Summary
Rimane una grande sfida di sviluppare condizionale gene knock-out o efficace gene-atterramento in organi di zebrafish adulto. Qui segnaliamo un protocollo per la performante siRNA nanoparticella-mediata silenziamento genico nel cuore adulto zebrafish, fornendo così un nuovo metodo di perdita di funzione per lo studio di organi adulti in zebrafish e altri organismi di modello.
Abstract
I mammiferi hanno una capacità molto limitata per rigenerare il cuore dopo infarto miocardico. D'altra parte, l'adulto zebrafish rigenera il suo cuore dopo resezione dell'apice o cryoinjury, che lo rende un importante organismo modello per lo studio di rigenerazione del cuore. Tuttavia, la mancanza di metodi di perdita-de-funzione per organi adulti ha limitato comprensioni nei meccanismi di rigenerazione del cuore. Interferenza del RNA tramite diversi sistemi di consegna è un potente strumento per il silenziamento di geni in cellule di mammiferi e organismi modello. Precedentemente abbiamo riferito che nanoparticelle siRNA-incapsulato correttamente entrano nelle cellule e provocare un atterramento di gene-specific del notevole nel cuore adulto zebrafish rigenerante. Qui, presentiamo un protocollo semplice, rapido ed efficiente per la consegna di siRNA Dendrimero-mediata e silenziamento genico nel cuore adulto zebrafish rigenerante. Questo metodo fornisce un approccio alternativo per determinare le funzioni del gene in organi adulti in zebrafish e può essere esteso ad altri organismi di modello pure.
Introduction
L'infarto miocardico è diventato una minaccia per la salute più importanti, che conduce a un enorme onere economico intorno al mondo1. Il cuore di un mammifero adulto non riesce a rigenerare e ricostituire i cardiomiociti persi su scala macroscopica dopo la ferita, che porta alla formazione di tessuti cicatriziali e conseguente insufficienza cardiaca. A differenza dei mammiferi, il pesce zebra è in grado di rigenerazione del cuore, principalmente attraverso la robusta proliferazione del miocardio dopo diversi tipi di lesione del cuore, rendendolo un organismo modello ideale per indagare i meccanismi molecolari della rigenerazione del cuore 2,3,4,5,6,7,8. Decifrare i meccanismi endogeni sottostante rigenerazione di cuore di zebrafish è un campo di ricerca nella ricerca di nuove strategie terapeutiche migliorare il cuore umano rigenerazione9emozionante.
Metodi di manipolazione genetica sono disponibili in zebrafish. Questi consistono di morpholinos (MO) che sono anche ampiamente utilizzati in rane, pulcino e mammiferi oltre in zebrafish10,11,12,13. MO ha efficiente atterramento di espressione genica in zebrafish adulto pinna, cervello e retina14,15,16,17,18,19. Acido nucleico bloccato (LNA) è un altro oligonucleotide artificiale utilizzato per abbattere l'espressione genica endogena non solo negli embrioni di zebrafish, ma anche in organi di animali adulti20,21,22, 23 , 24. Tuttavia, la mancanza di metodi efficaci di perdita di funzione per i cuori degli adulti rimane un ostacolo nello studiare i meccanismi molecolari della rigenerazione dell'organo. Al presenti, piccole molecole inibitori o transgenici espressione dei mutanti dominanti negativi vengono utilizzate principalmente per bloccare la funzione di un gene o una via per studiare la sua funzione nel cuore adulto zebrafish rigenerazione25,26 ,27. Tuttavia, non tutti i geni o vie di segnalazione sono applicabili per questi metodi.
Small-interfering RNAs (siRNAs) sono ampiamente usati per l'analisi di perdita-de-funzione di cellule di mammiferi ed embrioni di organismi modello, nonché organi adulti per studi preclinici in animale modelli28,29,30 , 31 , 32. siRNAs sono stati usati efficacemente per silenziare i geni nei tumori33,34,35 e in cardiomiociti36,37,38,39 ,40 tramite diversi sistemi di consegna. Recentemente, abbiamo sviluppato efficiente siRNA-incapsulato nanoparticella silenziamento genico nel cuore adulto rigenerante utilizzando diversi diversi nanoparticelle41,42,43, fornendo un nuovo strumento per studi funzionali dei geni negli organi di zebrafish adulto. Basato su nostri precedenti studi41,42,43, qui vi presentiamo un protocollo semplice, pratico, ma potente per siRNA silenziamento genico nel cuore adulto zebrafish rigenerante utilizzando f-PAMAM-PEG-R9 dendrimeri. Aldh1a2 (aldeide deidrogenasi 1, membro della famiglia A2) gene era sovraregolati dopo resezione dell'apice di zebrafish e ablazione di Aldh1a2 bloccato la rigenerazione cardiaca44. Qui prendiamo aldh1a2 gene come esempio per testare l'efficienza di atterramento genica mediata da siRNA nanoparticella-incapsulato iniezione. Questo protocollo è contenuta una procedura per resezione del cuore di zebrafish, sintesi chimica delle nanoparticelle e un metodo di consegna su nanoparticelle siRNA-incapsulato nel cuore di zebrafish adulto.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tutte le procedure di animale utilizzavano un protocollo di zebrafish, approvato dal comitato di uso all'Università di Pechino, che è pienamente accreditata dall'associazione per la valutazione e l'accreditamento di laboratorio Animal Care e istituzionali Animal Care.
