Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Nanopartikül aracılı siRNA Gene susturmak yetişkin zebra balığı kalbinde

Published: July 29, 2018 doi: 10.3791/58054
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 2, 1
1Beijing Key Laboratory of Cardiometabolic Molecular Medicine, State Key Laboratory of Natural and Biomimetic Drugs, Institute of Molecular Medicine, Peking University, 2Department of Biomedical Engineering, College of Engineering, Peking University

Summary

Koşullu gen-nakavt veya etkili gen-nakavt yetişkin zebra balığı organlarında geliştirmek için büyük bir meydan okuma olarak kalır. Burada performans gösteren nanopartikül aracılı siRNA gen-yetişkin zebra balığı kalbinde susturmak, böylece yetişkin organlarda zebra balığı ve diğer canlılar çalışmak için yeni bir işlev kaybı yöntemi sağlayan bir protokol raporu.

Abstract

Memeliler kalp akut miyokard infarktüsü sonrası yeniden oluşturmak için çok sınırlı bir kapasiteye sahip. Öte yandan, Yetişkin zebra balığı kalbini apex rezeksiyon veya yapım o kalp rejenerasyon çalışması için bir önemli model organizma cryoinjury, sonra yeniden oluşturur. Ancak, işlev kaybı yöntemleri yetişkin organları için eksikliği kalp rejenerasyon yatan mekanizmaları anlayışlar kısıtladı. RNA müdahale farklı dağıtım sistemleri üzerinden genlerini memeli hücrelerinde ve model organizmalar susturulması için güçlü bir araçtır. Biz daha önce siRNA kapsüllenmiş nano tanecikleri başarıyla hücreleri girin ve olağanüstü gene özgü köşenize Yenileyici yetişkin zebra balığı kalbinde neden bildirdin. Burada, basit, hızlı ve etkin iletişim kuralı dendrimer-aracılı siRNA teslimi ve gen susturmak için yenileyici yetişkin zebra balığı kalbinde mevcut. Bu yöntem, zebra balığı yetişkin organların işlevlerinde gen belirlemek için alternatif bir yaklaşım sağlar ve diğer canlılar için de uzatılabilir.

Introduction

Miyokard infarktüsü büyük bir ekonomik yük1dünya çapında önde gelen bir büyük sağlık tehdidi haline gelmiştir. Yetişkin memeli kalp yeniden ve skar doku ve sonraki kalp yetmezliği oluşumu için önde gelen yaralanma sonra makroskopik ölçüde kayıp cardiomyocytes doldurmak başarısız olur. Memeliler, zebra balığı kalp yaralanması, yapım o kalp yenilenme moleküler mekanizmaları araştıran bir ideal model organizma farklı türde sonra sağlam miyokardiyal yayılması yoluyla öncelikle kalp yenilenme yeteneğine sahip olan 2,3,4,5,6,7,8. Endojen mekanizmaları deşifre alttaki zebra balığı kalp rejenerasyon araştırma insan kalbi rejenerasyon9geliştirmek yeni tedavi stratejileri için arama heyecan verici alanıdır.

Genetik manipülasyon yöntemleri zebra balığı içinde kullanılabilir. Bunlar kurbağalar, piliç ve yanı sıra memelilerde zebra balığı10,11,12,13de yaygın olarak kullanılan morpholinos (MO) oluşur. MO hedef gen ekspresyonu yetişkin zebra balığı yüzgeci, beyin ve retina14,15,16,17,18,19verimli nakavt vardır. Knock down endojen gen ekspresyonu sadece zebra balığı embriyo zamanda yetişkin hayvan organları20,21,22, için kullanılan başka bir yapay oligonükleotid kilitli nükleik asit (LNA) olduğunu 23 , 24. ancak, yetişkinlerin kalpler için etkili işlev kaybı yöntemleri eksikliği organ rejenerasyon moleküler mekanizmaları eğitim bir engel kalmıştı. Mevcut, küçük molekül inhibitörleri veya baskın negatif mutant transgenik ifade öncelikle işlevi belirli bir gen veya yetişkin zebra balığı kalp rejenerasyon25,26 işlevini çalışmaya yol engellemek için kullanılır ,27. Ancak, tüm genler veya sinyal yolları bu yöntemleri için geçerlidir.

Preklinik hayvan çalışmalarında modelleri için28,29,30 RNA'ların (çift) küçük müdahale memeli hücrelerinde ve embriyo model organizmalar, hem de yetişkin organ fonksiyon kaybı analizi için yaygın olarak kullanılmaktadır , 31 , 32. Çift etkili bir şekilde kullanıldığını genler tümörler33,34,35 ve cardiomyocytes36,37,38,39 susturmak için ,40 farklı dağıtım sistemleri ile. Son zamanlarda, biz birkaç farklı nano tanecikleri41,42,43, kullanarak Yenileyici yetişkin kalbinde verimli siRNA kapsüllenmiş nanopartikül gen-susturmak için bir roman araç sağlayan gelişmiş Yetişkin zebra balığı organlarında genlerin fonksiyonel çalışmalar. Bizim önceki çalışmalar41,42,43numaraya bağlı olarak, burada siRNA gen f-PAMAM-PEG-R9 kullanarak Yenileyici yetişkin zebra balığı kalbinde susturmak için basit, pratik ama güçlü iletişim kuralı mevcut dendrimers. Aldh1a2 (aldehid dehidrojenaz 1 Aile, üye A2) gen zebra balığı apex rezeksiyonundan sonra upregulated oldu ve Aldh1a2 ablasyon bloke kardiyak rejenerasyon44. Burada biz almak aldh1a2 gen nanopartikül kapsüllenmiş siRNA enjeksiyonu ile aracılı gen devirme verimliliği test etmek için bir örnek olarak. Bu iletişim kuralı, Yetişkin zebra balığı kalbine zebra balığı kalp rezeksiyon, nano tanecikleri kimyasal sentez ve nano tanecikleri siRNA kapsüllü bir teslim yöntemi için bir yordam içerir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tüm hayvan prosedürleri kullanılan kurumsal hayvan bakım ve değerlendirme ve akreditasyon laboratuvar hayvan bakım Derneği tarafından tamamen akredite Pekin Üniversitesi'nde kullanım Komitesi tarafından onaylanmış zebra balığı protokol.

