Summary
在成年斑马鱼器官中发展有条件基因剔除或有效基因击倒仍是一项重大挑战。在这里, 我们报告了在成年斑马鱼心脏执行纳米粒子介导的 siRNA 基因沉默的协议, 从而为研究斑马鱼和其他模型生物体中的成年器官提供了一种新的功能损失方法。
Abstract
哺乳动物在心肌梗死后再生心脏的能力非常有限。另一方面, 成年斑马鱼在先端切除或 cryoinjury 后再生心脏, 使其成为心脏再生研究的重要模型机体。然而, 缺乏功能丧失的成人器官的方法, 限制了对心脏再生机制的洞察力。RNA 干扰通过不同的运载系统是一个强有力的工具为沉默基因在哺乳动物细胞和模型有机体。我们以前曾报道, siRNA 纳米粒子成功地进入细胞, 并导致在再生的成年斑马鱼心脏显着基因特定的击倒。在这里, 我们提出了一个简单, 快速, 有效的协议大分子介导的 siRNA 交付和基因沉默的再生成年斑马鱼心脏。该方法为确定斑马鱼成年器官中的基因功能提供了一种替代方法, 可推广到其他模型生物中。
Introduction
心肌梗死已成为严重的健康威胁, 导致1世界各地的巨大经济负担。成年哺乳动物心脏在损伤后无法再生和补充失去的心肌细胞, 导致瘢痕组织的形成和随后的心力衰竭。与哺乳动物不同的是, 斑马鱼能够心脏再生, 主要是通过各种类型的心脏损伤后的强健心肌增生, 使其成为研究心脏再生分子机制的理想模型有机体。2,3,4,5,6,7,8。破译斑马鱼心脏再生的内源机制是一个令人兴奋的研究领域, 寻找新的治疗策略, 以改善人类心脏再生9。
在斑马鱼身上有遗传操作方法。这些包括 morpholinos (MO), 也广泛用于青蛙, 小鸡和哺乳动物除斑马鱼10,11,12,13。MO 在成年斑马鱼鳍, 脑, 视网膜14,15,16,17,18,19, 有效地击倒靶基因表达。锁定核酸 (低噪声放大器) 是另一种用于除斑马鱼胚胎中的内源基因表达的人工寡核苷酸, 在成年动物器官中也有20,21,22,23,24. 然而, 对于成年人心脏缺乏有效的功能丧失方法, 仍然是研究器官再生分子机制的一个障碍。目前, 小分子抑制剂或显性阴性突变体的转基因表达主要用于阻断某一基因或通路的功能, 以研究其在斑马鱼心脏再生25、26 中的作用. ,27。然而, 并非所有的基因或信号通路都适用于这些方法。
小干扰 rna (siRNAs) 广泛应用于哺乳动物细胞和模型生物体胚胎的功能损失分析, 以及动物模型28、29、30的临床前研究的成人器官。,31,32. siRNAs 已有效地用于沉默的肿瘤33,34,35和心肌细胞36,37,38,39 的基因 ,40 通过不同的交付系统。最近, 我们开发了有效的 siRNA 封装纳米颗粒基因沉默的再生成人心脏使用几种不同的纳米粒子41,42,43, 提供了一个新的工具成年斑马鱼器官基因的功能研究。根据我们以前的研究41,42,43, 这里我们提出了一个简单的, 实用的, 但强大的协议 siRNA 基因沉默在再生成年斑马鱼心脏使用 f-PAMAM-PEG-R9大分子.Aldh1a2(醛脱氢酶1家族, 成员 A2) 基因上调后, 斑马鱼的先端切除和消融Aldh1a2阻断心脏再生44。以aldh1a2基因为例, 对纳米粒子包覆 siRNA 注射液介导的基因击倒效率进行了测试。本协议包含了斑马鱼心脏切除、纳米微粒的化学合成和 siRNA 包裹纳米微粒向成年斑马鱼心脏的传递方法。
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Protocol
所有动物程序都使用了由北京大学机构动物护理和使用委员会批准的斑马鱼议定书, 该协议由实验室动物护理评估和认可协会完全认可。
1. Tricaine 溶液的制备
- 要准备 tricaine 的溶液, 添加400毫克 3-氨基苯甲酸甲基磺酸粉到97.9 毫升蒸馏水, 然后加入2.1 毫升的1米 (ph 9.5) 调整 ph 值 ~ 7。将库存解决方案存储在摄氏4摄氏度。
- 为准备 tricaine 工作解决方案, 添加4.2 毫升 tricaine 库存解决方案, 100 毫升水族系统水。
