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Developmental Biology

वयस्क Zebrafish दिल में Nanoparticle-मध्यस्थता सिरना जीन-मुंह बंद करने

Published: July 29, 2018 doi: 10.3791/58054
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 2, 1
1Beijing Key Laboratory of Cardiometabolic Molecular Medicine, State Key Laboratory of Natural and Biomimetic Drugs, Institute of Molecular Medicine, Peking University, 2Department of Biomedical Engineering, College of Engineering, Peking University

Summary

वयस्क zebrafish अंगों में सशर्त जीन-नॉकआउट या प्रभावी जीन-पछाड़ना विकसित करना एक प्रमुख चुनौती बनी हुई है. यहाँ हम वयस्क zebrafish दिल में nanoparticle मध्यस्थता सिरना जीन-मुंह बंद करने प्रदर्शन के लिए एक प्रोटोकॉल की रिपोर्ट, इस प्रकार zebrafish और अन्य मॉडल जीवों में वयस्क अंगों के अध्ययन के लिए एक नया नुकसान की समारोह विधि प्रदान करते हैं.

Abstract

स्तनधारी हृदय को रोधगलन के बाद पुनर्जीवित करने की बहुत सीमित क्षमता होती है । दूसरी ओर, वयस्क zebrafish शीर्ष लकीर या cryoinjury के बाद अपने दिल पुनर्जीवित, यह दिल पुनर्जनन अध्ययन के लिए एक महत्वपूर्ण मॉडल जीव बना । हालांकि, वयस्क अंगों के लिए हानि के समारोह तरीकों की कमी के कारण हृदय पुनर्जनन तंत्र में अंतर्दृष्टि सीमित है । विभिन्न वितरण प्रणालियों के माध्यम से आरएनए हस्तक्षेप स्तनधारी कोशिकाओं और मॉडल जीवों में मुंह बंद करने जीन के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है । हमने पहले बताया है कि सिरना-encapsulated नैनोकणों सफलतापूर्वक regenerating वयस्क zebrafish दिल में एक उल्लेखनीय जीन विशिष्ट पछाड़ना में कोशिकाओं और परिणाम दर्ज करें । यहां, हम dendrimer के लिए एक सरल, तेजी से, और कुशल प्रोटोकॉल प्रस्तुत वयस्क zebrafish दिल में मध्यस्थता सिरना वितरण और जीन मुंह बंद करने । इस विधि zebrafish में वयस्क अंगों में जीन कार्यों का निर्धारण करने के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण प्रदान करता है और अंय मॉडल जीवों के लिए भी बढ़ाया जा सकता है ।

Introduction

रोधगलन एक प्रमुख स्वास्थ्य खतरा बन गया है, दुनिया भर में एक जबरदस्त आर्थिक बोझ के लिए अग्रणी1। वयस्क स्तनधारी दिल को पुनर्जीवित करने और चोट के बाद एक macroscopic पैमाने पर खो cardiomyocytes की भरपाई करने में विफल रहता है, निशान ऊतकों और बाद में दिल की विफलता के गठन के लिए अग्रणी । स्तनधारियों के विपरीत, zebrafish दिल पुनर्जनन के लिए सक्षम है, मुख्य रूप से मजबूत रोधगलन के माध्यम से दिल की चोट के विभिन्न प्रकार के बाद, यह हृदय उत्थान के आणविक तंत्र की जांच के लिए एक आदर्श मॉडल जीव बना रही है 2,3,4,5,6,7,8. अंतर्जात zebrafish हृदय पुनर्जनन अंतर्निहित तंत्र को समझने के उपंयास चिकित्सीय रणनीतियों के लिए खोज में अनुसंधान के एक रोमांचक क्षेत्र के लिए मानव हृदय9उत्थान में सुधार है ।

आनुवंशिक हेरफेर तरीकों zebrafish में उपलब्ध हैं । ये morpholinos (मो) कि भी व्यापक रूप से मेंढक, चूजा, और zebrafish में10,11,12,13के अलावा स्तनधारियों में इस्तेमाल किया जाता है से मिलकर बनता है । मो वयस्क zebrafish फिन, मस्तिष्क, और रेटिना14,15,16,17,18,19में लक्ष्य जीन अभिव्यक्ति की कुशल पछाड़ना है । बंद-न्यूक्लिक एसिड (LNA) एक और कृत्रिम oligonucleotide न केवल zebrafish भ्रूण में अंतर्जात जीन अभिव्यक्ति नीचे दस्तक करने के लिए इस्तेमाल किया है, लेकिन यह भी वयस्क पशु अंगों में20,21,22, 23 , 24. हालांकि, ' वयस्कों के दिलों के लिए प्रभावी हानि के समारोह तरीकों की कमी अंग पुनर्जनन के आणविक तंत्र का अध्ययन करने में एक बाधा बनी हुई है । वर्तमान में, छोटे अणु अवरोधकों या प्रमुख नकारात्मक म्यूटेंट के ट्रांसजेनिक अभिव्यक्ति मुख्य रूप से एक निश्चित जीन या मार्ग के समारोह को ब्लॉक करने के लिए उपयोग किया जाता है वयस्क zebrafish दिल पुनर्जनन25,26 में अपने समारोह का अध्ययन ,27. हालांकि, नहीं सभी जीन या संकेत रास्ते इन तरीकों के लिए लागू होते हैं ।

