Summary
条件遺伝子ノックアウトまたは効果的な遺伝子ノックダウン アダルト ゼブラフィッシュ臓器を開発する主要な課題が残った。ここで実行するナノ粒子を介したの siRNA 遺伝子-サイレンシング アダルト ゼブラフィッシュ心臓、ゼブラフィッシュと他のモデル有機体の大人の臓器を研究するための新しい機能喪失メソッドを提供するためのプロトコルを報告します。
Abstract
哺乳類は、心筋梗塞後、心臓を再生成する非常に限られた能力を持っています。その一方で、大人のゼブラフィッシュは尖切除または cryoinjury、それに心臓再生研究のための重要なモデル有機体の後その心を再生成します。ただし、大人の臓器機能の喪失方法の欠如は、心臓再生のメカニズムへの洞察力を制限されています。別の配信システムを介して RNA 干渉は、哺乳類細胞やモデル生物の遺伝子を黙らせるための強力なツールです。SiRNA でカプセル化されたナノ粒子は正常にセルを入力し、再生アダルト ゼブラフィッシュ中心部に顕著な特定遺伝子ノックダウンの結果について報告しました。再生アダルト ゼブラフィッシュ中心に siRNA のデンドリマーを介した配信ならびに遺伝子サイレンシングのシンプル、迅速、かつ効率的なプロトコルを紹介します。このメソッドは、ゼブラフィッシュの大人の臓器の遺伝子機能を決定するための代替アプローチを提供し、同様に他のモデル生物に拡張することができます。
Introduction
心筋梗塞世界の1のまわりの途方もない経済的負担につながる、主要な健康の脅威となっています。大人の哺乳類の心臓は再生成し、瘢痕組織とその後心不全の形成につながる外傷後巨視的スケールで失われた心筋細胞を補充するために失敗します。哺乳類とは異なり、ゼブラフィッシュは主に心臓の損傷、それにの心臓再生の分子メカニズムを調査するための理想的なモデル生物の種類ごとに堅牢な心筋拡散を通じて、心を再生できます。2,3,4,5,6,7,8。内因性メカニズムの解明の基になるゼブラフィッシュの心臓再生は人間の心の再生の9を改善する新しい治療戦略の検索で研究のエキサイティングな領域です。
ゼブラフィッシュ遺伝子操作方法があります。これらは、カエル、ひよこ、ゼブラフィッシュ10、11,12,13以外の哺乳類でも広く使用されている morpholinos (MO) で構成されます。MO は、大人ゼブラフィッシュ フィン、脳、網膜14,15,16,17,18,19ターゲット遺伝子発現の効率的なノックダウン。ロックされた核酸酸 (LNA) はゼブラフィッシュ胚のみならず大人動物臓器20,21,22,の内因性遺伝子の発現をノックダウンする使用別の人工オリゴヌクレオチド23,24します。 ただし、大人の心のための効果的な機能喪失方法の欠如のまま臓器再生の分子メカニズムを勉強中の障害物。現在、低分子阻害剤やドミナント ネガティブ変異体の遺伝子組換え発現で、主に特定の遺伝子やアダルト ゼブラフィッシュ心臓再生25,26 でその機能を勉強する経路の機能をブロックに使用します。 ,27。ただし、いないすべての遺伝子やシグナル伝達経路はこれらのメソッドに適用されます。
小さい干渉の Rna (Sirna) に広く哺乳類細胞および胚モデル生物だけでなく、大人の臓器の機能喪失における前臨床試験動物モデルの28,29,30,31,32. 沈黙遺伝子腫瘍33,34,35心筋36,37,38,39 に Sirna を効果的に使用されています。 ,40 別の配信システムを使用します。最近では、開発した効率的な siRNA でカプセル化されたナノ粒子はいくつか異なるナノ粒子41,42,43, を使用して再生の成人の心臓の遺伝子サイレンシングの新しいツールを提供します。アダルト ゼブラフィッシュ臓器における遺伝子の機能解析。私たち以前研究41,42,43に基づいて、ここでは提示 siRNA 遺伝子-サイレンシング f PAMAM-ペグ R9 を使用して再生アダルト ゼブラフィッシュ心臓のための実用的なシンプルで強力なプロトコルデンドリマー。Aldh1a2(アルデヒド脱水素酵素 1 家族、メンバー A2) ゼブラフィッシュ尖切除後亢進していた遺伝子とAldh1a2のアブレーション ブロック心筋再生44。ここでは、siRNA のナノ粒子カプセル注入による遺伝子ノックダウン効率をテストするための例としてaldh1a2遺伝子を取る。このプロトコルには、アダルト ゼブラフィッシュ心臓にゼブラフィッシュ心臓切除、ナノ粒子の化学合成 siRNA でカプセル化されたナノ粒子の配信方法の手順が含まれています。
