Införliva ett Otillagade derivat av lysin i antikroppar tillåter platsspecifika, snabb och effektiv sammanlänkningen av tetrazine-bärande molekyler att generera antikropp-drogen konjugat.
Antikropp-drogen konjugat (ADCs) används numera i klinisk praxis är blandningar av antikropp molekyler länkade till varierande antal gifter på olika positioner. Prekliniska studier har visat att det terapeutiska indexet av dessa traditionella ADCs kan förbättras genom platsspecifika sammanlänkningen av toxiner. Nuvarande metoder att producera homogen ADCs har dock flera begränsningar, såsom låg proteinuttryck och långsam reaktionskinetik. I detta protokoll beskriver vi hur du ställer in ett uttryck systemet att införliva ett Otillagade derivat av lysin (CypK) i antikroppar med hjälp av genetiska koden expansion. Denna minimala bioorthogonal möjliggör snabb Konjugation av tetrazine derivat genom en invers-efterfrågan Diels-Alder cykloadditionen. Uttryck systemet här rapporterade möjliggör lättköpt produktion och rening av trastuzumab med CypK i var och en av de tunga kedjorna. Vi förklarar hur du länka antikroppen till den toxin monometylfumarat auristatin E och karaktärisera immunoconjugate av hydrofob interaktion kromatografi och masspektrometri. Slutligen beskriver vi analyser att bedöma stabiliteten i humant serum av dihydropyridazine kopplingen följd konjugationen och testa selektiv cytotoxiciteten hos ADC för bröstcancerceller med höga nivåer av HER2-receptorn.
Antikropp-drogen konjugat (ADCs) kombinera biotherapeutics selektivitet och styrkan av cytotoxiska småmolekyler. De flesta ADCs syftar till att minska biverkningarna av traditionell kemoterapi med inriktning på läkemedel som påverkar DNA eller mikrotubulära polymerisation till cancer celler1. Första generationens ADCs godkänts av Food and Drug Administration (FDA) förlitar sig på modifiering av lysines och cysteines, som genererar blandningar av molekyler modified på olika positioner med minskade farmakokinetiska egenskaper2. Däremot kan platsspecifika Konjugation av droger att antikropparna generera föreningar med förbättrade terapeutiska eleverade3,4. Att försöka ta itu med utmaningen att producera homogen ADCs, har flera selektiv kemiska och enzymatiska modifieringar varit rapporterade1,5. Nuvarande metoder kan dock rikta endast viss position på antikroppen, lider av låg proteinuttryck, ge linkers låg stabilitet eller förlita sig på långsamt och lågavkastande reaktioner.
Införlivandet av icke-kanoniska aminosyror (ncAA) genom genetisk kod expansion möjliggör platsspecifik installation av en uppsjö av bioorthogonal reaktiva grupper till proteiner, potentiellt övervinna begränsningarna av andra metoder som används för att generera ADCs. Kodning ncAAs svar på en target (stopp)-kodon beroende av aminoacyl-tRNA Synthetasen/tRNA-par som är ortogonal till endogena paren som införlivar kanoniska aminosyror6. Flera ncAAs har införlivats i antikroppar att generera ADCs. Men mest lider av olika skulder för applikationer i terapeutisk konjugation. p-acetylphenylalanine (pAcF)7,8 är inte helt bioorthogonal, kräver lågt pH (4.5) och lång reaktionstid (> 60 h), medan azider såsom p-azidophenylalanine (pAzF)7,9,10, p-azidomethylphenylalanine (pAMF)11och ett natriumazid derivat av lysin (AzK)12,13 kan minskas i cell14, och den koppar som används för att katalysera Huisgen cykloadditioner kan inducera oxidativ skada 15.
