Summary
조건부 유전자 녹아웃 또는 효과적인 유전자-최저 성인 zebrafish 장기를 개발 하는 주요 도전 남아 있다. 여기 우리 보고 수행 나노 중재 siRNA 유전자-성인 zebrafish 마음에 입을, 성인 기관 zebrafish 및 다른 모형 유기 체 공부에 대 한 새로운 기능 손실 방법 제공에 대 한 프로토콜.
Abstract
포유류 심근 경색 후 심 혼을 회생 하는 매우 제한 된 용량을가지고. 다른 한편으로, 성인 zebrafish 정점 절제 또는 cryoinjury, 그것에 게 심장 재생 연구에 대 한 중요 한 모형 유기 체를 만드는 후 그것의 심 혼을 재생성 합니다. 그러나, 성인 기관에 대 한 손실의 기능 방법의 부족은 심장 재생을 기본 메커니즘에 대 한 통찰력을 제한 했다. 다른 배달 시스템을 통해 RNA 간섭 포유류 세포 및 모형 유기 체에서 유전자 침묵 시키기를 위한 강력한 도구입니다. 우리 이전 siRNA 캡슐화 된 나노 성공적으로 셀 입력 및 재생 성인 zebrafish 마음에 놀라운 유전자 특정 최저에서 결과 보고 있다. 여기, 우리는 재생 성인 zebrafish 마음에 dendrimer 중재 siRNA 전달 및 유전자 침묵에 대 한 간단한 빠르고 효율적인 프로토콜을 제시. 이 메서드 zebrafish 성인 기관에서 유전자 기능을 결정 하기 위한 다른 접근을 제공 하 고 뿐만 아니라 다른 모델 유기 체에 확장 될 수 있습니다.
Introduction
심근 경색은 세계1주위 엄청난 경제적 부담으로 이어지는 주요 건강 위협이 되었다. 성인 포유류 심장 재생성 하 고 거시적인 규모 손실된 cardiomyocytes 흉터 조직 및 후속 심장 마비의 형성으로 이어지는 부상 후 보충 되지 않습니다. 포유류, 달리는 제 브라는 주로 심장 상해, 조사 심장 재생 의 분자 메커니즘에 대 한 이상적인 모델 유기 체 그것을 만들기의 다른 유형 후에 강력한 심근 확산을 통해 심장 재생 2,3,,45,6,,78. 해독 생 메커니즘 기본 zebrafish 심장 재생 인간의 심장 재생9를 개선 하기 위해 새로운 치료 전략에 대 한 검색에 있는 연구의 흥미로운 지역입니다.
유전자 조작 방법 zebrafish에 사용할 수 있습니다. 개구리, 병아리, 그리고 zebrafish10,11,,1213포유류 외에 널리 사용 되는 morpholinos (MO) 이들에 의하여 이루어져 있다. 모 성인 zebrafish 지 느 러 미, 뇌, 그리고 망막14,15,16,17,,1819에 대상 유전자 발현의 효율적인 최저가 있다. 잠겨-핵 산 (LNA)는 내 생 유전자 표현의 zebrafish 태아 뿐만 아니라 성인 동물 장기20,,2122, 에 노크를 사용 하는 다른 인공 oligonucleotide 23 , 그러나 24. 성인 마음에 대 한 효과적인 손실의 기능 방법의 부족 장기 중생의 분자 메커니즘을 공부에 장애를 유지 하는. 현재, 작은 분자 억제제 또는 지배적인 부정적인 돌연변이의 유전자 변형 식에서 주로 사용 특정 유전자 또는 성인 zebrafish 심장 재생25,26에에서 그것의 기능을 공부 하는 통로의 기능을 차단 하 ,27. 그러나, 모든 유전자 또는 신호 통로 이러한 방법에 대 한 적용.