1. preparazione della soluzione di tricaina
- Per preparare la soluzione di riserva di tricaina, aggiungere polvere di 400mg etil 3-aminobenzoate methanesulfonate a 97,9 mL di acqua distillata e quindi aggiungere 2,1 mL di 1 M Tris (pH 9,5) per aggiustare il pH a ~ 7. Conservare la soluzione di riserva a 4 ° C.
- Per preparare la soluzione di lavoro di tricaina, aggiungere 4,2 mL di soluzione madre tricaina 100ml acquario sistema acqua.
2. adulti Zebrafish ventricolare resezione
- Preparare gli strumenti e materiali per la chirurgia che comprendono un pezzo di spugna, una capsula di Petri piena di tricaina lavoro soluzione, una pipetta di plastica, uno stereomicroscopio, due pinze taglienti, forbici iridectomy, e gomito pinzette (Figura 1).
- Preparare una piccola scanalatura delle dimensioni di 4 x 0,5 cm e 0,5 cm di profondità su una spugna per tenere il pesce zebra durante l'intervento chirurgico di resezione ventricolari.
- Riempire un serbatoio di zebrafish 3L con metà di un serbatoio d'acqua del sistema di zebrafish che viene effettuata mediante mare 60 mg/L di sali in dH2O per il recupero dei pesci feriti.
- Anestetizzare il pesce in un 10cm Petri con tricaina soluzione fino a quando i movimenti di gill diminuiscono di uno al secondo e tengono il pesce per almeno 30 s per garantire che esso è completamente anestetizzato.
- Trasferire il pesce anestetizzato con la pinzetta gomito alla scanalatura in un lato ventrale di spugna umida fino. Individuare visivamente il margine del cuore pulsante e quindi individuare il cuore sotto un microscopio stereoscopico.
- Utilizzare le forbici iridectomy per praticare una piccola incisione di circa 1 mm che penetra la pelle e muscoli e strappare con cura lo strato epiteliale argenteo del sac pericardico con i suggerimenti di forcipe per accedere al cuore. Non inserire la pinza troppo in profondità nella cavità per evitare la ferita del cuore.
Nota: A questo punto, tenere a mente per evitare vasto spurgo. Escludere i pesci dall'esperimento se vasto spurgo si verifica, poiché l'eccessivo sanguinamento è principalmente causato da lesioni accidentali al cuore e quindi si tradurrà in risultati fuorvianti. - Esporre il ventricolo che tiene delicatamente il suo apice con pinze taglienti con la mano non dominante o applicando leggera pressione addominale. Quindi, con l'altra mano, rimuovere ~ 20% del ventricolo all'apice usando le forbici iridectomy.
Nota: Nessun vasto spurgo dovrebbe verificarsi a questo punto. - Utilizzare un tovagliolo bagnato per coprire l'incisione, come il sanguinare ferite copiosamente per 15 – 45 s prima della coagulazione e poi rimettere il pesce nella vasca con acqua dell'impianto.
Nota: Non è necessario suturare l'incisione. - Assicurarsi che il pesce riacquista gill movimenti entro 1 min e poi riprende il nuoto. Se il pesce non Mostra gill movimenti dopo 50 s in acqua, facilitare e spruzzando acqua nelle branchie utilizzando una pipetta di plastica fino a quando il pesce riprende ventilazione attiva.
- Mantenere i pesci nel sistema di riciclo dopo la resezione ventricolo.
Nota: Nessun cure particolari sono necessarie rispetto con il pesce normale. Il tasso di mortalità di resezione ventricolari di zebrafish adulto è di circa 5 – 10%. Quasi tutte morte avviene entro 24 ore dopo l'intervento chirurgico.
3. preparazione di nanoparticelle siRNA-incapsulato
- Sintetizzare il f-PAM4-PEG-R9 Dendrimero.
Nota: La sintesi di f-PAM4-PEG-R9 Dendrimero materiali è stata eseguita come descritto in precedenza37 con alcune modifiche. La lunghezza del α, ω-dipiridile disulfido polietilenglicole (Py-PEG-Py) furono ridotti ad un peso molecolare di 1.000 per massimizzare l'incapsulamento di siRNA (Figura 2B). - Secco 10 mg del nucleo cistamina di Dendrimero G4.0 (chiamato PAMAM) utilizzando essiccatoio sottovuoto a 45 ° C per 1 h e poi si dissolvono il PAMAM in soluzione tampone fosfato e di 2 mL Dulbecco (DPBS, soluzione salina bilanciata utilizzata per una varietà di applicazioni della coltura delle cellule).
- Sciogliere della fosfina (TCEP) del tris(2-carboxyethyl) di 1,7 mg in 1 mL di DPBS, mescoli con la soluzione PAMAM preparata a 3.2 e lasciare a temperatura ambiente con agitazione delicata per 8 h.
Nota: TCEP è dieci volte nel rapporto molare in eccesso per i legami disolfuro della PAMAM. - Rimuovere eccessivo TCEP mediante ultrafiltrazione. Aggiungere DPBS alla miscela di cui sopra PAMAM-TCEP raggiunga il volume di 10 mL e la soluzione viene trasferita in una provetta di ultrafiltrazione 3 kDa MWCO (peso molecolare tagliato). Dopo la centrifugazione a 3000 g per 15 min, scartare la soluzione nel tubo di raccolta. Aggiungere DPBS al dispositivo filtro fino a 10 mL e delicatamente pipetta il campione più volte e centrifugare nuovamente. Ripetere questo passaggio per 4 volte. Dopo l'ultima filtrazione, aspirare il campione dal dispositivo di filtro.