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Protocol
すべて動物のプロシージャには、動物介護制度と評価・実験動物ケアの認定会の認定を受けて完全に北京大学利用委員会によって承認されたゼブラフィッシュ プロトコルが使用されます。
1 Tricaine 溶液の調製
- Tricaine 原液を準備するには、97.9 蒸溜水に 400 mg エチル 3-アミノ安息香酸メタンスルホン酸パウダーを追加し、1 M トリス (pH 9.5) 〜 7 の pH を調整するための 2.1 mL を追加します。4 ° C で原液を保存します。
- Tricaine 作業ソリューションを準備するには、4.2 mL tricaine 原液を 100 mL 水槽システムに追加します。
2. 大人のゼブラフィッシュ心室切除
- 器具をスポンジ、ペトリ皿作業ソリューション、プラスチック ピペット、顕微鏡、2 つの鋭い鉗子、虹彩はさみ、tricaine でいっぱいの作品を含む、手術材料を準備し、肘のピンセット (図 1)。
- 4 cm × 0.5 cm の心室切除術中、ゼブラフィッシュを保持するためにスポンジに深さ 0.5 cm サイズの小さな溝を準備します。
- DH2O 負傷魚の回復のための塩の 3 L ゼブラフィッシュ タンク タンク半分 60 mg/L 海を使用して作られているゼブラフィッシュ システム水の塗りつぶし。
- ギルの動き、1 秒あたり 1 に減少し、少なくとも 30 魚を飼うまで 10 cm シャーレ tricaine ソリューションで魚を麻酔完全に麻酔を確実に s。
- 肘ピンセットで麻酔をかけられた魚を湿ったスポンジの腹側の溝に転送します。心臓の鼓動のマージンを視覚的に特定し、顕微鏡下で心を見つけます。
- 皮膚と筋肉を貫通 1 mm 程度の小さな切開をする虹彩はさみを使用し、慎重に中心部にアクセスする鉗子先端の心膜嚢の銀色の上皮層を引き裂きます。心臓の損傷を避けるためにキャビティにあまりにも深く、鉗子を挿入しないでください。
注: この時点で、大量出血を避けるために覚えてをおいてください。広範な出血が発生した場合心に偶発的な損傷によって引き起こされる主に過度の出血、だから結果が誤解を招くことになりますので、実験から魚を除外します。 - 静かに非支配的な手を使ってシャープな鉗子で頂点を保持または腹部で穏やかな圧力を適用することで心室を公開します。その後、もう一方の手で、虹彩はさみを使用して頂点に心室の ~ 20% を削除します。
注: 大規模な出血は発生しませんこの時点で。 - 切開、凝固、前に 15-45 s のやたらと傷の出血としてカバーするウェット ナプキンを使用し、システムの水のタンクに魚を戻します。
注: 切開部を縫合する必要はありません。 - 魚が 1 分内鰓の動きを取り戻すし、水泳を再開していることを確認します。魚 50 後鰓の動きが表示されない場合 s 水では魚はアクティブ換気を再開するまでプラスチックのピペットを使用してエラに水を噴出させ、それを促進します。
- 心室の切除後、リサイクル システムで魚を維持します。
注: 特別な気する必要はありません通常の魚と比較しています。アダルト ゼブラフィッシュ心室切除術の死亡率は、約 5-10% です。ほとんどすべての死は手術後 24 時間内で発生します。
3. siRNA でカプセル化されたナノ粒子の調製
- 合成 f PAM4-ペグ-R9 デンドリマー。
注: f PAM4の合成-ペグ-R9 デンドリマー材料はいくつかの変更と37を前述のように行った。Α, ω-ジピリジル disulfido ポリエチレング リコール (PEG Py 坪) の長さは、(図 2B) siRNAs のカプセル化を最大限に 1,000 の分子量に減少しました。 - G4.0 抗ガン剤保持能 (と呼ばれる PAMAM) 45 ° C で 1 時間減圧乾燥機を使用してのシスタミン コアの 10 mg を乾燥し、2 mL ダルベッコ リン酸緩衝生理食塩水 (DPBS、様々 な細胞培養アプリケーションに使用されるバランスの取れた塩溶液) で PAMAM を解散します。
- 1 mL の DPBS に 1.7 mg tris(2-carboxyethyl) ホスフィン (TCEP) を解散、3.2 で、PAMAM 溶液を混ぜて、8 h の穏やかな攪拌しながら常温のまま。