작은 방해 RNAs (siRNAs)는 널리 사용 포유류 세포에 모형 유기 체 뿐만 아니라 성인 장기의 배아 손실의 기능 분석에 대 한 동물에서 전 임상 연구 모델28,,2930 , 31 , 32. siRNAs 종양33,,3435 그리고 cardiomyocytes36,,3738,39 유전자 침묵을 효과적으로 사용 되었습니다 ,40 다른 배달 시스템을 통해. 최근, 우리 개발 효율적인 siRNA로 캡슐화 된 나노 유전자-침묵 여러 다른 나노 입자41,,4243를 사용 하 여 재생 성인 심장에 대 한 새로운 도구를 제공 하 성인 zebrafish 장기에서 유전자의 기능 연구입니다. 우리의 이전 연구41,,4243을 바탕으로, 여기에 우리가 현재 siRNA 유전자 f PAMAM 페그-r 9을 사용 하 여 재생 성인 zebrafish 마음에 입을 위한 단순, 실용적인, 하지만 강력한 프로토콜 dendrimers입니다. Aldh1a2 (알데하이드 효소 1, 가족 A2) 유전자 upregulated zebrafish 정점 절제 후 되었고 Aldh1a2 의 제거 차단 심장 재생44. 여기 우리가 나노 캡슐화 siRNA 주입 하 여 중재 유전자 때 려 눕 힘 효율성을 테스트 하는 예제로 aldh1a2 유전자를 가져가 라. 이 프로토콜은 성인 zebrafish 마음에 zebrafish 심장 절제, 나노 입자의 화학 합성 siRNA 캡슐화 된 나노 입자에 전달 방법에 대 한 절차를 포함합니다.
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Protocol
모든 동물 절차는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 평가 및 실험 동물 관리 인증 협회 인증는 북경 대학에서 승인한 zebrafish 프로토콜 사용.
1입니다. Tricaine 솔루션의 준비
- Tricaine 재고 솔루션을 준비 하려면 97.9 mL 증 류 물, 400mg 에틸 3 aminobenzoate methanesulfonate 분말을 추가 하 고 2.1 mL 1 M 트리 스 (pH 9.5) ~ 7 pH 조정의 추가. 4 ° c.에 재고 솔루션 저장
- Tricaine 작업 솔루션을 준비, 100 mL 수족관 시스템 물 4.2 mL tricaine 재고 솔루션을 추가 합니다.
2. 성인 Zebrafish 심 실 절제술
- 악기와 스폰지, tricaine 솔루션, 플라스틱 피 펫는 stereomicroscope, 2 개의 날카로운 집게, iridectomy가 위 작업으로 가득 페 트리 접시의 조각을 포함 하는 수술에 대 한 자료를 준비 하 고 팔꿈치 핀셋 (그림 1).
- 심 실 절제술 수술 동안에 제 브라를 스펀지에 깊이 0.5 c m 4 c m x 0.5 c m 크기의 작은 홈 준비.
- 채우기 3 L zebrafish 탱크 60 mg/L 바다를 사용 하 여 만든 zebrafish 시스템 물의 절반 탱크와 dH2O 부상된 물고기의 복구에 대 한 소금.
- 길 움직임 초당 한 감소 시키고 적어도 30 물고기까지 10 cm 배양 접시 tricaine 솔루션 물고기 anesthetize 그것 완전히 마 취 되도록 s.
- 최대 팔꿈치 핀셋으로 촉촉한 스폰지 복 부 측에 홈 마 취 생선을 전송. 시각적으로 뛰는 심장의 여백을 찾아서 다음는 stereomicroscope 아래 마음을 찾습니다.
- Iridectomy가 위를 사용 하 여 피부와 근육, 침투 약 1 mm의 작은 절 개를 하 게 그리고 조심 스럽게 마음을 액세스할 수 겸 팁 pericardial sac의은 빛 상피 층을 찢 어. 너무 깊이 마음 부상을 피하기 위해 캐비티에는 집게를 삽입 하지 마십시오.
참고:이 시점에서 광범위 한 출혈 방지를 염두에 두십시오. 발생 하면 광범위 한 출혈, 과도 한 출혈은 주로 마음에 실수로 부상으로 발생 하 고 그래서 잘못 된 결과 발생 합니다 이후 실험에서 물고기를 제외 합니다. - 날카로운 집게를 사용 하 여 비 지배적인 손을 가진 그것의 꼭대기를 부드럽게 눌러 또는 부드러운 복 부 압력을 적용 하 여는 심 실 노출. 그런 다음, 다른 손으로 iridectomy가 위를 사용 하 여 정점에 심 실 ~ 20%를 제거 합니다.
