Summary
هنا، يمكننا وصف أسلوب جديد يتيح لزراعة اللاهوائية الطويلة الأجل من خطوط الخلايا المحددة. الوقت بقاء الحد الأقصى الذي تم اختباره 17 يوما. هذا الأسلوب مناسبة لاختبار العوامل السامة للخلايا واستكشاف الفسيولوجيا من تكرار أنوكسيكالي الخلايا.
Abstract
معظم الأسطح المخاطية جنبا إلى جنب مع نقاط المنتصف في الأورام والخلايا الجذعية المنافذ هي المناطق الجغرافية للهيئة التي وصول. تظهر الدراسات السابقة أن الاحتضان في نورموكسيك (5% CO2 في الهواء) أو التاكسج الظروف (مستويات الأوكسجين منخفض) تليها نتائج وصول حضانة (غياب الأكسجين الحرة) في صلاحية محدودة (2-3 أيام). وضعت منهجية مبتكرة تمكن زراعة خلية وصول (على الأقل 17 يوما؛ والحد الأقصى للوقت اختبار). الجانب الأكثر أهمية لهذه المنهجية ضمان أن لا الأكسجين الأخذ في النظام. وهذا يتم الحصول عليها جليحه لوسائل الإعلام، وأنابيب التفريغ والاطباق، وقوارير والماصات بأن خليط غاز اللاهوائية (ح2، وأول أكسيد الكربون2ن2) متبوعاً بالسماح للمواد اللازمة لحجته بالبيئة (غير الأكسجين) وصول قبل الاستخدام. يجب توخي الحذر إضافية عند اكتساب photomicrographs لضمان عدم احتواء ميكروجرافس حصل على القطع الأثرية. في غياب الأوكسجين، مورفولوجيا الخلايا هو تغيير كبير. تتم الإشارة إلى اثنين من مورفوتيبيس متميزة لكافة الخلايا نابعة من دون وجود عوامل هوائية. يمكن تطبيق القدرة على النمو والحفاظ على خلايا الثدييات في غياب الأكسجين في تحليل فسيولوجيا الخلية والتفاعلات أنه وصف مسارات السكروز لتطوير عقاقير السرطان رواية.
Introduction
وتوجد خلايا من الأورام الصلبة والكوات الخلايا الجذعية، وأولئك بطانة الأسطح المخاطية في البيئات التي تعاني من مستويات انخفاض الأكسجين، بما في ذلك أكسجين1،2،،من34. في الدول الفسيولوجية طبيعية، يختلف الأوكسجين إلى أبعد من ذلك لنقص أكسجين (الغياب الكامل للأوكسجين)5،6. وذكر إدراك أن الأكسجين الغلاف الجوي يؤثر سلبا على خلايا الثدييات النسخ المتماثل، ويمكن أن يكون الأمثل أن نمو الخلايا في المختبر تحت شروط استنفاد الأكسجين في أوائل السبعينات. ريختر et al. 7 أظهرت أن 1 – 3 في المائة مستويات الأوكسجين (نقص) تعزيز كفاءة الطلاء بالمقارنة مع أكسجين الغلاف الجوي (20%). تم تمديد عمر الخلايا ضعفاني البشرية أيضا في ظروف الثقافة التاكسج8.
في فيفو، تحدث الشروط التاكسج عند مخازن الأكسجين المستنفد (مثلاً، أثناء ممارسة التمرينات الرياضية)، حيث يتم تبديل إنتاج ATP في العضلات الهيكلية من التنفس الهوائي للتخمير (التنفس اللاهوائي) مع المنتج النهائي لحمض الالكتيك9. مرضية، في الأورام السرطانية، الداخلية للورم هو كتلة التاكسج لوصول بسبب ضعف الأوعية الدموية10. أثر نضح محدودة على الورم الداخلية بصورة مستقلة يقرها الداخلية الورم استعمر اللاهوائيات تلزم1. ميتشانيستيكالي، وورم الخلايا البقاء في نقص يعتقد أن تعتمد فقط على التعبير عن الجينات 1-ألفا عامل نقص إيندوسيبلي (HIF1-ألفا)، وهو استجابة عفوية الأولية لنقص4،11 , 12- HIF1-ألفا هو فعل بروتينات الصدمة الحرارية التي تربط HIF1تحت ظروف التاكسج-المروج ألفا و upregulate النسخ الجيني12. ويعتقد هذه البروتينات صدمة الحرارة للمساعدة في تنظيم دورات تعريفية لتعمل مختلف ينظر في ورم المكروية التاكسج. تعمل هذه يحمل تعبير زيادة ناقلات الجلوكوز غشاء الخلية ومعدل تحلل (تأثير واربورغ)13. والنتيجة هي التحول من الفسفرة المتقدرية لاكتات التخمير.