1. Tricaine çözüm hazırlanması

  1. Tricaine hisse senedi çözüm hazırlamak için 400 mg etil 3-aminobenzoate methanesulfonate toz 97,9 mL distile su ekleyin ve sonra Tris pH ~ 7 ayarlamak için 1 M (pH 9,5) 2.1 mL ekleyin. Hisse senedi çözüm 4 ° C'de depolayın
  2. Tricaine çalışma çözüm hazırlamak için 100 mL akvaryum sistemi su 4,2 mL tricaine hisse senedi çözüm ekleyin.

2. yetişkin zebra balığı ventrikül rezeksiyonu

  1. Ameliyat için bir parça sünger, çalışma çözümü, bir plastik pipet, bir stereomicroscope, iki keskin forseps, iridectomy makas, tricaine ile dolu bir petri içeren malzeme ve aletleri hazırlamak ve dirsek cımbız (Şekil 1).
  2. 4 cm x 0.5 cm ve ventrikül rezeksiyonu ameliyat sırasında zebra balığı tutmak için bir sünger derinliği 0.5 cm büyüklüğünde küçük bir oluk hazırlayın.
  3. 60 mg/L deniz kullanılarak yapılır zebra balığı sistem su yarım depo ile 3 L zebra balığı tank tuzlar dH2O yaralı balıkları kurtarılması için dolgu.
  4. Gill hareketleri bir saniyede azaltmak ve en az 30 için balık tutmak kadar 10 cm Petri kabına tricaine çözüm ile balıkta anestezi s tam anestezi emin olmak için.
  5. İmzalat balık kadar groove bir nemli sünger ventral yan dirsek cımbız ile aktarın. Görsel olarak kalbi kenar bulmak ve bir stereomicroscope altında kalp bulun.
  6. İridectomy makas yaklaşık 1 mm deri ve kasları nüfuz küçük bir kesi yapmak ve dikkatli bir şekilde perikardiyal sac kalp erişmek için forseps ipuçları ile gümüş epitel tabakası gözyaşı. Forseps kalp yaralanmayı önlemek için çok derin boşluğa yerleştirmek değil.
    Not: Bu noktada, geniş kanama önlemek için göz önünde bulundurun. Aşırı kanama özellikle kaza kalp neden olur ve bu yüzden sonuçlar yanıltıcı neden olur bu yana yoğun kanama çıktığında, deneyden balık hariç.
  7. Ventrikül yavaşça onun apex sigara dominant el kullanarak keskin forseps ile tutarak veya hafif karın basınç uygulayarak maruz. Daha sonra diğer eliyle ~ % 20 iridectomy makas kullanarak apex, ventrikül kaldırın.
    Not: Geniş kanama yok bu noktada gerçekleşmelidir.
  8. Kesi, pıhtılaşma önce bolca 15-45 s için yaraları kenar taşması olarak kapsayacak şekilde ıslak peçete kullanın ve sonra balık ile sistem su tankı içine koy.
    Not: Belgili tanımlık kesme dikiş gerek yoktur.
  9. Balık gill hareketleri 1 dk içinde kavuşur ve yüzme devam eder emin olun. Balık 50 sonra gill hareketleri görünmüyorsa s, suda o kadar balık etkin havalandırma devam eder bir plastik pipet kullanarak solungaçları su oyuncak tarafından kolaylaştırmak.
  10. Balık ventrikül rezeksiyonu sonra geri dönüşüm sistemi korumak.
    Not: Özel yok bakımları normal balık ile karşılaştırıldığında gereklidir. Yetişkin zebra balığı ventrikül rezeksiyonu ölüm oranı yaklaşık % 5-10 olduğunu. Hemen hemen tüm ölüm ameliyattan sonra 24 saat içinde olur.