注: TCEP はモル比、PAMAM のジスルフィド結合に過剰の 10 倍です。 - 限外濾過法による過剰な TCEP を削除します。DPBS、上記 PAMAM TCEP 混合物に追加 10 mL の量に達するし、ソリューションが 3 kDa MWCO (分子切断) 限外ろ過チューブに転送されます。15 分間 3,000 g で遠心分離後コレクションの管にソリューションを破棄します。DPBS デバイスに追加フィルター 10 mL と優しくピペット、サンプルを複数回、再び遠心力場します。4 回には、この手順を繰り返します。最後の濾過後フィルター デバイスからサンプルを吸引します。
注: この手順の製品が減少 PAMAM (f PAM4 と呼ばれる)。 - 14 mg Py ペグ Py 1 mL DPBS、ミックスで f PAM4 ソリューションを溶解し、3 時間室温で穏やかな攪拌でそれを残してください。限外ろ過ステップ 3.4 に記載して過剰な Py ペグ Py を削除します。最後の濾過後フィルター デバイスからサンプルを吸引します。
注: f PAM4 PEG 坪として製品と呼びます。Py-ペグ-Py の量は 10 倍 f PAM4 のチオール グループにモル比で。 - ディゾルブ システインの 6.4 mg 終了 1 mL DPBS R9 ペプチド (Ac-CRRRRRRRRR-NH2)、f PAM4 ペグ坪を混ぜて、室温で 8 時間ゆっくり撹拌します。限外ろ過ステップ DPBS を脱イオン水に変更することを除いて、3.4 で説明されているようで f PAM4 ペグ R9 と呼ばれる、最終製品を浄化します。凍結真空乾燥機を使用して製品を凍結乾燥します。
メモ: 3.5、3.6 凍結乾燥前に製品は、少なくとも 1 ヶ月-20 ℃ で保存されます。F PAM4-ペグ R9 の凍結乾燥後サンプルは最低 2 ヶ月は-20 ℃ で保存されます。 - PEG およびペプチドの修正の程度を判断するには、f-PAM4-ペグ-Py で D2O (重水) 5 mg を溶解し、NMR (核磁気共鳴) サンプル チューブに転送。400 MHz で 1 H NMR スペクトル解析を実行し、NMR データ分析ソフトウェア37を使用してデータを分析します。
注: 具体的には、代表 PAMAM ピーク (- NCH2CH2CO-)、ペグのピーク (- OCH2CH2-) とアルギニン残基のピーク (- HCCH2CH2CH2NH-)、ペプチドはそれぞれ範囲 2.4 – 2.6, 3.7-3.8, と 1.6-1.8 ppm にする予定です。PAMAM ピークにペグと R9 のピークの積分を計算することでペグと R9、PAMAM 基準の修正の度合いを決定します。Peg 修飾率は 100%、R9 の変更は少なくとも 50%。1H NMR スペクトル解析は、機関の中核施設で行われます。 - 4f PAM を溶解-ペグ-R9 デンドリマーを 4 mg/mL の PBS で粉体および 1 回の使用のためのソリューションの因数を作る。
注: デンドリマー ソリューション格納できます-20 ° C で少なくとも 1 ヶ月せずに凍結・融解を繰り返します。 - シアニン色素標識 Sirna (Cy5 siRNA と呼ばれる)、Aldh1a2 siRNA またはスクランブル ネガティブ コントロール siRNA 10 μ M の蒸留水で溶解します。
注: は、ナノ粒子カプセル化 siRNA は魚中心 (図 2A B) を入力できるかどうかを評価するシアニン色素標識 Sirna を使用します。このプロトコルは、f-PAM4-ペグ-R9 デンドリマー内包 siRNA の配信の効率を判断する例遺伝子としてaldh1a2を受け取ります。SiRNAs のシーケンス: Cy5 siRNA アンチセンス鎖: 3 '5'-ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT-、siAldh1a2 アンチセンス鎖: 5'-UUCAGGACAACCGUGUUCCdTdT-3' とスクランブルのネガティブ コントロール siRNA アンチセンス鎖: 5'-ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT-3'。 - SiRNA でカプセル化されたナノ粒子溶液を準備、デンドリマー ソリューションの等量と siRNA をミックス、インキュベートして 20 分室温でサンプルはたて使用する前に siRNA ナノ粒子溶液を準備します。