Även om alternativa ncAAs baserat på trans-cyclooctene (TCO), cyclooctyne (SCO) och etylbicyklo [6.1.0] nonene (BCN) har nyligen kodats i en antikropp för bio-imaging ändamål, uttryck systemet lider av mycket låg avkastning (0,5 mg/L)16. Dessutom cyclooctenes och cyclooctynes är stora och hydrofoba handtag som kan öka känsligheten för ADC för aggregering -ADC nyttolaster är traditionellt hydrofoba och fysikalisk-kemiska egenskaperna för länkaren har visat sig kraftigt påverka farmakokinetiken och terapeutiskt index17. 1,3-disubstitued cyclopropenes är däremot små reaktiva grupper som borde orsaka minimal förändring i det protein struktur och physichochemical egenskaper18. Cyclopropenes reagera selektivt och snabbt med tetrazines via en omvänd elektron-efterfrågan Diels-Alder cykloadditionen19. I detta protokoll vi göra använda av ett derivat av lysin (CypK, figur 1b) uthärda en metyl-Otillagade som är mindre påverkade av sterisk hinder än större ansträngda omättade cykler och har en reaktion hastighet konstant i storleksordningen 1-30 M-1s -1 i vattenmedium18,20.
Vi rapporterade nyligen hur att införliva CypK i antikroppar att generera ADCs genom att reagera denna minimala bioorthogonal handtag med tetrazine-bärande molekyler21. Här beskriver vi ADC förberedelser proceduren mer i detalj med tonvikt på de mest utmanande steg. Införlivandet av CypK riktas med hjälp av en pyrrolysyl-tRNA Synthetasen (PylRS) / tRNACUA(PylT) par som svar på en bärnstensfärgad kodon infördes i den tunga kedjan antikropp (HC)22. Här använder vi två plasmider för övergående transfection (figur 1a), en kodning den tunga kedjan av antikropp och den andra en kodning av lätt kedja (LC), båda innehållande PylRS/PylT kassett. Alternativt kan en stabil cellinje som möjliggör högre antikropp avkastning genereras genom en mer arbetskrävande förfarandet21.
De ovan nämnda uttryck system kan producera den terapeutiska anti-HER2 immunglobulin 1 (IgG1) trastuzumab med CypK på liknande nivåer till vildtyp antikroppen. Vi valde den första positionen CH1 domännamnet på den tunga kedjan att koda ncAA (HC-118TAG). Detta är den vanligaste modifierade platsen i ADCs23 och är känd som HC-118 (EU numrering) men har också kallats HC-121 (sekvens position) och HC-114 (Kabat numrering)24. Eftersom denna ståndpunkt är bevarad i hela alla IgG1s, bör dessa uttryck system bli föremål för mest terapeutiska antikroppar.
Vi visar trastuzumab(CypK)2 kan enkelt renas genom protein A följt av snabb protein vätskekromatografi med en hydrofob interaktion kolumn (FPLC-HIC). Därefter kopplas kovalent antikroppen inom 3 h att det mikrotubulära polymerisation hämmare monometylfumarat auristatin E (MMAE), som används i den FDA-godkända ADC Adcetris. Här använder vi ett bensyl-tetrazine derivat av MMAE (tetrazine-vcMMAE) med en länkare bestående av distanshylsa glutarat och beståndsdel valin-citrullin proteas-labila följt av en p– aminobenzylalcohol self-immolative enhet; Detta linker är klyvs av Cathepsin B i lysosomen vid internalisering av ADC resulterar i traceless frisläppandet av toxin25. För att visa den stora räckvidden av reaktionen, är antikroppen också kopplad till den fluorophore tetrametylrodamin (TAMRA). Vi förklarar hur att verifiera identiteten för konjugatet genom vätskekromatografi kopplad till masspektrometri (LC-MS) och beräkna förhållandet drog-till-antikropp (DAR) med högupplösande vätskekromatografi med en hydrofob interaktion kolumn (HPLC-HIC) .
Som en del av karakterisering av antikropp prestanda beskriver vi testa stabiliteten av dihydropyridazine kopplingen i humant serum. Denna parameter bedöms lättare i trastuzumab-TAMRA eftersom det kan kvantifieras med en enkel ELISA och tolkningen av resultaten försvåras inte av komponenten proteas labila trastuzumab(MMAE)2. Slutligen bedöms den selektivitet och styrkan av trastuzumab(MMAE)2 genom att jämföra cytotoxicitet av ADC över cellinjer som uttrycker olika nivåer av HER2. Denna analys ger också en funktionell bevis på ADC stabilitet när de utförs efter inkubation i immunoconjugate i humant serum.