بقاء وصول أيضا استخدام بدائل للسكر لدعم ال14،ظاهرة بقاء15. هو أفضل مثال الثدييات درس فأر الخلد، التي يمكن البقاء على قيد الحياة لما يقرب من 20 دقيقة دون الأوكسجين من خلال مسار تخمير جليكوليتيك الفركتوز يحركها14. يحدث تكيف بديلة في بعض الأسماك (مثلاً، سمك الشبوط [Carassius sp.]، التي يمكن البقاء على قيد الحياة لفترة أطول إلى حد كبير الوقت فترات استخدام تحلل مع الإيثانول كمنتج ثانوي المحطة الطرفية)15. وفي كلتا الحالتين، محركات التخمير الأيض التمكينية البقاء على قيد الحياة في الغياب الأكسجين. الفرضية الحالية لوصول البقاء على قيد الحياة أن فترة طويلة ك HIF1--يتم تنشيط ألفا خلال نقص، التنفس المتقدرية، دون الحاجة للأوكسجين، يحدث تحت الظروف اللاهوائية16. وعلاوة على ذلك، هو افترض أن يحسن استخدام مسار معفن لبقاء التاكسج/وصول بقاء الورم نظراً لتجنب الأكسدة التي يمكن أن تكون ضارة ل بقاء الخلية17من الخلايا. ويدعم هذه الفرضية دراسة أجريت مؤخرا مما يدل على أن نقص في cardiomyocytes، يقلل من الأكسدة على خلايا الورم17.
حتى الآن، الطبيعة الأساسية لمسار معفن لبقاء الخلية الثديية وصول قد تم متأصلة في الأدب، يرجع، في جزء كبير منه، إلى عدم قدرة على خلايا الثدييات الثقافة في الغياب الكامل للأكسجين لأكثر من 3 أيام. ومع ذلك، يحدث بديل لتحلل لبقاء اللاهوائية في البكتيريا. في بعض البكتيريا، والنيتروجين أو كبريتات (من بين مركبات أخرى) يمكن اعتبارها متقبلون إلكترون المحطة الطرفية لنظام السيتوكروم أوكسيديز في الغياب الأكسجين18. ورغم حدوث تطور البكتيريا وحقيقية النواة جنبا إلى جنب منذ متباينة من سلف مشترك عالمي آخر، يقدر أن الميتوكوندريا كان توفير الطاقة للخلايا 1.542 مليون سنة قبل الأكسجين المحيطات19 . منذ الباحثين أظهرت أن الميتوكوندريا المعزولة يمكن أن تنتج ATP في غياب الأكسجين، مع نتريت كما يقبلون الإلكترون المحطة الطرفية، أنها من المعقول افتراض أن الخلايا تستطيع أن تعمل لفترات زمنية أطول من 3 أيام في حالة عدم وجود الأوكسجين 20 , 21 , 22 , 23-المنهجية المشروحة في هذه الدراسة قد أداة لنمو خلايا الثدييات اللاهوائية للعديد من خطوط الخلايا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد وسائل الإعلام للثقافة اللاهوائية لمختلف خطوط خلايا الثدييات
-
جعل المتوسطة PS 74656 كاملة ل ثقافة وصول خلية25.
- جعل الحل نتريت العقيمة الأسهم (م 5؛ 100 x) بتذويب ز 17.25 من نتريت في 50 مل ماء المقطر منزوع، ثم تصفية لتعقيم عليه.
- إضافة 0.5 مل الحل نتريت الأسهم كل 50 مل الجلوكوز منخفضة دميم (1 غرام/لتر السكر) مع 110 مغ/لتر الجلوتامين لام، 584 مغ/لتر من بيروفات صوديوم، و 10% مصل بقرى الجنين (FBS؛ إبطال الحرارة).
ملاحظة: استخدام تركيزات FBS أكبر من 10% ومواد سامة. من المذكرة، خط خلية سرطان اختبار واحد كان التفاوت منخفض لوسائل الإعلام مع النتريت (نجمة داود الحمراء-ميغابايت-231، خط خلية سرطان الثدي)، وهكذا، يزرع في غياب نتريت. وبالإضافة إلى ذلك، على الرغم من أن متوسط PS-74656 تدعم نمو كل من خطوط الخلايا التي تم اختبارها (n = 9)، وبعض من خطوط الخلايا (مثلاً، الخلايا فيرو) أظهرت تركيزات أعلى الخلية وبقاء أعلى في PS-74656 مع ارتفاع الجلوكوز (4.5 غرام/لتر) دميم 25. - ضع 20 مل متوسطة في أنبوب الطرد مركزي مخروطية عقيمة 50 مل. لا تشديد عملية النداءات الموحدة؛ ينبغي أن تكون فضفاضة.
- إزالة الغاز المتوسطة عن طريق وضع الأنبوب في جرة الجرس فراغ في زاوية 45 درجة تقريبا، تحقيق أقصى قدر من المساحة السطحية المتوسطة.
- تطبيق فراغ باستخدام مضخة فراغ، أو ما يعادلها، في درجة حرارة الغرفة. الحفاظ على الفراغ حتى لم تعد تحترم فقاعات (ح 24 – 48).
- إزالة الأنبوب من الجرة وفورا بإغلاق الغطاء، ختم أنبوب لتقليل إدخال الهواء في المتوسط.
- ضع الأنبوبة في قاعة اللاهوائية التجارية.
- قم بفك غطاء أنبوب ويسمح الغلاف الجوي في أنبوب لحجته بخليط الغاز اللاهوائية في قاعة لمالا يقل عن 24 ساعة.
ملاحظة: ينبغي أن تظل المتوسطة حتى يتم استخدامه في الدائرة. لتسريع هذه العملية، تدفق الأنبوب مليئة x 3 على الأقل مع وصول الغاز المخلوط باستخدام ماصة نقل عقيمة وصول الغاز، الذي يتألف من ح2و CO2و N2- - ديغا جميع الأنابيب (10 – 15 دقيقة) توضع في قاعة اللاهوائية كما هو موضح أعلاه قبل إغلاق الأنبوب ووضع في الدائرة. قبل الاستخدام، طرد مع خليط الغاز اللاهوائية باستخدام الماصات نقل 1.5 – 2 مل أو ماصة النصائح التي قد تم مسح مع وصول الغاز x 3 على الأقل.
- بينما في قاعة اللاهوائية، إزالة 100 ميليلتر من المتوسط إلى أنبوب مايكرو--أجهزة الطرد المركزي ديجاسيد عقيمة واختباره للأكسجين المذاب باستخدام مسبار الأوكسجين داخل الدائرة.
ملاحظة: يتم معايرة مسرى الأوكسجين كل الشركة المصنعة على البروتوكول قبل الاستخدام. قراءات وسائط مزيج الغاز اللاهوائية بشكل صحيح يطرد ومتوازن هي 0.
تنبيه: إذا كانت القراءات فوق 0.3 جزء في المليون أكسجين، تواصل احتضان وسائط الإعلام في قاعة اللاهوائية منذ مطلوب مزيد من الوقت لحجته في المتوسط.
2-وصول زراعة مختلف خطوط خلايا الثدييات
-
يوم معين-1
- تنمو خلايا (37 درجة مئوية، 5% CO2) في قارورة T150 لالتقاء 90% لمراقبة وصول ونورموكسيك الثقافة لتوفير عدد كاف من الخلايا لثلاثة آبار 24 لوحات (التقاء 80%).
ملاحظة: لهذه الدراسة، استخدمت خلايا هيلا 229 و فيرو. هذا البروتوكول أيضا اختبارها وأثبتت نجاحها للنمو والحفاظ على سبعة آخرين خلية خطوط25. - إزالة المتوسطة من قارورة بالطموح وغسله مع 10 مل حبس.
- استبدال المتوسطة مع 5 مل التربسين. تحرض قارورة حتى فصل الخلايا بصريا من البلاستيك. نضح معظم التربسين، ثم انقر على قارورة لإزاحة الخلايا ملتصقة. إضافة 10 – 15 مل من ارتفاع الجلوكوز دميم (4.5 غ/لتر جلوكوز، 110 مغ/لتر من الجلوتامين لام، 10% FBS، 50 ميكروغرام/مل من الجنتاميسين) لإلغاء تنشيط التربسين.
- تريتوراتي الخلايا باستخدام ماصة 25 مل حتى تعطلت جميع كتل الخلية.
- عد الخلايا وتحديد جدوى استخدام هيموسيتوميتير القياسية وطريقة الاستبعاد صبغة زرقاء تريبان أو ما يعادلها الآلي.
- تعليق الخلايا الموجودة في الجلوكوز عالية دميم كما سبقت الإشارة إلى كثافة خلية 2.24 × 105 خلايا/مل.
- أضف 1 مل تعليق خلية لآبار طبق استنبات الأنسجة 24-جيدا (2.24 × 105 خلايا/جيدا؛ والتقاء 80%). لوحة البذور 1 لثقافة وصول وآخر لثقافة نورموكسيك عنصر تحكم.
- احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في ظروف نورموكسيك (5% CO2) 24 ساعة.
ملاحظة: يمكن أن يكون مطلي بالخلايا في لوحات جيدا الحجم مختلف. ومع ذلك، بذر الخلايا لوصول النمو في قوارير ينطوي على خطر الأخذ بالأكسجين في النظام، ما لم يمارس الرعاية لطرد تماما غازات الغلاف الجوي.
- تنمو خلايا (37 درجة مئوية، 5% CO2) في قارورة T150 لالتقاء 90% لمراقبة وصول ونورموكسيك الثقافة لتوفير عدد كاف من الخلايا لثلاثة آبار 24 لوحات (التقاء 80%).
-
اليوم المعين 0
- بعد 24 ساعة الحضانة نورموكسيك، وضع لوحات لوصول النمو في قاعة اللاهوائية (اللاهوائية غرفة تجارية؛ الشكل 1).
- فورا تغيير الوسيلة خالية من المضادات الحيوية دي المشككين PS-74656 المتوسطة التي قد تم تأقلم ح 24 إلى الدائرة اللاهوائية. ضع اللوحة في حاوية مع منشفة رطبة وفضفاضة وإغلاقه للحفاظ على الرطوبة.
ملاحظة: تتم معالجة اللوحات للنمو نورموكسيك مطابق تماما باستثناء أن جميع العلاجات تتم تحت الظروف الجوية.
-
مكان مخصص يوم 1
- يبدأ يوم 1 من حضانة اللاهوائية بعد 24 ساعة الحضانة في قاعة اللاهوائية التجاري الذي يحتوي على خليط الغاز اللاهوائية القياسية من 10 ٪ ح2و 10% CO2و 80% N2.
- احتضان الخلايا لفترات زمنية مختلفة.
- رصد المتوسطة اللاهوائية لتغيير اللون مع مرور الوقت.
ملاحظة: تحول لون من البرتقالي الأحمر إلى الأرجواني إشارات الوقت لتغيير في المتوسط. هذا يمكن أن تصل إلى 2 أسابيع لتحدث. تحول لون في الأجلين المتوسط ومن الأحمر-البرتقالي الأصفر يدل على وجود التلوث البكتيري. - عندما يتغير المتوسط من الأحمر إلى البنفسجي، إزالة الخلايا رانجيت بالطموح.
- مكان يستنشق قضى وسائط الإعلام مع خلايا رانجيت اللاهوائية ويطرد غاز اكويليبراتيد [ميكروفوج] أنابيب، وإغلاق الأنابيب مع التأكد من أن الختم آمنة، وثم الطرد المركزي لهم (326 × ز؛ وفي درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق). فورا استبدال الوسائط يستنشق في البئر مع 1 مل من جديد يطرد PS-74656 المتوسطة.
- المكان [ميكروفوج] أنابيب مع خلايا الأعلاف في قاعة اللاهوائية قبل فتحه. نضح المتوسطة المستهلك واستبداله بالطازج يطرد PS-74656 المتوسطة إلى إجمالي حجم 1 مل في [ميكروفوج] أنابيب.
- عودة الخلايا من الأنبوب إلى بئر في لوحة زراعة الأنسجة 24-جيدا.
3-تقييم خلية المظهرية التفرقة بالفحص المجهري للخلايا المستزرعة لاهوائيا
-
بينما في قاعة اللاهوائية، ضع اللوحة في مربع resealable مسح مع خليط الغاز اللاهوائية وإغلاق المربع.
ملاحظة: يجب أن يحتوي على المربع منشفة ورقية رطبة لتوفير الرطوبة ومنع اللوحة من الجفاف. للفحص المجهري، عمل أكياس ساندويتش الأفضل نظراً لأنها رقيقة.- لمراقبة الخلايا تحت المجهر، ختم الحقيبة تماما وإزالته من الدائرة.
- بعناية تمتد الكيس من البلاستيك على اللوحة وفحص الخلايا باستخدام مجهر الطوري مقلوب مع المرفق الكاميرا واتخاذ photomicrographs في تكبير مختلفة.
- العودة اللوحة في حقيبة مختومة إلى الدائرة، وتستمر في الحضانة كما هو موضح في الخطوة 2.3.3.
- لتحليل رانجيت الخلايا الموجودة في التعليق بشكل منفصل، اتبع الخطوات الموضحة في الخطوة 2.3.5.
ملاحظة: هذه الخلايا يمكن استخدامها بعد ذلك لاختبار الهوائية أو يمكن إرجاعها إلى قاعة اللاهوائية للاختبار لهذه الفئة من السكان.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وتكمن قوة هذا البروتوكول في دعمه لطول العمر والنمو في العديد من خطوط الخلايا، وفي الاعتراف بأن هناك التغيير العميق والاختلاف في مورفولوجيا الخلايا25. أن أهم عنصر في هذه الدراسة هو نقل وصيانة الخلايا تحت أنايروبيوسيس صارمة. وهذا يتطلب دائرة اللاهوائية للمنظمة إلى أقصى حد ممكن في البروتوكول (الشكل 1) والتأكيد على أن إزالة الخلايا للفحص المجهري أو اختبارات أخرى يتم الاحتفاظ بها في بيئة مغلقة. حتى الآن، كان 15 – 17 يوما للسرطان الخالد خطوط الخلية نطاق وصول البقاء على قيد الحياة وتصل إلى 17 يوما لتحويل خطوط الخلايا (تسعة خطوط الخلية فرز لوصول النمو). مستويات خلايا قابلة للحياة، وبمجرد نقل هذه الخلايا إلى ظروف وصول، انخفض 10 في المائة على الأقل، بحد أقصى 90%، قبل أنها استقرت. عادت جميع خطوط الخلايا لتعمل المزدوج (المربوطة ورانجيت) مع نسبة الخلايا في وقف زيادة بمرور الوقت. حتى بعد حضانة ممتدة لعدة أسابيع، لا تزال هناك بعض الخلايا المربوطة، لكن معظم الخلايا في مورفولوجية روناجاتي مدورة (الشكل 2). وكما ذكرت، من هذه الخلايا رانجيت قابلة للحياة وشرع خلال دورة الخلية بهم. تجدر الإشارة إلى أن تشمل المتغيرات التي قد تحتاج إلى تعديل مستويات السكر وتركيز النيتريت. أن قال، من الصياغات ما يزيد على 60 من وسائل الإعلام المختلفة التي تم اختبارها لقدرتها على دعم كل من نورموكسيك وحضانة وصول، والمتوسطة PS-74656 كان قادرة على دعم بقاء والنسخ المتماثل لما يقرب من جميع خطوط الخلية اختبار.
ملاحظة أساسية تم التفريق بين وصول الخلايا، بغض النظر عن الخلية اختبار، إلى اثنين متميزة تعمل، المربوطة ورانجيت (الشكل 2). مشابهة للخلايا نورموكسيك أحادي الطبقة، ألحقت الخلايا المربوطة بالبلاستيك زراعة الأنسجة. ومع ذلك، كان المرفق أضعف وأسهل تريبسينيزي أو إزاحة بالقشط، من المرفق الذي حدث ظروف نورموكسيك. وبالإضافة إلى ذلك، كان مورفولوجية الخلية أصغر مع المزيد من ملحقات المغزل (الجذعية)26. وكانت مورفوتيبي الخلوية الثانية لاحظ الخلايا في تعليق (أي، رانجيت الخلايا). تلقائياً تحويل هذه الخلايا إلى خلية مفردة التعويم الحر تعليق حضور البلاستيكية المعالجة بزراعة الأنسجة، التي تم تقريب حجم خلية أصغر وأقل السيتوبلازم. أنها تختلف عن الخلايا الثقافة تعليق الكلاسيكية، والتي عادة تتطلب تكييف الانزيمية، تنمو في المجاميع، تتطلب الحاويات التعامل مع زراعة الأنسجة، وهي أكبر من نظرائهم نورموكسيك على27. مع مرور الوقت، يمكن ملاحظة الخلية وصول السكان إلى التحول من أحادي الطبقة الغالب المربوطة لأن الخلايا رانجيت في التعليق. كانت هذه الخلايا في تعليق قابلة للاستمرار وتكرار؛ وهكذا، كان الرعاية ممارسة ينبغي إزالة المادة طافية. أيضا، من المذكرة أن المتوسط لا يتطلب تغيير خلال فترة الحضانة اللاهوائية كامل. مؤشر الرقم الهيدروجيني المتوسط تحت حضانة وصول، على النقيض من سيطرتها نورموكسيك، وكان أيضا (أي، ظل أحمر) بدون تغيير. ينبغي أن يرغب المحقق حصاد الخلايا رانجيت، أو تغيير في المتوسط، الخلايا يمكن الحصول عليها باستخدام اللاهوائية مسح الغاز الصغير-الطرد المركزي أنابيب مغلقة محكم داخل قاعة اللاهوائية. للخلية غسل الخلايا المربوطة، يجب إجراء الإجراء أيضا في قاعة للقضاء على أي التعرض للأوكسجين.
وكان بقاء الخلية النهائية لزراعة المدى الطويل، إلى حد كبير، يعتمد على الخلية المستخدمة والتقاء التي كانت الآبار أو قارورة المبذورة في البداية (الشكلان 3 و 4). وقال أن نقطة انطلاق جيدة هو 80%، الذي كان أكبر فرصة للنمو الأمثل. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تحدث خسارة تعتمد على خط خلية من 10% إلى 60% بقاء في الأيام الأولى 2-4. ومع ذلك، أثناء أدائهم لهذه التجربة، تدوير من خلال دورة الخلية الخلايا المتبقية وتكرارها28. يتبين أثر التقاء البذر على طول العمر لزراعة الخلية في الشكلان 3 و 4. خلايا هيلا 229 و فيرو كانت تبذر في لوحات جيدا 24 إلى 40% و 60% 80% من التقاء الأولى (التقاء 100% = 2.8 × 105 خلايا/البئر) وثم المحتضنة في غياب الأكسجين لمدة 17 يوما. خلية 229 هيلا وصول النمو الأمثل في التقاء نثر البذور أولى 80%. وفي المقابل، كان الخلايا فيرو الأمثل البذر التقاء 60%. وهذا يدل على الحاجة إلى تحسين كثافة البذر تعتمد على خط الخلية المستخدمة في البداية.