注: siRNA でカプセル化されたナノ粒子溶液の量は注入するつもりの魚の数に依存します。たとえば、少なくとも 120 μ L デンドリマー ソリューション (ミックス 60 μ L siRNA ソリューションと 60 μ L デンドリマー ソリューション) を 10 魚 (魚あたり 〜 10 μ L) 注入の準備ソリューションの損失にカウントします。
4. 大人のゼブラフィッシュ心臓に siRNA でカプセル化されたナノ粒子の注入
- 前述のように、溝、tricaine ソリューション, プラスチック製のピペット、顕微鏡、肘ピンセット、インスリン注射器 (図 1) と 10 cm シャーレでスポンジの部分を用いた水槽だけでなく、水の準備住宅、注入後の魚します。
- 心室切除後 1 日回復する準備手順 2.1-2.10 で負傷したゼブラフィッシュを可能にし、2.4 で説明されているように tricaine ソリューション 1 の dpa (日後切断) 魚を麻酔します。
- 麻酔をかけられた魚、肘ピンセットを使用して、湿ったスポンジの溝に、腹側を転送します。個人差の下で心臓の鼓動を探します。
- インスリン注射器に siRNA でカプセル化されたナノ粒子溶液 10 μ L をロードします。できるだけ多くの泡を避けるため。
- 優しく非支配的な手で胸部を保持するために肘のピンセットを使用して魚を固定します。あまりにもしっかりと魚を固定しないで
注: 注入中に広範な出血が発生しないことを覚えておいてください。 - ~ 30 ° でインスリン注射器を押し、他の手 (補足図 1) を使用して、胸腔内にソリューションの ~ 10 μ L を注入します。
注: ソリューションは時々 注入中を流れるが、siRNA の効果には影響しません。SiRNA ナノ粒子溶液は、特定実験計画によって、1 ヶ月に数日間一日一回注入することができます。たびに、siRNA の一種で魚を挿入します。SiRNA の以上 2 つのタイプは、1 匹の魚に注入する必要がある、たびに、siRNA の一種を注入し、siRNA 1 h 後の別の種類を挿入します。このプロトコルでは、siRNA 魚ごとの 1 種類のみを注入しました。 - システム水のタンクに魚を転送します。
注: 魚は 1 分以内の換気を再起動し、スイミングを再開する予定です。SiRNA でカプセル化されたナノ粒子や siRNA の注入通常発生しません死アダルト ゼブラフィッシュ。
5. ハート コレクション、固定および siRNA 配信の効率の評価
- グループごとに微量遠心チューブに 4% パラホルムアルデヒド溶液の 1 mL を準備します。
- Tricaine ソリューションで魚を麻酔注射後選択した日。しっとりスポンジに溝に無気力の魚を配置します。胸部に大きな切開を行うし、ピンセットで広く開きます。流出路のグリップし、ピンセットで慎重に全体の心を抜きます。
- PBS で心を洗い、ナプキンで余分な液体を急速に除去。最大 10 心を 1 mL パラホルムアルデヒドで 1.5 mL 遠心チューブに入れます。軽く数回、チューブを反転し、4 ° C で一晩を維持
- 生体内イメージング システム (補足図 2) Cy5 Sirna 注入心の蛍光強度を測定します。本研究ではグループごとに 3-4 ゼブラフィッシュ心を使用します。
- パラフィンまたは 10 月化合物 (最適切削温度を確保するための組織検体の冷凍の埋め込み中) のいずれかで固定の心をマウントします。
6. ナノ粒子を介した siRNA 遺伝子サイレンシングの評価
- 断熱容器と長いピンセットを準備します。液体窒素容器の体積の 3 分の 1 を注ぐ。
- Tricaine 溶液中 2 dpa で魚を麻酔します。5.2 で説明されているように、心を解剖し、流出路とアトリウムを削除します。
注: 魚は 1 日で、手術から回復することができ、マイナス コントロールまたは aldh1a2 siRNA でカプセル化されたナノ粒子 (siAldh1a2) としていずれかのスクランブル siRNA でカプセル化された微粒子 (siNC) 1 dpa にそれから注入されます。 - ピンセットを使用して 1.5 mL 遠心チューブに心室を転送、チューブの蓋を蓋をしてすぐに液体窒素で断熱容器にチューブを配置します。いくつ分コンテナーからチューブを削除する長いピンセットを使用のため、液体窒素にチューブのフロートをしましょう。