참고:이 시점에서 발생 한다 광범위 한 출혈 없음. - 젖은 냅킨을 사용 하 여 서 라도 응고, 전에 15-45 s에 대 한 상처 출혈으로 절 개를 커버 하 고 다시 시스템 물 탱크에 생선을 넣어.
참고: 그것은 절 개를 봉합 하는 데 필요한 아니다. - 물고기 1 분 이내 길 움직임을 차릴 다음 수영을 다시 시작 되었는지 확인 합니다. 물고기 50 후 길 움직임을 보여주지 않는 경우 물에 s 물고기 다시 활성 환기 때까지 플라스틱 피 펫을 사용 하 여 아가미로 물 분출에 의해 촉진.
- 심 실 절제술 후 재활용 시스템에서 물고기를 유지 합니다.
참고: 특별 한 관심이 없는 일반 생선에 비해 필요 하다. 성인 제 브라 심 실 절제술의 사망률은 약 5-10%. 거의 모든 죽음은 수술 후 24 시간 이내에 발생합니다.
3입니다. siRNA 캡슐화 된 나노 입자의 준비
- F-팸4합성-말뚝-R9 dendrimer.
참고: f-팸4의 합성-말뚝-R9 dendrimer 자료37 일부 수정 이전에 설명 된 대로 수행 했다. Α, ω-dipyridyl disulfido 폴 리 에틸렌 글리콜 (Py-말뚝-Py)의 길이 siRNAs (그림 2B)의 보호를 극대화 하기 위해 1, 000의 분자량을 감소 되었다. - G4.0 polyamidoamine (불리 PAMAM) 진공 건조 기를 사용 하 여 1 h를 45 ° C에서의 cystamine 코어의 10 mg을 건조 하 고 2 mL Dulbecco의 인산 염 버퍼 식 염 수 (DPBS, 셀 문화 응용 프로그램의 다양 한 사용 균형된 소금 솔루션)에 PAMAM 해산.
- 1.7 mg tris(2-carboxyethyl) phosphine (TCEP) 1 ml DPBS 녹, 3.2에서 준비 PAMAM 솔루션 혼합이 고 8 h에 대 한 부드러운 교 반으로 실 온에서 두고.
참고: TCEP는 어 금 니 비율 초과 PAMAM의 이황화 결합 ten-fold. - 적용 하 여 과도 한 TCEP를 제거 합니다. DPBS 10 mL의 볼륨에 도달 위의 PAMAM TCEP 혼합물에 추가 하 고 솔루션 3 kDa MWCO (분자 무게 차단) 한 관으로 전송 됩니다. 15 분 동안 3000 g에서 원심 분리 후 컬렉션 튜브에서 솔루션을 삭제 합니다. 추가 DPBS 필터 장치에 10 mL와 부드럽게 피 펫 샘플을 여러 번 하 고 다시 원심. 4 번에 대해이 단계를 반복 합니다. 마지막 여과 후 필터 장치에서 샘플을 발음.
참고:이 단계의 제품 감소 PAMAM (f PAM4 불리). - F-PAM4 솔루션 1 ml DPBS, 혼합 14 mg 평-말뚝-Py를 녹이 고 3 시간 실 온에서 부드러운 교 반으로 그것을 두고. 3.4에 설명 된 대로 적용 단계에 의해 제거 하 고 과도 한 평-말뚝-평. 마지막 여과 후 필터 장치에서 샘플을 발음.
참고: 제품 f-PAM4-말뚝-Py로 지명 된다. Py-말뚝-평의 금액은 10 f PAM4에서 thiol 그룹에 어 금 니 비율에서. - 디졸브의 시스테인 6.4 mg 1 ml DPBS R9 펩 티 드 (Ac-CRRRRRRRRR-NH2)를 종료, f-PAM4-말뚝-Py로 혼합 하 고 실 온에서 8 h 동안 부드럽게 저 어. 한 단계 제외 하 고는 DPBS 이온된 수로 변경 3.4에 설명 된 대로 f-PAM4-말뚝-R9, 호출한 최종 제품을 정화. 동결 진공 건조 기를 사용 하 여 제품을 lyophilize.