3. siRNA kapsüllenmiş nano tanecikleri hazırlanması

  1. F-PAM4sentez-PEG-R9 dendrimer.
    Not: F-PAM4sentezi-PEG-R9 dendrimer malzeme gerçekleştirilen37 bazı değişikliklerle daha önce açıklandığı gibi. α, ω-dipyridyl disulfido Polietilen glikol (Py-PEG-Py) uzunluğu 1000 çift (Şekil 2B) encapsulation en üst düzeye çıkarmak için bir molekül ağırlığı azaltılmış.
  2. G4.0 polyamidoamine (adlandırılan PAMAM) Vakum kurutma makinesi 45 ° C'de 1 h için kullanarak cystamine özünü 10 mg kuru ve PAMAM 2 mL Dulbecco'nın fosfat tamponlu tuz (DPBS, çeşitli hücre kültür uygulamaları için kullanılan bir dengeli tuz solüsyonu) içinde çözülür.
  3. 1 ml DPBS (TCEP) 1.7 mg tris(2-carboxyethyl) fosfamin dağıtılması, 3.2 hazırlanan PAMAM çözüm ile karıştırın ve 8 h için nazik karıştırma ile Oda sıcaklığında bırakın.
    Not: TCEP molar oranı PAMAM disülfür bağları aşırı panolarında.
  4. Aşırı TCEP Ultrafiltrasyon tarafından kaldırın. DPBS 10 mL hacmi ulaşmak için yukarıdaki PAMAM-TCEP karışıma ekleyin ve çözüm 3 kDa MWCO (moleküler ağırlık kesilmiş) Ultrafiltrasyon tüp içine aktarılır. Sonra Santrifüjü 15dk için 3000 g de çözüm toplama tüp içinde atmak. DPBS filtresi cihazın 10 mL ve pipet örnek için hafifçe birden çok kez ekleyebilir ve yine santrifüj kapasitesi. Bu adım için 4 kere tekrar edin. Son filtrasyon sonra örnek filtre aygıttan Aspire edin.
    Not: Ürün bu adımın azalır (f-PAM4 olarak adlandırdığı) PAMAM.
  5. F-PAM4 çözüm ile 1 ml DPBS, mix 14 mg Py-PEG-Py dağıtılması ve 3 h için oda sıcaklığında hafif karıştırarak ile bırakın. Sonra aşırı Py-PEG-Py Ultrafiltrasyon adım 3.4 içinde açıklandığı gibi kaldırın. Son filtrasyon sonra örnek filtre aygıttan Aspire edin.
    Not: Ürün f-PAM4-PEG-Py adlandırılır. Py-PEG-Py miktarı 10 kat f-PAM4 içindeki thiol gruplara molar oranı.
  6. Erime sistein 6.4 mg 1 mL DPBS R9 peptid (Ac-CRRRRRRRRR-NH2) sona erdi, f-PAM4-PEG-Py ile karıştırın ve oda sıcaklığında 8 h için hafifçe karıştırın. Ultrafiltrasyon adım DPBS deiyonize su değiştirilir dışında ki 3.4 içinde açıklandığı gibi f-PAM4-PEG-R9, adı verilen nihai ürün arındırmak. Ürün bir donma Vakum kurutma makinesi kullanarak lyophilize.
    Not: 3.5 ve 3.6 lyophilization önce ürünleri-20 ℃ en az 1 ay boyunca saklanır. F-PAM4-PEG-R9 lyophilization sonra örnekleri-20 ℃ en az 2 ay süreyle depolanır.
  7. PEG ve peptid değişiklik derecesini belirlemek için f-PAM4-PEG-Py D2O (döteryum oksit) 5 mg dağıtılması ve NMR (nükleer manyetik rezonans) örnek tüp içine aktarın. 400 MHz 1 H-NMR spektral analiz ve NMR veri analizi yazılım37kullanarak veri analiz.
    Not: Özellikle, temsilcisi PAMAM (- NCH2CH2CO-) doruklarına, PEG (- OCH2CH2-) doruklarına ve arginin kalıntı Peaks'e (- HCCH2CH2CH2NH-) peptidler aralıkların 2,4-2,6, 3.7 – 3,8 ve 1.6-1.8 ppm, sırasıyla olacağı tahmin ediliyor. PAMAM tepeler için PEG ve R9 doruklarına integraller hesaplayarak PEG ve R9 PAMAM göre değişiklik derecesini belirler. PEG değişiklik derecesi % 100 ve R9 değişiklik en az % 50'dir. 1H-NMR spektral analizleri kurum çekirdek tesisinde gerçekleştirilir.
  8. F-PAM4dissolve-PEG-R9 dendrimer 4 mg/mL için PBS içinde toz ve aliquots çözüm tek seferlik kullanım için yapmak.
    Not: Dendrimer çözüm-20 ° C'de en az bir ay için dondurma ve çözme yinelenen olmadan saklanabilir.
  9. (Cy5-siRNA denir) siyanür boyalar etiketli çift, Aldh1a2 siRNA veya şifreli negatif kontrol siRNA 10 µM için distile suda çözülür.
    Not: boyalar etiketli siyanür çift kapsüllenmiş nanopartikül siRNA balık kalp (Şekil 2A-B) girebilirsiniz olup olmadığını değerlendirmek için kullanın. Bu iletişim kuralı aldh1a2 f-PAM4-PEG-R9 dendrimer kapsüllenmiş siRNA teslimini verimliliğini belirlemek için bir örnek gen alır. Çift sıraları şunlardır: Cy5-siRNA antianlamlı iplik: 5 '-ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT-3 ', siAldh1a2 antianlamlı iplik: 5'-UUCAGGACAACCGUGUUCCdTdT-3' ve şifreli negatif kontrol siRNA antianlamlı iplik: 5'-ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT-3'.
  10. Örnek, oda sıcaklığında 20 dakika süreyle siRNA kapsüllenmiş nanopartikül çözüm hazırlamak, siRNA eşit bir dendrimer çözüm hacmi ile karıştırın ve kuluçkaya taze siRNA nanopartikül çözüm kullanmadan önce hazırlayın.
    Not: SiRNA kapsüllenmiş nanopartikül çözüm hacmi enjekte edecek balık sayısına bağlıdır. Örneğin, en az 120 µL dendrimer çözüm (mix 60 µL siRNA çözüm ve 60 µL dendrimer çözüm) 10 balık (balık başına ~ 10 µL), enjeksiyon için hazırlamak çözüm kaybına sayma.