Nota: Il prodotto di questa fase viene ridotto PAMAM (chiamati f-PAM4). - Sciogliere mg 14 Py-PEG-Py in 1 mL di DPBS, mix con la soluzione di f-PAM4 e lasciarlo con delicata agitazione a temperatura ambiente per 3 h. Quindi rimuovere l'eccessiva Py-PEG-Py il passo di ultrafiltrazione come descritto in 3.4. Dopo l'ultima filtrazione, aspirare il campione dal dispositivo di filtro.
Nota: Il prodotto è denominato come f-PAM4-PEG-Py. La quantità di Py-PEG-Py è 10 volte nel rapporto molare i gruppi tiolo in f-PAM4. - Sciogliere 6,4 mg di cisteina terminato R9 Peptide (Ac-CRRRRRRRRR-NH2) in 1 mL di DPBS, mescolare con f-PAM4-PEG-Py e mescolare delicatamente per 8 h a temperatura ambiente. Purificare il prodotto finale, chiamato f-PAM4-PEG-R9, dopo il passo di ultrafiltrazione come descritto in 3.4 tranne che DPBS viene modificato in acqua deionizzata. Lyophilize il prodotto utilizzando un essiccatoio sottovuoto di congelare.
Nota: I prodotti in 3.5 e 3.6 prima di liofilizzazione sono conservati a-20 ° c per almeno 1 mese. Dopo la liofilizzazione di f-PAM4-PEG-R9, i campioni sono conservati a-20 ℃ per almeno 2 mesi. - Per determinare il grado di modificazione PEG e peptide, sciogliere 5 mg del f-PAM4-PEG-Py in2D O (ossido di deuterio) e trasferirlo nella provetta del campione NMR (Nuclear Magnetic Resonance). Eseguire l'analisi spettrale 1H-NMR a 400 MHz e analizzare i dati mediante NMR dati analisi software37.
Nota: In particolare, il rappresentante PAMAM picchi (- NCH2CH2CO-), PEG picchi (- OCH2CH2-) e picchi di residui di arginina (- HCCH2CH2CH2NH-) nei peptidi si pensano che siano nelle gamme 2.4-2.6, 3,7-3,8 e 1,6 – 1,8 ppm, rispettivamente. Determinare il grado di modificazione della PEG e R9 riguardante il PAMAM calcolando gli integrali delle cime PEG e R9 per i picchi PAMAM. Il grado di modificazione di PEG è 100% e la modifica di R9 è almeno il 50%. L'analisi spettrale di 1H-NMR vengono eseguite all'interno della struttura di nucleo dell'istituzione. - Sciogliere il f-PAM4-PEG-R9 Dendrimero a polvere a 4 mg/mL in PBS e rendere le aliquote della soluzione utilizzabile una sola volta.
Nota: La soluzione Dendrimero può essere conservata a-20 ° C per almeno un mese, senza ripetuti di congelamento e scongelamento. - Sciogliere la cianina coloranti-labeled siRNA (chiamati Cy5-siRNA), Aldh1a2 siRNA o siRNA di controllo negativo strapazzate in acqua distillata a 10 µM.
Nota: Utilizzare il cianina coloranti-labeled siRNA per valutare se il siRNA nanoparticella incapsulato può entrare nel cuore di pesce (Figura 2A-B). Questo protocollo si aldh1a2 come un gene di esempio per determinare l'efficienza della consegna di f-PAM4-PEG-R9 incapsulato Dendrimero siRNA. Le sequenze dei siRNAs sono: filo antisenso Cy5-siRNA: 5 ′-ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT-3 ′, siAldh1a2 antisenso strand: 5'-UUCAGGACAACCGUGUUCCdTdT-3' e controllo negativo strapazzate siRNA antisenso strand: 5'-ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT-3'. - Per preparare la soluzione di nanoparticelle siRNA-incapsulato, mescolare siRNA con un volume uguale di soluzione Dendrimero e incubare il campione a temperatura ambiente per 20 minuti appena preparare la soluzione di siRNA-nanoparticelle prima dell'uso.
Nota: Il volume della soluzione di nanoparticelle siRNA-incapsulato dipende dal numero di pesci andando a essere iniettato. Ad esempio, preparare almeno 120 µ l di soluzione di Dendrimero (mix 60 µ l di soluzione siRNA e 60 µ l di soluzione di Dendrimero) per l'iniezione di 10 pesci (~ 10 µ l per pesce), contando la perdita di soluzione.
4. iniezione di nanoparticelle siRNA-incapsulato nel cuore di Zebrafish adulto
- Come descritto in precedenza, preparare un pezzo di spugna con un solco, una capsula di Petri 10 cm riempito con soluzione di tricaina, una pipetta di plastica, uno stereomicroscopio, gomito pinzette e una siringa da insulina (Figura 1), nonché un serbatoio di pesce con sistema acqua per l'alloggiamento del pesce dopo l'iniezione.
- Consentire l'infortunato zebrafish preparato nei passaggi 2.1 – 2,10 per recuperare per 1 giorno dopo resezione ventricolare e poi anestetizzare il 1 pesce di dpa (post-amputazione giorni) nella soluzione di tricaina come descritto al punto 2.4.