참고: 3.5와 3.6 동결은 전에 제품 적어도 1 개월-20 ℃에 저장 됩니다. F-PAM4-말뚝-R9 동결은 후 샘플 2 개월 이상-20 ℃에 저장 됩니다. - 수정이 고 펩 티 드의 정도 확인 하는 f-PAM4-말뚝-Py D2O (산화 중수소)의 5 밀리 그램을 녹이 고 NMR (핵자기공명) 샘플 튜브로 전송. 400 MHz에서 1 H NMR 스펙트럼 분석을 수행 하 고 NMR 데이터 분석 소프트웨어37을 사용 하 여 데이터를 분석.
참고: 특히, 대표 PAMAM 봉우리 (-NCH2CH2CO-), 페그 봉우리 (-OCH2CH2-), 그리고는 펩 티 드에 아르기닌 잔류물 봉우리 (-HCCH2CH2CH2NH-) 2.4-2.6, 3.7-3.8, 범위 및 1.6-1.8 ppm에 각각 있을 것으로 예상 된다. PAMAM 봉우리 고 R9 봉우리의 적분을 계산 하 여 말뚝과 R9는 PAMAM 기준의 변경의 정도 결정 합니다. 못의 수정 정도 100% 이며 R9 수정 적어도 50%. 1H NMR 스펙트럼 분석 기관의 핵심 시설에서 수행 됩니다. - F-팸4분해-말뚝-R9 dendrimer 4 mg/mL PBS에 분말을 1 회 사용에 대 한 솔루션의 aliquots.
참고: dendrimer 솔루션 저장할 수 있습니다-20 ° C에서 한 달 이상에 대 한 중지 및 재개를 반복 하지 않고. - Cyanine 염료 표시 siRNAs (Cy5-siRNA 불리), Aldh1a2 siRNA 또는 스크램블된 부정적인 제어 siRNA 10 µ M 증류수에 용 해.
참고: 나노 캡슐화 siRNA 물고기 마음 (그림 2A-B)를 입력할 수 있는지 여부를 평가 하 cyanine 염료 표시 siRNAs를 사용 합니다. 이 프로토콜 f-PAM4-말뚝-R9 dendrimer 캡슐화 siRNA 전달의 효율성을 결정 하는 예 진으로 aldh1a2 를 사용 합니다. siRNAs의 순서는: Cy5-siRNA 센스 가닥: 5 '-ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT-3, siAldh1a2 센스 가닥: 5'-UUCAGGACAACCGUGUUCCdTdT-3'와 뒤섞여 부정적인 제어 siRNA 센스 가닥: 5'-ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT-3'. - 20 분에 대 한 실 온에서 샘플은 갓 siRNA 캡슐화 나노 솔루션을 준비, siRNA dendrimer 솔루션의 동등한 양으로 혼합 품 어을 사용 하기 전에 siRNA 나노 솔루션 준비 하 고.
참고: siRNA 캡슐화 나노 솔루션의 볼륨을 주입 하려고 하는 물고기의 수에 따라 달라 집니다. 예를 들어 10 생선 생선 당 (~ 10 µ L)의 주입을 위해 적어도 120 µ L dendrimer 솔루션 (믹스 60 µ L siRNA 솔루션 및 60 µ L dendrimer 솔루션)를 준비 솔루션의 손실에서.
4. 성인 Zebrafish 마음에 siRNA 캡슐화 된 나노 입자의 주입
- 위에서 설명한 대로 홈, tricaine 솔루션, 플라스틱 피 펫는 stereomicroscope, 팔꿈치 핀셋, 그리고 인슐린 주사기 (그림 1) 가득 10 cm 배양 접시와 스폰지의 조각 시스템과 물고기 탱크 뿐만 아니라 물을 준비 주택에 주입 후 물고기.
- 심 실 절제술 후 1 일에 대 한 복구 단계 2.1-2.10에에서 준비가 부상된 zebrafish를 허용 하 고 tricaine 솔루션 2.4에 설명 된 대로 1 dpa (일 후 절단) 물고기를 anesthetize.
- 마 취 물고기, 복 부 쪽, 팔꿈치 핀셋을 사용 하 여 촉촉한 스폰지에 홈에 전송 합니다. stereomicroscope에서 뛰는 심장을 찾습니다.
- 인슐린 주사기를 siRNA로 캡슐화 된 나노 솔루션의 10 µ L를 로드 합니다. 가능한 한 많은 거품을 하지 마십시오.
- 부드럽게 비 지배적인 손 가진 흉부 영역을 팔꿈치 핀셋을 사용 하 여 물고기를 무력화. 생선을 너무 단단히 클램프 하지 마십시오.
참고: 주사 동안 발생 한다 아무 광범위 한 출혈 하는 명심 하십시오. - ~ 30 °에서 채워진된 인슐린 주사기를 누른 다른 손 (보충 그림 1)를 사용 하 여 흉 강에 솔루션의 ~ 10 µ L를 주입 합니다.
참고: 솔루션 때때로 주입, 동안 밖으로 흐르는 하지만이 siRNA 효과 영향을 주지 않습니다. SiRNA 나노 솔루션 특정 실험 계획에 따라 한 달에 몇 일 동안 하루에 한 번 주입 수 있습니다. 때마다 siRNA의 한 유형으로는 생선을 주사. SiRNA의 두 개 이상의 종류 한 물고기 투입 될 필요가 있는 경우 주사 한 가지 유형의 siRNA 때마다, 그리고 주사 siRNA 1 h 나중의 다른 종류. 이 프로토콜에서 물고기 당 siRNA의 한 유형을 주입 했다. - 시스템 물 탱크에 있는 물고기를 전송 합니다.
참고: 물고기는 1 분 안에 환기를 다시 시작 하 고 수영을 다시 시작 것으로 예상. SiRNA 캡슐화 된 나노 입자 또는 siRNA의 주사는 일반적으로 성인 zebrafish에 죽음을 발생 하지 않습니다.
5. 심장 컬렉션, 고정, 및 siRNA 전달의 효율성 평가
- 각 그룹에 대 한 microcentrifuge 관에 4 %paraformaldehyde 솔루션의 1 mL를 준비 합니다.
- 주사 후 선택한 일에 tricaine 솔루션에서 물고기를 anesthetize. 촉촉한 스폰지에 홈에 supinely 물고기를 놓습니다. 흉부에 큰 절 개를 하 게 하 고 널리는 핀셋으로 엽니다. 유출 관을 핀셋으로 신중 하 게 온 마음을 꺼내.
- PBS 가진 마음을 헹 구 고 빠르게 냅킨으로 여분 액체를 제거. 1.5 mL 튜브 microcentrifuge 1 mL paraformaldehyde로 10 마음을 넣어. 부드럽게 튜브를 여러 번, 반전 하 고 하룻밤 4 ° c.에 유지
- Cy5 siRNAs 주입 하트는 vivo에서 이미징 시스템 (보충 그림 2)를 사용 하 여 형광 강도 측정 합니다. 이 연구에서는 각 그룹에 대 한 3-4 zebrafish 마음을 사용 합니다.
- 파라핀 또는 10 월 복합 (동결 조직 표본을 최적의 절삭 온도 대 한 매체 포함) 고정된 마음을 탑재 합니다.
6. 나노 중재 siRNA 유전자 침묵의 평가
- 절연된 컨테이너와 긴 핀셋을 준비 합니다. 컨테이너의 볼륨의 세 번째를 액체 질소에 붓는 다.
- 물고기 2 dpa에 tricaine 솔루션 anesthetize 5.2에 설명 된 대로 마음을 해 부하 고 유출 관 및 아 트리 움 제거.
참고: 물고기 하루에 수술에서 복구할 수 있습니다 그리고 중 스크램블된 siRNA 캡슐화 된 나노 입자 (싱크)와 1 dpa에는 부정적인 제어 또는 aldh1a2 siRNA 캡슐화 된 나노 입자 (siAldh1a2)로 주입. - 심 핀셋을 사용 하 여 1.5 mL microcentrifuge 튜브로 전송, 튜브 뚜껑을 커버 하 고 즉시 액체 질소로 절연된 용기에 튜브를 배치. 긴 핀셋을 사용 하 여 컨테이너에서 튜브를 제거 하는 몇 분에 대 한 액체 질소에 튜브 플 로트 보자.
- 6.2, 6.3 단계를 반복 하 여 모든 심 수집 됩니다. 6-10 마음을 사용 하 여 각 그룹에 대 한.
