Summary
Det er fortsat en stor udfordring at udvikle betinget af gen-knockout eller effektiv af gen-knockdown i voksen zebrafisk organer. Her rapporterer vi en protokol for udfører nanopartikel-medieret siRNA genhæmning i voksen zebrafisk hjertet, hvilket giver en ny tab af funktion metode til at studere voksen organer i zebrafisk og andre modelorganismer.
Abstract
Pattedyr har en meget begrænset kapacitet til at regenerere hjertet efter myokardieinfarkt. På den anden side regenererer den voksne zebrafisk sit hjerte efter apex resektion eller cryoinjury, hvilket gør det en vigtig model organisme for hjertet regenerering undersøgelse. Manglen på tab af funktion metoder for voksne organer har imidlertid begrænset indsigt i de underliggende hjerte regenerering mekanismer. RNA-interferens via forskellige leveringssystemer er et kraftfuldt værktøj til silencing gener i pattedyrsceller og modelorganismer. Vi har tidligere rapporteret at siRNA-indkapslede nanopartikler med held angive celler og resultere i en bemærkelsesværdig gen-specifikke knockdown i regenererende voksen zebrafisk hjertet. Her præsenterer vi en enkel, hurtig og effektiv protokol for dendrimer-medieret siRNA levering og genhæmning regenererende voksen zebrafisk midt. Denne metode giver en alternativ metode til bestemmelse af genet funktioner i voksen organer i zebrafisk og kan udvides til at omfatte andre modelorganismer så godt.
Introduction
Myokardieinfarkt er blevet en stor sundhedstrussel, fører til en enorm økonomisk byrde omkring verden1. Den voksne pattedyr hjerte undlader at regenerere og genopbygge den tabte cardiomyocytes på en makroskopisk skala efter den skade, hvilket fører til dannelsen af ar væv og efterfølgende hjertesvigt. I modsætning til pattedyr er zebrafisk i stand til at hjertet regenerering, primært gennem robust Myokardie spredning efter forskellige typer af hjerte skade, hvilket gør det en ideel model organisme for at undersøge de molekylære mekanismer af hjertet regenerering 2,3,4,5,6,7,8. Decifrere de endogene mekanismer er underliggende zebrafisk hjerte regenerering et spændende område for forskning i søgningen for nye terapeutiske strategier til at forbedre menneskers hjerte regenerering9.
Genetisk manipulation metoder er tilgængelige i zebrafisk. Disse består af morpholinos (MO), er også meget udbredt i frøer, kylling og pattedyr udover i zebrafisk10,11,12,13. MO har effektive knockdown af target genekspression i voksen zebrafisk fin, hjernen og nethinden14,15,16,17,18,19. Låst-nucleic acid (LNA) er en anden kunstig oligonukleotid bruges til at banke ned endogene genekspression i zebrafisk embryoner, men også i voksne dyrs organer20,21,22,, 23 , 24. dog manglen på effektive tab af funktion metoder for voksnes hjerter stadig en hindring i at studere de molekylære mekanismer af orgel regeneration. På nuværende, små-molekyle hæmmere eller transgene udtryk for dominerende-negative mutanter bruges primært til at blokere funktionen af et bestemt gen eller vej at undersøge dets funktion i voksen zebrafisk hjerte regenerering25,26 ,27. Dog ikke alle gener eller signaling veje er gældende for disse metoder.
Blander sig små RNA'er (siRNAs) er almindeligt anvendt til analysen af tab af funktion i pattedyrsceller og embryoner af modelorganismer samt voksne organer efter prækliniske undersøgelser i dyr modeller28,29,30 , 31 , 32. siRNAs har brugt effektivt til tavshed gener i tumorer33,34,35 og cardiomyocytes36,37,38,39 ,40 via forskellige leveringssystemer. For nylig har udviklet vi effektive siRNA-indkapslede nanopartikel genhæmning i regenererende voksen hjertet ved hjælp af flere forskellige nanopartikler41,42,43, giver et nyt værktøj til funktionelle studier af gener i voksen zebrafisk organer. Baseret på vores tidligere undersøgelser41,42,43, her vil vi præsentere en enkel, praktisk, men kraftfuld protokol for siRNA genhæmning i regenererende voksen zebrafisk hjertet ved hjælp af f-PAMAM-PIND-R9 dendrimers. Aldh1a2 (aldehyd dehydrogenase 1, familiemedlem A2) gen var upregulated efter zebrafisk apex resektion og ablation af Aldh1a2 blokeret hjerte regenerering44. Her tager vi aldh1a2 genet som et eksempel at teste gen knockdown effektivitet medieret af nanopartikler-indkapslede siRNA injektion. Denne protokol indeholder en procedure for zebrafisk hjerte resektion, kemisk syntese af nanopartikler og en leveringsmetode på siRNA-indkapslede nanopartikler i voksen zebrafisk hjerte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyr procedurer bruges en zebrafisk protokol godkendes af det institutionelle Animal Care og brug udvalg ved Peking University, som er fuldt ud godkendt af Association for evaluering og akkreditering af Laboratory Animal Care.