छोटे हस्तक्षेप RNAs (siRNAs) व्यापक रूप से स्तनधारी कोशिकाओं और मॉडल जीवों के भ्रूण में हानि-समारोह विश्लेषण के लिए उपयोग किया जाता है, साथ ही पशु मॉडल में नैदानिक अध्ययन के लिए वयस्क अंगों28,29,30 , 31 , ३२. siRNAs प्रभावीढंग से ट्यूमर३३,३४,३५ और cardiomyocytes३६,३७,३८,३९ में जीन मौन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है ,४० विभिंन वितरण प्रणालियों के माध्यम से । हाल ही में, हम कुशल सिरना-encapsulated nanoparticle जीन मुंह बंद करने-regenerating वयस्क दिल में कई अलग नैनोकणों४१,४२,४३का उपयोग कर विकसित, के लिए एक उपंयास उपकरण प्रदान वयस्क zebrafish अंगों में जीन के कार्यात्मक अध्ययन । हमारे पिछले अध्ययन४१,४२,४३के आधार पर, यहां हम सिरना जीन के लिए एक सरल, व्यावहारिक, अभी तक शक्तिशाली प्रोटोकॉल वर्तमान-मुंह बंद करने वयस्क zebrafish दिल में एफ पमम-खूंटी-R9 का उपयोग कर dendrimers । Aldh1a2 (एल्डिहाइड डिहाइड्रोजनेज 1 परिवार, सदस्य A2) जीन zebrafish एपेक्स लकीर और Aldh1a2 के पृथक के बाद अनियमित था हृदय पुनर्जनन४४अवरुद्ध । यहां हम एक उदाहरण के रूप में जीन पछाड़ना दक्षता nanoparticle-encapsulated सिरना इंजेक्शन द्वारा मध्यस्थता परीक्षण के रूप में aldh1a2 जीन ले । इस प्रोटोकॉल zebrafish दिल लकीर, नैनोकणों के रासायनिक संश्लेषण के लिए एक प्रक्रिया है, और सिरना पर एक प्रसव विधि-encapsulated नैनोकणों वयस्क zebrafish दिल में शामिल हैं ।

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Protocol

सभी पशु प्रक्रियाओं एक zebrafish संस्थागत पशु देखभाल और पेकिंग विश्वविद्यालय है, जो पूरी तरह से मूल्यांकन और प्रयोगशाला पशु देखभाल के प्रत्यायन के लिए संघ द्वारा मांयता प्राप्त है पर उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया ।

1. Tricaine समाधान की तैयारी

  1. tricaine स्टॉक समाधान तैयार करने के लिए, जोड़ें ४०० मिलीग्राम एथिल 3-aminobenzoate methanesulfonate पाउडर ९७.९ मिलीलीटर आसुत जल के लिए, और फिर 1 मीटर Tris (पीएच ९.५) के २.१ मिलीलीटर जोड़ने के लिए ~ 7 पीएच समायोजित करने के लिए । 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टॉक समाधान स्टोर ।
  2. tricaine काम समाधान तैयार करने के लिए, जोड़ें ४.२ मिलीलीटर tricaine स्टॉक समाधान १०० एमएल मछलीघर सिस्टम पानी के लिए ।

२. प्रौढ Zebrafish वेंट्रिकुलर लकीर

  1. सर्जरी के लिए उपकरणों और सामग्री तैयार करें जिसमें स्पंज का एक टुकड़ा, tricaine वर्किंग सॉल्यूशन, एक प्लास्टिक पिपेट, एक stereomicroscope, दो तेज संदंश, iridectomy कैंची, और कोहनी चिमटी (चित्रा 1) से भरा एक पेट्री डिश शामिल है ।
  2. वेंट्रिकुलर लकीर सर्जरी के दौरान zebrafish पकड़ करने के लिए एक स्पंज पर 4 सेमी x ०.५ सेमी और गहराई में ०.५ सेमी के आकार की एक छोटी नाली तैयार करें ।
  3. zebrafish प्रणाली पानी के आधे टैंक के साथ एक 3 एल zebrafish टैंक भरें कि डीएच2में ६० मिलीग्राम/एल समुद्री लवण का उपयोग करके बनाया है घायल मछली की वसूली के लिए ।
  4. Anesthetize एक 10 सेमी पेट्री डिश में tricaine समाधान के साथ जब तक गिल आंदोलनों एक प्रति सेकंड के लिए कमी और मछली रखने के लिए यह सुनिश्चित करें कि यह पूरी तरह से anesthetized है के लिए कम से कम 30 एस ।
  5. एक नम स्पंज ventral पक्ष में नाली के लिए कोहनी चिमटी के साथ anesthetized मछली स्थानांतरण । नेत्रहीन धड़कते दिल के मार्जिन का पता लगाने, और फिर एक stereomicroscope के तहत दिल का पता लगाने ।
  6. के बारे में 1 मिमी है कि त्वचा और मांसपेशियों में प्रवेश का एक छोटा सा चीरा बनाने के लिए iridectomy कैंची का प्रयोग करें, और ध्यान से संदंश युक्तियों के साथ pericardial थैली की चांदी की उपकला परत आंसू दिल का उपयोग करने के लिए । दिल की चोट से बचने के लिए संदंश को भी गहरी कैविटी में न डालें ।
    नोट: इस बिंदु पर, व्यापक रक्तस्राव से बचने के लिए ध्यान में रखें । प्रयोग से मछली को छोड़ अगर व्यापक रक्तस्राव होता है, के बाद से अत्यधिक रक्तस्राव मुख्य रूप से दिल को आकस्मिक चोट के कारण होता है और इसलिए भ्रामक परिणामों में परिणाम होगा ।
  7. धीरे से तेज संदंश गैर-प्रमुख हाथ का उपयोग कर या कोमल पेट दबाव लागू करने के साथ अपने सर्वोच्च पकड़ द्वारा निलय बेनकाब । फिर, दूसरे हाथ के साथ, iridectomy कैंची का उपयोग कर शीर्ष पर निलय के ~ 20% निकालें ।
    नोट: इस बिंदु पर कोई व्यापक रक्तस्राव होने चाहिए ।
  8. चीरा कवर करने के लिए एक गीला नैपकिन का प्रयोग करें, के रूप में घावों 15 के लिए दरियादिली से खून-45 के थक्के से पहले, और फिर मछली प्रणाली पानी के साथ टैंक में वापस डाल दिया ।
    नोट: यह चीरा टांका करने के लिए आवश्यक नहीं है ।
  9. सुनिश्चित करें कि मछली 1 मिनट के भीतर गिल आंदोलनों फिर से हासिल है और फिर शुरू तैराकी । यदि मछली गिल आंदोलनों पानी में ५० एस के बाद नहीं दिखा है, यह एक प्लास्टिक पिपेट का उपयोग कर गिल में पानी फुहार से सुविधा जब तक मछली सक्रिय वेंटिलेशन शुरू ।
  10. वेंट्रिकुलर लकीर के बाद रीसायकल प्रणाली में मछली बनाए रखें ।
    नोट: कोई विशेष परवाह सामांय मछली के साथ तुलना में आवश्यक हैं । वयस्क zebrafish वेंट्रिकुलर लकीर की मृत्यु दर के बारे में है 5 – 10%. लगभग सभी मौत सर्जरी के बाद 24 घंटे के भीतर होता है ।