- RNA 분리 시 약으로 마음의 총 RNA를 추출 합니다. 양적 RT-PCR에 의해 각각 유전자의 식 수준을 평가 뇌관 Gapdh f: GATACACGGAGCACCAGGTT;를 사용 하 여 Gapdh r: GCCATCAGGTCACATACACG; Aldh1a2 f: TGAGCGAGGAGCAGCAGAGA; Aldh1a2 r: TCCACGAAGAAGCCTTTAGTAGCA입니다.
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Representative Results
Dendrimer 중재 siRNA 전달의 효율성을 확인 하려면 우리 zebrafish 심장의 심 실의 꼭대기를 절제 후 약 10 µ L dendrimer만의 (모의 그룹), Cy5 siRNA만 (벌 거 벗은 그룹), 또는 f-PAMAM-말뚝-R9 dendrimer 캡슐을 주입 Cy5-siRNA (Cy5-siRNA 그룹) intrapleurally, 각각 (그림 2A-B). 형광 신호는 dendrimer 캡슐화 Cy5-siRNA 3, 24, 48 hpi (시간 후 주입)에 주사 하는 마음에서 감지 48 hpi (그림 2C D)에서 모의 하 고 벌 거 벗은 그룹에서 마음에서 거의 감지 했다 f-PAMAM-말뚝-R9 dendrimer 효과적으로 성인 zebrafish 마음에 siRNAs의 납품을 촉진 하 고 적어도 2 일 동안 안정 되어 제안.
유전자 침묵에 dendrimer 캡슐화 siRNA의 효과 조사, 우리는 심 실 절제술44 후 심장 재생을 위해 필요한 것으로 보고 되었습니다 대상 유전자로 aldh1a2 (retinoic 산 합성 효소)를 선택 . 그림 3A같이 물고기 심 실 절제술 후에 1 일에 대 한 복구할 수 있었고 dendrimer 캡슐화 siRNA와 microinjected. 우리 aldh1a2 mRNA 식 수준 f-PAMAM-말뚝-R9 dendrimer 캡슐화 siAldh1a2 dendrimer 캡슐화 스크램블된 siRNA (싱크) 2 dpa (그림 3B)에서 비교로 치료 하는 마음에 감소 발견 시연 f-PAMAM-말뚝-R9 dendrimer 중재 siRNAs 유전자 특정 성인 zebrafish 마음에 입을 달성.
그림 1 : 심장 수술 및 흉부 주입 계기입니다. 성인 zebrafish 심장 심 실 절제술에 사용 되는 악기의 사진: 스폰지와 홈, 팔꿈치 핀셋, 날카로운 집게, iridectomy가 위, 긴 핀셋, 인슐린 주사기 dendrimer 캡슐화 siRNA 전달에 사용. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 효과적인 f-PAMAM-말뚝-R9 dendrimer 기반 배달 siRNA의 부상된 성인 zebrafish 마음에. (A) 심 실 절제술 후 나노 캡슐화 Cy5-siRNA 성인 zebrafish 심장에서의 통풍 관 효율 조사 제도 (dpa: 일 후 절단, hpi: 시간 후 주입). (B) 합성 f-PAMAM-말뚝-R9 dendrimer dendrimer 캡슐화 Cy5-siRNA의 준비 (C) 마음의 dendrimers만 주사 (모의) Cy5-siRNA dendrimer 캡슐화 (알몸), 및 형광 dendrimer 캡슐화 없이 Cy5 형광 이미징 Cy5-siRNA (Cy5-siRNA) 에서 생체 내 이미징에 의해 감지 표시 시스템, 형광 신호 강한 신호는 dendrimer 캡슐화 Cy5-siRNA 그룹 3에서 48 hpi 유지 하면서 48 hpi에서 모의 하 고 벌 거 벗은 그룹에서 거의 감지 되지 않은 것을 보여주는. 임의 규모의 형광 신호 강한 (빨간색) 약한 (파란색)에서 보여줍니다. (D) 정량화 Cy5-siRNA 형광의 비보에 이미징 시스템 패널 C로 평가 하는 마음에 신호 (* P < 0.05, * * * P < 0.001; 데이터는 평균 ± s.e.m. 