- すべて心室が収集されるまでは、6.2 と 6.3 の手順を繰り返します。グループごとに 6-10 心を使用します。
- RNA 分離試薬と心のトータル RNA を抽出します。定量的 RT-PCR 法によりそれぞれの遺伝子の発現レベルを評価するプライマー Gapdh f: GATACACGGAGCACCAGGTT; を使用してGapdh r: GCCATCAGGTCACATACACG;Aldh1a2 f: TGAGCGAGGAGCAGCAGAGA;Aldh1a2 r: TCCACGAAGAAGCCTTTAGTAGCA。
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Representative Results
デンドリマーを介したによる siRNA デリバリーの効率を決定するには、我々 はゼブラフィッシュ心臓の心室の頂点を切除し、デンドリマーのみ約 10 μ L (モック グループ)、Cy5-siRNA だけ (裸グループ)、または f PAMAM ペグ R9 デンドリマー内包を注入Cy5 siRNA (Cy5 siRNA グループ) intrapleurally それぞれ (図 2の B)。蛍光信号が 3、24、および 48 時間 (時間後注入)、デンドリマー内包 Cy5 siRNA を注入した心の中に検出可能な 48 hpi (図 2C D) のモックと裸のグループから心の中でほとんど検出不可能であったf-PAMAM-ペグ-R9 デンドリマーは効果的にアダルト ゼブラフィッシュ心臓に siRNAs の配達を促進し、少なくとも 2 日間は安定を示唆しています。
デンドリマー内包 sirna 遺伝子サイレンシングに及ぼす影響を調べるためには、我々 は心室切除44後心臓再生の報告されている標的遺伝子としてaldh1a2 (レチノイン酸合成酵素) を選んだ.図 3Aに示すように、魚が心室切除後 1 日を回復させて、デンドリマー内包 siRNA と microinjected。奏効したデンドリマー内包スクランブル siRNA (siNC) 2 dpa (図 3B) と比較して f PAMAM-ペグ R9 デンドリマー内包 siAldh1a2 心の中でaldh1a2の mRNA 発現レベルを減少することがわかったf-PAMAM-ペグ-R9 デンドリマーを介した Sirna が特定遺伝子サイレンシング アダルト ゼブラフィッシュ心臓を達成することを示します。
図 1:心臓手術、胸部フローインジェクション分析装置。アダルト ゼブラフィッシュ心臓の心室の切除に使用楽器の写真: 溝、肘ピンセット、鋭い鉗子、虹彩はさみ、長いピンセット デンドリマー内包による siRNA デリバリー用インスリン注射器とスポンジ。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2:効果的な f-PAMAM-ペグ-R9 デンドリマーによる配信 siRNA の負傷したアダルト ゼブラフィッシュ心臓にします。心室切除後大人ゼブラフィッシュ心臓でナノ粒子内包 Cy5 siRNA の吸収効率を調査するため (A) 方式 (dpa: 日後切断; hpi: 時間投与後)。(B) 合成 f PAMAM-ペグ R9 デンドリマーとデンドリマー内包 Cy5 siRNA の準備。(C) 心のみを有するデンドリマーを注入 (もどき) のみデンドリマー カプセル化 (裸)、および蛍光のデンドリマー内包しない Cy5 siRNA の Cy5 蛍光ラベル Cy5 siRNA (Cy5 siRNA) in vivoイメージングによる検出蛍光信号は強い信号デンドリマー内包 Cy5 siRNA グループ 3 から 48 時間内に保持しながら、48 時間でモックと裸のグループでほぼ検出されなかったことを示すシステム。強い (赤) に弱い (青) から蛍光信号の任意のスケールを示しています。心生体内イメージング パネル C のようにシステム評価における信号の Cy5 siRNA 蛍光の (D) の定量化 (* P < 0.05 * * * P < 0.001 データが平均 ± s.e.m.; ボンフェローニ続いて一方向の分散分析の多重比較テスト;n = 3-4 心)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 効率的な siRNA が負傷したアダルト ゼブラフィッシュ中心部にaldh1a2のサイレンシングします。