- Trasferire il pesce anestetizzato, lato ventrale, la scanalatura nella spugna umida con le pinzette di gomito. Individuare il cuore che batte sotto lo stereomicroscopio.
- Caricare 10 µ l della soluzione nanoparticella siRNA-incapsulato nella siringa dell'insulina. Evitare per quanto possibile di bolle.
- Immobilizzare il pesce da delicatamente con le pinzette di gomito per tenere la regione toracica con la mano non dominante. Non stringere eccessivamente il pesce.
Nota: Tenere presente che nessun vasto spurgo dovrebbe verificarsi durante l'iniezione. - Tenere la siringa preriempita di insulina a ~ 30° e iniettare ~ 10 µ l di soluzione nella cavità toracica con l'altra mano (Supplemental figura 1).
Nota: La soluzione a volte fuoriesce durante l'iniezione, ma ciò non pregiudica l'effetto di siRNA. La soluzione di siRNA-nanoparticelle può essere iniettata una volta al giorno per diversi giorni a un mese, a seconda di un piano sperimentale specifico. Iniettare un pesce con un solo tipo di siRNA ogni volta. Se più di due tipi di siRNA bisogno di essere iniettato in un pesce, iniettare un tipo di siRNA ogni volta e poi iniettare un altro tipo di siRNA 1 h più successivamente. In questo protocollo, è stato iniettato un solo tipo di siRNA per pesce. - Trasferire il pesce per il serbatoio con l'acqua dell'impianto.
Nota: I pesci sono tenuti a riavviare ventilazione entro 1 min e poi riprendere nuoto. L'iniezione di nanoparticelle siRNA-incapsulati o siRNA normalmente non causa la morte in zebrafish adulto.
5. raccolta, fissazione e la valutazione dell'efficienza del siRNA consegna del cuore
- Preparare 1 mL di soluzione di paraformaldeide 4% in una microcentrifuga per ogni gruppo.
- Anestetizzare il pesce nella soluzione di tricaina a determinati giorni dopo le iniezioni. Mettere il pesce supinamente nella scanalatura in una spugna umida. Fare una grande incisione nella regione toracica e aprire ampiamente con le pinzette. Afferrare il tratto di efflusso ed estrarre l'intero cuore delicatamente con le pinzette.
- Sciacquare il cuore con PBS e rimuovere rapidamente il liquido supplementare con un tovagliolo. Mettere fino a 10 cuori in una microcentrifuga da 1,5 mL con paraformaldeide 1 mL. Delicatamente capovolgendo il tubo e mantenere una notte a 4 ° C.
- Misurare l'intensità di fluorescenza dei cuori Cy5-siRNA-iniettato usando lo in vivo imaging system (Supplemental figura 2). Utilizzare i cuori di zebrafish di 3 – 4 per ogni gruppo in questo studio.
- Montare i cuori fissi con paraffina o OCT composto (Embedding Medium per campioni di tessuto congelato garantire la temperatura ottimale di taglio).
6. valutazione delle nanoparticelle-mediata siRNA silenziamento genico
- Preparare un contenitore isolato e pinzette lunghe. Versare in azoto liquido ad un terzo del volume del contenitore.
- Anestetizzare il pesce nella soluzione di tricaina alle 2 dpa. Sezionare i cuori come descritto al punto 5.2 e quindi rimuovere il tratto di efflusso e l'atrio.
Nota: Il pesce può recuperare dalla chirurgia in un giorno e poi iniettato in 1 dpa con entrambi strapazzate siRNA-incapsulato nanoparticelle (siNC) come un negativo controllo o aldh1a2 siRNA-incapsulato nanoparticelle (siAldh1a2). - Trasferire i ventricoli in una microcentrifuga da 1,5 mL con le pinzette, coprire il coperchio del tubo e inserire subito il tubo nel contenitore isolante con azoto liquido. Lasciate che il galleggiante di tubi sull'azoto liquido per un minimo di qualche uso le lunghe pinzette per rimuovere i tubi dal contenitore.
- Ripetere i passaggi 6.2 e 6.3 sono raccolti tutti i ventricoli. Utilizzare 6 – 10 cuori per ogni gruppo.
- Estratto il RNA totale dei cuori con il reagente di isolamento del RNA. Valutare i livelli di espressione dei rispettivi geni mediante RT-PCR quantitativa utilizzando primers Gapdh f: GATACACGGAGCACCAGGTT; GAPDH r: GCCATCAGGTCACATACACG; Aldh1a2 f: TGAGCGAGGAGCAGCAGAGA; Aldh1a2 r: TCCACGAAGAAGCCTTTAGTAGCA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Per determinare l'efficienza della consegna Dendrimero-mediata siRNA, abbiamo resecato all'apice del ventricolo del cuore zebrafish, poi iniettato circa 10 µ l di Dendrimero solo (gruppo mock), Cy5-siRNA solo (gruppo nudo) o f-PAMAM-PEG-R9 Dendrimero-incapsulato Intrapleurally di Cy5-siRNA (gruppo Cy5-siRNA), rispettivamente (Figura 2A-B). Il segnale di fluorescenza era rilevabile nei cuori iniettati con incapsulato Dendrimero Cy5-siRNA a 3, 24 e 48 hpi (ore dopo l'iniezione), mentre era appena rilevabile nei cuori dai gruppi fittizi e nudi a 48 hpi (Figura 2C-D), suggerendo che il f-PAMAM-PEG-R9 Dendrimero efficacemente facilita la consegna di siRNA nel cuore adulto zebrafish ed è stabile per almeno due giorni.
Per studiare l'effetto di siRNA Dendrimero-incapsulato il silenziamento genico, abbiamo scelto aldh1a2 (enzima di sintesi di acido retinoico) come un gene target, che è stato segnalato per essere richiesto per la rigenerazione del cuore dopo resezione ventricolari44 . Come mostrato in Figura 3A, il pesce erano autorizzato a recuperare per un giorno dopo resezione ventricolo e quindi microiniettato con siRNA Dendrimero-incapsulato. Abbiamo trovato che il livello di espressione del mRNA di aldh1a2 è diminuito nei cuori trattati con f-PAMAM-PEG-R9 incapsulato Dendrimero siAldh1a2 rispetto a quella di siRNA strapazzato Dendrimero-incapsulato (siNC) alle 2 dpa (Figura 3B), dimostrando che f-PAMAM-PEG-R9 Dendrimero-mediata siRNAs raggiungere silenziamento gene-specifico nel cuore di zebrafish adulto.
Figura 1 : Strumenti di iniezione toracica e cardiochirurgia. Fotografia degli strumenti utilizzati per resezione ventricolo nel cuore adulto zebrafish: spugna con una scanalatura, gomito pinzette, pinze taglienti, iridectomy forbici, pinzette lunghe e la siringa di insulina utilizzato per il recapito di siRNA Dendrimero-incapsulato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Efficace f-PAMAM-PEG-R9 Dendrimero consegna-aiutata di siRNA nel cuore ferito di zebrafish adulto. (A) schema per analizzare l'efficienza di assorbimento delle nanoparticelle-incapsulato Cy5-siRNA in zebrafish adulto cuore dopo resezione ventricolo (dpa: post-amputazione giorni; hpi: ore post-iniezione). (B) sintesi di f-PAMAM-PEG-R9 Dendrimero e preparazione di Dendrimero-incapsulato Cy5-siRNA. (C) Cy5 imaging di fluorescenza di cuori iniettati con dendrimeri solo (Lupetto), Cy5-siRNA solo senza Dendrimero incapsulamento (nudo) e fluorescenza Dendrimero-incapsulato con l'etichetta Cy5-siRNA (Cy5-siRNA) rilevato dall'imaging in vivo sistema, mostrando che i segnali di fluorescenza sono stati quasi inosservabili nei gruppi fittizi e nudi alla 48 hpi, mentre forti segnali conservati nei gruppi di Cy5-siRNA Dendrimero-incapsulato da 3 a 48 hpi. La scala arbitraria dei segnali di fluorescenza Mostra da debole (blu) al forte (rosso). (D) quantificazione della fluorescenza di Cy5-siRNA segnali nei cuori valutati in vivo imaging sistema come pannello C (* P < 0,05, * * * P < 0,001; dati sono media ± s.e.m.; analisi unidirezionale della varianza seguita da Bonferroni di confronto tra più prove; n = 3-4 cuori). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Efficiente siRNA silenziamento di aldh1a2 nel cuore ferito di zebrafish adulto. (A) schema per lo studio dell'effetto di silenziamento genico di aldh1a2 siRNA. (B) qPCR rivela che aldh1a2 mRNA è diminuito nei cuori di nanoparticelle-incapsulato siAldh1a2 rispetto ai cuori delle nanoparticelle-incapsulato strapazzate siRNA (siNC). Il livello di espressione del mRNA di aldh1a2 è stato normalizzato di GAPDH (* * * P < 0,001; dati sono media ± s.e.m. con abbinato il test t di Student). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Complementare figura 1: immagini della cavità toracica iniezione. (A), la cavità toracica in pesci adulti al posto di 1 giorno l'amputazione. (B) iniezione di siRNA nanoparticella-incapsulato nella cavità toracica. Scala bar: 1 mm. per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Complementare figura 2: l'efficienza di assorbimento di nanoparticelle-incapsulato Cy5-siRNA in zebrafish adulto illeso cuore. (A) formazione immagine di fluorescenza Cy5 di cuori iniettati con dendrimeri solo (Lupetto), Cy5-siRNA nuda senza Dendrimero incapsulamento (nudo) e Cy5-siRNA Dendrimero-incapsulati sotto lo in vivo imaging system. La scala arbitraria dei segnali di fluorescenza è da deboli (blu) al forte (rosso). (B) quantificazione della fluorescenza di Cy5-siRNA segnali nei cuori misurati in vivo imaging sistema come pannello A (NC: non significativo diverso; dati sono media ± s.e.m.; analisi unidirezionale della varianza seguita dal Bonferroni di più test di confronto; n = 3-4 cuori). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Zebrafish è pienamente in grado di rigenerare una varietà di organi compreso il cuore adulto5. Mentre i metodi genetici e transgenici sono ben sviluppati per lo studio delle funzioni dei geni negli embrioni di zebrafish, gli investigatori sono ancora affrontare l'arduo compito di generare gli alleli del mutante condizionali in zebrafish45,46. Così, transgenici mutanti dominanti negativi o piccole molecole sono frequentemente utilizzato per le funzioni del gene di indirizzo in zebrafish adulto organi25,27,42. Negli ultimi pochi anni, abbiamo sviluppato un metodo alternativo per l'analisi di perdita di funzione di geni nel cuore adulto zebrafish utilizzando siRNA nanoparticella-mediate consegna e il silenziamento genico41,42, 43. qui, un protocollo dettagliato per questo metodo utilizzando siRNA Dendrimero-mediata silenziamento genico in zebrafish cuori in particolare e possibilmente in altri organi di zebrafish, in generale, è presentato.
La molecola di siRNA può entrare nelle cellule di per sé a causa della sua carica negativa e potrebbe essere facilmente degradata dalla nucleasi. Con mono-disperdere molecole, sintonizzabile strutture e proprietà, dendrimeri sono stati considerati come promettente siRNA vettori 47. I dendrimeri PAMAM hanno ricche periferie cationiche e ammine buffer all'interno della quale potrebbero mediare siRNA incapsulamento in condizioni fisiologiche e indurre un effetto "spugna protone" per rilasciare siRNA da endosomi nel citoplasma rispettivamente48 , 49 , 50. in questo articolo, il PAMAM è stato modificato per migliorare l'efficienza, stabilità e consegna. Il sistema f-PAMAM-PEG-R9 fornisce una testa emisferica di Dendrimero PAMAM con la carica positiva per l'incapsulamento di siRNA al fine di prevenire la degradazione della nucleasi. Il braccio di PEG e il peptide del transmembrane R9 è stato utilizzato per migliorare l'idrofilia delle nanoparticelle per la stabilizzazione e promuovere l'assorbimento dalle cellule rispettivamente.
La qualità e il tipo di nanoparticelle sono critici per la consegna efficace siRNA e silenziamento genico nel cuore zebrafish. Abbiamo studiato con successo tre nanoparticelle strutturalmente diversificata per questo scopo: PEG-PLA, f-PAMAM-PEG-R9 e PEI-HYD-RGD nanoparticelle41,42,43. Anche se non sono commercialmente prodotte, un laboratorio di chimica organica regolari può facilmente sintetizzare e purificare le nanoparticelle come descritto in precedenza35,37,43. Qui, abbiamo scelto il Dendrimero f-PAMAM-PEG-R9 come esempio per mostrare la consegna semplice, efficiente, Dendrimero-mediata siRNA e silenziamento genico nel cuore adulto zebrafish dopo resezione ventricolo, perché è relativamente facile da preparare siRNA-caricato Dendrimero-complessi, come incubando la miscela a temperatura ambiente per circa 20 min. D'altra parte, il pH deve essere regolata per siRNA-caricato nanocomplexes se PEI-HYD-RGD è usato43. Allo stesso modo, procedure emulsionante e purificazione sono essenziali per ottenere la soluzione uniforme delle nanoparticelle-incapsulato siRNA se PEG-PLA nanoparticelle sono usate35,41.
Un altro passo fondamentale è quello di ridurre al minimo o non avere nessun sanguinamento durante l'iniezione di siRNA Dendrimero-incapsulato come descritto in 4.5 in quanto vasto spurgo ostacola la rigenerazione del cuore e altri sistemi biologici. Quindi, suggeriamo escluse pesce da gruppi sperimentali, se l'emorragia si verifica durante l'iniezione. In generale, questa procedura semplice iniezione è facilmente imparata dopo un paio di prove.
Le principali limitazioni di questo metodo sono nella tecnologia siRNA, quali potenziali effetti fuori bersaglio e incompleta delezione dei geni di interesse. In caso contrario, replica altamente riproducibile biologica di silenziamento genico di diversi geni è stato dimostrato nel nostro lavoro e quello degli altri41. D'importanza, questo protocollo è rapido, semplice ed efficiente, e il trattamento di iniezione è ben tollerato di zebrafish adulto. Analisi sperimentale dell'efficienza di silenziamento genico di siRNA possono includere la valutazione dei livelli di espressione di mRNA di ibridazione in situ o RT-PCR quantitativa, o dei livelli di espressione della proteina mediante Western blot, immunoistochimica, o altre analisi funzionale. Insieme condividiamo appieno nanoparticella-facilitato siRNA consegna come uno strumento alternativo per gli studi di perdita-de-funzione nel cuore adulto zebrafish in particolare e questo approccio può essere esteso anche ad altri organi in zebrafish adulto e altri organismi di modello.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano il Dr. IC Bruce per osservazioni critiche e leggere il manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal National Natural Science Foundation of China (31430059, 31701272, 31730061, 81470399 e 31521062), Asia di AstraZeneca e medicina innovativa mercato emergenti e lo sviluppo iniziale.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| tricaine | Sigma | E10521 | Store at 4 °C |
| stereomicroscope | Leica | S8AP0 | |
| sharp forcep | WPI | 14098 | |
| iridectomy scissors | WPI | 501778 | |
| elbow tweezers | Suzhou Liuliu | SE05Cr | |
| α,ω-dipyridyl disulfido polyethylene glycol(Py-PEG-Py) | Biomatrik (Jiaxing) Inc. | 5239 | |
| core of G4.0 polyamidoamine (PAMAM) | Andrews ChemServices | AuCS-297 | |
| vacuum drying equipment | Yiheng | DZF-6020 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 14190144 | |
| tris(2-carboxyethyl)phosphine(TCEP) | Alfar Aesar | 51805-45-9 | Causes severe skin burns and eye damage. Causes serious eye damage. |
| ultrafiltration tube | Millipore | UFC900308 | |
| freeze dryer | Martin Christ | Alpha 2-4 Ldplus | |
| NMR spectrometer | Bruker | AV400 | |
| Deuterium oxide(D2O) | J&K | 174611 | |
| NMR sample tube | J&K | WG-1000-7-50 | |
| 3 kDa MWCO ultrafiltration tube | Merck | UFC900308 | |
| sea salts | Instant Ocean® | SS15-10 |
References
- Writing Group Members. Executive Summary: Heart Disease and Stroke Statistics--2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 133 (4), 447-454 (2016).