Övergående uttryck förfarandet att producera trastuzumab(CypK)2 beskrivs i detta protokoll är enkel och möjliggör hög modularitet. Den avkastning som erhålls är inom de som förväntat i en akademisk miljö27 och stabil cellinjer kan skapas för att ytterligare öka produktionen avkastning21. Under uttryck lägre koncentrationer av CypK än 5 mM kan resultera i lägre ncAA införlivandet, och högre belopp kan påverka cellernas tillväxt och minska antikropp avkastning. CypK som en fri aminosyra har låg vattenlöslighet, således det bör först upplöst på 100 mM i 0,1 M NaOH och sedan läggs till odlingsmediet. Efter utspädning CypK på medellång och innan den läggs till celler, är det viktigt att neutralisera mediet med HCl och filter för att sterilisera. Därefter med transfection reagens anges i detta protokoll och följa de inkubationstider som rekommenderas av tillverkaren är viktigt för ett högavkastande uttryck. För ytterligare information om övergående uttryck av humana antikroppar hänvisas till andra publicerade protokoll31,32.
När antikroppen har renats, krävs en hög överskott av protein A harts för förmånerna som anges för att säkerställa fullständig antikropp dra ner från supernatanten. För att förhindra utfällning av trastuzumab under eluering, är det rekommendabelt att använda en lösning med hög buffert kapacitet, utspädd omedelbart med PBS och utbyta bufferten att undvika överdriven koncentration. Alltid hålla antikroppen < 5 mg/mL.
Konjugationen av trastuzumab(CypK)2 med tetrazine-vcMMAE är snabbare än de flesta reaktioner rapporterats med andra bioorthogonal handtag för ADCs. Dessutom denna cycladdition sker under mycket milda förhållanden: rumstemperatur eller lägre och fysiologiska pH. Det är viktigt att späda DMSO lager lösningar av reaktanterna med acetonitril före tillsats av PBS och antikroppen; annars kommer tetrazine derivat fällningen. Acetonitril krävs endast på grund av den höga vattenavvisande egenskaper av MMAE och TAMRA, men mindre hydrofoba molekyler kan inte behöva tillägg av co lösningsmedel. Alternativt, tetrazine-vcMMAE kan vara konjugerade utan acetonitril och endast 2 molar likvida medel tetrazine-vcMMAE inom 20 h. Denna lilla mängd toxin kan innebära en avsevärd minskning av tillverkningskostnaden för ADC jämfört med nuvarande ncAA-baserad teknik. Trastuzumab(CypK)2 är fullt reaktivt för minst 4 månader när bevaras vid 4 ° C.
HPLC-HIC möjliggör en noggrann bestämning av DAR eftersom MMAE är starkt hydrofoba och ger en utmärkt upplösning av de toppar som motsvarar antikroppen konjugat med 0, 1 och 2 gifter. Oreagerad tetrazine-vcMMAE eluerar runt 13,7 min och detekteras vid 280 nm. Denna teknik kräver utgångsmaterial med hög renhet. Det är dessutom inte rekommendabelt att släcka reaktion med andra tetrazine-reaktiva molekyler såsom BCN-OH eftersom de kan förändra retentionstiderna och formen på topparna. Det är viktigt att Saltkoncentrationen av proverna motsvarar det som i den mobila fasen i början av övertoningen för att erhålla en bra separation, speciellt om mer än 10-20 µL injiceras.
Angående den LC-MS-analysen krävs deglycosylation antikropp prover att få en enkel topp vid deconvolution raw spektrum. Riktigheten av de totala antikropp och ADC massorna kan variera beroende på kalibreringsmönstret av instrumentet. Därför, för att beräkna massan för modifiering, subtrahera massan erhålls för omodifierade antikropparna från en erhålls för ADC. Moderna högupplösta masspektrometrar bör ge ett relativt fel nedanför 1:10000. Även om LC-MS kan också användas för att beräkna förhållandet mellan olika arter, är detta värde vanligtvis en överskattning eftersom ändringen kan påverka jonisering kapaciteten av de arter som genereras och låga mängder föroreningar identifieras inte.
Stabiliteten i länkaren i ADCs är kritisk eftersom förtida frisläppandet av drogen resulterar i högre toxicitet och lägre effektivitet. den gratis cellgift skadar friska vävnader och nakna antikroppen konkurrerar med den väpnade för målet bindande platser på sjuka celler. En release under 5%, vilket är inom variabilityen av stabilitet analysen, bör förväntas.
Slutligen en ADC inriktning HER2 som trastuzumab(MMAE)2 kan bedömas genom att jämföra cytotoxiciteten i SK-BR-3 celler (HER2 hög) och MCF-7 celler (HER2 låg) sedan den senare uttrycker 15-fold mindre HER2-receptorer än tidigare28 selektivitet . Immunoconjugate förväntas resultera i en cellviabilitet minst 2 tiopotenser lägre i SK-BR-3 jämfört med MCF-7. De EG50 i SK-BR-3 bör vara i intervallet tvåsiffriga nanomolar återspeglar den höga potensen av denna ADC29,30. Omodifierade antikroppen, antingen trastuzumab(MMAE)2 eller trastuzumab, bör Visa ingen toxicitet i denna analys. Tetrazine-vcMMAE bör ha en effekt 3 tiopotenser lägre än ADC eftersom länkaren tar bort aktiviteten av peptidomimetic toxin. Eftersom MMAE ska kunna genomsyra de cellmembran30, bör det omvänt, har en liknande toxicitet för ADC men Visa någon diskriminering mellan HER2 hög och HER2 låg cellinjer. Dessutom om denna analys utförs efter en 5-dagars inkubation av ADC i serum, det kan användas för att ge en funktionell bevis på stabiliteten i länkaren: en release av toxinet skulle resultera i antingen en minskning av ADC effektivitet i SK-BR-3 om MMAE släpptes med p konsten att länkaren eller en minskning av selektivitet om länkaren var klyvs i ett traceless mode.
ADC tekniken beskrivs häri gör effektiv och platsspecifika införlivandet av ett Otillagade derivat av lysin i IgG1s. Efter en lättköpt rening, kan vara snabbt konjugerade antikroppar med tetrazine-innehållande molekyler, framställning av homogena produkter. På grund av liten storlek och höga reaktivitet av Otillagade minimal handtag, bör denna metod möjliggöra konjugationen av produkter hindras nyttolaster. De resulterande immunoconjugates är stabila i serum och är mycket potent och selektiv. Sammantaget möjliggör CypK en snabb och stabil och platsspecifika bioorthogonal koppling för antikroppar och andra protein konjugat som ska användas i behandling eller diagnos.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöds av medicinska forskningsrådet, UK. B.O.-S. rymmer ett EMBO stipendium (ATLF 158-2016) och är tacksam att H. Pelham och J.W. hakan för stöd, och G. Kym, C. W. Morgan och O. Perisic för hjälp och råd.