2. 成年斑马鱼心室切除术
- 为手术准备器械和材料, 包括一块海绵, 培养皿中充满 tricaine 工作溶液, 塑料吸管, 显微镜, 两个锋利的镊子, 虹膜剪刀和肘钳 (图 1)。
- 在海绵中准备一个直径为4厘米 x 0.5 厘米和0.5 厘米的小凹槽, 在心室切除手术中保存斑马鱼。
- 用60毫克/升海水盐在弶镀 ' p2O 为受伤的鱼回收, 在3升斑马鱼罐内加装半罐斑马鱼系统水。
- 麻醉鱼在一个10厘米培养皿与 tricaine 溶液, 直到鳃运动减少到每秒, 并保持鱼至少三十年代, 以确保它完全麻醉。
- 将麻醉鱼与肘部镊子转移到湿海绵腹侧的凹槽上。视觉定位跳动的心脏的边缘, 然后找到显微镜下的心脏。
- 使用虹膜剪刀做一个小切口约1毫米, 穿透皮肤和肌肉, 并仔细撕裂的银色上皮层的心包囊与镊子提示进入心脏。不要把镊子插入太深的腔内以避免心脏损伤。
注意: 在这一点上, 请记住避免大量出血。排除鱼的实验, 如果广泛出血发生, 因为过量出血主要是由于意外伤害心脏, 因此将导致误导的结果。 - 使用非显性的手或施加温和的腹部压力, 用锋利的镊子轻轻地握住它的顶端以暴露心室。然后, 用虹膜剪刀把20% 的心室放在顶端。
注: 此时不应发生广泛出血。 - 用湿纸巾覆盖切口, 因为伤口在凝固前 15–45, 然后用系统水把鱼放回水箱里。
注意: 没有必要缝合切口。 - 确保鱼在1分钟内恢复鳃运动, 然后继续游泳。如果鱼在五十年代以后不显示鳃运动在水中, 促进它通过喷水入鳃使用塑料吸管, 直到鱼恢复活跃透气。
- 在心室切除后的回收系统中保持鱼。
注意: 与普通鱼相比, 没有必要特别关心。成年斑马鱼心室切除术的死亡率约为5–10%。几乎所有的死亡发生在手术后24小时内。
3. siRNA 纳米粒子的制备
- 合成了 f-PAM4-PEG-R9 大分子。
注: 对 f-PAM4-PEG-R9 大分子材料的合成进行了前述37的一些修改。α、ω-dipyridyl disulfido 聚乙二醇 () 的长度降低为分子量的 1000, 以最大程度地封装 siRNAs (图 2B)。 - 干10毫克的半胱胺核心 G4.0 polyamidoamine (称为 PAMAM) 使用真空干燥器在45摄氏度1小时, 然后溶解 PAMAM 在2毫升 Dulbecco 的磷酸盐缓冲盐水 (DPBS, 平衡盐溶液用于各种细胞培养应用)。
- 将1.7 毫克的三 (2-羧乙基) 膦 (TCEP) 溶于1毫升 DPBS, 与3.2 制备的 PAMAM 溶液混合, 在室温下以温和搅拌为 8 h。
注: TCEP 的摩尔比超过 PAMAM 的二硫化物键的十倍。 - 通过超滤去除过量 TCEP。添加 DPBS 到上述 PAMAM-TCEP 混合物达到10毫升的体积和解决方案转移到 3 kDa 截留分子量 (分子量切断) 超滤管。离心后以3000克为15分钟, 在收集管中丢弃溶液。将 DPBS 添加到10毫升的过滤器中, 并轻轻地将样品多次吸出并再次离心。重复此步骤4次。最后一次过滤后, 从过滤器中抽取样品。
注: 此步骤的产品减少 PAMAM (称为 f-PAM4)。 - 在1毫升 DPBS 中溶解14毫克的 PEG, 并与 f-PAM4 溶液混合, 在室温下保持3小时的温和搅拌。然后用3.4 中描述的超滤步骤去除过量的脱钉。最后一次过滤后, 从过滤器中抽取样品。
注: 该产品被命名为 f-PAM4-PEG-Py。f-PAM4 中的硫醇组的摩尔比值为10倍。 - 将6.4 毫克半胱氨酸终止 R9 肽 (Ac-CRRRRRRRRR-NH2) 溶于1毫升 DPBS, 与 f-PAM4-PEG-Py 混合, 在室温下轻轻搅拌8小时。净化最后的产品, 称为 f-PAM4-PEG-R9, 由超滤步骤, 如3.4 所述, 除了 DPBS 被改为去离子水。使用冷冻真空干燥机 Lyophilize 产品。
注: 冻干前3.5 和3.6 的产品储存在-20 ℃至少1月。在 f-PAM4-PEG-R9 冻干后, 样品储存在-20 ℃, 至少2月。 - 为了确定 PEG 和肽的改性程度, 将5毫克的 f-PAM4-PEG-Py 在 D2O (氘氧化物) 中溶解, 并将其转移到 NMR (核磁共振) 样品管中。在 400 MHz 进行1的 h-核磁共振谱分析, 并用核磁共振数据分析软件37分析数据。
注: 具体而言, 多肽中的代表性 PAMAM 峰 (-NCH2CH2CO)、PEG 峰 (-OCH2CH2) 和精氨酸残留峰 (-HCCH2CH2CH2NH), 应分别在2.4–2.6、3.7–3.8 和 1.6–1.8 ppm 范围内。通过计算 peg 和 R9 峰到 PAMAM 峰的积分, 确定 R9 相对于 PAMAM 的改性程度。PEG 的改性程度为 100%, R9 改性至少为50%。在该机构的核心设施中进行了1的 H 核磁共振谱分析。 - 将4-PEG-R9 大分子粉在 PBS 中溶解至4毫克/毫升, 并使整除数溶液一次性使用。
注: 大分子溶液可储存在-20 摄氏度, 至少一个月, 不重复冻结和解冻。 - 将 siRNAs 中的菁染料 (称为 Cy5-siRNA)、Aldh1a2 siRNA 或炒阴控制 siRNA 在蒸馏水中溶解至10µM。
注: 使用菁染料标记的 siRNAs, 以评估纳米颗粒封装的 siRNA 是否可以进入鱼心 (图 2A B)。该协议以aldh1a2为例, 确定 f-PAM4-PEG-R9 大分子封装 siRNA 的传递效率。siRNAs 的序列为: Cy5-siRNA 反义链: 5′-ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT 3′, siAldh1a2 反义链: 5 '-UUCAGGACAACCGUGUUCCdTdT-3 ' 和炒负控制 siRNA 反义链: 5 '-ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT-3 '。 - 为制备 siRNA 封装的纳米微粒溶液, 将 siRNA 与大分子溶液的等量量混合, 并在室温下孵化样品20分钟. 在使用前新鲜地准备 siRNA 纳米微粒溶液。
注: siRNA 纳米粒子溶液的体积取决于要注射的鱼的数量。例如, 准备至少120µL 大分子溶液 (混合60µL siRNA 溶液和60µL 大分子溶液), 用于注射10条鱼 (每条鱼的10µL), 计算出溶液的损失。
4. 将 siRNA 纳米微粒注射入成年斑马鱼心脏
- 如上所述, 准备一块海绵与槽, 一个10厘米培养皿填充 tricaine 溶液, 一个塑料吸管, 显微镜, 肘部镊子, 和胰岛素注射器 (图 1), 以及一个鱼缸与系统水的住房鱼注射后。
- 允许受伤的斑马鱼2.1–2.10 在心室切除术后1天恢复, 然后麻醉 1 dpa (在截肢后的几天内) 鱼, 如2.4 所述, tricaine 溶液中。
- 用肘钳将麻醉鱼、腹侧向上转移到湿润海绵中的沟槽。在显微镜下找到跳动的心脏。
- 将 siRNA 封装的纳米微粒溶液加载10µL 胰岛素注射器。尽量避免气泡。
- 用肘钳轻轻地将鱼固定在不占主导地位的手上。不要把鱼夹得太紧。
注: 请记住, 注射过程中不应发生广泛出血。 - 将填充的胰岛素注射器放在µL, 用另一只手将10的溶液注入胸腔 (补充图 1)。
注: 溶液有时在注射过程中流出, 但这并不影响 siRNA 效应。siRNA 纳米微粒溶液可以每天注射一次, 为期数天到一个月, 这取决于具体的实验计划。每次给鱼注射一种 siRNA。如果有两种以上的 siRNA 需要注入一条鱼, 每次注射一种 siRNA, 然后再注入另一种类型的 siRNA 1 小时。在本议定书中, 每条鱼只注射一种 siRNA 类型。 - 用系统水把鱼转移到水箱里。
注: 该鱼有望在1分钟内重新启动通风, 然后恢复游泳。注射 siRNA 纳米颗粒或 siRNA 通常不会导致成年斑马鱼死亡。
5. 心脏的收集、固定和 siRNA 分娩效率的评价
- 在离心管中为每个组准备1毫升的4% 多聚甲醛溶液。