- Chablais, F., Veit, J., Rainer, G., Jazwinska, A. The zebrafish heart regenerates after cryoinjury-induced myocardial infarction. BMC Dev Biol. 11, 21 (2011).
- Gonzalez-Rosa, J. M., Martin, V., Peralta, M., Torres, M., Mercader, N. Extensive scar formation and regression during heart regeneration after cryoinjury in zebrafish. Development. 138 (9), 1663-1674 (2011).
- Parente, V., et al. Hypoxia/reoxygenation cardiac injury and regeneration in zebrafish adult heart. PLoS One. 8 (1), 53748 (2013).
- Poss, K. D., Wilson, L. G., Keating, M. T.
- Raya, A., et al. Activation of Notch signaling pathway precedes heart regeneration in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, Suppl 1 11889-11895 (2003).
- Schnabel, K., Wu, C. C., Kurth, T., Weidinger, G. Regeneration of cryoinjury induced necrotic heart lesions in zebrafish is associated with epicardial activation and cardiomyocyte proliferation. PLoS One. 6 (4), 18503 (2011).
- Wang, J., et al. The regenerative capacity of zebrafish reverses cardiac failure caused by genetic cardiomyocyte depletion. Development. 138 (16), 3421-3430 (2011).
- Gonzalez-Rosa, J. M., Burns, C. E., Burns, C. G. Zebrafish heart regeneration: 15 years of discoveries. Regeneration (Oxf). 4 (3), 105-123 (2017).
- Heasman, J., Kofron, M., Wylie, C. Beta-catenin signaling activity dissected in the early Xenopus embryo: a novel antisense approach. Dev Biol. 222 (1), 124-134 (2000).
- Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish. Nat Genet. 26 (2), 216-220 (2000).
- Coonrod, S. A., Bolling, L. C., Wright, P. W., Visconti, P. E., Herr, J. C. A morpholino phenocopy of the mouse mos mutation. Genesis. 30 (3), 198-200 (2001).
- London, C. A., et al. A novel antisense inhibitor of MMP-9 attenuates angiogenesis, human prostate cancer cell invasion and tumorigenicity. Cancer Gene Ther. 10 (11), 823-832 (2003).
- Kizil, C., Otto, G. W., Geisler, R., Nusslein-Volhard, C., Antos, C. L. Simplet controls cell proliferation and gene transcription during zebrafish caudal fin regeneration. Dev Biol. 325 (2), 329-340 (2009).
- Thummel, R., et al. Inhibition of zebrafish fin regeneration using in vivo. electroporation of morpholinos against fgfr1 and msxb. Dev Dyn. 235 (2), 336-346 (2006).
- Kizil, C., Brand, M. Cerebroventricular microinjection (CVMI) into adult zebrafish brain is an efficient misexpression method for forebrain ventricular cells. PLoS One. 6 (11), 27395 (2011).
- Kizil, C., Iltzsche, A., Kaslin, J., Brand, M. Micromanipulation of gene expression in the adult zebrafish brain using cerebroventricular microinjection of morpholino oligonucleotides. J Vis Exp. (75), e50415 (2013).
- Craig, S. E., et al. The zebrafish galectin Drgal1-l2 is expressed by proliferating Muller glia and photoreceptor progenitors and regulates the regeneration of rod photoreceptors. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (6), 3244-3252 (2010).
- Thummel, R., Bailey, T. J., Hyde, D. R. In vivo electroporation of morpholinos into the adult zebrafish retina. J Vis Exp. (58), e3603 (2011).
- Rayburn, E. R., Zhang, R. Antisense, RNAi and gene silencing strategies for therapy: mission possible or impossible. Drug Discov Today. 13 (11-12), 513-521 (2008).
- Seth, P. P., et al. Short antisense oligonucleotides with novel 2'-4' conformationaly restricted nucleoside analogues show improved potency without increased toxicity in animals. J Med Chem. 52 (1), 10-13 (2009).
- Prakash, T. P., et al. Antisense oligonucleotides containing conformationally constrained 2',4'-(N-methoxy)aminomethylene and 2',4'-aminooxymethylene and 2'-O,4'-C-aminomethylene bridged nucleoside analogues show improved potency in animal models. J Med Chem. 53 (4), 1636-1650 (2010).
- Yamamoto, T., Nakatani, M., Narukawa, K., Obika, S. Antisense drug discovery and development. Future Med Chem. 3 (3), 339-365 (2011).
- Itoh, M., Nakaura, M., Imanishi, T., Obika, S. Target gene knockdown by 2',4'-BNA/LNA antisense oligonucleotides in zebrafish. Nucleic Acid Ther. 24 (3), 186-191 (2014).