4. enjeksiyon siRNA kapsüllenmiş nano tanecikleri yetişkin zebra balığı kalbine

  1. Yukarıda açıklandığı gibi bir parça sünger bir oluk, 10 cm Petri kabına tricaine çözüm, bir plastik pipet, bir stereomicroscope, dirsek cımbız ve insülin şırınga (Şekil 1), ile dolu ile yanı sıra bir akvaryum sistemi ile su konut için hazırlamak Enjeksiyon sonra balık.
  2. 1 gün sonra ventrikül rezeksiyonu için kurtarmak için adımlar 2,1-2,10 hazırlanan yaralı zebra balığı izin ve 2.4 açıklandığı gibi tricaine çözüm 1 dpa (gün sonrası amputasyon) balıkta anestezi.
  3. İmzalat balık, ventral tarafına dirsek Cımbız kullanarak nemli sünger oluk, aktarın. Kalbi stereomicroscope altında bulun.
  4. SiRNA kapsüllenmiş nanopartikül çözüm 10 µL insülin şırınga yükleyin. Kabarcıklar mümkün olduğunca kaçının.
  5. Balık göğüs bölgesi sigara dominant el ile tutmak için hafifçe dirsek Cımbız kullanarak hareketsiz. Balık çok sıkı kelepçe değil.
    Not: geniş kanama enjeksiyon sırasında gerçekleşmesi gereken aklınızda bulundurun.
  6. Dolgulu insülin şırınga ~ 30 ° tutun ve ~ 10 µL çözüm öte yandan (Tamamlayıcı Şekil 1) kullanarak göğüs boşluğuna enjekte.
    Not: Çözüm bazen enjeksiyon sırasında dışarı akar, ancak bu siRNA etkisi etkilemez. SiRNA nanopartikül çözüm bağlı olarak belirli bir deneysel plan bir ay için birkaç gün için günde bir kez enjekte edilebilir. Bir balık siRNA bir tür birlikte her zaman enjekte et. SiRNA daha--dan iki tür bir balık enjekte edilir gerekiyorsa, her zaman bir tür siRNA enjekte ve siRNA 1s daha sonra başka bir tür enjekte etmek. Bu protokol için tek tip bir siRNA balık başına enjekte ettiler.
  7. Balık tank sistemi su ile aktarın.
    Not: Balık havalandırma 1 dakika içinde yeniden başlatın ve sonra yüzme devam bekleniyor. SiRNA kapsüllenmiş nano tanecikleri veya siRNA enjeksiyon normalde içinde yetişkin zebra balığı ölüm neden olmaz.

5. kalp toplama, fiksasyon ve siRNA teslim etkinliğinin değerlendirilmesi

  1. 1 mL % 4 paraformaldehyde çözeltisi microcentrifuge tüp içinde her grup için hazırlamak.
  2. Seçili gün sonra enjeksiyonları, tricaine çözüm balıkta anestezi. Yer supinely nemli bir sünger oluk içine balık. Göğüs bölgesinde büyük bir kesi yapmak ve yaygın cımbız ile açın. Çıkış yolu kavrama ve bütün kalbinle dikkatle cımbızla çekin.
  3. Kalp PBS ile durulayın ve hızla bir peçete ile ekstra sıvı kaldırın. En çok 10 kupa ile 1 mL paraformaldehyde 1.5 mL microcentrifuge tüp içine koymak. Yavaşça tüp birkaç kez ters çevir ve gecede 4 ° C'de tutmak
  4. Vivo görüntüleme sistemi (Tamamlayıcı Şekil 2) kullanarak Cy5 çift enjekte kalpler floresan yoğunluğu ölçmek. Bu çalışmada her grup için 3-4 zebra balığı kalpler kullanın.
  5. Sabit mavi kalpler olan parafin ya da Ekim bileşik (katıştırma orta numuneler en iyi kesim ısı sağlamak doku dondurulmuş) mount.

6. nanopartikül aracılı siRNA Gene susturmak değerlendirilmesi

  1. Yalıtımlı Konteyner ve uzun cımbız hazırlayın. Sıvı azot konteyner hacmi üçte dökün.
  2. Tricaine çözüm 2 dpa, balıkta anestezi. Kalpleri 5,2 açıklandığı gibi incelemek ve çıkış yolu ve atrium kaldırın.
    Not: Balık ameliyattan bir gün içinde kurtarabilirsiniz ve daha sonra her iki şifreli siRNA kapsüllenmiş nano tanecikleri (Eşitle) ile 1 dpa, bir negatif kontrol veya aldh1a2 siRNA kapsüllenmiş nano tanecikleri (siAldh1a2) enjekte.
  3. Ventrikül Cımbız kullanarak 1.5 mL microcentrifuge tüp içine transfer tüp kapak kapak ve hemen tüp sıvı azot ile Yalıtımlı Konteyner içine yerleştirin. Bir kaç dk. tüpler kapsayıcıdan kaldırmak için uzun cımbız kullanım için sıvı azot tüp float izin.
  4. Tüm ventrikül toplanır 6.2 ve 6,3 tamamlayana dek. 6-10 kupa her grup için kullanın.
  5. Toplam RNA mavi kalpler olan RNA izolasyon reaktif ayıklayın. Kantitatif RT-PCR ile ilgili genlerin ifade düzeylerini değerlendirmek Gapdh F: GATACACGGAGCACCAGGTT; primerler kullanılarak Gapdh bilgi: GCCATCAGGTCACATACACG; Aldh1a2 F: TGAGCGAGGAGCAGCAGAGA; Aldh1a2 bilgi: TCCACGAAGAAGCCTTTAGTAGCA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Dendrimer-aracılı siRNA teslim verimliliğini belirlemek için zebra balığı kalp ventrikül apeks rezeke ardından yaklaşık 10 µL (sahte grubu), yalnızca dendrimer, Cy5-siRNA sadece (çıplak grubu) veya f-PAMAM-PEG-R9 dendrimer kapsüllenmiş enjekte Cy5-siRNA (Cy5-siRNA grup) intrapleurally, sırasıyla (Şekil 2A-B). Floresans sinyal tespit dendrimer kapsüllü Cy5-siRNA 3, 24 ve 48 HPI (saat sonrası enjeksiyon) enjekte kalplerinde kalpler, 48 HPI (Şekil 2C-D), sahte ve çıplak gruplardan çok zor tespit iken telkin f-PAMAM-PEG-R9 dendrimer etkili bir şekilde çift teslim yetişkin zebra balığı kalbine kolaylaştırır ve en az iki gün boyunca stabildir.