1. forberedelse af Tricaine løsning
- For at forberede tricaine stamopløsning, tilføje 400 mg ethyl 3-aminobenzoat methanesulfonate pulver til 97,9 mL destilleret vand og derefter tilsættes 2,1 mL 1 M Tris (pH 9.5) til at justere pH ~ 7. Butik stamopløsning ved 4 ° C.
- For at forberede tricaine brugsopløsning, tilføje 4,2 mL tricaine stamopløsning til 100 mL akvarium system vand.
2. voksen zebrafisk ventrikulær resektion
- Forberede instrumenter og materialer til kirurgi, som omfatter et stykke af svamp, en petriskål, fyldt med tricaine arbejder løsning, en plastik pipette, et stereomikroskop, to skarpe pincet, iridectomy saks, og albue pincet (figur 1).
- Forberede en lille rille i størrelsen 4 cm x 0,5 cm og 0,5 cm i dybden på en svamp til at holde zebrafisk under den ventrikulære resektion kirurgi.
- Fyld en 3 L zebrafisk tank med en halv tank zebrafisk system vand, der er lavet ved hjælp af 60 mg/L sea salte i dH2O til genopretning af de skadede fisk.
- Bedøver fisk i en 10 cm petriskål med tricaine løsning indtil gill bevægelser falde til én pr sekund og holde fiskene for mindst 30 s til at sikre, at det er fuldt bedøvede.
- Overføre den bedøvede fisk med albue pincet til groove i en fugtig svamp ventrale side op. Synligt lokalisere margin af det bankende hjerte, og find derefter hjertet under et stereomikroskop.
- Brug iridectomy saks til at gøre en lille snit på ca. 1 mm der trænger ind i huden og musklerne, og forsigtigt rive den sølvfarvede epitel lag af hjertesæk med pincet tips til at få adgang til hjertet. Indsæt ikke pincet for dybt i hulrum at undgå hjerte skade.
Bemærk: på dette punkt, huske på at undgå omfattende blødning. Udelukke fisk fra forsøget, hvis omfattende blødning opstår, da den overdreven blødning er hovedsageligt forårsaget af personulykker til hjertet og så vil resultere i misvisende resultater. - Udsætte ventrikel ved at forsigtigt holde sin apex med skarpe pincet ved hjælp af ikke-dominerende hånd eller ved at anvende blid abdominal pres. Derefter, med anden hånden, fjerne ~ 20% af ventrikel ved spids ved hjælp af iridectomy saks.
Bemærk: Ingen omfattende blødning bør opstå på dette punkt. - Bruge en våd serviet til at dække indsnittet, som sår bløder voldsomt for 15 – 45 s før koagulation, og derefter sætte fisken tilbage i tanken med system vand.
Bemærk: Det er ikke nødvendigt at sutur snit. - Sørg for at fiskene genvinder gill bevægelser inden for 1 min og derefter genoptager svømning. Hvis fiskene ikke viser gill bevægelser efter 50 s i vand, lette det sprøjter vand ind i gæller ved hjælp af en plastik pipette, indtil fisken genoptager aktiv ventilation.
- Opretholde fisken i genanvende systemet efter den ventrikulære resektion.
Bemærk: Ingen særlige bekymringer er nødvendige i forhold til den normale fisk. Dødeligheden af voksen zebrafisk ventrikulær resektion er omkring 5-10%. Næsten alle dødsfald sker inden for 24 timer efter operationen.
3. forberedelse af siRNA-indkapslede nanopartikler
- Syntetisere f-PAM4-PLØK-R9 dendrimer.
Bemærk: Syntese af f-PAM4-PLØK-R9 dendrimer materialer blev udført som beskrevet tidligere37 med nogle ændringer. Længden af α, ω-dipyridyl disulfido polyethylen glycol (Py-PIND-Py) blev reduceret til en molekylvægt på 1.000 at maksimere indkapsling af siRNAs (figur 2B). - Tørre 10 mg cystamine kerne af G4.0 polyamidoamine (kaldet PAMAM) ved hjælp af vakuum tørretumbler ved 45 ° C i 1 time og derefter opløse PAMAM i 2 mL Dulbecco fosfatbufferet saltopløsning (DPBS, en afbalanceret saltopløsning bruges til en lang række celle kultur applikationer).
- Opløse 1,7 mg tris(2-carboxyethyl) phosphine (TCEP) i 1 mL DPBS, blandes med PAMAM løsning parat i 3.2 og forlade ved stuetemperatur med blid omrøring i 8 h.
Bemærk: TCEP er billeddetaljerne i kindtand forholdet overskydende til disulfid obligationer af PAMAM. - Fjerne overdreven TCEP ved ultrafiltrering. Føje DPBS til ovennævnte PAMAM-TCEP blanding at nå volumen på 10 mL og løsningen er overført til en 3 kDa MWCO (Molekylær vægt afskåret) ultrafiltrering tube. Efter centrifugering ved 3000 g i 15 min., kasseres løsning i collection tube. Føje DPBS til filter enheden til 10 mL og forsigtigt pipette prøven flere gange og centrifugeres igen. Gentag dette trin for 4 gange. Efter den sidste filtrering, Aspirér prøve fra filter enhed.