Expi293F | ThermoFisher Scientific | A14527 | HEK suspension cells |
Expi293 Expression Medium | ThermoFisher Scientific | A1435101 | Expression medium |
Antibiotic-antimycotic | ThermoFisher Scientific | 15240062 | Penicillin-streptomycin-amphotericin B |
125mL Polycarbonate Erlenmeyer Flask with Vent Cap | Corning | 431143 | Shake flasks |
Brunswick S41i incubator | Eppendorf | S41I230011 | CO2 incubator with a shaker |
Sodium hydroxide 4 mol/l (4 N) in aqueous solution | VWR | 191373M | |
Cyclopropene lysine | Sichem | SC-8017 | In this study it was synthesized as described by Elliot et al. 2014 |
Steriflip-GP, 0.22 µm, polyethersulfone, gamma irradiated | Merck Millipore | SCGP00525 | |
Opti-MEM, Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific | 31985070 | Reduced serum medium |
ExpiFectamine 293 Transfection Kit | ThermoFisher Scientific | A14525 | Transfection reagent |
5810 R centrifuge | Eppendorf | 5811000460 | |
Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm, polyethersulfone, 33 mm, gamma sterilized | Merck Millipore | SLGP033RS | |
Protein A resin | Sino Biological | 10600-P07E-RN-25 | |
Poly-Prep Chromatography Columns, Pkg of 50 | Bio-Rad | 7311550 | Polypropylene chromatography column |
Econo-Column Funnel | Bio-Rad | 7310003 | |
Sodium citrate | Fluka | 71635 | |
ÄKTA explorer FPLC | GE Healthcare | ||
HiTrap HIC Selection Kit | GE Healthcare | 28-4110-07 | Includes HiTrap 1 mL Butyl HP |
Ammonium sulfate | VWR | 2133.296 | |
Isopropanol | Honywell | 34863-2.5L | |
Dymethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418-50ML | |
Tetrazine-vcMMAE | ChemPartner | – | Costum synthesized |
Tetrazine-5-TAMRA | Jena Bioscience | CLK-017-05 | |
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel 1.0mm x 10 well | ThermoFisherScientific | NP0321BOX | |
Xcell SureLock Mini-Cell | ThermoFisherScientific | EI0001 | |
UltiMate 3000 HPLC | ThermoFisherScientific | ||
Thermo Scientific MAbPac, HIC-20, 4.6 x 100 mm, 5 µm | ThermoFisherScientific | 088553 | |
PNGase F | New England BioLabs | P0704S | |
NanoAcquity | Waters | ||
C4 BEH 1-5 µm 1.0 x 100 mm UPLC column | Waters | ||
96-well microplates for cell culture | ThermoFisherScientific | 156545 | |
Human serum | Sigma-Aldrich | H4522-20mL | |
CO2 incubator | Panasonic | ||
HER2 ECD | Sino Biological | 10004-HCCH | |
Anti-TAMRA | Abcam | an171120 | |
Anti-mouse HRP | Santa Cruz | sc-2005 | |
TMB | BioLengend | 421101 | |
Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 84727-500ML | |
PHERAstar FS | BMG Labtech | Plate reader | |
DMEM | Sigma-Aldrich | D5671-500ML | |
SK-BR-3 | ATCC | HTB-30 | |
MCF-7 | ATCC | HTB-22 | |
CellTiterGlo 2.0 Assay | Promega | G9242 | Cell viability assay based on the measurement of ATP released after cell lysis. The output signal is luminscence. |
Monomethyl Auristatin E | Cayman Chemical | 16267 | |
NanoDrop 2000 | ThermoFisherScientific | Microvolume spectrophotometer | |
Human IgG ELISA Quantificaiton Set | Bethyl | E80-104 | |
MaxEnt1 in MassLynx | Waters | Software application for mass spectrum deconvolution | |
IntantBlue | Expedeon | ISB1L | Coomassie-based stain |
Intact MMAE-ADC ELISA Kit (Sandwich Assay) | Epitope Diagnostics, Inc. | KTR 782 | |
Tube 50 mL, 114x28mm, PP | Sarstedt | 62.547.254 | Conical tube |
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units 50,000 NMWL | Merck | UFC905024 | Centrifugal filtration concentrator (after protein A pull down) |
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units 50,000 NMWL | Merck | UFC805024 | Centrifugal filtration concentrators (after FPLC or HPLC purification) |
Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL | ThermoFisherScientific | 89882 | Size exclusion spin columns |
Tube PCR 0.2ml Flat Cap | Thistle Scientific Ltd | AX-PCR-02-C-CS | PCR tubes |
Nunc MaxiSorpª flat-bottom | ThermoFisherScientific | 44-2404-21 | Plates for ELISA |