Gen susturmak üzerindeki etkisi dendrimer kapsüllenmiş siRNA araştırmak için aldh1a2 (retinoik asit sentezleme enzim) kalp yeniden oluşturma tamamlandıktan sonra ventrikül rezeksiyonu44 için gerekli olduğu bildirilen bir hedef gen olarak seçtik . Şekil 3' teAgösterildiği gibi balık bir gün sonra ventrikül rezeksiyonu için kurtarmak için izin ve dendrimer kapsüllenmiş siRNA ile microinjected. Biz aldh1a2 mRNA ifade düzey bu dendrimer kapsüllenmiş şifreli siRNA (Eşitle) adlı 2 dpa (Şekil 3B), ile karşılaştırıldığında f-PAMAM-PEG-R9 dendrimer kapsüllü siAldh1a2 ile tedavi kalplerinde düşmüştür bulundu f-PAMAM-PEG-R9 dendrimer-aracılı çift yetişkin zebra balığı kalbinde gene özgü susturmak başarmak gösteren.

Figure 1
Resim 1 : Kalp ameliyatı ve torasik enjeksiyon aletleri. Yetişkin zebra balığı kalbinde ventrikül rezeksiyonu için kullanılan araçların fotoğraf: sünger bir oluk, dirsek cımbız, keskin forseps, iridectomy makas, uzun cımbız ve dendrimer kapsüllenmiş siRNA teslimi için kullanılan insülin enjektörü ile. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2 : Etkili f-PAMAM-PEG-R9 dendrimer destekli teslimini siRNA yaralı yetişkin zebra balığı kalbine. Nanopartikül kapsüllü Cy5-siRNA yetişkin zebra balığı kalbinde alımını verimliliğini ventrikül rezeksiyonu sonra soruşturma için(a)düzeni (dpa: gün sonrası amputasyon; HPI: saat sonrası enjeksiyon). F-PAMAM-PEG-R9 dendrimer ve dendrimer kapsüllü Cy5-siRNA hazırlanması (B) sentezi. (C) Cy5 floresan görüntüleme kalplerin dendrimers ile sadece enjekte (sahte), Cy5-siRNA sadece olmadan dendrimer saklama (çıplak) ve floresan dendrimer kapsüllenmiş etiketli Cy5-siRNA (Cy5-siRNA) içinde vivo görüntüleme tarafından tespit Sistem, floresan sinyallerini güçlü sinyaller dendrimer kapsüllü Cy5-siRNA gruplar halinde 3 48 HPI için muhafaza süre 48 HPI, sahte ve çıplak gruplarındaki neredeyse belirlenemeyen gösterilen. Floresan sinyallerini rasgele ölçeğini zayıf (mavi) güçlü (kırmızı) gösterir. (D) miktar Cy5-siRNA floresans in sinyalleri görüntüleme sistemi olduğu gibi masası C vivo içinde tarafından değerlendirildi Hearts (* P < 0,05, *** P < 0,001; ortalama ± s.e.m. verilerdir; tek yönlü Bonferroni tarafından takip Varyans Analizi'nın birden fazla karşılaştırma testleri; n 3-4 kupa =). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3 : Aldh1a2 yaralı yetişkin zebra balığı kalbinde, verimli siRNA susturmak. (A)Düzen aldh1a2 siRNA gen susturmak etkisini araştırıyor. (B) qPCR ortaya çıkarır bu aldh1a2 mRNA azalmıştır nanopartikül kapsüllü siAldh1a2 kalplerine nanopartikül kapsüllenmiş şifreli siRNA kalpler (Eşitle) ile karşılaştırıldığında. Aldh1a2 mRNA ifade düzey GAPDH tarafından normalize (*** P < 0,001; veri ± s.e.m. ile eşleştirilmiş öğrenci t-testi demek). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Supplementary Figure 1
Ek Şekil 1: göğüs boşluğuna enjeksiyon görüntülerini. (A) 1 gün Post yetişkin balık göğüs boşluğuna ampütasyon. Göğüs boşluğuna içine nanopartikül kapsüllenmiş siRNA (B) enjeksiyon. Ölçek çubukları: 1 mm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Supplementary Figure 2
Ek Şekil 2: nanopartikül kapsüllü Cy5-siRNA zarar görmemiş yetişkin zebra balığı kalbinde verimliliğini alımı. (A)Cy5 floresan görüntüleme ile dendrimers sadece (sahte), enjekte kalplerin çıplak Cy5-siRNA dendrimer saklama (çıplak) ve dendrimer kapsüllü Cy5-siRNA görüntüleme sistemi içinde vivo altında olmadan. Floresan sinyallerini rasgele ölçeğini zayıf (mavi) güçlü (kırmızı) olduğunu. (B) miktar Cy5-siRNA floresans in sinyalleri görüntüleme sistemi olduğu gibi panel A vivo içinde tarafından ölçülen Hearts (NC: Hayır önemli veri ortalama ± s.e.m.; tek yönlü Bonferroni tarafından takip varyans analizi birden çok farklı; karşılaştırma testi; n 3-4 kupa =). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Zebra balığı organları yetişkin kalp5de dahil olmak üzere çeşitli Yenileyici tam olarak kullanabilir. Transgenik ve genetik yöntemleri zebra balığı embriyo gen fonksiyonları eğitimi için iyi gelişmiş olmakla birlikte, araştırmacılar hala koşullu mutant gen zebra balığı45,46yılında üretme zor bir görev ile karşı karşıyayız. Böylece, transgenik baskın negatif mutantlar veya küçük molekül inhibitörleri sık yetişkin zebra balığı organları25,27,42adres gen fonksiyonları için kullanılır. Son bir kaç yıl, biz nanopartikül aracılı siRNA teslim ve41,42, susturmak gen kullanarak yetişkin zebra balığı kalbinde genlerin fonksiyon kaybı analizi için alternatif bir yöntem geliştirdik 43. burada, bu yöntemi kullanarak dendrimer-aracılı siRNA gen zebra balığı kalbimizde özellikle ve büyük olasılıkla diğer zebra balığı organlara, genel olarak, susturmak için detaylı bir protokol sunulmuştur.