(A) 方式aldh1a2 sirna 遺伝子サイレンシング効果を調査するため。(B) qPCR 明らかにそのaldh1a2ナノ粒子内包スクランブル siRNA 心 (siNC) と比較してナノ粒子カプセル siAldh1a2 心の中で mRNA が減少しました。Aldh1a2の mRNA 発現レベルは、GAPDH によって正常化されました (* * * P < 0.001; データで ± s.e.m. ペア スチューデントの t 検定を意味)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
補足図 1: 胸腔内注入の画像。(A) 1 日のポストで成魚で胸腔内の切断。(B) 注入ナノ粒子カプセル化 siRNA の胸腔内。バーをスケール: 1 mm.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
補足図 2: ナノ粒子内包 Cy5 siRNA 無傷アダルト ゼブラフィッシュ心臓での吸収効率。(A) デンドリマーのみ (もどき) を注入した心の Cy5 蛍光イメージング (裸)、デンドリマーのカプセル化デンドリマー内包 Cy5 siRNA の生体内イメージング システムなし裸 Cy5 siRNA。蛍光信号の任意のスケールは弱い (青) から強い (赤) です。心生体内イメージング システム パネル A のように測定信号を Cy5 siRNA 蛍光の (B) の定量化 (NC: 有意データ平均 ± s.e.m.; ボンフェローニ続いて一方向の分散分析は複数の異なる比較テストn = 3-4 心)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
ゼブラフィッシュはさまざまな成人の心臓5を含む臓器を再生可能です。遺伝子と遺伝的メソッドがゼブラフィッシュの胚の遺伝子機能を勉強のためよく発達した中、捜査官がまだゼブラフィッシュ45,46で条件付き変異対立遺伝子の生成の困難な課題に直面します。したがって、遺伝子ドミナント ネガティブ変異体または低分子阻害剤は、大人のゼブラフィッシュ臓器25,27,42で遺伝子機能に対応するよく使用されます。過去数年、代替によるナノ粒子を介した siRNA 遺伝子サイレンシング41,42,アダルト ゼブラフィッシュ心臓における遺伝子の機能喪失の解析法を開発した43。 この手法を用いてデンドリマーを介した siRNA 遺伝子サイレンシング ゼブラフィッシュ心特に、おそらく一般的には、他のゼブラフィッシュ臓器のための詳しいプロトコルを提示するここでは。
SiRNA 分子はその負電荷により自体によってセルに入力できないし、ヌクレアーゼによって容易に分解します。単分散の分子、可変構造と特性、デンドリマーは、有望な siRNA キャリア47とみなされています。PAMAM デンドリマーは、豊富な陽イオン周辺と内部にバッファリング アミンが生理的条件での siRNA のカプセル化を仲介する細胞のエンドソームから siRNA をそれぞれリリースする「プロトン スポンジ」の効果を誘発する48,49,50します。 この記事で、PAMAM が安定性と配信の効率を高めるために変更されました。F-PAMAM-ペグ-R9 システムは、siRNA 封入ヌクレアーゼによる劣化を防止するために正の電荷をもつ半球 PAMAM デンドリマー頭を提供します。ペグ腕と R9 の貫通型ペプチドは、安定化のナノ粒子の親水性を向上し、それぞれ細胞による取り込みを促進する使用されました。
品質とナノ粒子の種類、効果的な siRNA 送達の重要な遺伝子-サイレンシング ゼブラフィッシュ心臓。この目的のため 3 つの構造的に多様なナノ粒子を調べた正常に: ナノ粒子 f PAMAM ペグ R9 とプリンスエド ワード島 HYD RGD41,42,43ペグ PLA。商業生産はしていないが通常の有機化学研究室は簡単に合成し、35,37,43を前述のようにナノ粒子を浄化できます。アダルト ゼブラフィッシュ心臓の心室切除後シンプル、効率的、デンドリマーを介した siRNA 送達ならびに遺伝子サイレンシングを示す例として f PAMAM-ペグ R9 デンドリマーを選びました siRNA ロードを準備する比較的簡単だからここでは、デンドリマー-錯体などの 〜 20 分常温混合物の孵化によって。その一方で、pH は PEI HYD RGD が使用される43siRNA ロード nanocomplexes の補正します。同様に、乳化と精製の手順は、ペグ PLA ナノ粒子が使用される35,41場合均一なナノ粒子内包 siRNA ソリューションを取得に不可欠です。