3. सिरना-encapsulated नैनोकणों की तैयारी

  1. एफ-पाम4संश्लेषित-खूंटी-R9 dendrimer ।
    नोट: एफ के संश्लेषण-पाम4-खूंटी-R9 dendrimer सामग्री के रूप में कुछ संशोधनों के साथ पहले३७ वर्णित किया गया था । α की लंबाई, ω-dipyridyl disulfido पॉलीथीन ग्लाइकोल (Py-खूंटी-Py) १,००० के एक आणविक वजन करने के लिए siRNAs के encapsulation को अधिकतम करने के लिए कम किया गया (चित्रा 2बी).
  2. सूखी 10 जी 4.0 polyamidoamine के cystamine कोर के मिलीग्राम (पमम) 1 के लिए ४५ ° c पर वैक्यूम ड्रायर का उपयोग कर एच और फिर 2 मिलीलीटर है Dulbecco फॉस्फेट में पमम भंग-खारा (DPBS, एक संतुलित नमक समाधान सेल संस्कृति अनुप्रयोगों की एक किस्म के लिए इस्तेमाल किया) ।
  3. भंग १.७ मिलीग्राम tris (2-carboxyethyl) phosphine (TCEP) में 1 मिलीलीटर DPBS, पमम में तैयार समाधान के साथ मिश्रण ३.२ और 8 एच के लिए कोमल सरगर्मी के साथ कमरे के तापमान पर छोड़ दें ।
    नोट: TCEP दस गुना है दाढ़ अनुपात में पमम के डाइसल्फ़ाइड बांड के लिए अतिरिक्त ।
  4. ultrafiltration द्वारा अत्यधिक TCEP निकालें । ऊपर पमम-TCEP मिक्सचर में DPBS डालकर 10 एमएल की मात्रा तक पहुंच जाए और सॉल्यूशन को 3 केडीए MWCO (आणविक वेट कट ऑफ) ultrafiltration ट्यूब में ट्रांसफर किया जाए । 15 मिनट के लिए ३,००० g पर केंद्रापसारक के बाद, संग्रह ट्यूब में समाधान त्यागें । 10 मिलीलीटर अप करने के लिए फ़िल्टर डिवाइस के लिए DPBS जोड़ें और धीरे नमूना कई बार पिपेट और फिर से केंद्रापसारक । इस चरण को 4 बार दोहराएं । अंतिम निस्पंदन के बाद, महाप्राण फ़िल्टर डिवाइस से नमूना है ।
    नोट: इस चरण के उत्पाद पमम (टर्म्ड f-PAM4) कम है ।
  5. भंग 14 मिलीग्राम Py-खूंटी-Py में 1 मिलीलीटर DPBS, f-PAM4 समाधान के साथ मिश्रण और 3 एच के लिए कमरे के तापमान पर कोमल सरगर्मी के साथ छोड़ दें । इसके बाद ३.४ में बताए अनुसार ultrafiltration कदम से अत्यधिक Py-खूंटी-Py को हटा दें । अंतिम निस्पंदन के बाद, महाप्राण फ़िल्टर डिवाइस से नमूना है ।
    नोट: उत्पाद f-PAM4-खूंटी-Py के रूप में नाम है । Py-खूंटी-Py की मात्रा एफ-PAM4 में thiol समूहों को दाढ़ अनुपात में १० गुना है.
  6. भंग ६.४ Cysteine के मिलीग्राम 1 मिलीलीटर DPBS में R9 पेप्टाइड (एसी-CRRRRRRRRR-NH2) समाप्त, f-PAM4-खूंटी-Py के साथ मिश्रण और धीरे कमरे के तापमान पर 8 घंटे के लिए हलचल । अंतिम उत्पाद को शुद्ध करें, जिसे एफ-PAM4-पेग-R9 कहा जाता है, ultrafiltration चरण के अनुसार ३.४ में वर्णित है सिवाय इसके कि DPBS जल को बदल दिया गया है । एक फ्रीज वैक्यूम ड्रायर का उपयोग करके उत्पाद Lyophilize ।
    नोट: lyophilization से पहले ३.५ और ३.६ में उत्पाद-20 ℃ में कम से 1 महीने के लिए जमा हो जाती है । f-PAM4-खूंटी-R9 के lyophilization के बाद, नमूनों में कम से 2 महीने के लिए-20 ℃ पर संग्रहित किया जाता है ।