الشكل 1 : نموذج لإنشاء الدائرة اللاهوائية لثقافة خلايا الثدييات. الحد الأدنى من المواد المطلوبة وتشمل لوحات زراعة الأنسجة، بيبيتس نقل عقيمة، أكياس واقية، شطب المشككين في وسائل الإعلام، وأنبوب لتجاهل وسائل الإعلام أو السوائل الأخرى، وأكياس resealable لنقل اللوحات للمجهر مع الحفاظ على الظروف اللاهوائية.
رقم 2: "هيلا وصول" الخلايا التمايز مورفولوجك. (أ) هذا الفريق يظهر الطوري من عناصر الخلية هيلا نورموكسيك 4 أيام بعد التطعيم، مع تكبير X 20. (ب) هذا الفريق يظهر خلايا هيلا وصول 17 يوما بعد انتهاء التطعيم (مع يتغير من يوم 1 PS-74656 المتوسطة والتقاء 80% المصنف وتكبير X 20). (ج) الفحص المجهري يظهر الفريق هذه القطع الأثرية من قطرات الماء في داخل كيس من البلاستيك مختومة تحتوي على صفيحة وصول 24-جيدا. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: نسبة لوصول إلى نورموكسيك هيلا 229 صالحة خلايا الحضانة بعد 17 يوما- ويبين هذا الفريق تأثير كثافة البذر جدوى 229 هيلا خلية في المتوسط PS 74656 بالمقارنة مع عنصر التحكم نورموكسيك. يتم إظهار النتائج كما يعني ± sem.
4 الرقم: نسبة لوصول إلى نورموكسيك فيرو مجدية خلايا الحضانة بعد 17 يوما- ويبين هذا الفريق تأثير كثافة البذر على بقاء الخلية فيرو في المتوسط PS 74656 بالمقارنة مع عنصر التحكم نورموكسيك. يتم إظهار النتائج كما يعني ± sem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ويمثل هذا الأسلوب خلايا الثدييات في المرة الأولى التي تم مثقف لفترات طويلة من الزمن في حالة عدم وجود الأوكسجين. استناداً إلى الملاحظات الحالية، وصول النمو قدرة عبر مسار غير معفن يظهر أن يكون عالمياً بين خلايا الثدييات خطوط28، حيث أدت إلى نمو اللاهوائية في اختلاف النمط الظاهري. وقد لوحظ لجميع خطوط الخلايا اختبارها. مع زراعة اللاهوائية وزيادة نسب الخلايا أصبح تقريب نمواً سكان مثل تعليق وتمكنت من إجراء نسخ متماثل. نوع الخلية الثانوية ظلت متمسكة بالركيزة؛ ومع ذلك، مورفولوجيا الخلايا عادت إلى شكل مغزل (الجذعية). هذه النتائج تشير إلى خطأ شائع في التحليلات والملاحظات فيما يتعلق بزراعة وصول زراعة الأنسجة. من المقبول عموما عند اعتقال خلايا الثدييات التي نمت تحت ظروف نورموكسيك (5% CO2) وفصل، أنهم يموتون. بل على العكس يبدو أن الصحيح للخلايا التي نمت في غياب الأكسجين، في هذه الحالة، الخلايا التي قد جمعوا ومنفصلة، ببساطة يتدنى خلية شكلياً متباينة.
تحسين ظروف وصول النمو خط الخلية التابعة. PS--74656 المتوسطة عموما يؤيد نمو الخلية جميع خطوط تحت نورموكسيك وظروف وصول النمو، باستثناء جمعية نجمة داود الحمراء-ميغابايت-231، خط خلية سرطان الثدي التي تفضل النمو في الغياب من النترات. ملاحظة مشجع أنه حتى مع يموت قبالة 98% من الخلايا كل بئر، المتبقية يتطابق، أسفر عن عدد سكانها كبير تكييف. الإجراء الحاسم الحفاظ على الثقافات حتى عند ملاحظة بعض الخلايا فقط مباشرة بالفحص المجهري. وبالتالي، يجب توخي الحذر لضمان أن الخلايا المنفصلة ميتة، تريبان الأزرق صبغ الاستبعاد أو بأسلوب الكشف عن صلاحية خلية بديلة. تجدر الإشارة إلى أنه مع انخفاض كبير في إعداد الخلايا، يجب أن المصنف آبار كافية إلى أعدادا كافية خلية الإجمالي للتجارب اللاحقة. الخسائر المتوقعة في خلايا قابلة للحياة هو خط الخلية والبذر التقاء تعتمد؛ وهكذا، يجب أن يتحدد تجريبيا أرقام الخلية المثلى، مع مرور الوقت، ولا يمكن استقراؤها من النتائج التي توصل إليها مع خطوط الخلايا الأخرى. وقال أن هو نقطة انطلاق جيدة التقاء 80%، الذي لديه أكبر فرصة للنمو الأمثل. تجدر الإشارة إلى أن أي التعرض للأوكسجين خلال اللاهوائية الخطوات في هذا الإجراء، بغض النظر عن كيفية موجزة، سوف يعرض للخطر النتائج بسبب الخلوية العفوي عنها منطقياً-1-رد ألفا11،12.