もう一つの重要なステップは、最小化または心臓再生やその他の生物学的システムに割り込み大量出血から 4.5 の説明に従ってデンドリマー内包 siRNA 投与中に出血がなくなります。注入中に発生した実験群から魚を除外する場合は出血と考えられました。一般的には、この簡単な注射の手順はいくつかの試験の後容易に習得します。
このメソッドの主要な制限は、潜在的なターゲットを離れて効果など興味のある遺伝子の不完全な削除自体は、siRNA 技術にあります。それ以外の場合、いくつかの遺伝子の遺伝子サイレンシングの再現性の高い生物学的レプリケーションされている41私たちの仕事と他のことで示されます。重要なは、このプロトコルは、迅速、簡単、かつ効率的で、注射治療は成人のゼブラフィッシュをよく容認。SiRNA 遺伝子サイレンシング効率の実験的解析は、 in situハイブリダイゼーションや定量的 RT-PCR による mRNA 発現レベルのまたは西部のしみ、免疫組織化学的染色を用いたバイオマーカ発現量の評価を含めることができますかその他の機能解析。一緒に、我々 は完全に、特にアダルト ゼブラフィッシュ心臓の機能喪失研究の代替ツールとして容易にナノ粒子による siRNA デリバリーを支持する、このアプローチは大人ゼブラフィッシュと他のモデル有機体の他の臓器にも拡張可能性があります。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
著者は批判的なコメントありがとう博士 IC ブルースと原稿を読んでします。この作品は、国家自然科学基金、中国の (31430059、31701272、31730061、81470399、および 31521062)、アストラゼネカ アジア、新興市場の革新的な医学、初期開発からの補助金によって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| tricaine | Sigma | E10521 | Store at 4 °C |
| stereomicroscope | Leica | S8AP0 | |
| sharp forcep | WPI | 14098 | |
| iridectomy scissors | WPI | 501778 | |
| elbow tweezers | Suzhou Liuliu | SE05Cr | |
| α,ω-dipyridyl disulfido polyethylene glycol(Py-PEG-Py) | Biomatrik (Jiaxing) Inc. | 5239 | |
| core of G4.0 polyamidoamine (PAMAM) | Andrews ChemServices | AuCS-297 | |
| vacuum drying equipment | Yiheng | DZF-6020 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 14190144 | |
| tris(2-carboxyethyl)phosphine(TCEP) | Alfar Aesar | 51805-45-9 | Causes severe skin burns and eye damage. Causes serious eye damage. |
| ultrafiltration tube | Millipore | UFC900308 | |
| freeze dryer | Martin Christ | Alpha 2-4 Ldplus | |
| NMR spectrometer | Bruker | AV400 | |
| Deuterium oxide(D2O) | J&K | 174611 | |
| NMR sample tube | J&K | WG-1000-7-50 | |
| 3 kDa MWCO ultrafiltration tube | Merck | UFC900308 | |
| sea salts | Instant Ocean® | SS15-10 |
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