  7. खूंटी और पेप्टाइड संशोधन की डिग्री निर्धारित करने के लिए, डी2ओ (ड्यूटेरियम ऑक्साइड) में एफ-PAM4-खूंटी-Py के 5 मिलीग्राम भंग और यह एनएमआर (परमाणु चुंबकीय अनुनाद) नमूना ट्यूब में स्थानांतरण । ४०० मेगाहर्ट्ज में एक ज एनएमआर वर्णक्रमीय विश्लेषण प्रदर्शन और एनएमआर डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर३७का उपयोग कर डेटा का विश्लेषण ।
    नोट: विशेष रूप से, प्रतिनिधि पमम चोटियों (-NCH2CH2CO-), खूंटी चोटियों (-OCH2CH2-), और arginine अवशेष चोटियों (-HCCH2CH2CH2NH-) पेप्टाइड्स में 2.4 पर्वतमाला में होने की उम्मीद कर रहे हैं-2.6, 3.7 – 3.8, और 1.6 – 1.8 पीपीएम, क्रमशः. खूंटी और R9 चोटियों के पमम चोटियों के अभिन्नता की गणना करके पमम के सापेक्ष खूंटी और R9 के संशोधन की डिग्री निर्धारित करें. खूंटी के संशोधन की डिग्री १००% है और R9 संशोधन कम से ५०% है । 1एच एनएमआर वर्णक्रमीय विश्लेषण संस्था की कोर सुविधा में प्रदर्शन कर रहे हैं ।
  8. एफ-पाम4-खूंटी-R9 dendrimer पाउडर पंजाब में 4 मिलीग्राम/एमएल और एक बार उपयोग के लिए समाधान के aliquots बनाने के भंग ।
    नोट: dendrimer समाधान दोहराया ठंड और गल के बिना, कम से कम एक महीने के लिए-20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है ।
  9. भंग cyanine रंजक-त्यसपछि siRNAs (मियादी Cy5-सिरना), Aldh1a2 सिरना या तले ऋणात्मक नियन्त्रण सिरना आसुत जल में १० µ मी.
    नोट: cyanine रंजक का प्रयोग करें-लेबल siRNAs मूल्यांकन करने के लिए कि क्या nanoparticle encapsulated सिरना मछली दिल (चित्रा 2A-B) दर्ज कर सकते हैं । यह प्रोटोकॉल एक उदाहरण जीन के रूप में aldh1a2 लेता है f-PAM4-खूंटी-R9 dendrimer-encapsulated सिरना के वितरण की क्षमता का निर्धारण । siRNAs का जुगाड़ कर रहे हैं: Cy5-सिरना antisense कतरा: 5 ′-ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT-3 ′, siAldh1a2 antisense कतरा: 5 '-UUCAGGACAACCGUGUUCCdTdT-3 ' और तले निगेटिव कंट्रोल सिरना antisense कतरा: 5 '-ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT-3 ' ।
  10. सिरना-encapsulated nanoparticle समाधान तैयार करने के लिए, dendrimer समाधान की एक समान मात्रा के साथ सिरना मिश्रण, और 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर नमूना गर्मी. हौसले से उपयोग करने से पहले सिरना-nanoparticle समाधान तैयार करते हैं ।
    नोट: सिरना-encapsulated nanoparticle समाधान की मात्रा इंजेक्शन होने जा मछली की संख्या पर निर्भर करता है । उदाहरण के लिए, १२० µ l dendrimer समाधान (मिश्रण ६० µ l सिरना समाधान और ६० µ l dendrimer समाधान) 10 मछली (~ 10 µ एल प्रति मछली) के इंजेक्शन के लिए, समाधान की हानि में गिनती तैयार करें ।