단방향 분산 분석 이어서 Bonferroni의 여러 비교 테스트; n = 3-4 마음). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 효율적인 siRNA 부상된 성인 zebrafish 마음에 aldh1a2 의 입을. (A) 체계의 aldh1a2 siRNA 유전자 침묵 효과 조사. (B) 정량 밝혀 그 aldh1a2 mRNA 나노 캡슐화 siAldh1a2 마음 스크램블된 siRNA 나노 캡슐화 마음 (싱크)에 비해 감소. Aldh1a2 mRNA 식 수준 GAPDH 정상화 했다 (* * * P < 0.001; 데이터는 ± s.e.m.와 짝 스튜던트 t-검정을 의미). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
보충 그림 1: 흉 강 주입의 이미지. (A) 1 일 게시물에서 성인 물고기에 흉 강 절단. 흉 강에 나노 캡슐화 siRNA의 (B) 주입 스케일 바: 1. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
보충 그림 2: 나노 캡슐화 Cy5-siRNA 손상 되지 않은 성인 zebrafish 심장에서의 통풍 관 효율. (A) Cy5 형광 이미징 마음 dendrimers만 (모의), 주사의 알몸 Cy5-siRNA dendrimer 캡슐화 (알몸), 및 dendrimer 캡슐화 Cy5-siRNA는 vivo에서 이미징 시스템에서 하지 않고. 형광 신호의 임의 규모 약한 (파란색)에서 강한 (빨간색)입니다. (B) 부 량 Cy5-siRNA 형광의 비보에 이미징 시스템 패널 A로 측정 하는 마음에 신호 (NC: 더 중요 한 다른; 데이터는 평균 ± s.e.m.; 단방향 분산 분석 뒤에 Bonferroni의 여러 비교 테스트; n = 3-4 마음). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
Zebrafish는 완전히 성인 심장5를 포함 하는 기관의 다양 한 재생 가능 하다. 유전자 변형 및 유전자 메서드는 zebrafish의 배아에서 유전자 기능을 연구 개발, 조사 zebrafish45,46에서 생성 하는 조건부 돌연변이 체 대립 유전자의 발굴 작업으로 아직도 직면 된다. 따라서, 유전자 변형 지배적인 부정적인 돌연변이 또는 작은 분자 억제제 자주 성인 zebrafish 장기25,,2742주소 유전자 기능에 사용 됩니다. 지난 몇 년 동안, 나노 중재 siRNA 전달 및 유전자 침묵41,42, 를 사용 하 여 성인 zebrafish 마음에 유전자의 손실의 기능 분석을 위한 다른 방법을 개발 했습니다 43. dendrimer 중재 siRNA 유전자 침묵 zebrafish 마음에 특히 그리고 다른 zebrafish 장기, 일반적으로 사용 하 여이 메서드에 대 한 자세한 프로토콜 제시, 여기.
SiRNA 분자 자체적으로 셀에 입력할 수 없습니다 때문에 네거티브 차지 하 고는 nuclease에 의해 쉽게 저하 될 것 이다. 모노-분산 분자, 가변 구조와 속성, dendrimers 유망 siRNA 사업자 47간주 되었습니다. PAMAM dendrimers 풍부한 양이온 peripheries 있고 어떤 내부 버퍼링 아민 생리 적 조건에 siRNA 캡슐화를 중재 하 고 세포질에 endosomes에서 siRNA를 각각 출시 "양성자 스폰지" 효과 유발 수48 , 49 , 50.이 기사는 PAMAM 안정성 및 전달 효율을 향상 시키기 위해 수정 되었습니다. F-PAMAM-말뚝-R9 시스템 반구형 PAMAM dendrimer 머리를 nuclease에 의해 저하를 방지 하기 위해 siRNA 캡슐화에 대 한 긍정적인 요금을 제공 합니다. 못 팔과 R9 막 횡단 펩 티 드 안정화를 위한 나노 입자의 화란을 개선 하 고 세포에 의하여 통풍 관을 각각 추진 하 사용 되었다.