Bemærk: Produktet af dette trin er reduceret PAMAM (såkaldte f-PAM4). - Opløses 14 mg Py-PIND-Py i 1 mL DPBS, mix med f-PAM4 løsning og forlade det med blid omrøring ved stuetemperatur i 3 timer. Derefter fjerne overdreven Py-PIND-Py ved ultrafiltrering trin som beskrevet i 3.4. Efter den sidste filtrering, Aspirér prøve fra filter enhed.
Bemærk: Produktet er benævnt nemlig f-PAM4-PIND-Py. Mængden af Py-PIND-Py er 10-fold i den molære forhold til thiol grupper i f-PAM4. - Opløs 6,4 mg af cystein opsagt R9 peptid (Ac-CRRRRRRRRR-NH2) i 1 mL DPBS, bland med f-PAM4-PIND-Py og forsigtigt røre i 8 timer ved stuetemperatur. Rense det endelige produkt, kaldet f-PAM4-PIND-R9, ved ultrafiltrering trin som beskrevet i 3.4, bortset fra at DPBS er ændret til deioniseret vand. Lyophilize produktet ved hjælp af en fryse vakuum tørretumbler.
Bemærk: Produkter i 3.5 og 3.6 før ingot opbevares ved-20 ℃ i mindst 1 måned. Efter ingot af f-PAM4-PIND-R9 er prøverne opbevares ved-20 ℃ i mindst 2 måneder. - For at bestemme graden af PIND og peptid modifikation, 5 mg af f-PAM4-PIND-Py i D2O (deuteriumoxid) opløses og overføre det til NMR (Nuclear Magnetic Resonance) prøveglas. Udføre 1H-NMR spektralanalyse på 400 MHz og analysere data ved hjælp af NMR data analyse software37.
Bemærk: Specifikt repræsentant PAMAM toppe (- NCH2CH2CO-), PIND toppe (- OCH2CH2-), og arginin rester toppe (- HCCH2CH2CH2NH-) i peptider forventes at være i områderne 2,4-2,6, 3,7-3,8 og 1,6-1,8 ppm, henholdsvis. Bestemme graden af ændring af PIND og R9 i forhold til PAMAM ved beregning af integraler af PIND og R9 toppene til PAMAM tinderne. Ændring af PIND er 100% og R9 ændring er mindst 50%. 1H-NMR spektrale analyser er udført i core facilitet af institutionen. - Opløse f-PAM4-PLØK-R9 dendrimer pulver i PBS til 4 mg/mL og gøre delprøver af løsning for engangs brug.
Bemærk: Dendrimer løsning kan opbevares ved-20 ° C i mindst en måned, uden gentagen nedfrysning og optøning. - Opløs cyanine farvestoffer-mærket siRNAs (såkaldte Cy5-siRNA), Aldh1a2 siRNA eller røræg negativ kontrol siRNA i destilleret vand til 10 µM.
Bemærk: Brug cyanine farvestoffer-mærket siRNAs for at vurdere, om nanopartikler indkapslet siRNA kan indtaste fisk hjertet (figur 2A-B). Denne protokol finder aldh1a2 som et eksempel-gen til at bestemme effektiviteten af levering af f-PAM4-PIND-R9 dendrimer-indkapslede siRNA. Sekvenser af siRNAs er: Cy5-siRNA antisense strand: 5 '-ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT-3 ' siAldh1a2 antisense strand: 5'-UUCAGGACAACCGUGUUCCdTdT-3' og scrambled negativ kontrol siRNA antisense strand: 5'-ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT-3'. - For at forberede siRNA-indkapslede nanopartikel løsning, bland siRNA med en tilsvarende mængde dendrimer-opløsning og inkuberes prøve ved stuetemperatur i 20 min. frisk forberede siRNA-nanopartikel løsning før brug.
Bemærk: Mængden af siRNA-indkapslede nanopartikel løsning afhænger af antallet af fisk vil blive injiceret. For eksempel, forberede mindst 120 µL dendrimer løsning (60 µL dendrimer løsning og mix 60 µL siRNA løsning) til injektion af 10 fisk (~ 10 µL pr. fisk), tælle tab af løsning.
4. indsprøjtning af siRNA-indkapslede nanopartikler i voksen zebrafisk hjerte
- Som beskrevet ovenfor, forberede et stykke af svamp med en rille, en 10 cm petriskål fyldt med tricaine løsning, en plastik pipette, et stereomikroskop, albue pincet og en insulin sprøjte (figur 1), samt et akvarium med system vand til boliger af fiske efter injektion.
- Tillader den tilskadekomne zebrafisk forberedt i trin 2.1-2.10 til at inddrive i 1 dag efter ventrikulær resektion, og derefter bedøver den 1 dpa (dage efter amputation) fisk i tricaine løsning som beskrevet i punkt 2.4.
- Overføre den bedøvede fisk, ventrale side op, at rillen i fugtig svamp ved hjælp af albue pincet. Find det bankende hjerte under stereomikroskopet.
- Læg 10 µL af opløsningen siRNA-indkapslede nanopartikel i insulin sprøjten. Undgå boblerne så meget som muligt.