4. सिरना के इंजेक्शन-encapsulated नैनोकणों वयस्क Zebrafish दिल में

  1. जैसा कि ऊपर वर्णित है, एक नाली, एक 10 सेमी पेट्री tricaine समाधान, एक प्लास्टिक पिपेट, एक stereomicroscope, कोहनी चिमटी से भरा पकवान, और एक इंसुलिन सिरिंज (चित्रा 1), साथ ही आवास के लिए प्रणाली पानी के साथ एक मछली टैंक के साथ स्पंज का एक टुकड़ा तैयार इंजेक्शन के बाद मछली ।
  2. की अनुमति दें घायल zebrafish चरणों में तैयार 2.1 – 2.10 वेंट्रिकुलर लकीर के बाद 1 दिन के लिए ठीक करने के लिए, और फिर anesthetize 1 dpa (दिनों के बाद विच्छेदन) tricaine समाधान में मछली के रूप में वर्णित २.४.
  3. कोहनी चिमटी का उपयोग नम स्पंज में नाली के लिए, anesthetized मछली, ventral पक्ष को स्थानांतरित । stereomicroscope के तहत धड़कते दिल का पता लगाएँ ।
  4. सिरना-encapsulated nanoparticle समाधान के 10 µ एल लोड इंसुलिन सिरिंज में । जितना संभव हो बुलबुले से बचें ।
  5. गैर-प्रमुख हाथ के साथ वक्ष क्षेत्र पकड़ करने के लिए धीरे कोहनी चिमटी का उपयोग करके मछली को स्थिर । मछली को भी कसकर न दबाना ।
    नोट: ध्यान रखें कि इंजेक्शन के दौरान कोई व्यापक रक्तस्राव नहीं होने चाहिए.
  6. ~ 30 डिग्री पर भरा इंसुलिन सिरिंज पकड़ो और ~ 10 µ एल वक्ष गुहा में समाधान का एक दूसरे हाथ का उपयोग (पूरक चित्रा 1) ।
    नोट: समाधान इंजेक्शन के दौरान कई बार बाहर बहती है, लेकिन यह सिरना प्रभाव को प्रभावित नहीं करता है । सिरना-nanoparticle समाधान एक महीने के लिए कई दिनों के लिए एक दिन में एक बार इंजेक्शन किया जा सकता है, एक विशिष्ट प्रयोगात्मक योजना के आधार पर. सिरना के एक प्रकार के साथ एक मछली इंजेक्षन हर बार । यदि सिरना के दो से अधिक प्रकार के एक मछली में इंजेक्शन की जरूरत है, हर बार सिरना का एक प्रकार सुई, और फिर सिरना के एक अंय प्रकार के इंजेक्षन 1 बाद में एच । इस प्रोटोकॉल में, केवल एक प्रकार की मछली प्रति सिरना इंजेक्शन था ।
  7. प्रणाली पानी के साथ टैंक के लिए मछली हस्तांतरण ।
    नोट: मछली 1 मिनट के भीतर वेंटिलेशन पुनः आरंभ करने की उंमीद कर रहे हैं, और फिर फिर से शुरू तैराकी । सिरना-encapsulated नैनोकणों या सिरना के इंजेक्शन आम तौर पर वयस्क zebrafish में मौत का कारण नहीं है ।

5. हृदय संग्रह, निर्धारण, और सिरना वितरण की दक्षता का मूल्यांकन

  1. प्रत्येक समूह के लिए एक microcentrifuge ट्यूब में 4% paraformaldehyde समाधान की 1 मिलीलीटर तैयार करें ।
  2. Anesthetize इंजेक्शन के बाद चयनित दिनों में tricaine समाधान में मछली । एक नम स्पंज में नाली में मछली supinely प्लेस । वक्ष क्षेत्र में एक बड़ा चीरा बनाओ और चिमटी के साथ व्यापक रूप से खुला । पकड़ बहिर्वाह पथ और चिमटी के साथ ध्यान से पूरे दिल बाहर खींचो ।
  3. पंजाबियों के साथ दिल कुल्ला और तेजी से एक नैपकिन के साथ अतिरिक्त तरल निकालें । 1 मिलीलीटर paraformaldehyde के साथ एक १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में 10 दिलों को रखो । धीरे ट्यूब कई बार पलटना, और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर रहते हैं ।
  4. vivo इमेजिंग सिस्टम (पूरक चित्रा 2) का उपयोग करके Cy5-siRNAs-इंजेक्टेड दिलों की प्रतिदीप्ति तीव्रता को मापने । इस अध्ययन में प्रत्येक समूह के लिए 3 – 4 zebrafish दिलों का प्रयोग करें ।
  5. या तो आयल या अक्टूबर यौगिक के साथ तय दिल माउंट (जमे हुए ऊतक नमूनों के लिए मध्यम embedding इष्टतम तापमान में कटौती सुनिश्चित करने के लिए) ।

6. Nanoparticle-मध्यस्थता सिरना जीन-मुंह बंद करने का मूल्यांकन

  1. एक अछूता कंटेनर और लंबी चिमटी तैयार करें । कंटेनर की मात्रा के एक तिहाई करने के लिए तरल नाइट्रोजन में डालो ।
  2. 2 dpa पर tricaine सॉल्यूशन में मछली Anesthetize । काटना दिलों को ५.२ में वर्णित के रूप में, और फिर बहिर्वाह पथ और atrium निकालें ।
    नोट: मछली एक दिन में शल्य चिकित्सा से ठीक हो सकता है और फिर एक नकारात्मक नियंत्रण या aldh1a2 सिरना-encapsulated नैनोकणों (siAldh1a2) के रूप में या तो तले सिरना-encapsulated नैनोकणों (शिंक्र) के साथ 1 dpa पर इंजेक्शन ।
  3. एक १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में निलय स्थानांतरण चिमटी का उपयोग कर, ट्यूब ढक्कन कवर, और तुरंत तरल नाइट्रोजन के साथ अछूता कंटेनर में ट्यूब जगह है । ट्यूबों कुछ मिनट के लिए तरल नाइट्रोजन पर नाव चलो । कंटेनर से ट्यूबों को दूर करने के लिए लंबी चिमटी का प्रयोग करें ।
  4. सभी निलय एकत्र कर रहे हैं जब तक ६.२ और ६.३ चरणों को दोहराएँ । प्रत्येक समूह के लिए 6-10 दिलों का प्रयोग करें ।
  5. आरएनए अलगाव रिएजेंट के साथ दिलों की कुल आरएनए निकालें. मात्रात्मक आरटी द्वारा संबंधित जीन की अभिव्यक्ति का स्तर का आकलन-पीसीआर का उपयोग कर Gapdh च: GATACACGGAGCACCAGGTT; Gapdh R: GCCATCAGGTCACATACACG; Aldh1a2 च: TGAGCGAGGAGCAGCAGAGA; Aldh1a2 R: TCCACGAAGAAGCCTTTAGTAGCA ।