- Han, P., et al. Hydrogen peroxide primes heart regeneration with a derepression mechanism. Cell Res. 24 (9), 1091-1107 (2014).
- Jopling, C., et al. Zebrafish heart regeneration occurs by cardiomyocyte dedifferentiation and proliferation. Nature. 464 (7288), 606-609 (2010).
- Lepilina, A., et al. A dynamic epicardial injury response supports progenitor cell activity during zebrafish heart regeneration. Cell. 127 (3), 607-619 (2006).
- McManus, M. T., Sharp, P. A. Gene silencing in mammals by small interfering RNAs. Nat Rev Genet. 3 (10), 737-747 (2002).
- de Fougerolles, A., Vornlocher, H. P., Maraganore, J., Lieberman, J. Interfering with disease: a progress report on siRNA-based therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 6 (6), 443-453 (2007).
- Kim, D. H., Rossi, J. J. Strategies for silencing human disease using RNA interference. Nat Rev Genet. 8 (3), 173-184 (2007).
- McCaffrey, A. P., et al. Inhibition of hepatitis B virus in mice by RNA interference. Nat Biotechnol. 21 (6), 639-644 (2003).
- Raoul, C., et al. Lentiviral-mediated silencing of SOD1 through RNA interference retards disease onset and progression in a mouse model of ALS. Nat Med. 11 (4), 423-428 (2005).
- Hu-Lieskovan, S., Heidel, J. D., Bartlett, D. W., Davis, M. E., Triche, T. J. Sequence-specific knockdown of EWS-FLI1 by targeted, nonviral delivery of small interfering RNA inhibits tumor growth in a murine model of metastatic Ewing's sarcoma. Cancer Res. 65 (19), 8984-8992 (2005).
- Schiffelers, R. M., et al. Cancer siRNA therapy by tumor selective delivery with ligand-targeted sterically stabilized nanoparticle. Nucleic Acids Res. 32 (19), 149 (2004).
- Yang, X. Z., et al. Systemic delivery of siRNA with cationic lipid assisted PEG-PLA nanoparticles for cancer therapy. J Control Release. 156 (2), 203-211 (2011).
- Ko, Y. T., Hartner, W. C., Kale, A., Torchilin, V. P. Gene delivery into ischemic myocardium by double-targeted lipoplexes with anti-myosin antibody and TAT peptide. Gene Ther. 16 (1), 52-59 (2009).
- Liu, J., et al. Functionalized dendrimer-based delivery of angiotensin type 1 receptor siRNA for preserving cardiac function following infarction. Biomaterials. 34 (14), 3729-3736 (2013).
- Nam, H. Y., Kim, J., Kim, S. W., Bull, D. A. Cell targeting peptide conjugation to siRNA polyplexes for effective gene silencing in cardiomyocytes. Mol Pharm. 9 (5), 1302-1309 (2012).
- Nam, H. Y., McGinn, A., Kim, P. H., Kim, S. W., Bull, D. A. Primary cardiomyocyte-targeted bioreducible polymer for efficient gene delivery to the myocardium. Biomaterials. 31 (31), 8081-8087 (2010).
- Won, Y. W., McGinn, A. N., Lee, M., Bull, D. A., Kim, S. W. Targeted gene delivery to ischemic myocardium by homing peptide-guided polymeric carrier. Mol Pharm. 10 (1), 378-385 (2013).
- Diao, J., et al. PEG-PLA nanoparticles facilitate siRNA knockdown in adult zebrafish heart. Dev Biol. 406 (2), 196-202 (2015).
- Xiao, C., et al. Chromatin-remodelling factor Brg1 regulates myocardial proliferation and regeneration in zebrafish. Nat Commun. 7, 13787 (2016).
- Wang, F., et al. A Neutralized Noncharged Polyethylenimine-Based System for Efficient Delivery of siRNA into Heart without Toxicity. ACS Appl Mater Interfaces. 8 (49), 33529-33538 (2016).
- Kikuchi, K., et al. Retinoic acid production by endocardium and epicardium is an injury response essential for zebrafish heart regeneration. Dev Cell. 20 (3), 397-404 (2011).
- Hoshijima, K., Jurynec, M. J., Grunwald, D. J. Precise Editing of the Zebrafish Genome Made Simple and Efficient. Dev Cell. 36 (6), 654-667 (2016).
- Zu, Y., et al. TALEN-mediated precise genome modification by homologous recombination in zebrafish. Nat Methods. 10 (4), 329-331 (2013).
- Kesharwani, P., Gajbhiye, V., Jain, N. K. A review of nanocarriers for the delivery of small interfering RNA. Biomaterials. 33 (29), 7138-7150 (2012).
- Luong, D., et al. PEGylated PAMAM dendrimers: Enhancing efficacy and mitigating toxicity for effective anticancer drug and gene delivery. Acta Biomater. 43, 14-29 (2016).
- Luo, K., He, B., Wu, Y., Shen, Y., Gu, Z. Functional and biodegradable dendritic macromolecules with controlled architectures as nontoxic and efficient nanoscale gene vectors. Biotechnol Adv. 32 (4), 818-830 (2014).
- Shcharbin, D., Shakhbazau, A., Bryszewska, M. Poly(amidoamine) dendrimer complexes as a platform for gene delivery. Expert Opin Drug Deliv. 10 (12), 1687-1698 (2013).