لتنفيذ هذا الإجراء، الخطوة الأكثر أهمية فصل الغاز من المتوسطة، وأنابيب، وجميع الأجهزة والمواد المستخدمة. الأخذ بمستويات منخفضة جداً حتى من الأوكسجين يمكن إيقاف الانتقال من الأيض التخمير إلى التنفس اللاهوائي. بدلاً من ذلك، فإنه يمكن إطالة الأيض معفن حتى أن يسفر أي تجارب قياس نقص أكسجين لا. استخدام هذا الإجراء رواية لقياس سيتوتوكسيسيتي ونشاط العلاج الكيميائي يمكن أن تساعد على تفسير فشل المخدرات في علاج الأورام الصلبة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
يشكر المؤلفون بمكتب بحوث جامعة الغرب الأوسط ورعاية برامج لدعمهم.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Whitney A35 anaerobic chamber | Don Whitley Scientific | Microbiology International | The ability to remove the front of the chamber makes it easy to put instruments inside without concern about getting them through the portals. |
| CO2 incubator | Fisher Scientific | 3531 | |
| Tissue Culture Hood | Labconco | DO55735 | |
| pipet aid | Drummond | 4-000-100 | |
| sterile transfer pipets | Santa Cruz | sc-358867 | |
| 50 cc sterile conical centrifuge tubes | DOT | 451-PG | |
| vaccum jar | Nalgene 111410862889 | BTA-Mall 5311-0250 | |
| DMEM high glucose (4.5 g/L) | CellGro | 10-017-CM | |
| DMEM low glucose (1 g/L) | CellGro | 10-014-CV | |
| FBS | VWR | 1500-500 | |
| HBSS | VWR | 20-021-CV | |
| trypsin | VWR | 25-052-CI | |
| gentamicin | Gibco | 15750-060 | |
| sterile pipets | CellTreat | 229210B, 229205B | |
| Tissue culture flask (T75 or T150) | Santa Cruz | sc-200263, sc-200264 | |
| 24 well tissue culture treated dishes | DOT | 667124 | |
| glad ziplock sandwich bags | Ziploc | Costco | |
| inverted phase microscope (10, 20 40x objectives with camera mont) | Nikon Eclipse | TS100 | |
| trypan blue | Invitrogen | T10282 | |
| hemocytometer | Invitrogen | C10283 | |
| Countess Automated Cell Counter | Life Technologies | AMQAF1000 | |
| Rainin microtiter pipets | Mettler Toledo | Rainin Classic Pipette PR-100 | |
| microtiter tips | Santa Cruz Biotechnology | sc-213233 & sc-201717 | |
| test tube rack (50cc tubes) | The Lab Depot | HS29050A | |
| sodium nitrite | Sigma | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigald/237213?lang=en®ion=US | |
| clear boxes with lids | Rosti Mepal | Rubber maid | |
| paper towels | In House | ||
| cell scraper | CellTreat | 229310 | |
| PBS | In house prepared | ||
| 70% Ethanol | Fisher Scientific | 64-17-5 | |
| microcentrifuge tubes sterile | Santa Cruz | sc-200273 | |
| biohazard bags with holder (desktop) | Heathrow Scientific | HS10320 | |
| Nitrile Gloves | VWR | 89428 | |
| oxygen electrode | eDAQ | EPO354 | |
| pH meter | Jenway | 3510 | |
| pH paper/ pHydrion | Sigma Aldich | Z111813 |
References
- Cummins, J., Tangney, M. Bacteria and tumours: causative agents or opportunistic inhabitants? Infectious Agents and Cancer. 8 (1), 11 (2013).
- Liao, J., et al. Enhanced efficiency of generating induced pluripotent stem (iPS) cells from human somatic cells by a combination of six transcription factors. Cell Research. 18 (5), 600-603 (2008).
- Park, I. H., Lerou, P. H., Zhao, R., Huo, H., Daley, G. Q. Generation of human-induced pluripotent stem cells. Nature Protocols. 3 (7), 1180-1186 (2008).
- Semenza, G. L. HIF-1: mediator of physiological and pathophysiological responses to hypoxia. Journal of Applied Physiology. 88 (4), 1474-1480 (2000).