나노 입자의 유형과 품질 있으며 효과적인 siRNA 전달에 대 한 중요 한 유전자가 zebrafish 마음에 입을. 우리가 성공적으로이 목적에 대 한 3 개의 구조적으로 다양 한 나노 입자 조사: f-PAMAM-말뚝-R9, 그리고 페이-유압-RGD 나노41,,4243못 PLA. 비록 그들은 상업적으로 생산 되지 않습니다 일반 유기 화학 실험실 및 수 있습니다 쉽게 합성 나노35,,3743위에서 설명한 대로 정화. 여기, 우리가 선택한 f-PAMAM-말뚝-R9 dendrimer 심 실 절제술, 후 성인 zebrafish 마음에 간단 하 고, 효율적인, dendrimer 중재 siRNA 전달 및 유전자 침묵을 표시 하는 예제로 그것은 siRNA 로드 준비 하기 상대적으로 쉬운 하기 때문에 dendrimer-단지, 같은 ~ 20 분 동안 실내 온도에 혼합물을 배양 하 여. 다른 한편으로, pH 페이-유압-RGD 사용된43이면 siRNA 로드 nanocomplexes에 대 한 조정할 수 있다. 마찬가지로, 유화 및 정화 절차 못 PLA 나노 입자 사용된35,41경우 균일 한 나노 캡슐화 siRNA 솔루션을 얻기 위해 필수적입니다.
또 다른 중요 한 단계는 최소화 하거나 심장 재생 및 다른 생물 학적 시스템 인터럽트 광범위 한 출혈 이후 4.5에 설명 된 대로 아무 출혈 dendrimer 캡슐화 siRNA의 주입 하는 동안. 따라서, 주입 하는 동안 발생 출혈 하는 경우 실험 그룹에서 물고기를 제외 하는 것이 좋습니다. 일반적으로,이 간단한 주입 절차는 몇 가지 시도 후 쉽게 장악 된다.
이 방법의 주요 제한 잠재적인 대상 오프 효과 등의 유전자의 불완전 한 삭제 siRNA 기술 자체에 있습니다. 그렇지 않으면, 여러 유전자의 유전자 침묵 시키기의 높은 재현성 생물 복제 되었습니다41우리의 일에 사람의 증명. 중요 한 것은,이 프로토콜은, 간단, 신속 하 고 효율적인, 그리고 주입 치료는 성인 zebrafish에 의해 잘 용납입니다. SiRNA 유전자 침묵 효율의 실험적인 분석 mRNA 식 레벨에 제자리 교 잡 또는 정량 RT-PCR의 또는 서쪽 오 점, immunohistochemical 얼룩를 사용 하 여 단백질 식 레벨의 평가 포함 될 수 있습니다 또는 다른 기능 분석입니다. 함께, 우리가 완전히 특히 성인 zebrafish에 손실의 기능 연구에 대 한 대체 도구로 siRNA 나노 촉진 배달 보증 하 고이 방법은 또한 성인 제 브라와 다른 모델 유기 체에서 다른 장기로 연장 될 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
저자는 중요 한 의견에 대 한 박사 IC 브루스를 감사 하 고 원고를 읽고. 이 작품은 국립 자연 과학 재단의 중국 (31430059, 31701272, 31730061, 81470399, 및 31521062), 아 스 트 라 아시아 및 신흥 시장 혁신적인 의학 및 초기 발달에서 교부 금에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| tricaine | Sigma | E10521 | Store at 4 °C |
| stereomicroscope | Leica | S8AP0 | |
| sharp forcep | WPI | 14098 | |
| iridectomy scissors | WPI | 501778 | |
| elbow tweezers | Suzhou Liuliu | SE05Cr | |
| α,ω-dipyridyl disulfido polyethylene glycol(Py-PEG-Py) | Biomatrik (Jiaxing) Inc. | 5239 | |
| core of G4.0 polyamidoamine (PAMAM) | Andrews ChemServices | AuCS-297 | |
| vacuum drying equipment | Yiheng | DZF-6020 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 14190144 | |
| tris(2-carboxyethyl)phosphine(TCEP) | Alfar Aesar | 51805-45-9 | Causes severe skin burns and eye damage. Causes serious eye damage. |
| ultrafiltration tube | Millipore | UFC900308 | |
| freeze dryer | Martin Christ | Alpha 2-4 Ldplus | |
| NMR spectrometer | Bruker | AV400 | |
| Deuterium oxide(D2O) | J&K | 174611 | |
| NMR sample tube | J&K | WG-1000-7-50 | |
| 3 kDa MWCO ultrafiltration tube | Merck | UFC900308 | |
| sea salts | Instant Ocean® | SS15-10 |
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