- 麻醉在 tricaine 溶液中的鱼在注射后选定的日子。将鱼仰在潮湿的海绵中放入凹槽中。在胸腔内做一个大切口, 用镊子广泛开放。抓住流出道, 用镊子小心翼翼地拔出整个心脏。
- 用 PBS 冲洗心脏, 用餐巾快速取出多余的液体。将10颗心放入1.5 毫升的离心管中, 1 毫升多聚甲醛。轻轻地将管子反转几次, 并保持隔夜在4摄氏度。
- 使用体内成像系统测量 Cy5-siRNAs-injected 心脏的荧光强度 (补充图 2)。在这项研究中, 每组使用3–4斑马鱼的心脏。
- 安装固定的心脏, 无论是石蜡或 OCT 化合物 (嵌入培养基为冷冻组织标本, 以确保最佳切削温度)。
6. 纳米粒子介导的 siRNA 基因沉默的评价
- 准备一个隔热容器和长镊子。将液氮倒入容器容积的第三位。
- 麻醉鱼在 tricaine 解决方案在 2 dpa。解剖心脏如5.2 所述, 然后去除流出道和心房。
注: 鱼可以在一天内从手术中恢复, 然后注入 1 dpa, 其中任一 siRNA 封装纳米微粒 (siNC) 为阴性对照或 aldh1a2 siRNA 封装纳米粒子 (siAldh1a2)。 - 使用镊子将心室转成1.5 毫升的离心管, 盖上管盖, 并立即将管子放入带有液氮的绝缘容器中。让管子在液氮上漂浮几分钟. 使用长镊子从容器中取出管子。
- 重复步骤6.2 和 6.3, 直到所有心室被收集。每组使用6–10心。
- 用 rna 分离试剂提取心脏总 rna。用引物 Gapdh F: GATACACGGAGCACCAGGTT 对各基因的表达水平进行定量 rt-pcr 评价;Gapdh R: GCCATCAGGTCACATACACG;Aldh1a2 F: TGAGCGAGGAGCAGCAGAGA;Aldh1a2 R: TCCACGAAGAAGCCTTTAGTAGCA。
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Representative Results
为了确定大分子介导的 siRNA 分娩的效率, 我们切除了斑马鱼心脏心室的顶端, 然后注射了约10µL 的大分子 (模拟组), Cy5-siRNA 只 (裸组), 或 f-PAMAM-PEG-R9 大分子封装Cy5-siRNA (Cy5-siRNA 组) intrapleurally 分别 (图 2A B)。荧光信号是可检测的心脏注射大分子封装 Cy5-siRNA 在 3, 24 和 48 hpi (小时后注射), 而它是很难检测到心脏从模拟和裸组在 48 hpi (图 2C D),建议 f-PAMAM-PEG-R9 大分子有效地促进 siRNAs 向成年斑马鱼心脏的输送, 并稳定至少两天。
为了研究大分子封装 siRNA 对基因沉默的影响, 我们选择aldh1a2 (维甲酸合成酶) 作为靶基因, 据报道在心室切除术后心脏再生需要44.如图 3所示, 鱼被允许在心室切除后一天恢复, 然后用大分子封装的 siRNA 杏仁。我们发现, 与大分子封装的大分子 (siRNA) 在 2 dpa (图 3B) 相比, aldh1a2 mRNA 表达水平下降的心脏与 f-PAMAM-PEG-R9 包覆的 siNC 被包裹的 siAldh1a2;表明 f-PAMAM-PEG-R9 大分子介导的 siRNAs 实现了成年斑马鱼心脏的基因特异沉默。
图 1:心脏手术和胸腔注射器械。在成年斑马鱼心脏的心室切除仪器的照片: 海绵与槽, 肘部镊子, 锋利的钳, 虹膜剪刀, 长镊子, 和胰岛素注射器用于大分子封装 siRNA 交付。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2:有效 f-PAMAM-PEG-R9 大分子协助向受伤的成年斑马鱼心脏运送 siRNA.(A) 调查在成年斑马鱼心脏切除术后的 Cy5-siRNA 吸收效率的方案 (dpa: 截肢后天数; hpi: 注射后小时)。(B) 合成 f-PAMAM-PEG-R9 大分子和制备大分子封装的 Cy5-siRNA。