- Immobilisere fisken af forsigtigt ved hjælp af albue pincet til at holde den thorax region med ikke-dominerende hånd. Ikke klemme fisken for stramt.
Bemærk: Husk på, ingen omfattende blødning bør forekomme under injektionen. - Hold fyldt insulin sprøjten på ~ 30° og injicere ~ 10 µL af løsning i brysthulen ved hjælp af anden side (supplerende figur 1).
Bemærk: Løsningen løber undertiden ud under indsprøjtningen, men dette berører ikke siRNA effekt. SiRNA-nanopartikel løsning kan injiceres en gang om dagen i flere dage til en måned, afhængigt af en konkret eksperimentelle plan. Indsprøjtes en fisk med én type af siRNA hver gang. Hvis mere end to typer af siRNA har brug for til at blive injiceret i en fisk, injicere én type af siRNA hver gang, og derefter indsprøjtes en anden type af siRNA 1 time senere. I denne protokol, blev kun én slags siRNA pr. fisk injiceret. - Overføre fisken tank med vand, system.
Bemærk: Fisken forventes at genstarte ventilation inden for 1 min, og derefter genoptage svømning. Injektion af siRNA-indkapslede nanopartikler eller siRNA forårsager normalt ikke død i voksen zebrafisk.
5. hjerte samling, fiksering og evaluering af effektiviteten af siRNA levering
- Forberede 1 mL af 4% PARAFORMALDEHYD løsning i et microcentrifuge rør til hver gruppe.
- Bedøver fisk i tricaine løsning på udvalgte dage efter injektioner. Læg fisken dvask ind i rillen i en fugtig svamp. Gøre en stor indsnit i regionen thorax og åbne bredt med pincet. Greb udstrømning tarmkanalen og trække ud hele hjertet omhyggeligt med pincet.
- Skyl hjerte med PBS og hurtigt fjerne ekstra væske med en serviet. Lagt op til 10 hjerter i et 1,5 mL microcentrifuge rør med 1 mL PARAFORMALDEHYD. Forsigtigt Vend røret flere gange, og holde natten over ved 4 ° C.
- Måle fluorescens-intensiteten af Cy5-siRNAs-indsprøjtning hjerter med den i vivo imaging system (supplerende figur 2). Bruge 3-4 zebrafisk hjerter for hver gruppe i denne undersøgelse.
- Montere faste hjerter med enten paraffin eller OLT sammensatte (indlejring Medium til frosne væv prøver at sikre Optimal opskæring temperatur).
6. evaluering af nanopartikler-medieret siRNA genhæmning
- Forbered en isoleret container og lange pincet. Hæld i flydende kvælstof til en tredjedel af mængden af beholderen.
- Bedøver fisk i tricaine løsning på 2 dpa. Dissekere hjerter som beskrevet i punkt 5.2, og fjern derefter udstrømning tarmkanalen og atrium.
Bemærk: Fisken kan inddrive fra kirurgi på én dag og derefter sprøjtet på 1 dpa med enten scrambled siRNA-indkapslede nanopartikler (siNC) som en negativ kontrol eller aldh1a2 siRNA-indkapslede nanopartikler (siAldh1a2). - Overføre hjertekamrene til en 1,5 mL microcentrifuge tube bruger en pincet, dække tube låget, og straks røret anbringes i en isoleret beholder med flydende kvælstof. Lad rør float på de flydende kvælstof i et par min. Brug den lange pincet til at fjerne rør fra beholderen.
- Gentag trin 6.2 og 6.3, indtil alle hjertekamrene er indsamlet. Bruge 6-10 hjerter til hver gruppe.
- Uddrag den samlede RNA hjerter med RNA isolering reagens. Vurdere udtryk niveauer af de respektive gener ved kvantitativ RT-PCR ved hjælp af primere Gapdh F: GATACACGGAGCACCAGGTT; Gapdh R: GCCATCAGGTCACATACACG; Aldh1a2 F: TGAGCGAGGAGCAGCAGAGA; Aldh1a2 R: TCCACGAAGAAGCCTTTAGTAGCA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at bestemme effektiviteten af dendrimer-medieret siRNA levering, vi resektion apex af ventrikel zebrafisk hjerte, derefter injiceres 10 µL af dendrimer kun (mock gruppe), Cy5-siRNA kun (nøgen gruppe) eller f-PAMAM-PIND-R9 dendrimer-indkapslede Cy5-siRNA (Cy5-siRNA gruppe) intrapleurally, henholdsvis (figur 2A-B). Fluorescens signal var påvises i hjerter sprøjtes med dendrimer-indkapslede Cy5-siRNA på 3, 24 og 48 hpi (timer efter injektion), mens det var næppe spores i hjerter fra grupperne mock og nøgen på 48 hpi (figur 2C-D), tyder på, at f-PAMAM-PIND-R9 dendrimer effektivt letter levering af siRNAs til voksne zebrafisk hjertet og er stabil i mindst to dage.
