cultured human diploid cells. Nature. 267, 423 (1977).
- Warburg, O. On the origin of cancer. Science. 123 (3191), 309-314 (1956).
- Döme, B., Hendrix, M. J. C., Paku, S., Tóvári, J., Tímár, J. Alternative Vascularization Mechanisms in Cancer. The American Journal of Pathology. 170 (1), 1-15 (2007).
- Jewell, U. R., et al. Induction of HIF-1α in response to hypoxia is instantaneous. The FASEB Journal. 15 (7), 1312-1314 (2001).
- Lee, J. W., Bae, S. H., Jeong, J. W., Kim, S. H., Kim, K. W. Hypoxia-inducible factor (HIF-1)alpha: its protein stability and biological functions. Experimental & Molecular Medicine. 36 (1), 1-12 (2004).
- Pagoulatos, D., Pharmakakis, N., Lakoumentas, J., Assimakopoulou, M. Etaypoxia-inducible factor-1alpha, von Hippel-Lindau protein, and heat shock protein expression in ophthalmic pterygium and normal conjunctiva. Molecular Vision. 20, 441-457 (2014).
- Park, T. J., et al. Fructose-driven glycolysis supports anoxia resistance in the naked mole-rat. Science. 356 (6335), 307 (2017).
- Johnston, I. A., Bernard, L. M. Utilization of the Ethanol Pathway in Carp Following Exposure to Anoxia. Journal of Experimental Biology. 104 (1), 73 (1983).
- Takahashi, E., Sato, M. Anaerobic respiration sustains mitochondrial membrane potential in a prolyl hydroxylase pathway-activated cancer cell line in a hypoxic microenvironment. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 306 (4), C334-C342 (2014).
- Mandziuk, S., et al. Effect of hypoxia on toxicity induced by anticancer agents in cardiomyocyte culture. Medycyna Weterynaryjna. 70 (5), 287-291 (2014).
- Arai, H., Kodama, T., Igarashi, Y. The role of the nirQOP genes in energy conservation during anaerobic growth of Pseudomonas aeruginosa. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 62 (10), 1995-1999 (1998).
- Müller, M., et al. Biochemistry and Evolution of Anaerobic Energy Metabolism in Eukaryotes. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 76 (2), 444-495 (2012).
- Gupta, K. J., Igamberdiev, A. U. The anoxic plant mitochondrion as a nitrite: NO reductase. Mitochondrion. 11 (4), 537-543 (2011).
- Gupta, K. J., Igamberdiev, A. U. Reactive Nitrogen Species in Mitochondria and Their Implications in Plant Energy Status and Hypoxic Stress Tolerance. Frontiers in Plant Science. 7 (369), (2016).
- Kozlov, A. V., Staniek, K., Nohl, H. Nitrite reductase activity is a novel function of mammalian mitochondria. FEBS letters. 454 (1-2), 127-130 (1999).
- Nohl, H., Staniek, K., Kozlov, A. V. The existence and significance of a mitochondrial nitrite reductase. Redox Report. 10 (6), 281-286 (2005).
- Lawson, J. C., Blatch, G. L., Edkins, A. L. Cancer stem cells in breast cancer and metastasis. Breast Cancer Research and Treatment. 118 (2), 241-254 (2009).
- Plotkin, B. J., et al. A method for the long-term cultivation of mammalian cells in the absence of oxygen: Characterization of cell replication, hypoxia-inducible factor expression and reactive oxygen species production. Tissue and Cell. 50 (Supplement C), 59-68 (2018).
- Sarmento, B., et al. Cell-based in vitro models for predicting drug permeability. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 8 (5), 607-621 (2012).
- Collins, S. J., Gallo, R. C., Gallagher, R. E. Continuous growth and differentiation of human myeloid leukaemic cells in suspension culture. Nature. 270 (5635), 347-349 (1977).
- Plotkin, B. J., et al. A method for the long-term cultivation of mammalian cells in the absence of oxygen: Characterization of cell replication, hypoxia-inducible factor expression and reactive oxygen species production. Tissue and Cell. 50, 59-68 (2018).