- Biedermann, L., Rogler, G. The intestinal microbiota: its role in health and disease. European Journal of Pediatrics. 174 (2), 151-167 (2015).
- Cui, X. Y., et al. Hypoxia influences stem cell-like properties in multidrug resistant K562 leukemic cells. Blood Cells, Molecules, and Diseases. 51 (3), 177-184 (2013).
- Richter, A., Sanford, K. K., Evans, V. J. Influence of Oxygen and Culture Media on Plating Efficiency of Some Mammalian Tissue Cells. JNCI: Journal of the National Cancer Institute. 49 (6), 1705-1712 (1972).
- Packer, L., Fuehr, K. Low oxygen concentration extends the lifespan of cultured human diploid cells. Nature. 267, 423 (1977).
- Warburg, O. On the origin of cancer. Science. 123 (3191), 309-314 (1956).
- Döme, B., Hendrix, M. J. C., Paku, S., Tóvári, J., Tímár, J. Alternative Vascularization Mechanisms in Cancer. The American Journal of Pathology. 170 (1), 1-15 (2007).
- Jewell, U. R., et al. Induction of HIF-1α in response to hypoxia is instantaneous. The FASEB Journal. 15 (7), 1312-1314 (2001).
- Lee, J. W., Bae, S. H., Jeong, J. W., Kim, S. H., Kim, K. W. Hypoxia-inducible factor (HIF-1)alpha: its protein stability and biological functions. Experimental & Molecular Medicine. 36 (1), 1-12 (2004).
- Pagoulatos, D., Pharmakakis, N., Lakoumentas, J., Assimakopoulou, M. Etaypoxia-inducible factor-1alpha, von Hippel-Lindau protein, and heat shock protein expression in ophthalmic pterygium and normal conjunctiva. Molecular Vision. 20, 441-457 (2014).
- Park, T. J., et al. Fructose-driven glycolysis supports anoxia resistance in the naked mole-rat. Science. 356 (6335), 307 (2017).
- Johnston, I. A., Bernard, L. M. Utilization of the Ethanol Pathway in Carp Following Exposure to Anoxia. Journal of Experimental Biology. 104 (1), 73 (1983).
- Takahashi, E., Sato, M. Anaerobic respiration sustains mitochondrial membrane potential in a prolyl hydroxylase pathway-activated cancer cell line in a hypoxic microenvironment. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 306 (4), C334-C342 (2014).
- Mandziuk, S., et al. Effect of hypoxia on toxicity induced by anticancer agents in cardiomyocyte culture. Medycyna Weterynaryjna. 70 (5), 287-291 (2014).
- Arai, H., Kodama, T., Igarashi, Y. The role of the nirQOP genes in energy conservation during anaerobic growth of Pseudomonas aeruginosa. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 62 (10), 1995-1999 (1998).
- Müller, M., et al. Biochemistry and Evolution of Anaerobic Energy Metabolism in Eukaryotes. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 76 (2), 444-495 (2012).
- Gupta, K. J., Igamberdiev, A. U. The anoxic plant mitochondrion as a nitrite: NO reductase. Mitochondrion. 11 (4), 537-543 (2011).
- Gupta, K. J., Igamberdiev, A. U. Reactive Nitrogen Species in Mitochondria and Their Implications in Plant Energy Status and Hypoxic Stress Tolerance. Frontiers in Plant Science. 7 (369), (2016).
- Kozlov, A. V., Staniek, K., Nohl, H. Nitrite reductase activity is a novel function of mammalian mitochondria. FEBS letters. 454 (1-2), 127-130 (1999).
- Nohl, H., Staniek, K., Kozlov, A. V. The existence and significance of a mitochondrial nitrite reductase. Redox Report. 10 (6), 281-286 (2005).
- Lawson, J. C., Blatch, G. L., Edkins, A. L. Cancer stem cells in breast cancer and metastasis. Breast Cancer Research and Treatment. 118 (2), 241-254 (2009).
- Plotkin, B. J., et al. A method for the long-term cultivation of mammalian cells in the absence of oxygen: Characterization of cell replication, hypoxia-inducible factor expression and reactive oxygen species production. Tissue and Cell. 50 (Supplement C), 59-68 (2018).
- Sarmento, B., et al. Cell-based in vitro models for predicting drug permeability. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 8 (5), 607-621 (2012).
- Collins, S. J., Gallo, R. C., Gallagher, R. E. Continuous growth and differentiation of human myeloid leukaemic cells in suspension culture. Nature. 270 (5635), 347-349 (1977).
- Plotkin, B. J., et al. A method for the long-term cultivation of mammalian cells in the absence of oxygen: Characterization of cell replication, hypoxia-inducible factor expression and reactive oxygen species production. Tissue and Cell. 50, 59-68 (2018).