For at undersøge effekten af dendrimer-indkapslede siRNA på genhæmning, valgte vi aldh1a2 (retinoid syre-syntetisere enzym) som en mål-gen, som er blevet rapporteret at være nødvendige for hjertet regenerering efter ventrikulær resektion44 . Som vist i figur 3A, var fisk tilladt at komme for en dag efter ventrikulær resektion og derefter microinjected med dendrimer-indkapslede siRNA. Vi fandt, at aldh1a2 mRNA udtryk niveauet faldt i hjerter behandlet med f-PAMAM-PIND-R9 dendrimer-indkapslede siAldh1a2 sammenlignet med dendrimer-indkapslede scrambled siRNA (siNC) på 2 dpa (fig. 3B), demonstrere, at f-PAMAM-PIND-R9 dendrimer-medieret siRNAs opnå gen-specifik genhæmning i voksen zebrafisk hjerte.
Figur 1 : Hjerteoperation og thorax injektion instrumenter. Fotografi af instrumenterne for ventrikulær resektion i voksen zebrafisk hjerte: svamp med en rille, albue pincet, skarpe pincet, iridectomy saks, lang pincet og insulin sprøjten bruges til dendrimer-indkapslede siRNA levering. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Effektiv f-PAMAM-PIND-R9 dendrimer-assisteret levering af siRNA ind i såret voksen zebrafisk hjertet. (A) ordningen for at undersøge optagelse effektiviteten af nanopartikler-indkapslede Cy5-siRNA i voksen zebrafisk hjertet efter ventrikulær resektion (dpa: dage efter amputation; hpi: timer efter injektion). (B) syntese af f-PAMAM-PIND-R9 dendrimer og forberedelse af dendrimer-indkapslede Cy5-siRNA. (C) Cy5 fluorescens billeddannelse af hjerter injiceres med dendrimers kun (mock), Cy5-siRNA kun uden dendrimer indkapsling (nøgen) og dendrimer-indkapslede fluorescens mærket Cy5-siRNA (Cy5-siRNA) opdaget af in vivo billeddannelse system, viser, at fluorescens signaler blev næsten ikke målbart i grupperne mock og nøgen på 48 hpi, mens stærke signaler bevares i de dendrimer-indkapslede Cy5-siRNA grupper fra 3 til 48 hpi. Det vilkårlige omfanget af fluorescens signaler viser fra svage (blå) til stærk (rød). (D) kvantificering af Cy5-siRNA fluorescens signaler i hjerter vurderet af de i vivo imaging system som i panelet C (* P < 0,05, *** P < 0,001 data er gennemsnit ± s.e.m.; en-vejs variansanalyse efterfulgt af Bonferroni's flere sammenligning tests. n = 3-4 hjerter). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Effektiv siRNA hæmning af aldh1a2 i den skadede voksen zebrafisk hjerte. (A) ordningen for at undersøge den genhæmning effekt af aldh1a2 siRNA. (B) qPCR afslører aldh1a2 mRNA faldt i nanopartikel-indkapslede siAldh1a2 hjerter sammenlignet med nanopartikler-indkapslede scrambled siRNA hjerter (siNC). Aldh1a2 mRNA udtryk niveauet var normaliseret af GAPDH (*** P < 0,001; data er ensbetydende med ± s.e.m. med parret Student's t-test). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Tillægs figur 1: billeder af brysthulen injektion. (A) brysthulen i voksne fisk på 1 dag post amputation. (B) injektion af nanopartikler-indkapslede siRNA i brysthulen. Skalere barer: 1 mm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Tillægs figur 2: optagelse effektivitet af nanopartikler-indkapslede Cy5-siRNA i uskadt voksen zebrafisk hjerte. (A) Cy5 fluorescens billeddannelse af hjerter injiceres med dendrimers kun (mock), nøgne Cy5-siRNA uden dendrimer indkapsling (nøgen) og dendrimer-indkapslede Cy5-siRNA under den i vivo imaging system. Det vilkårlige omfanget af fluorescens signaler er fra svage (blå) til stærk (rød). (B) kvantificering af Cy5-siRNA fluorescens signaler i hjerter målt ved de i vivo imaging system som i panelet A (NC: ikke signifikant forskellige; data er gennemsnit ± s.e.m.; en-vejs variansanalyse efterfulgt af Bonferroni's flere sammenligning test; n = 3-4 hjerter). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For zebrafisk er fuldt ud i stand til at regenerere en række organer, herunder voksen hjerte5. Mens transgene og genetiske metoder er veludviklet for at studere genet funktioner i embryoner fra zebrafisk, efterforskere stadig over for en skræmmende opgave at generere betinget mutante alleler i zebrafisk45,46. Således transgene dominerende-negative mutanter eller små-molekyle hæmmere bruges ofte til adresse genet funktioner i voksen zebrafisk organer25,27,42. I seneste år, har vi udviklet en alternativ metode til tab af funktion analyse af gener i voksen zebrafisk hjertet ved hjælp af nanopartikler-medieret siRNA levering og genhæmning41,42, 43. her, en detaljeret protokol til denne metode ved hjælp af dendrimer-medieret siRNA genhæmning i zebrafisk hjerter i særdeleshed og eventuelt i andre zebrafisk organer, i almindelighed, er præsenteret.