(C) Cy5 荧光成像的心脏仅注射大分子 (模拟), Cy5-siRNA 只有没有大分子封装 (裸), 和大分子封装荧光标记 Cy5-siRNA (Cy5-siRNA)在体内成像检测系统, 表明在 48 hpi 的模拟和裸组中, 荧光信号几乎无法检测到, 而强信号则保留在大分子封装的 Cy5-siRNA 组中, 从3到 48 hpi。荧光信号的任意尺度显示从微弱 (蓝色) 到强 (红色)。(D) 在体内成像系统评估的心脏 Cy5-siRNA 荧光信号的量化, 如面板 C (* p < 0.05, ** p < 0.001; 数据是平均的 s.e.m.; 方差分析 Bonferroni 多元比较测试n = 3-4 心脏)。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 有效 siRNA 沉默的aldh1a2在受伤的成年斑马鱼心脏.(A) 调查aldh1a2 siRNA 基因沉默效应的计划。(B) qPCR 显示, 与纳米颗粒封装的 siAldh1a2 心脏 (siNC) 相比, aldh1a2 mRNA 在纳米粒子封装的心内下降。aldh1a2 mRNA 表达水平由 GAPDH (** P < 0.001) 规范化; 数据是平均的 s.e.m. 与配对学生的 t 测试)。请单击此处查看此图的较大版本.
补充图 1: 胸腔注射图像。(A) 成年鱼的胸腔在截肢后1天。(B) 将纳米微粒封装的 siRNA 注射到胸腔内。刻度条: 1 毫米.请点击这里查看这个数字的大版本.
补充图 2: 纳米微粒封装 Cy5-siRNA 在未受伤的成年斑马鱼心脏的吸收效率。(A) Cy5 荧光成像的心脏注射大分子 (模拟), 裸 Cy5-siRNA 无大分子封装 (裸), 大分子封装 Cy5-siRNA在体内成像系统。荧光信号的任意尺度是从弱 (蓝) 到强 (红色)。(B) 用体内成像系统测量的心脏中的 Cy5-siRNA 荧光信号的量化 (NC: 没有显著的不同; 数据是平均的, s.e.m.; 方差分析 Bonferroni 多比较试验;n = 3-4 心脏)。请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
斑马鱼完全有能力再生各种器官, 包括成人心脏5。尽管转基因和遗传方法在研究斑马鱼胚胎中的基因功能方面发展良好, 研究者仍面临着在斑马鱼45,46中产生条件突变基因的艰巨任务。因此, 转基因显性阴性突变体或小分子抑制剂经常被用来处理成年斑马鱼器官的基因功能25,27,42。在过去的几年中, 我们已经开发了一种替代方法, 在成年斑马鱼心脏的基因丧失功能分析使用纳米粒子介导的 siRNA 交付和基因沉默41,42, 43. 在这里, 本文提出了一种使用大分子介导的 siRNA 基因沉默的详细协议, 尤其是斑马鱼的心脏, 可能还有其他的斑马杆菌器官。
siRNA 分子由于其负电荷而不能进入细胞, 容易被核酸酶降解。随着单分散分子, 可调谐结构和性能, 大分子被认为是有希望的 siRNA 载体47。PAMAM 大分子有丰富的阳离子周边和缓冲胺, 可以在生理条件下调节 siRNA 的封装, 并诱导 "质子海绵" 作用, 以释放 siRNA 内涵体在细胞质中分别48,49,50. 在本文中, 对 PAMAM 进行了修改, 以提高稳定性和交付效率。f-PAMAM-PEG-R9 系统提供一个半球 PAMAM 大分子头与 siRNA 封装的正电荷, 以防止核酸酶降解。采用 PEG 和 R9 跨膜肽, 提高纳米粒子的亲水性, 促进细胞的吸收。
纳米粒子的质量和类型对斑马鱼心脏的有效 siRNA 和基因沉默至关重要。我们已经成功地研究了三结构多样的纳米粒子, 为此目的: 聚乳酸, f-PAMAM-PEG-R9, 和裴--41,42,43纳米粒子。尽管它们不是商业化生产的, 但常规有机化学实验室可以很容易地合成和纯化纳米粒子, 如前35、37、43所述。在这里, 我们选择了 f-PAMAM-PEG-R9 大分子作为一个例子, 以显示简单, 有效, 大分子介导的 siRNA 分娩和基因沉默的成年斑马鱼心脏切除后, 因为它是相对容易准备 siRNA 加载大分子-配合物, 如通过在室温下孵化混合物20分钟。另一方面, 如果使用 siRNA-nanocomplexes43, 则必须对 pH 值进行调整。同样, 如果使用35、41的聚乳酸纳米粒子, 乳化和纯化程序对于获得均匀的纳米颗粒封装的 siRNA 溶液是必不可少的。