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Representative Results

dendrimer-मध्यस्थता सिरना वितरण की दक्षता का निर्धारण करने के लिए, हम zebrafish के दिल निलय के शीर्ष, तो dendrimer के बारे में 10 µ l इंजेक्शन केवल (नकली समूह), Cy5-सिरना केवल (नग्न समूह), या एफ पमम-खूंटी-R9 dendrimer-समझाया resect Cy5-सिरना (Cy5-सिरना group) intrapleurally, क्रमशः (चित्रा २ए-बी). प्रतिदीप्ति संकेत dendrimer-encapsulated Cy5-सिरना, 3, 24, और ४८ hpi (घंटे के बाद इंजेक्शन) के साथ इंजेक्शन दिलों में detectable था, जबकि यह शायद ही ४८ hpi पर नकली और नग्न समूहों से दिलों में detectable था (चित्रा 2सी-डी), सुझाव है कि एफ पमम-खूंटी-R9 dendrimer प्रभावी ढंग से वयस्क zebrafish दिल में siRNAs के वितरण की सुविधा है और कम दो दिनों के लिए स्थिर है ।

जीन मुंह बंद करने पर dendrimer-encapsulated सिरना के प्रभाव की जांच करने के लिए, हम एक लक्ष्य जीन के रूप में aldh1a2 (retinoic एसिड-synthesizing एंजाइम) चुना है, जो वेंट्रिकुलर लकीर४४ के बाद हृदय पुनर्जनन के लिए आवश्यक होने की सूचना दी गई है . के रूप में चित्रा 3एमें दिखाया गया है, मछली वेंट्रिकुलर लकीर के बाद एक दिन के लिए ठीक करने की अनुमति दी गई और फिर dendrimer के साथ microinjected-encapsulated सिरना । हमने पाया है कि aldh1a2 mRNA अभिव्यक्ति स्तर के साथ इलाज दिल में कमी आई एफ-पमम-खूंटी-R9 dendrimer-encapsulated siAldh1a2 के साथ तुलना में dendrimer-encapsulated तले सिरना (शिंक्र) पर 2 dpa (चित्रा 3बी), प्रदर्शन है कि एफ पमम-खूंटी-R9 dendrimer-मध्यस्थता siRNAs वयस्क मुंह बंद करने दिल में जीन विशिष्ट zebrafish हासिल ।

Figure 1
चित्रा 1 : दिल की सर्जरी और वक्ष इंजेक्शन उपकरणों। वयस्क zebrafish दिल में वेंट्रिकुलर लकीर के लिए इस्तेमाल उपकरणों की तस्वीर: एक नाली के साथ स्पंज, कोहनी चिमटी, तेज संदंश, iridectomy कैंची, लंबी चिमटी, और इंसुलिन dendrimer-समझाया सिरना वितरण के लिए इस्तेमाल किया सिरिंज । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 : प्रभावी एफ पमम-खूंटी-R9 dendrimer-घायल वयस्क zebrafish दिल में सिरना की सहायता वितरण । (क) वेंट्रिकुलर लकीर के बाद वयस्क zebrafish दिल में nanoparticle-encapsulated Cy5-सिरना के ऊपर की क्षमता की जांच करने के लिए योजना (dpa: दिनों के बाद विच्छेदन; hpi: घंटे के बाद इंजेक्शन) । (ख) च का संश्लेषण-पमम-खूंटी-R9 dendrimer और dendrimer-encapsulated Cy5-सिरना की तैयारी. (ग) दिलों की Cy5 प्रतिदीप्ति इमेजिंग dendrimers के साथ इंजेक्शन ही (मॉक), Cy5-सिरना केवल बिना dendrimer encapsulation (नग्न), और dendrimer-encapsulated प्रतिदीप्ति लेबल Cy5-सिरना (Cy5-सिरना) द्वारा पता लगाया vivo में इमेजिंग प्रणाली, दिखा रहा है कि प्रतिदीप्ति संकेतों ४८ hpi पर नकली और नग्न समूहों में लगभग undetect थे, जबकि मजबूत संकेतों dendrimer-encapsulated Cy5-सिरना समूहों में 3 से ४८ hpi को बनाए रखा । प्रतिदीप्ति संकेतों के मनमाने पैमाने कमजोर (नीले) से पता चलता है मजबूत (लाल) । (घ) vivo इमेजिंग सिस्टम द्वारा मूल्यांकन किए गए दिलों में Cy5-सिरना प्रतिदीप्ति संकेतों के ठहराव के रूप में पैनल C (* p < 0.05, * * * p < 0.001; डेटा का अर्थ है ± s.e.m.; Bonferroni की एकाधिक तुलना के बाद प्रसरण का एक-तरफ़ा विश्लेषण परीक्षण n = 3-4 दिल) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 : घायल प्रौढ़ zebrafish हृदय में aldh1a2 के कुशल सिरना मुंह बंद करने । (क) aldh1a2 सिरना के जीन-मुंह बंद करने प्रभाव की जांच के लिए योजना. (ख) qPCR से पता चलता है कि aldh1a2 mRNA siAldh1a2-encapsulated तले nanoparticle दिल (सिरना) के साथ तुलना में nanoparticle-encapsulated शिंक्र दिलों में कमी आई । aldh1a2 mRNA व्यंजक स्तर GAPDH (* * * P < 0.001; डेटा युग्मित छात्र के t-परीक्षण के साथ माध्य ± s.e.m. हैं) द्वारा सामान्यीकृत किया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Supplementary Figure 1
अनुपूरक चित्रा 1: वक्ष गुहा इंजेक्शन की छवियां। (क) 1 दिन बाद विच्छेदन पर वयस्क मछली में वक्ष गुहा । (ख) वक्ष गुहा में nanoparticle-encapsulated सिरना के इंजेक्शन । स्केल सलाखों: 1 मिमी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Supplementary Figure 2
अनुपूरक चित्रा 2: nanoparticle-encapsulated Cy5-सिरना की क्षमता को घायल वयस्क zebrafish दिल में। (क) दिलों की Cy5 प्रतिदीप्ति इमेजिंग dendrimers के साथ इंजेक्शन केवल (नकली), नग्न Cy5-सिरना बिना dendrimer encapsulation (नग्न), और dendrimer-encapsulated Cy5-सिरना में vivo इमेजिंग प्रणाली के तहत. प्रतिदीप्ति संकेतों के मनमाने पैमाने कमजोर (नीले) से मजबूत (लाल) है । (ख) Cy5-सिरना प्रतिदीप्ति संकेतों के दिलों में ठहराव के रूप में vivo इमेजिंग प्रणाली द्वारा मापा पैनल में एक (नेकां: कोई महत्वपूर्ण अलग; डेटा ± s.e.m. मतलब; प्रसरण का एक-तरफ़ा विश्लेषण Bonferroni के गुणज के बाद तुलना परीक्षण; n = 3-4 दिल) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