SiRNA molekül hücrelere kendi kendine onun negatif yük nedeniyle giremezsiniz ve kolayca nükleaz tarafından bozulmuş. İle mono dağılın-moleküller, akort yapıları ve özellikleri, dendrimers olarak umut verici siRNA taşıyıcıları 47olarak kabul edilmiştir. PAMAM dendrimers zengin katyonik çevrelerine ve hangi içinde arabelleğe alma aminler aracılık fizyolojik şartlarda siRNA katma ve sırasıyla siRNA üzerinden endosomes sitoplazmada serbest bırakmak için bir "proton sünger" etkisi neden48 , 49 , 50. Bu makalede, istikrar ve teslimat verimliliği artırmak için PAMAM güncellenmiştir. F-PAMAM-PEG-R9 sistemi yarımküresel PAMAM dendrimer kafayla nükleaz tarafından bozulması önlemek siRNA Kapsülleme için olumlu ücret sağlar. PEG kol ve R9 transmembran peptid sabitleme için nano tanecikleri hydrophilicity geliştirmek ve sırasıyla hücreleri tarafından alımını teşvik için kullanıldı.

Nano tanecikleri türünü ve kalitesini etkili siRNA teslimat için kritik ve gen-zebra balığı kalp susturmak. Bu amaçla üç yapısal olarak farklı nano tanecikleri başarılı bir şekilde araştırdık: PEG-PLA, f-PAMAM-PEG-R9 ve PEI-HYD-RGD nano tanecikleri41,42,43. Her ne kadar ticari olarak üretilen değil, normal organik kimya laboratuvar kolayca sentez ve35,37,43daha önce açıklandığı gibi nano tanecikleri arındırmak. SiRNA yüklü hazırlamak nispeten kolaydır çünkü burada, biz f-PAMAM-PEG-R9 dendrimer basit, verimli, dendrimer-aracılı siRNA teslim ve gen susturmak yetişkin zebra balığı kalbinde ventrikül rezeksiyonu sonra göstermek için bir örnek olarak seçti dendrimer-kompleksleri, gibi karışımı ~ 20 dakika oda sıcaklığında kuluçka tarafından. Öte yandan, pH PEI-HYD-RGD kullanılan43ise siRNA yüklü nanocomplexes için ayarlanması gerekir. Benzer şekilde, hazırlama için ve arıtma işlemleri PEG-PLA nano tanecikleri kullanılan35,41ise tek tip nanopartikül kapsüllenmiş siRNA çözüm elde etmek için gereklidir.

Başka bir önemli adım en aza indirmek veya geniş kanama kalp rejenerasyon ve diğer biyolojik sistemleri kesmeleri beri 4.5 içinde açıklandığı gibi kanama yok dendrimer kapsüllenmiş siRNA enjeksiyon sırasında sahip olmaktır. Böylece, biz balık kanama deneysel grupları hariç enjeksiyon sırasında oluşur öneririz. Genel olarak, bu basit iğne yordamı kolayca birkaç deneme sonra hakim.

Bu yöntem büyük potansiyel hedef kapalı efektleri ve ilgi genlerin eksik silme gibi siRNA teknoloji kendisi, sınırlamalardır. Aksi takdirde, son derece tekrarlanabilir biyolojik çoğaltma birkaç genler gen damping oldu çalışmalarımız ve diğerlerinin41gösterdi. Önemlisi, bu hızlı, basit ve etkili iletişim kuralıdır ve enjeksiyon tedavisi tarafından yetişkin zebra balığı iyi tolere. SiRNA gen susturmak verimlilik deneysel Analizi değerlendirme mRNA ifade düzeyleri içinde in situ hibridizasyon veya kantitatif RT-PCR veya Batı lekesi, boyama, immunohistokimyasal kullanarak protein ifade düzeyleri içerebilir veya diğer fonksiyonel analizleri. Birlikte, tamamen nanopartikül kolaylaştırdı siRNA teslim yetişkin zebra balığı kalp fonksiyon kaybı çalışmaları için alternatif bir araç olarak özellikle onaylamaz ve bu yaklaşım aynı zamanda diğer organlara yetişkin zebra balığı ve diğer canlılar için uzatılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

El yazması okuma ve yazar Dr. IC Bruce kritik Yorumlar için teşekkür ederim. Bu eser Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı Çin (31430059, 31701272, 31730061, 81470399 ve 31521062), AstraZeneca Asya ve gelişmekte olan piyasa yenilikçi ilaç ve erken gelişme gelen hibe tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
tricaine Sigma E10521 Store at 4 °C
stereomicroscope Leica  S8AP0
sharp forcep WPI 14098
iridectomy scissors WPI 501778
elbow tweezers Suzhou Liuliu SE05Cr
α,ω-dipyridyl disulfido polyethylene glycol(Py-PEG-Py) Biomatrik (Jiaxing) Inc. 5239
core of G4.0 polyamidoamine (PAMAM) Andrews ChemServices AuCS-297
vacuum drying equipment Yiheng DZF-6020
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) Gibco 14190144
tris(2-carboxyethyl)phosphine(TCEP) Alfar Aesar 51805-45-9 Causes severe skin burns and eye damage. Causes serious eye damage.
ultrafiltration tube Millipore UFC900308
freeze dryer Martin Christ Alpha 2-4 Ldplus
NMR spectrometer Bruker AV400
Deuterium oxide(D2O) J&K 174611
NMR sample tube J&K WG-1000-7-50
3 kDa MWCO ultrafiltration tube Merck UFC900308
sea salts Instant Ocean® SS15-10