另一个关键步骤是尽量减少或没有出血, 在注射大分子封装的 siRNA, 如4.5 所述, 因为广泛的出血中断心脏再生和其他生物系统。因此, 如果在注射过程中发生出血, 我们建议排除实验组中的鱼。一般来说, 这种简单的注射程序是很容易掌握后几次试验。
这种方法的主要局限性在于 siRNA 技术本身, 如潜在的靶向效应和不完全删除感兴趣的基因。否则, 我们的工作和其他41种基因的基因沉默的高度可重复性的生物复制已经被证明。重要的是, 这个协议是快速, 简单, 有效的, 注射治疗是良好的耐受性的成年斑马鱼。siRNA 基因沉默效率的实验分析可以包括通过原位杂交或定量 rt-pcr 评估 mRNA 表达水平, 或利用西方印迹、免疫组化染色或其他功能分析。同时, 我们完全赞同纳米微粒促进 siRNA 的提供, 作为在成年斑马鱼心脏的功能损失研究的替代工具, 这种方法也可以扩展到成年斑马鱼和其他模式有机体的其他器官。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者感谢 IC 布鲁斯博士的批评性评论和阅读手稿。这项工作得到了中国国家自然科学基金 (31430059、31701272、31730061、81470399和 31521062)、亚洲经济和新兴市场创新医学和早期发展的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| tricaine | Sigma | E10521 | Store at 4 °C |
| stereomicroscope | Leica | S8AP0 | |
| sharp forcep | WPI | 14098 | |
| iridectomy scissors | WPI | 501778 | |
| elbow tweezers | Suzhou Liuliu | SE05Cr | |
| α,ω-dipyridyl disulfido polyethylene glycol(Py-PEG-Py) | Biomatrik (Jiaxing) Inc. | 5239 | |
| core of G4.0 polyamidoamine (PAMAM) | Andrews ChemServices | AuCS-297 | |
| vacuum drying equipment | Yiheng | DZF-6020 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 14190144 | |
| tris(2-carboxyethyl)phosphine(TCEP) | Alfar Aesar | 51805-45-9 | Causes severe skin burns and eye damage. Causes serious eye damage. |
| ultrafiltration tube | Millipore | UFC900308 | |
| freeze dryer | Martin Christ | Alpha 2-4 Ldplus | |
| NMR spectrometer | Bruker | AV400 | |
| Deuterium oxide(D2O) | J&K | 174611 | |
| NMR sample tube | J&K | WG-1000-7-50 | |
| 3 kDa MWCO ultrafiltration tube | Merck | UFC900308 | |
| sea salts | Instant Ocean® | SS15-10 |
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