zebrafish वयस्क दिल5सहित अंगों की एक किस्म को फिर से पैदा करने में पूरी तरह से सक्षम है । जबकि ट्रांसजेनिक और आनुवंशिक तरीके अच्छी तरह से zebrafish के भ्रूण में जीन कार्यों का अध्ययन करने के लिए विकसित कर रहे हैं, जांचकर्ताओं अभी भी zebrafish४५,४६में सशर्त उत्परिवर्ती alleles पैदा करने के चुनौतीपूर्ण काम के साथ सामना कर रहे हैं । इस प्रकार, ट्रांसजेनिक प्रमुख नकारात्मक म्यूटेंट या छोटे-अणु अवरोधकों अक्सर वयस्क zebrafish अंगों में जीन कार्यों को संबोधित करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं25,27,४२. पिछले कुछ वर्षों में, हम nanoparticle-मध्यस्थता सिरना वितरण और जीन मुंह बंद करने४१,४२का उपयोग कर वयस्क zebrafish दिल में जीन की हानि-समारोह विश्लेषण के लिए एक वैकल्पिक विधि विकसित की है, ४३. यहाँ, विशेष रूप से और संभवतः अन्य zebrafish अंगों में zebrafish दिलों में dendrimer मध्यस्थता सिरना जीन मुंह बंद करने का उपयोग कर इस विधि के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल, सामान्य रूप से प्रस्तुत किया गया है.

सिरना अणु अपने नकारात्मक प्रभार के कारण ही कोशिकाओं में प्रवेश नहीं कर सकता है और आसानी से nuclease द्वारा अपमानित किया जाएगा । मोनो फैलाने के अणुओं, स्वरित्र संरचनाओं और संपत्तियों के साथ, dendrimers होनहार सिरना वाहक ४७के रूप में माना गया है । पमम dendrimers अमीर cationic परिधि और अंदर बफर अमीन जो शारीरिक स्थितियों में सिरना encapsulation मध्यस्थता सकता है और एक "प्रोटॉन स्पंज" प्रभाव सिरना में endosomes से कोशिका द्रव्य क्रमशः४८ जारी करने के लिए प्रेरित किया है , ४९ , ५०. इस आलेख में, पमम स्थिरता और वितरण दक्षता बढ़ाने के लिए संशोधित किया गया था । एफ पमम-खूंटी-R9 प्रणाली dendrimer encapsulation के लिए सकारात्मक प्रभारी के साथ एक अर्धगोल पमम सिरना सिर प्रदान करता है nuclease द्वारा क्षरण को रोकने के लिए । खूंटी बांह और R9 transmembrane पेप्टाइड स्थिरीकरण के लिए नैनोकणों के hydrophilicity में सुधार और क्रमशः कोशिकाओं द्वारा को बढ़ावा देने के लिए इस्तेमाल किया गया था ।