SiRNA molekyle kan ikke træde i cellerne af sig selv på grund af dens negative ladning og ville blive let forringet af nukleasen. Med mono-sprede molekyler, afstemmelige strukturer og egenskaber, dendrimers har været betragtet som så lovende siRNA luftfartsselskaber 47. PAMAM dendrimers har rige kationiske periferier og bufferkapacitet aminer inde som kunne mægle siRNA indkapsling i fysiologiske forhold og fremkalde en "proton svamp" effekt at frigive siRNA fra endosomes i cytoplasmaet henholdsvis48 , 49 , 50. i denne artikel, PAMAM blev ændret for at effektivisere stabilitet og levering. F-PAMAM-PIND-R9 system giver en halvkugleformet PAMAM dendrimer hoved med den positive ladning for siRNA indkapsling at forhindre nedbrydningen af nukleasen. PIND arm og R9 transmembrane peptid blev brugt til at forbedre hydrofiliciteten af nanopartikler til stabilisering og fremme udbredelsen af celler henholdsvis.
Kvalitet og type af nanopartikler er kritisk for effektiv siRNA levering og genhæmning i zebrafisk hjerte. Vi har med succes undersøgt tre strukturelt forskelligartede nanopartikler til dette formål: PIND-PLA, f-PAMAM-PIND-R9 og PEI-HYD-M.H.T. nanopartikler41,42,43. Selv om de ikke er kommercielt produceret, kan en regelmæssig organisk kemi lab nemt syntetisere og rense nanopartikler som tidligere beskrevet35,37,43. Her, valgte vi f-PAMAM-PIND-R9 dendrimer som et eksempel for at vise enkle, effektive, dendrimer-medieret siRNA levering og genhæmning i voksen zebrafisk hjertet efter ventrikulær resektion, fordi det er relativt let at tilberede siRNA-loaded dendrimer-komplekser, som f.eks ved at inkubere blanding ved stuetemperatur for ~ 20 min. På den anden side har pH-værdien justeres til siRNA-loaded nanocomplexes hvis PEI-HYD-M.H.T. er brugt43. Tilsvarende er emulgerende og rensning procedurer afgørende for at opnå ensartet nanopartikel-indkapslede siRNA løsning hvis PIND-PLA nanopartikler er brugt35,41.
En anden kritisk trin er at minimere eller har ingen blødning under injektion af dendrimer-indkapslede siRNA som beskrevet i 4.5 da omfattende blødning afbryder hjerte regenerering og andre biologiske systemer. Vi foreslår således, undtagen fisk fra eksperimentelle grupper, hvis blødning forekommer under injektion. Denne enkle injektion procedure er generelt let mestret efter et par forsøg.
De store begrænsninger af denne metode er i siRNA selve teknologien, som potentielle off target effekter og ufuldstændige sletning af gener af interesse. Ellers meget reproducerbare biologiske replikering af genhæmning af flere gener er blevet påvist i vores arbejde og andres41. Vigtigst, denne protokol er hurtige, enkle og effektive, og indsprøjtning behandling er veltolereret af voksen zebrafisk. Eksperimentel analyse af siRNA genhæmning effektivitet kan omfatte vurdering af mRNA udtryk niveauer af in situ hybridisering eller kvantitativ RT-PCR eller protein udtryk niveauer ved hjælp af Western blotting, immunhistokemisk farvning, eller andre funktionelle analyser. Sammen, vi støtter fuldt ud lettes nanopartikel siRNA levering som en alternativ værktøj til tab af funktion undersøgelser i voksen zebrafisk hjerte især og denne tilgang kan også udvides til andre organer i voksen zebrafisk og andre modelorganismer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Forfatterne takke Dr. IC Bruce for kritiske kommentarer og læsning af manuskript. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Natural Science Foundation of China (31430059, 31701272, 31730061, 81470399 og 31521062), AstraZeneca Asien og Emerging Market innovativ medicin og tidlige udvikling.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| tricaine | Sigma | E10521 | Store at 4 °C |
| stereomicroscope | Leica | S8AP0 | |
| sharp forcep | WPI | 14098 | |
| iridectomy scissors | WPI | 501778 | |
| elbow tweezers | Suzhou Liuliu | SE05Cr | |
| α,ω-dipyridyl disulfido polyethylene glycol(Py-PEG-Py) | Biomatrik (Jiaxing) Inc. | 5239 | |
| core of G4.0 polyamidoamine (PAMAM) | Andrews ChemServices | AuCS-297 | |
| vacuum drying equipment | Yiheng | DZF-6020 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 14190144 | |
| tris(2-carboxyethyl)phosphine(TCEP) | Alfar Aesar | 51805-45-9 | Causes severe skin burns and eye damage. Causes serious eye damage. |
| ultrafiltration tube | Millipore | UFC900308 | |
| freeze dryer | Martin Christ | Alpha 2-4 Ldplus | |
| NMR spectrometer | Bruker | AV400 | |
| Deuterium oxide(D2O) | J&K | 174611 | |
| NMR sample tube | J&K | WG-1000-7-50 | |
| 3 kDa MWCO ultrafiltration tube | Merck | UFC900308 | |
| sea salts | Instant Ocean® | SS15-10 |
References
- Writing Group Members. Executive Summary: Heart Disease and Stroke Statistics--2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 133 (4), 447-454 (2016).
- Chablais, F., Veit, J., Rainer, G., Jazwinska, A. The zebrafish heart regenerates after cryoinjury-induced myocardial infarction. BMC Dev Biol. 11, 21 (2011).
- Gonzalez-Rosa, J. M., Martin, V., Peralta, M., Torres, M., Mercader, N. Extensive scar formation and regression during heart regeneration after cryoinjury in zebrafish. Development. 138 (9), 1663-1674 (2011).
- Parente, V., et al. Hypoxia/reoxygenation cardiac injury and regeneration in zebrafish adult heart. PLoS One. 8 (1), 53748 (2013).
- Poss, K. D., Wilson, L. G., Keating, M. T.
- Raya, A., et al. Activation of Notch signaling pathway precedes heart regeneration in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, Suppl 1 11889-11895 (2003).
- Schnabel, K., Wu, C. C., Kurth, T., Weidinger, G. Regeneration of cryoinjury induced necrotic heart lesions in zebrafish is associated with epicardial activation and cardiomyocyte proliferation. PLoS One. 6 (4), 18503 (2011).
- Wang, J., et al. The regenerative capacity of zebrafish reverses cardiac failure caused by genetic cardiomyocyte depletion. Development. 138 (16), 3421-3430 (2011).
- Gonzalez-Rosa, J. M., Burns, C. E., Burns, C. G. Zebrafish heart regeneration: 15 years of discoveries. Regeneration (Oxf). 4 (3), 105-123 (2017).
- Heasman, J., Kofron, M., Wylie, C. Beta-catenin signaling activity dissected in the early Xenopus embryo: a novel antisense approach. Dev Biol. 222 (1), 124-134 (2000).
- Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish. Nat Genet. 26 (2), 216-220 (2000).
- Coonrod, S. A., Bolling, L. C., Wright, P. W., Visconti, P. E., Herr, J. C. A morpholino phenocopy of the mouse mos mutation. Genesis. 30 (3), 198-200 (2001).
- London, C. A., et al. A novel antisense inhibitor of MMP-9 attenuates angiogenesis, human prostate cancer cell invasion and tumorigenicity. Cancer Gene Ther. 10 (11), 823-832 (2003).
- Kizil, C., Otto, G. W., Geisler, R., Nusslein-Volhard, C., Antos, C. L. Simplet controls cell proliferation and gene transcription during zebrafish caudal fin regeneration. Dev Biol. 325 (2), 329-340 (2009).
- Thummel, R., et al. Inhibition of zebrafish fin regeneration using in vivo. electroporation of morpholinos against fgfr1 and msxb. Dev Dyn. 235 (2), 336-346 (2006).
- Kizil, C., Brand, M. Cerebroventricular microinjection (CVMI) into adult zebrafish brain is an efficient misexpression method for forebrain ventricular cells. PLoS One. 6 (11), 27395 (2011).
- Kizil, C., Iltzsche, A., Kaslin, J., Brand, M. Micromanipulation of gene expression in the adult zebrafish brain using cerebroventricular microinjection of morpholino oligonucleotides. J Vis Exp. (75), e50415 (2013).
- Craig, S. E., et al. The zebrafish galectin Drgal1-l2 is expressed by proliferating Muller glia and photoreceptor progenitors and regulates the regeneration of rod photoreceptors. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (6), 3244-3252 (2010).
- Thummel, R., Bailey, T. J., Hyde, D. R. In vivo electroporation of morpholinos into the adult zebrafish retina. J Vis Exp. (58), e3603 (2011).
- Rayburn, E. R., Zhang, R. Antisense, RNAi and gene silencing strategies for therapy: mission possible or impossible. Drug Discov Today. 13 (11-12), 513-521 (2008).
- Seth, P. P., et al. Short antisense oligonucleotides with novel 2'-4' conformationaly restricted nucleoside analogues show improved potency without increased toxicity in animals. J Med Chem. 52 (1), 10-13 (2009).
- Prakash, T. P., et al. Antisense oligonucleotides containing conformationally constrained 2',4'-(N-methoxy)aminomethylene and 2',4'-aminooxymethylene and 2'-O,4'-C-aminomethylene bridged nucleoside analogues show improved potency in animal models. J Med Chem. 53 (4), 1636-1650 (2010).
- Yamamoto, T., Nakatani, M., Narukawa, K., Obika, S. Antisense drug discovery and development. Future Med Chem. 3 (3), 339-365 (2011).
- Itoh, M., Nakaura, M., Imanishi, T., Obika, S. Target gene knockdown by 2',4'-BNA/LNA antisense oligonucleotides in zebrafish. Nucleic Acid Ther. 24 (3), 186-191 (2014).
- Han, P., et al. Hydrogen peroxide primes heart regeneration with a derepression mechanism. Cell Res. 24 (9), 1091-1107 (2014).