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Writing Group Members. Executive Summary: Heart Disease and Stroke Statistics--2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 133 (4), 447-454 (2016).
  2. Chablais, F., Veit, J., Rainer, G., Jazwinska, A. The zebrafish heart regenerates after cryoinjury-induced myocardial infarction. BMC Dev Biol. 11, 21 (2011).
  3. Gonzalez-Rosa, J. M., Martin, V., Peralta, M., Torres, M., Mercader, N. Extensive scar formation and regression during heart regeneration after cryoinjury in zebrafish. Development. 138 (9), 1663-1674 (2011).
  4. Parente, V., et al. Hypoxia/reoxygenation cardiac injury and regeneration in zebrafish adult heart. PLoS One. 8 (1), 53748 (2013).
  5. Poss, K. D., Wilson, L. G., Keating, M. T. Heart regeneration in zebrafish. Science. 298 (5601), 2188-2190 (2002).
  6. Raya, A., et al. Activation of Notch signaling pathway precedes heart regeneration in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, Suppl 1 11889-11895 (2003).
  7. Schnabel, K., Wu, C. C., Kurth, T., Weidinger, G. Regeneration of cryoinjury induced necrotic heart lesions in zebrafish is associated with epicardial activation and cardiomyocyte proliferation. PLoS One. 6 (4), 18503 (2011).
  8. Wang, J., et al. The regenerative capacity of zebrafish reverses cardiac failure caused by genetic cardiomyocyte depletion. Development. 138 (16), 3421-3430 (2011).
  9. Gonzalez-Rosa, J. M., Burns, C. E., Burns, C. G. Zebrafish heart regeneration: 15 years of discoveries. Regeneration (Oxf). 4 (3), 105-123 (2017).
  10. Heasman, J., Kofron, M., Wylie, C. Beta-catenin signaling activity dissected in the early Xenopus embryo: a novel antisense approach. Dev Biol. 222 (1), 124-134 (2000).
  11. Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish. Nat Genet. 26 (2), 216-220 (2000).
  12. Coonrod, S. A., Bolling, L. C., Wright, P. W., Visconti, P. E., Herr, J. C. A morpholino phenocopy of the mouse mos mutation. Genesis. 30 (3), 198-200 (2001).
  13. London, C. A., et al. A novel antisense inhibitor of MMP-9 attenuates angiogenesis, human prostate cancer cell invasion and tumorigenicity. Cancer Gene Ther. 10 (11), 823-832 (2003).
  14. Kizil, C., Otto, G. W., Geisler, R., Nusslein-Volhard, C., Antos, C. L. Simplet controls cell proliferation and gene transcription during zebrafish caudal fin regeneration. Dev Biol. 325 (2), 329-340 (2009).
  15. Thummel, R., et al. Inhibition of zebrafish fin regeneration using in vivo. electroporation of morpholinos against fgfr1 and msxb. Dev Dyn. 235 (2), 336-346 (2006).
  16. Kizil, C., Brand, M. Cerebroventricular microinjection (CVMI) into adult zebrafish brain is an efficient misexpression method for forebrain ventricular cells. PLoS One. 6 (11), 27395 (2011).
  17. Kizil, C., Iltzsche, A., Kaslin, J., Brand, M. Micromanipulation of gene expression in the adult zebrafish brain using cerebroventricular microinjection of morpholino oligonucleotides. J Vis Exp. (75), e50415 (2013).
  18. Craig, S. E., et al. The zebrafish galectin Drgal1-l2 is expressed by proliferating Muller glia and photoreceptor progenitors and regulates the regeneration of rod photoreceptors. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (6), 3244-3252 (2010).
  19. Thummel, R., Bailey, T. J., Hyde, D. R. In vivo electroporation of morpholinos into the adult zebrafish retina. J Vis Exp. (58), e3603 (2011).
  20. Rayburn, E. R., Zhang, R. Antisense, RNAi and gene silencing strategies for therapy: mission possible or impossible. Drug Discov Today. 13 (11-12), 513-521 (2008).
  21. Seth, P. P., et al. Short antisense oligonucleotides with novel 2'-4' conformationaly restricted nucleoside analogues show improved potency without increased toxicity in animals. J Med Chem. 52 (1), 10-13 (2009).
  22. Prakash, T. P., et al. Antisense oligonucleotides containing conformationally constrained 2',4'-(N-methoxy)aminomethylene and 2',4'-aminooxymethylene and 2'-O,4'-C-aminomethylene bridged nucleoside analogues show improved potency in animal models. J Med Chem. 53 (4), 1636-1650 (2010).
  23. Yamamoto, T., Nakatani, M., Narukawa, K., Obika, S. Antisense drug discovery and development. Future Med Chem. 3 (3), 339-365 (2011).
  24. Itoh, M., Nakaura, M., Imanishi, T., Obika, S. Target gene knockdown by 2',4'-BNA/LNA antisense oligonucleotides in zebrafish. Nucleic Acid Ther. 24 (3), 186-191 (2014).
  25. Han, P., et al. Hydrogen peroxide primes heart regeneration with a derepression mechanism. Cell Res. 24 (9), 1091-1107 (2014).
  26. Jopling, C., et al. Zebrafish heart regeneration occurs by cardiomyocyte dedifferentiation and proliferation. Nature. 464 (7288), 606-609 (2010).