नैनोकणों की गुणवत्ता और प्रकार zebrafish दिल में प्रभावी सिरना प्रसव और जीन-मुंह बंद करने के लिए महत्वपूर्ण हैं । हम सफलतापूर्वक इस प्रयोजन के लिए तीन संरचनात्मक-विविध नैनोकणों की जांच की है: खूंटी-पीएलए, एफ-पमम-खूंटी-R9, और पी-HYD-RGD नैनोकणों४१,४२,४३। हालांकि वे व्यावसायिक उत्पादन नहीं कर रहे हैं, एक नियमित रूप से कार्बनिक रसायन प्रयोगशाला आसानी से संश्लेषित कर सकते है और शुद्ध नैनोकणों के रूप में वर्णित पहले३५,३७,४३। यहाँ, हम सिरना लकीर के बाद वयस्क मुंह बंद करने दिल में सरल, कुशल, dendrimer मध्यस्थता zebrafish वितरण और जीन-वेंट्रिकुलर दिखाने के लिए एक उदाहरण के रूप में एफ-पमम-खूंटी-R9 dendrimer चुना है, क्योंकि यह सिरना-लोड तैयार करने के लिए अपेक्षाकृत आसान है dendrimer-परिसरों, जैसे ~ 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मिश्रण मशीन द्वारा के रूप में । दूसरी ओर, पीएच सिरना-लोड nanocomplexes के लिए समायोजित किया जाना है अगर पी-HYD-RGD४३प्रयोग किया जाता है । इसी प्रकार, पायसीकारी और शुद्धि प्रक्रियाओं३५,४१का उपयोग किया जाता है अगर खूंटी-पीएलए नैनोकणों, वर्दी nanoparticle-encapsulated सिरना समाधान प्राप्त करने के लिए आवश्यक हैं ।

एक और महत्वपूर्ण कदम को कम करने या dendrimer के इंजेक्शन के दौरान कोई खून बह रहा है-encapsulated सिरना के रूप में ४.५ में वर्णित के बाद से व्यापक रक्तस्राव दिल पुनर्जनन और अंय जैविक प्रणालियों में रुकावट । इस प्रकार, हम प्रयोगात्मक समूहों से मछली को छोड़कर सुझाव है कि खून बह रहा है इंजेक्शन के दौरान होता है । सामांय में, यह सरल इंजेक्शन प्रक्रिया आसानी से कुछ परीक्षणों के बाद महारत हासिल है ।

इस विधि की प्रमुख सीमाएं सिरना प्रौद्योगिकी में ही हैं, जैसे कि संभावित ऑफ-टारगेट इफेक्ट्स और ब्याज के जीन का अपूर्ण विलोपन. अंयथा, जीन के अत्यधिक reproducible जैविक प्रतिकृति-कई जीन के मुंह बंद करने हमारे काम में प्रदर्शन किया गया है और दूसरों की है कि४१। महत्वपूर्ण बात, इस प्रोटोकॉल तेजी से, सरल है, और कुशल, और इंजेक्शन उपचार वयस्क zebrafish द्वारा अच्छी तरह से सहन किया है । सिरना जीन-मुंह बंद करने दक्षता के प्रायोगिक विश्लेषण में सीटू संकरण या मात्रात्मक RT-पीसीआर द्वारा mRNA अभिव्यक्ति स्तरों का आकलन शामिल हो सकता है, या पश्चिमी दाग का उपयोग करके प्रोटीन अभिव्यक्ति स्तर, immunohistochemical धुंधला, या अंय कार्यात्मक विश्लेषण । एक साथ, हम पूरी तरह से वयस्क zebrafish दिल में नुकसान-समारोह के अध्ययन के लिए एक वैकल्पिक उपकरण के रूप में nanoparticle-सुविधा सिरना वितरण का समर्थन विशेष रूप से और इस दृष्टिकोण भी वयस्क zebrafish और अंय मॉडल जीवों में अंय अंगों के लिए बढ़ाया जा सकता है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखकों गंभीर टिप्पणी के लिए डॉ आईसी ब्रूस धंयवाद और पांडुलिपि पढ़ने । यह काम चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (३१४३००५९, ३१७०१२७२, ३१७३००६१, ८१४७०३९९, और ३१५२१०६२), AstraZeneca एशिया, और उभरते बाजार अभिनव चिकित्सा और जल्दी विकास से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
tricaine Sigma E10521 Store at 4 °C
stereomicroscope Leica  S8AP0
sharp forcep WPI 14098
iridectomy scissors WPI 501778
elbow tweezers Suzhou Liuliu SE05Cr
α,ω-dipyridyl disulfido polyethylene glycol(Py-PEG-Py) Biomatrik (Jiaxing) Inc. 5239
core of G4.0 polyamidoamine (PAMAM) Andrews ChemServices AuCS-297
vacuum drying equipment Yiheng DZF-6020
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) Gibco 14190144
tris(2-carboxyethyl)phosphine(TCEP) Alfar Aesar 51805-45-9 Causes severe skin burns and eye damage. Causes serious eye damage.
ultrafiltration tube Millipore UFC900308
freeze dryer Martin Christ Alpha 2-4 Ldplus
NMR spectrometer Bruker AV400
Deuterium oxide(D2O) J&K 174611
NMR sample tube J&K WG-1000-7-50
3 kDa MWCO ultrafiltration tube Merck UFC900308
sea salts Instant Ocean® SS15-10

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विकास जीवविज्ञान अंक १३७ Zebrafish वयस्क हृदय पुनर्जनन नैनोकणों सिरना जीन मुंह बंद करने विकासात्मक जीवविज्ञान आनुवंशिकी
वयस्क Zebrafish दिल में Nanoparticle-मध्यस्थता सिरना जीन-मुंह बंद करने
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Xiao, C., Wang, F., Hou, J., Zhu,… More

Xiao, C., Wang, F., Hou, J., Zhu, X., Luo, Y., Xiong, J. W. Nanoparticle-mediated siRNA Gene-silencing in Adult Zebrafish Heart. J. Vis. Exp. (137), e58054, doi:10.3791/58054 (2018).

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