- Jopling, C., et al. Zebrafish heart regeneration occurs by cardiomyocyte dedifferentiation and proliferation. Nature. 464 (7288), 606-609 (2010).
- Lepilina, A., et al. A dynamic epicardial injury response supports progenitor cell activity during zebrafish heart regeneration. Cell. 127 (3), 607-619 (2006).
- McManus, M. T., Sharp, P. A. Gene silencing in mammals by small interfering RNAs. Nat Rev Genet. 3 (10), 737-747 (2002).
- de Fougerolles, A., Vornlocher, H. P., Maraganore, J., Lieberman, J. Interfering with disease: a progress report on siRNA-based therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 6 (6), 443-453 (2007).
- Kim, D. H., Rossi, J. J. Strategies for silencing human disease using RNA interference. Nat Rev Genet. 8 (3), 173-184 (2007).
- McCaffrey, A. P., et al. Inhibition of hepatitis B virus in mice by RNA interference. Nat Biotechnol. 21 (6), 639-644 (2003).
- Raoul, C., et al. Lentiviral-mediated silencing of SOD1 through RNA interference retards disease onset and progression in a mouse model of ALS. Nat Med. 11 (4), 423-428 (2005).
- Hu-Lieskovan, S., Heidel, J. D., Bartlett, D. W., Davis, M. E., Triche, T. J. Sequence-specific knockdown of EWS-FLI1 by targeted, nonviral delivery of small interfering RNA inhibits tumor growth in a murine model of metastatic Ewing's sarcoma. Cancer Res. 65 (19), 8984-8992 (2005).
- Schiffelers, R. M., et al. Cancer siRNA therapy by tumor selective delivery with ligand-targeted sterically stabilized nanoparticle. Nucleic Acids Res. 32 (19), 149 (2004).
- Yang, X. Z., et al. Systemic delivery of siRNA with cationic lipid assisted PEG-PLA nanoparticles for cancer therapy. J Control Release. 156 (2), 203-211 (2011).
- Ko, Y. T., Hartner, W. C., Kale, A., Torchilin, V. P. Gene delivery into ischemic myocardium by double-targeted lipoplexes with anti-myosin antibody and TAT peptide. Gene Ther. 16 (1), 52-59 (2009).
- Liu, J., et al. Functionalized dendrimer-based delivery of angiotensin type 1 receptor siRNA for preserving cardiac function following infarction. Biomaterials. 34 (14), 3729-3736 (2013).
- Nam, H. Y., Kim, J., Kim, S. W., Bull, D. A. Cell targeting peptide conjugation to siRNA polyplexes for effective gene silencing in cardiomyocytes. Mol Pharm. 9 (5), 1302-1309 (2012).
- Nam, H. Y., McGinn, A., Kim, P. H., Kim, S. W., Bull, D. A. Primary cardiomyocyte-targeted bioreducible polymer for efficient gene delivery to the myocardium. Biomaterials. 31 (31), 8081-8087 (2010).
- Won, Y. W., McGinn, A. N., Lee, M., Bull, D. A., Kim, S. W. Targeted gene delivery to ischemic myocardium by homing peptide-guided polymeric carrier. Mol Pharm. 10 (1), 378-385 (2013).
- Diao, J., et al. PEG-PLA nanoparticles facilitate siRNA knockdown in adult zebrafish heart. Dev Biol. 406 (2), 196-202 (2015).
- Xiao, C., et al. Chromatin-remodelling factor Brg1 regulates myocardial proliferation and regeneration in zebrafish. Nat Commun. 7, 13787 (2016).
- Wang, F., et al. A Neutralized Noncharged Polyethylenimine-Based System for Efficient Delivery of siRNA into Heart without Toxicity. ACS Appl Mater Interfaces. 8 (49), 33529-33538 (2016).
- Kikuchi, K., et al. Retinoic acid production by endocardium and epicardium is an injury response essential for zebrafish heart regeneration. Dev Cell. 20 (3), 397-404 (2011).
- Hoshijima, K., Jurynec, M. J., Grunwald, D. J. Precise Editing of the Zebrafish Genome Made Simple and Efficient. Dev Cell. 36 (6), 654-667 (2016).
- Zu, Y., et al. TALEN-mediated precise genome modification by homologous recombination in zebrafish. Nat Methods. 10 (4), 329-331 (2013).
- Kesharwani, P., Gajbhiye, V., Jain, N. K. A review of nanocarriers for the delivery of small interfering RNA. Biomaterials. 33 (29), 7138-7150 (2012).
- Luong, D., et al. PEGylated PAMAM dendrimers: Enhancing efficacy and mitigating toxicity for effective anticancer drug and gene delivery. Acta Biomater. 43, 14-29 (2016).
- Luo, K., He, B., Wu, Y., Shen, Y., Gu, Z. Functional and biodegradable dendritic macromolecules with controlled architectures as nontoxic and efficient nanoscale gene vectors. Biotechnol Adv. 32 (4), 818-830 (2014).
- Shcharbin, D., Shakhbazau, A., Bryszewska, M. Poly(amidoamine) dendrimer complexes as a platform for gene delivery. Expert Opin Drug Deliv. 10 (12), 1687-1698 (2013).