  27. Lepilina, A., et al. A dynamic epicardial injury response supports progenitor cell activity during zebrafish heart regeneration. Cell. 127 (3), 607-619 (2006).
  28. McManus, M. T., Sharp, P. A. Gene silencing in mammals by small interfering RNAs. Nat Rev Genet. 3 (10), 737-747 (2002).
  29. de Fougerolles, A., Vornlocher, H. P., Maraganore, J., Lieberman, J. Interfering with disease: a progress report on siRNA-based therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 6 (6), 443-453 (2007).
  30. Kim, D. H., Rossi, J. J. Strategies for silencing human disease using RNA interference. Nat Rev Genet. 8 (3), 173-184 (2007).
  31. McCaffrey, A. P., et al. Inhibition of hepatitis B virus in mice by RNA interference. Nat Biotechnol. 21 (6), 639-644 (2003).
  32. Raoul, C., et al. Lentiviral-mediated silencing of SOD1 through RNA interference retards disease onset and progression in a mouse model of ALS. Nat Med. 11 (4), 423-428 (2005).
  33. Hu-Lieskovan, S., Heidel, J. D., Bartlett, D. W., Davis, M. E., Triche, T. J. Sequence-specific knockdown of EWS-FLI1 by targeted, nonviral delivery of small interfering RNA inhibits tumor growth in a murine model of metastatic Ewing's sarcoma. Cancer Res. 65 (19), 8984-8992 (2005).
  34. Schiffelers, R. M., et al. Cancer siRNA therapy by tumor selective delivery with ligand-targeted sterically stabilized nanoparticle. Nucleic Acids Res. 32 (19), 149 (2004).
  35. Yang, X. Z., et al. Systemic delivery of siRNA with cationic lipid assisted PEG-PLA nanoparticles for cancer therapy. J Control Release. 156 (2), 203-211 (2011).
  36. Ko, Y. T., Hartner, W. C., Kale, A., Torchilin, V. P. Gene delivery into ischemic myocardium by double-targeted lipoplexes with anti-myosin antibody and TAT peptide. Gene Ther. 16 (1), 52-59 (2009).
  37. Liu, J., et al. Functionalized dendrimer-based delivery of angiotensin type 1 receptor siRNA for preserving cardiac function following infarction. Biomaterials. 34 (14), 3729-3736 (2013).
  38. Nam, H. Y., Kim, J., Kim, S. W., Bull, D. A. Cell targeting peptide conjugation to siRNA polyplexes for effective gene silencing in cardiomyocytes. Mol Pharm. 9 (5), 1302-1309 (2012).
  39. Nam, H. Y., McGinn, A., Kim, P. H., Kim, S. W., Bull, D. A. Primary cardiomyocyte-targeted bioreducible polymer for efficient gene delivery to the myocardium. Biomaterials. 31 (31), 8081-8087 (2010).
  40. Won, Y. W., McGinn, A. N., Lee, M., Bull, D. A., Kim, S. W. Targeted gene delivery to ischemic myocardium by homing peptide-guided polymeric carrier. Mol Pharm. 10 (1), 378-385 (2013).
  41. Diao, J., et al. PEG-PLA nanoparticles facilitate siRNA knockdown in adult zebrafish heart. Dev Biol. 406 (2), 196-202 (2015).
  42. Xiao, C., et al. Chromatin-remodelling factor Brg1 regulates myocardial proliferation and regeneration in zebrafish. Nat Commun. 7, 13787 (2016).
  43. Wang, F., et al. A Neutralized Noncharged Polyethylenimine-Based System for Efficient Delivery of siRNA into Heart without Toxicity. ACS Appl Mater Interfaces. 8 (49), 33529-33538 (2016).
  44. Kikuchi, K., et al. Retinoic acid production by endocardium and epicardium is an injury response essential for zebrafish heart regeneration. Dev Cell. 20 (3), 397-404 (2011).
  45. Hoshijima, K., Jurynec, M. J., Grunwald, D. J. Precise Editing of the Zebrafish Genome Made Simple and Efficient. Dev Cell. 36 (6), 654-667 (2016).
  46. Zu, Y., et al. TALEN-mediated precise genome modification by homologous recombination in zebrafish. Nat Methods. 10 (4), 329-331 (2013).
  47. Kesharwani, P., Gajbhiye, V., Jain, N. K. A review of nanocarriers for the delivery of small interfering RNA. Biomaterials. 33 (29), 7138-7150 (2012).
  48. Luong, D., et al. PEGylated PAMAM dendrimers: Enhancing efficacy and mitigating toxicity for effective anticancer drug and gene delivery. Acta Biomater. 43, 14-29 (2016).
  49. Luo, K., He, B., Wu, Y., Shen, Y., Gu, Z. Functional and biodegradable dendritic macromolecules with controlled architectures as nontoxic and efficient nanoscale gene vectors. Biotechnol Adv. 32 (4), 818-830 (2014).
  50. Shcharbin, D., Shakhbazau, A., Bryszewska, M. Poly(amidoamine) dendrimer complexes as a platform for gene delivery. Expert Opin Drug Deliv. 10 (12), 1687-1698 (2013).

Tags

Gelişim biyolojisi sayı: 137 zebra balığı Yetişkin kalp rejenerasyon nano tanecikleri siRNA gen susturmak gelişimsel biyoloji genetik
Nanopartikül aracılı siRNA Gene susturmak yetişkin zebra balığı kalbinde
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xiao, C., Wang, F., Hou, J., Zhu,… More

Xiao, C., Wang, F., Hou, J., Zhu, X., Luo, Y., Xiong, J. W. Nanoparticle-mediated siRNA Gene-silencing in Adult Zebrafish Heart. J. Vis. Exp. (137), e58054, doi:10.3791/58054 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter