Summary
Einbeziehung einer Cyclopropen-Derivat von Lysin in Antikörper ermöglicht die ortsspezifische, schnelle und effiziente Verknüpfung von kurz-tragenden Moleküle, Antikörper-Wirkstoff-Konjugate zu generieren.
Abstract
Antikörper-Wirkstoff-Konjugate (ADCs) verwendet heute in der klinischen Praxis sind Gemische aus Antikörpermoleküle verbunden mit einer unterschiedlichen Anzahl von Giftstoffen an verschiedenen Positionen. Präklinische Studien haben gezeigt, dass der therapeutische Index von diesen traditionellen ADCs, indem die ortsspezifische Verknüpfung von Toxinen verbessert werden. Aktuelle Ansätze, homogene ADCs zu produzieren haben jedoch einige Einschränkungen, z. B. niedrige Proteinexpression und langsame Reaktionskinetik. In diesem Protokoll beschreiben wir wie eine Expressionssystems eingerichtet, ein Cyclopropen Derivat von Lysin (CypK) in Antikörper mit genetischen Code Expansion zu integrieren. Diese minimale Bioorthogonal Griff ermöglicht schnelle Konjugation von kurz-Derivaten durch eine Inverse Nachfrage Diels-Alder Cycloaddition. Hier berichtet Expressionssystems ermöglicht die einfache Herstellung und Reinigung von Trastuzumab mit CypK in jedem der die schweren Ketten. Wir erklären, wie man die Antikörper mit Toxin Monomethyl Auristatin E und charakterisieren das Immunoconjugate durch hydrophobe Wechselwirkung Gaschromatographie und Massenspektrometrie. Schließlich beschreiben wir Assays, die Stabilität in humanem Serum der Dihydropyridazine Verbindung durch die Konjugation bewerten und testen Sie die selektive Zytotoxizität des ADC für Brustkrebs-Zellen mit hohen HER2-Rezeptor.
Introduction
Antikörper-Wirkstoff-Konjugate (ADCs) kombinieren die Selektivität der Biotherapeutika und die Potenz des kleinen zellschädigende Moleküle. Die meisten ADCs sollen die Nebenwirkungen der herkömmlichen Chemotherapie zu verringern, indem Sie auf Medikamente, die DNA oder Mikrotubuli Polymerisation zu Krebs Zellen1beeinflussen. Ersten Generation ADCs von der Food and Drug Administration (FDA) genehmigt verlassen sich auf die Änderung der Lysines und Cysteine, die Mischungen von Molekülen, die an verschiedenen Positionen mit verminderter pharmakokinetischen Eigenschaften2geändert erzeugt. Im Gegensatz dazu erzeugen ortsspezifische Konjugation von Medikamenten, um die Antikörper Verbindungen mit verbesserten therapeutischen Indizes3,4. Ich Suche die Herausforderungen zur Herstellung von homogenen ADCs, wurden mehrere selektiven chemische und enzymatische Veränderungen berichtet1,5. Jedoch können aktuelle Methoden nur bestimmten Zielposition auf der Antikörper, leiden unter niedrigen Protein-Expression, geringe Stabilität Linker bieten oder verlassen Sie sich auf langsame und niedrig verzinsliche Reaktionen.
Einbeziehung der nicht-kanonischen Aminosäuren (ncAA) durch den genetischen Code Ausbau ermöglicht die ortsspezifische Installation einer Vielzahl von Bioorthogonal reaktiven Gruppen in Proteine, potenziell Überwindung der Einschränkungen der anderen Methoden zur Erzeugung von ADCs. Codierung NcAAs als Reaktion auf ein Ziel (Stop)-Codon setzt auf Aminoacyl-tRNA synthestase/tRNA-Paare, die orthogonal zu den endogenen Paare sind, die kanonischen Aminosäuren6zu integrieren. Mehrere NcAAs wurden in Antikörper erzeugen ADCs aufgenommen. Am meisten leiden Sie jedoch verschiedene Verbindlichkeiten für Anwendungen in therapeutisches Medikament Konjugation. p-Acetylphenylalanine (pAcF)7,8 ist nicht vollständig Bioorthogonal, erfordert niedrige pH-Wert (4.5) und langen Reaktionszeiten (> 60 h), während Azides wie z. B. p-Azidophenylalanine (pAzF)7,9,10, p-Azidomethylphenylalanine (pAMF)11und ein azid-Derivat von Lysin (AzK)12,13 in der Zelle14reduziert werden kann, und das Kupfer verwendet, um Huisgen Cycloadditions katalysieren oxidative Schäden auslösen können 15.
Obwohl alternative NcAAs auf Trans-Cyclooctene (TCO), Cyclooctyne (SCO) und Bicyclo [6.1.0] Nonene (BCN) haben vor kurzem wurde in kodiert einen Antikörper für Bio-Imaging-Zwecke, Expressionssystems leidet sehr niedrigen Erträgen (0,5 mg/L)16. Darüber hinaus Cyclooctenes und Cyclooctynes sind groß und hydrophoben Griffe, die die Anfälligkeit des ADC für Aggregation -ADC Nutzlasten zu erhöhen sind traditionell hydrophob und die physikalisch-chemischen Eigenschaften des Linkers haben gezeigt, dass stark Pharmakokinetik und therapeutischen Index17auswirken. Im Gegensatz dazu sind 1,3-Disubstitued Cyclopropenes kleine reaktive Gruppen, die minimale Veränderung in der Protein-Struktur und Physichochemical Eigenschaften18führen sollte. Cyclopropenes reagieren gezielt und schnell mit Tetrazines über eine inverse Elektron-Nachfrage Diels-Alder Cycloaddition19. In diesem Protokoll machen wir nutzen ein Derivat von Lysin (CypK, Abb. 1 b) Lager eine Methyl-Cyclopropen, der kleiner ist beeinflusst durch sterische Behinderung als größere angespannten ungesättigten Zyklen und hat eine reaktionsratenkonstante in der Größenordnung von 1-30 M-1s -1 in wässrigen Medien18,20.
Wir berichteten vor kurzem wie CypK in Antikörper ADCs generieren durch die Reaktion dieser minimalen Bioorthogonal Griff mit kurz-tragenden Moleküle21integrieren. Hier beschreiben wir die ADC Vorbereitung Vorgehensweise ausführlicher mit Schwerpunkt auf die schwierigsten Schritte. Die Einbeziehung der CypK richtet sich mit einem Pyrrolysyl-tRNA synthestase (PylRS) / tRNACUA(PylT) Paare als Reaktion auf eine bernsteinfarbene Codon eingeführt in die schwere Kette des Antikörpers (HC)22. Hier verwenden wir zwei Plasmide für Transiente Transfektion (Abbildung 1a), eine Codierung der schweren Kette des Antikörpers und die ander Codierung die Lichterkette (LC), beide mit der PylRS/PylT-Kassette. Alternativ kann eine stabile Zelllinie, die höhere Erträge der Antikörper ermöglicht durch ein mühsamer Vorgang21erzeugt werden.
Die oben genannten Expressionssysteme produzieren die therapeutische Anti-HER2-Immunglobulin 1 (IgG1) mit CypK auf ähnlichem Niveau an den Wildtyp-Antikörper Trastuzumab. Wir haben die erste Position der CH1-Domäne auf die schwere Kette Kodieren der ncAA (HC-118TAG). Dies ist die am häufigsten geänderten ADCs23 und ist bekannt als HC-118 (EU-Nummerierung) aber wurde auch als HC-121 (Sequenz-Position) und HC-114 (Kabat Nummerierung)24bezeichnet. Da diese Position in allen IgG1s konserviert wird, sollte diese Expressionssysteme meisten therapeutischen Antikörpern zugänglich sein.
Wir zeigen, dass trastuzumab(CypK)2 leicht durch Protein ein gefolgt von schnellen Protein Flüssigchromatographie mit einer hydrophoben Wechselwirkungen Spalte (FPLC-HIC) gereinigt werden können. Anschließend ist der Antikörper kovalent innerhalb 3 h zu den Mikrotubuli Polymerisation Inhibitor Monomethyl Auristatin E (MMAE) verbunden, die in der FDA-zugelassene ADC Adcetris verwendet wird. Hier verwenden wir ein Benzyl-kurz-Derivat von MMAE (kurz VcMMAE) mit einem Linker, bestehend aus einem Glutarate Abstandhalter und Valin-Citrullin Protease-labile Komponente gefolgt von einem p- Aminobenzylalcohol-self-immolative-Einheit; Diese Linker ist von Cathepsin B in den Lysosomen nach Internalisierung des ADC was die spurlose Auflösung der Toxin-25abgespalten. Um das breite Spektrum der Reaktion zu zeigen, ist der Antikörper auch mit dem Fluorophor Tetramethylrhodamine (TAMRA) verbunden. Wir erklären, wie man die Identität des Konjugats von Flüssigkeitschromatographie gekoppelt mit Massenspektrometrie (LC-MS) und das Drogen-Antikörper-Verhältnis (DAR) verwenden Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie mit einer hydrophoben Wechselwirkungen Spalte (HPLC-HIC) berechnen .
Im Rahmen der Charakterisierung der Antikörper-Performance beschreiben wir, wie die Stabilität der Dihydropyridazine Verbindung im menschlichen Serum zu testen. Dieser Parameter wird leichter in Trastuzumab-TAMRA beurteilt, denn es durch eine einfache ELISA quantifiziert kann und die Interpretation der Ergebnisse nicht durch die Protease labil Komponente des trastuzumab(MMAE)2 kompliziert ist. Schließlich ist die Selektivität und die Potenz des trastuzumab(MMAE)2 durch den Vergleich der Cytoxicity des ADC über Zell-Linien mit dem Ausdruck unterschiedlicher HER2 bewertet. Dieser Test bietet auch eine funktionelle Standsicherheitsnachweis der ADC wenn nach Inkubation der Immunoconjugate in humanem Serum durchgeführt.
Protocol
(1) zu produzieren Sie und zu charakterisieren Sie, die Antikörper
- Ausdruck des Antikörpers
- Tauen Sie ein Fläschchen mit HEK Aussetzung Zellen in eine 250 mL Flasche mit 50 mL Ausdruck Medium ergänzt mit 100 Einheiten/mL Penicillin, 100 µg/mL Streptomycin und 250 ng/mL Amphotericin B. halten die Zellen bei 37 ° C mit 8 % CO2 in Inkubatoren ausgestattet befeuchtet mit einem Shaker bei 125 u/min. Teilen von Zellen um 0,3-0,5 x 106 Zellen/mL (alle 2-3 Tage) mindestens 2 Mal vor transfecting.
- Bei einer Dichte von 2,5 x 106 Zellen/mL ist erreicht (ca. 2-3 Tage nach der Trennung), bereiten Sie eine frische Lösung von 100 mM CypK. Wiegen Sie zu diesem Zweck 64 mg CypK, hinzu kommen 2,5 mL 0,1 Natriumhydroxid, Wirbel, Drehung nach unten alle ungelöste Partikeln zu erholen und beschallen.
- 42,5 mL Ausdruck Medium ergänzt mit Antibiotika fügen Sie 2,5 mL CypK (100 mM in 0,1 M NaOH hinzu). Gut mischen, fügen Sie 250 µL 0.1 M HCl und Sterilisieren mit einem 0,22 µm-Filter.
- Verdünnen Sie 50 µg HC und LC pKym1 Plasmide21 bis 2,5 mL mit reduzierten Serum Medium. Verdünnen Sie in einem separaten Rohr 135 µL Transfection Reagens bis 2,5 mL mit reduzierten Serum Medium.
- Fünf Minuten nach der Vorbereitung der Lösungen den Plasmiden und die Transfektion Reagenzlösung mischen und 20 min erlauben die Bildung von komplexen zwischen der DNA und die Transfection Reagens inkubieren.
- In der Zwischenzeit 125 Millionen Zellen an der Ziel-Dichte für 5 min bei 500 X g zentrifugieren, erneut mit dem Ausdruck Medium mit CypK und fügen Sie die DNA-Transfection Reagens Mischung. CypK kann gekauft oder synthetisiert, wie bereits18berichtet.
- Fügen Sie nach Inkubation der Zellen für 20 h 250 µL Transfection Reagens Enhancer im Bausatz enthalten.
- Ernten Sie Antikörper der Überstand ca. 6-7 Tage nach Zugabe von CypK (beim Ausdruck ist keine Änderung des Mediums erforderlich).
* Alternativ kann um höhere und gleichmäßigere Erträge zu erzielen, eine stabile Zelllinie erzeugt werden wie in Oller-Salvia Et Al. beschrieben 201821. Trastuzumab(CypK)2 drückt sich in diesem Fall einfach durch Zugabe von CypK 5 mM Mittel-und Ausdruck.
- Reinigen des Antikörpers
- Zentrifugieren Sie die Zellen für 15 min bei 3000 X g.
- Filtern Sie den Überstand mit einer 0,45 oder 0,22 µm Filter. Wenn der Filter verdeckt wird, für eine neue zu ersetzen und weiter filtern. Geschieht dies nach nur wenige Milliliter, Zentrifugieren Sie den überstand für eine zusätzliche 15 Minuten bei 7000 X g.
- Protein A Harz (2 mL/100 mL Überstand) in eine leere Polypropylen Chromatographiesäule hinzufügen und das Harz mit mindestens 5 Bände der Wulst Waschpuffer (0,1 M Natriumphosphat, 150 mM NaCl) equilibrate.
- Den überstand in zwei 50 mL konische Röhrchen aufgeteilt, und fügen Sie 5 x Perle Waschpuffer (0,5 M Natriumphosphat, 150 mM NaCl) gefolgt von der Pre äquilibriert Protein A Harz. Legen Sie das konische Rohr auf eine Walze für 3 h bei Raumtemperatur herunterziehen der Antikörper im überstand.
Alternativ: Den überstand an der Säule mit mindestens das Doppelte der empfohlenen Volumen von Harz und durchfließen. Stellen Sie sicher, dass es keine erhebliche Menge an Antikörper Links im überstand von SDS-PAGE. Wenn vorhanden ist, den Überstand durch das Harz wieder eluieren. - Übertragen Sie Protein A Harz mit überstand in eine Spalte zu und die Flüssigkeit ungehindert durchfließen.
- Fügen Sie 25 mL waschen Puffer (oder mindestens 10 Harz Bände) und durchfließen lassen.
- Eluieren Sie den Antikörper mit 4 mL Natriumcitrat 0,1 M, pH 3, auf 1 mL 1 M Phosphatpuffer, 150 mM NaCl.
- Den Antikörper mit 10 mL PBS verdünnen, konzentrieren Sie sich auf 0,5-1 mL durch zentrifugale Filtration und Austausch Puffer dreimal mit PBS.
- Reinigen Sie die Proben von FPLC mit einer Butyl-HIC-Spalte mit einem Strom von 0,5 mL/min und 0-100 % Steigung in 30 min von salzarmen Puffer (50 mM Natriumphosphat pH 7,0, 20 % Isopropanol) in hohem Salzgehalt Puffer (1,5 M (NH4)2SO4, 50 mM Natriumphosphat pH 7,0 5 % Isopropanol). Alle Fraktionen erfassen und Überwachen der Elution bei 280 nm. Kleine Mengen (< 1 mg) können mit HPLC-HIC unter 2.4, Ausbeute und Reinheit zu maximieren beschriebenen Bedingungen gereinigt werden.
- Bündeln Sie die Fraktionen, die Antikörper enthalten, um mindestens 4 mL mit PBS zu verdünnen, durch zentrifugale Filtration und Austausch Puffer dreimal mit PBS zu konzentrieren.
- Quantifizieren des Antikörpers
- Erhalten Sie eine ungefähre Konzentration durch Messung der Absorption bei 280 nm mit einem Mikro-Volume Spektralphotometer.
- Wenn eine genaue Messung erforderlich ist, verwenden Sie eine ELISA-Kit um menschliche IgGs zu messen. Verwenden Sie für eine grobe Schätzung SDS-PAGE mit einem Coomassie-basierte Fleck folgendermaßen:
- Bereiten Sie Normen durch Verdünnung sechsmal zweifach eine Trastuzumab standard bei 1 mg/mL durch ELISA quantifiziert.
- Kochen Sie die Standards und die Proben bei etwa 0,25 mg/mL bei der Verringerung der Belastung Puffer.
- Laufen sie in eine 4-12 % Bis-Tris SDS-PAGE mit MES-SDS-Puffer und Fleck mit einem Farbstoff Coomassie-basierte. Schließlich messen Farbdichte der Band, das Licht oder die schwere Kette mit ImageJ entspricht und das Signal aus den Proben in der Standardkurve interpoliert.
- Speichern des Antikörpers bei 4 ° C.
(2) den Antikörper Konjugat und charakterisieren die ADC
- Konjugieren Sie den Antikörper mit dem kurz-tragende Molekül
- 10 molare Entsprechungen von kurz-VcMMAE (4 µL, Dimethyl Sulfoxid (DMSO) 3,4 mM) mit 20 µL Acetonitril und 76 µL PBS in einer kleinen konischen Röhre (z.B.PCR-Röhrchen) verdünnen.
- 1 molare Äquivalent von trastuzumab(CypK)2 (100 µL, 2 mg/mL in PBS) hinzufügen, mischen und für 3 h bei Raumtemperatur (25 ° C), trastuzumab(MMAE)2bilden reagieren können.
Hinweis: An den Antikörper anstelle von kurz-VcMMAE unter Verwendung dieses Protokolls können andere Moleküle wie kurz-5-TAMRA verknüpft werden.
- Reinigen des ADCs
- Pre-equilibrate eine Ausgrenzung Spin Spalte "Größe" mit PBS, die Anweisungen des Herstellers.
- Fügen Sie das gesamte Volumen der Reaktion auf die Spin-Spalte und Zentrifuge bei 1500 X g für 1 min.
- Quantifizieren Sie den ADC zu und analysieren Sie das Konjugat von SDS-PAGE
- Den ADC zu quantifizieren, wie in 1.3.2 beschrieben. durch die Messung der Farbdichte der leichten Kette auf einem SDS-PAGE mit dem nicht modifizierte Antikörper für die Standardkurve.
- Die schwere Kette sollte leicht verschoben haben, mit einem Anstieg im Molekulargewicht auf die Konjugation.
Hinweis: Wenn der Antikörper mit einem Fluorophore wie z. B. in trastuzumab(TAMRA)2geändert wird, sollte nur die Band, die schwere Kette entspricht in Gel Fluoreszenz vor der Färbung zeigen.
- Analysieren Sie das Konjugat durch HPLC-HIC
- Equilibrate die HPLC-HIC-Spalte mit 100 % Puffer A (1,5 M (NH4)2SO4, 50 mM Natriumphosphat pH 7,0, 5 % Isopropanol) für 5 Minuten.
- Mix 15 µL (67 Pmol) einer 1 mg/mL Lösung von Trastuzumab (CypK) 2 mit 2 X 15 µL Puffer A in einem Fläschchen. Dann programmieren Sie eine 10 µL-Injektion in der HPLC.
- Eluieren Sie eine isokratische 1 mL/min Flow mit 100 % Puffer A für 1 min, gefolgt von einem Gradienten von 15 min von 100 auf 0 % des Puffers A in B (50 mM Natriumphosphat pH 7,0, 20 % Isopropanol). Überwachen der Elution bei 280 nm.
- Berechnen Sie DAR durch Integration der Spitze entsprechend für die einzelnen Arten und der daraus resultierenden Flächen in der folgenden Gleichung:
DAR = (1 X trastuzumab(MMAE) + 2 X trastuzumab(MMAE)2)
/(Trastuzumab(MMAE)0 + trastuzumab(MMAE)1 trastuzumab(MMAE)2)
Erwartete Verweilzeit für trastuzumab(CypK)2 ist 7,5 bis 8,0 min für Trastuzumab (CypK, MMAE) 9.1-9.6 min ist, und für trastuzumab(MMAE)2 10,5-11,0 min.
- Analysieren Sie das Konjugat von LC-MS
- Deglycosylate 30 µL 1 mg/mL ADC und der unveränderten Antikörper in nicht-reduzierenden Bedingungen mit 250 PNGase F Einheiten für mindestens 6 h bei 37 ° C.
- Eluieren des Antikörpers in das Massenspektrometer in einem C4 1-5 µm 1.0 x 100 mm Wassersäule mit einem 20 min Gefälle von 2 % bis 80 % Acetonitril in Wasser. Erfassen Sie Daten über einen m/Z-Bereich von 350-4000 in positive Ionen-Modus mit einem Kegel-Spannung von 150v.
- Deconvolute Sie die raw-Daten mittels geeigneter Software. Berechnen Sie die Differenz in der Masse der modifizierten und unmodifizierten Antikörper.
(3) Assay Stabilität der Dihydropyridazine Verbindung im Trastuzumab(TAMRA)2 im Serum
- Filtern Sie das Serum mit einem 0,22-μm-Filter unter sterilen Bedingungen. Sie können 100 Einheiten/mL Penicillin und 100 μg/mL Streptomycin hinzufügen.
- Füllen Sie die externe Brunnen einer 96-Well-Platte mit Wasser. Mischen Sie in den zentralen Brunnen in dreifacher Ausfertigung 90 µL des gefilterten Serum mit 10 µL 1 mg/mL trastuzumab(TAMRA)2 mit PBS-Puffer auf eine Endkonzentration von 0,1 mg/mL. Legen Sie die Platte in einem Inkubator gesättigt mit Feuchtigkeit bei 37 ° C und 4 bis 5 % CO2.
- Alle 24 h 5 Messetagen, pipettieren jeder nun gründlich zu mischen, nehmen eine 5 µL aliquoten, Schockfrosten mit flüssigem Stickstoff und Lagerung bei-80 ° C.
- Sobald alle Proben gesammelt haben, tauen die Aliquote und analysieren mit einem indirekten ELISA als zuvor gemeldeten12 mit einigen Änderungen:
- Mantel einer 96-Well-Platte über Nacht mit 0,25 µg/mL HER2 bei 4 ° c Alle weiteren Schritte sind bei Raumtemperatur durchgeführt.
- Am folgenden Tag 5 Mal mit PBS-0,05 % Tween (PBS-T) waschen und mit 1 % Rinderserumalbumin für 1 h blockieren.
- Waschen Sie und inkubieren Sie die Proben bei Verdünnung 1: 10000 mit PBS-Puffer für 2 h.
- Waschen Sie und inkubieren Sie Antikörpers Anti-TAMRA wuchs in Maus bei Verdünnung von 1: 2000 in PBS-T mit 0,5 % BSA für 1 h.
- Waschen Sie und inkubieren Sie ein Anti-Maus HRP conjugate 1: 1000 in PBS-T mit 0,5 % BSA für 1 h.
- TMB und ca. 5-10 min zu reagieren.
- Stoppen Sie Reaktion mit 50 µL H2SO4 1 M und Maßnahme Extinktion bei 450 nm. Subtrahieren Sie Hintergrund gemessen bei 570 nm.
- Passen Sie eine 4-Parameter logistische Regression-Kurve, standard Verdünnungen und interpolieren Sie Messungen von Proben zu.
Hinweis: Die Stabilität des trastuzumab(MMAE)2 kann das gleiche Protokoll durch eine Änderung des Tests beschrieben in 3.3 für eine kommerzielle ELISA-Kit zur Messung der Konzentration des ADC mit beurteilt werden.
4. Bewerten Sie die Zytotoxizität des ADC
Hinweis: Dieses Protokoll basiert auf bereits berichtet Assays23,26 mit einigen Änderungen.
- Tauen Sie SK-BR-3 und MCF-7 Zellen auf und lassen sie sich in p25 Fläschchen mit kompletten Medium, d. h., dass DMEM mit 10 % Wärme ergänzt fötalen Rinderserum, 100 Einheiten/mL Penicillin und 100 µg/mL Streptomycin inaktiviert.
- Teilen von Zellen mit 80-90 % Zusammenfluss (alle 3-4 Tage) mindestens 2 Mal vor dem Test.
- Füllen Sie zwei Tage vor dem Test, die äußere Vertiefungen einer 96-Well-Platte mit Wasser. Dann Aufzug Zellen mit 0,05 % Trypsin in 0,5 mM EDTA, Zentrifuge 3 min bei 250 X g im neuen Medium aufschwemmen und Samen 3000 Zellen in 100 µL pro (leer) Well in 96-Well-Platten.
- Bereiten Sie zwei Tage nach der Aussaat der Zellen 10 serielle Verdünnungen aller Proben in dreifacher Ausfertigung mit 0,1 % DMSO in kompletten Medium. Berücksichtigen Sie die folgenden Proben und Kontrollen: trastuzumab(MMAE)2, trastuzumab(CypK)2, Trastuzumab Wildtyp, kurz-VcMMAE und MMAE.
- Fügen Sie 100 µL jeder Probe in jede Vertiefung und inkubieren Sie für 5 Tage bei 37 ° C und 4 bis 5 % CO2.
- Am 5. Tag Messen Sie Zellviabilität. Verwenden Sie zu diesem Zweck eine kommerzielle Kit zur lyse der Zellen und Messung der ATP veröffentlicht. Zeichnen Sie den Prozentsatz des Signals in Bezug auf 0,1 % DMSO behandelte Kontrollzellen.
Hinweis: ADCs können für 5 Tage im Serum inkubiert und untersucht für die Zytotoxizität, funktionelle Stabilität beweisen.
Achtung: MMAE ist hochgiftig. Daher verwenden Sie Handschuhe und Schutzbrillen beim Umgang mit MMAE Derivate. Wenn Sie unmodifizierte MMAE als Steuerelement in Ihrem Experiment verwenden bei der Vorbereitung der Stammlösung in DMSO, behandeln Sie das feste Produkt innerhalb einer Abzugshaube.
Representative Results
Die gemeldeten transiente Expressionssystem (Abbildung 1a) ergibt 22 ± 2 mg trastuzumab(CypK)2 pro Liter Kulturmedium, entspricht 2/3 der Wildtyp-Antikörper produziert unter den gleichen Bedingungen (Abbildung 1 c). Die stabile Zelllinie kann diese Ausbeute bis zu 31 ± 2 mg/L21erhöhen.
Trastuzumab(CypK)2 kann mit kurz-VcMMAE, konjugiert werden, was quasi homogenen trastuzumab(MMAE)2 innerhalb von 3 h bei 25 ° C (Abbildung 2) ergibt. Hohe Hydrophobie von diesem Zytotoxin erfordert Zugabe von 10 % Acetonitril bei 5 oder mehr molaren Entsprechungen von Toxin pro CypK verwendet werden. Die Cycloaddition ist alternativ auch innerhalb von 20 h mit 2 Äquivalente von kurz-VcMMAE ohne Acetonitril (Abbildung 2 c) abgeschlossen. Trastuzumab(CypK)2 reagiert mit kurz-TAMRA innerhalb 2 h bei 25 ° C und ca. 3-6 h sind erforderlich, wenn die Temperatur um 4 ° C (Abb. 3 c) verringert wird.
Die erwarteten DAR für trastuzumab(MMAE)2 gemessen durch HPLC-HIC ist 1,9 (Abb. 2 b). Der Gipfel zunächst beobachtet im Chromatogramm bei 8,0 min stellt den unconjugated Antikörper (DAR 0) und sollte sind völlig verschwunden, wenn die Reaktion beendet ist. Die Arten mit DAR 1 9.1-9.6 min elutes und hätte einen Bereich von < 10 % nach 3 h; und das Zielprodukt mit DAR 2 hat eine Retentionszeit von 10,5 bis 11,0 mit einer erwarteten Bereich > 90 %. Die Mobilität Shift und Fluoreszenz in den SDS-PAGE Gelen bestätigt, dass die Einbeziehung von TAMRA (Abb. 3 b) und die Identität der immunokonjugate von LC-MS (Abb. 2d-e und Abbildung 3d) verifiziert ist.
Inkubation von trastuzumab(TAMRA)2 für 5 Tage in humanem Serum und anschließende Analyse von ELISA bestätigt, dass die Nutzlast an den Antikörper (Abbildung 4 b) bleibt. In Bezug auf die Zytotoxizität Assay trastuzumab(MMAE)2 zeigt hohe Wirksamkeit in SK-BR-3 (HER2 hohe) Brust Krebszellen mit einer halben maximalen effektiven Konzentration (EG50) von 55 ± 22:00 (Abbildung 4D). Trastuzumab(MMAE)2 unterhält die Zytotoxizität nach 5 Tagen Inkubationszeit im menschlichen Serum (Abb. 4 c). Umgekehrt, wenn der ADC MCF-7 (HER2 niedrig) untersucht ist die EG-50 ist 200-fold (Abbildung 4D) zu senken. Der Wildtyp-Antikörper, trastuzumab(CypK)2 und kurz-VcMMAE zeigen extrem geringen Toxizität (Zahlen 4D und 4e), während MMAE hohe nicht-selektive Zytotoxizität in beiden Zelllinien (Abb. 4e zeigt).
Abbildung 1: transiente Expressionssystem. A. relevanten Regionen der Plasmide für Transiente Transfektion in HEK293 Zellen verwendet. CMV: Zytomegalievirus Promotor, WPRE: Murmeltier Hepatitis Virus Posttranskritionelle regulatorisches Element, PylT: Pyrrolysyl tRNA, U6: spezifischen Promotor, PylRS: Pyrrolysil tRNA synthestase > und <: Richtung der Transkription. B. Nε-[((2-methylcycloprop-2-en-1-yl)methoxy)carbonyl]-L-lysine (CypK). C. Ausdruck ergibt der Wildtyp (WT) Trastuzumab und trastuzumab(CypK)2 gemessen in einem Western blot nach Protein eine Reinigung. Fehlerbalken repräsentieren die Standardabweichung der biologischen Triplicates. Diese Zahl wurde mit freundlicher Genehmigung von Oller-Salvia Et Al. modifiziert 201821. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Konjugation von trastuzumab(CypK)2 mit kurz-VcMMAE. A. Inverse Elektron-Nachfrage Diels-Alder Cycloaddition zwischen die CypK Rückstände in der Antikörper und die kurz-Ableitung von MMAE. Die reagierenden Gruppen sind rot markiert, p- Aminobenzylalcohol ist in grün und Valin-Citrullin Dipeptid in blau dargestellt. B. HPLC-HIC Chromatogramme und zeigt den Fortschritt der Konjugation des Antikörpers. C. Grad der Umwandlung in Bezug auf die maximale DAR von 1,9 mit verschiedenen Reagenzien Konzentrationen. D-E. Deconvoluted Massenspektren von der Full-Length Antikörper vor und nach der Konjugation. Trastuzumab(CypK)2 wurde mittels der stabile Zelllinie erhalten. Diese Zahl wurde mit freundlicher Genehmigung von Oller-Salvia Et Al. modifiziert 201821. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Konjugation von trastuzumab(CypK)2 mit kurz-TAMRA. A. Inverse Elektron-Nachfrage Diels-Alder Cycloaddition zwischen die CypK Rückstände in der Antikörper und die kurz-Ableitung von TAMRA. B. SDS-PAGE Gelen zeigt die Verschiebung der Mobilität und entstand durch die Konjugation von TAMRA in Gel-Fluoreszenz. C. Konjugation Kinetik bei zwei unterschiedlichen Temperaturen. D. Deconvoluted-Massenspektrum von trastuzumab(TAMRA)2. Trastuzumab(CypK)2 wurde mittels der stabile Zelllinie erhalten. Diese Zahl wurde mit freundlicher Genehmigung von Oller-Salvia Et Al. modifiziert 201821. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: Stabilität in Serum und Zytotoxizität von Trastuzumab Konjugate. A. Cartoon Hervorhebung der Eigenschaften in einer Verinnerlichung ADC gewünscht. B. die Stabilität der trastuzumab(TAMRA)2 in humanem Serum gemessen in ELISA. C. Zelle Lebensfähigkeit Assay mit trastuzumab(MMAE)2 nach 5 Tagen in humanem Serum (+ Serum, schwarz). Ein Beispiel für ein Steuerelement mit PBS-Puffer statt Serum inkubiert (-Serum, rot) wurde in der gleichen Probe aufgenommen. D. Zelle Lebensfähigkeit Assay mit frisch verdünnten Antikörper Proben. E. Zelle Lebensfähigkeit Assay mit frisch verdünnten MMAE-Derivate. Fehlerbalken repräsentieren den Standardfehler des Mittelwerts 3 unabhängigen Experimenten. Diese Zahl wurde mit freundlicher Genehmigung von Oller-Salvia Et Al. modifiziert 201821. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Discussion
Die transiente Expression-Verfahren, trastuzumab(CypK)2 beschrieben in diesem Protokoll zu produzieren ist einfach und ermöglicht eine hohe Modularität. Die Renditen erzielt sind nur diejenigen erwartet in einem akademischen Umfeld27 und stabilen Zelllinien erzeugt werden können, um die Produktion Ertrag21weiter zu steigern. Während der Ausdruck niedrigere Konzentrationen von CypK als 5 mM kann in niedrigeren ncAA Einbeziehung und höhere Beträge können beeinflussen Zellwachstum und Antikörper Erträge zu verringern. CypK als freie Aminosäure hat niedrige Wasserlöslichkeit, so sollte zunächst bei 100 mM in 0,1 M NaOH aufgelöst und danach das Kulturmedium hinzugefügt. Nach Verdünnung CypK Mittel- und bevor Sie Zellen hinzufügen, ist es wichtig, das Medium mit HCl und Filter zu sterilisieren zu neutralisieren. Anschließend mit der Transfektion Reagenzien in diesem Protokoll angegeben und nach den vom Hersteller empfohlenen Inkubationszeiten ist wichtig für eine ertragreiche Ausdruck. Für weitere Details über transiente Expression humaner Antikörper wird der Leser andere veröffentlichten Protokolle31,32bezeichnet.
Wenn der Antikörper gereinigt wird, muss ein hoher Überschuss an Protein A Harz wie angegeben um volle Antikörper Pulldown aus der Überstand zu gewährleisten. Um die Ausfällung von Trastuzumab während der Elution zu verhindern, ist es empfehlenswert eine Lösung mit hoher Pufferung, Kapazität, sofort mit PBS verdünnen verwenden und Austauschen des Puffers, die übermäßige Konzentration zu vermeiden. Halten Sie immer die Antikörper < 5 mg/mL.
Die Konjugation des trastuzumab(CypK)2 mit kurz-VcMMAE ist schneller als die meisten Reaktionen mit anderen Bioorthogonal-Griffe für ADCs gemeldet. Darüber hinaus tritt dieses Cycladdition unter sehr milden Bedingungen: Raumtemperatur oder niedriger und physiologischen pH. Es ist wichtig, die DMSO Stammlösungen der Edukte mit Acetonitril vor der Zugabe von PBS und der Antikörper zu verdünnen; Ansonsten werden die kurz-Derivate auszufällen. Acetonitril ist nur durch die hohe Hydrophobie MMAE und TAMRA erforderlich, aber weniger hydrophobe Moleküle können die Zugabe von Co Lösungsmittel nicht brauchen. Alternativ kann kurz-VcMMAE ohne Acetonitril und nur 2 molaren Entsprechungen von kurz-VcMMAE innerhalb von 20 h konjugiert werden. Diese kleine Menge des Toxins könnte einen erheblichen Rückgang der Herstellkosten des ADC im Vergleich zu aktuellen ncAA-basierten Technologien. Trastuzumab(CypK)2 ist für mindestens 4 Monate voll reaktiv, wenn bei 4 ° c aufbewahrt
HPLC-HIC ermöglicht eine genaue Bestimmung der DAR, da MMAE stark hydrophob ist und bietet eine hervorragende Auflösung der entsprechenden Antikörper Konjugate mit 0, 1 und 2 Toxine Gipfel. Nicht umgesetztes kurz-VcMMAE elutes rund 13,7 min und wird erkannt bei 280 nm. Diese Technik erfordert ein Ausgangsmaterial mit hoher Reinheit. Darüber hinaus empfiehlt es sich nicht um die Reaktion mit anderen kurz-reaktive Moleküle wie BCN-OH zu stillen, da sie die Aufbewahrungsfristen und die Form der Zinnen verändern können. Es ist wichtig, dass die Salzkonzentration der Proben in der mobilen Phase zu Beginn des Farbverlaufs entspricht Erlangung eine gute Trennung, vor allem, wenn mehr als 10-20 µL injiziert werden.
Bezüglich der LC-MS-Analyse ist Deglycosylation der Antikörper Proben erforderlich, um einen einzigen Höhepunkt bei der Entfaltung des rohen Spektrums zu erhalten. Die Genauigkeit der gesamten Antikörper und ADC Massen variieren je nach der Justierung des Instruments. Daher, um die Masse für die Modifikation zu berechnen, subtrahieren Sie die Masse für die unveränderte Antikörper von der für die ADC erhalten erhalten. Moderne hochauflösende Massenspektrometer soll einen relativen Fehler unter 1: 10000. Obwohl LC-MS auch verwendet werden, kann um das Verhältnis zwischen den verschiedenen Arten zu berechnen, ist dieser Wert in der Regel eine Überschätzung, weil die Änderung die Ionisation Kapazität der Gattung generiert beeinträchtigen und geringe Mengen an Verunreinigungen nicht erkannt werden können.
Die Stabilität der Linker in ADCs ist kritisch, da die vorzeitige Freisetzung des Wirkstoffes zu höheren Toxizität und geringere Wirksamkeit führt; die freie Zellgift schädigt gesunde Gewebe und nackte Antikörper konkurriert mit dem bewaffneten für die Ziel-Bindungsstellen auf kranke Zellen. Eine Veröffentlichung unter 5 %, die innerhalb der Variabilität des Assays Stabilität ist, sollte man rechnen.
Zu guter Letzt die Selektivität der ein ADC targeting HER2 wie trastuzumab(MMAE)2 beurteilt werden können, durch den Vergleich der Zytotoxizität in SK-BR-3 Zellen (HER2 hoch) und MCF-7 Zellen (HER2 niedrig) seit der letzten 15-fold weniger HER2-Rezeptoren als ehemalige28 Express . Das Immunoconjugate wird voraussichtlich in einem Zellviabilität mindestens 2 Größenordnungen niedriger in SK-BR-3 im Vergleich zu MCF-7 führen. Die EG-50 in SK-BR-3 sollte im zweistelligen nanomolaren Bereich spiegelt die hohe Wirksamkeit dieser ADC29,30. Der unveränderte Antikörper trastuzumab(MMAE)2 oder Trastuzumab, sollte keine Toxizität in diesem Test zeigen. Kurz-VcMMAE sollte ein Effekt 3 Größenordnungen niedriger als der ADC haben, da der Linker die Aktivität des Toxins Peptidomimetic entfernt. Umgekehrt, weil MMAE die Zellmembran30durchdringen kann, sollte es haben eine ähnliche Toxizität an den ADC aber keine Unterscheidung zwischen HER2 hohe und niedrige Zelllinien HER2 anzeigen. Darüber hinaus erfolgt dieser Test nach einer 5-Tage-Inkubation des ADC im Serum, es lässt sich die Stabilität der Linker eine funktionale nachweisen: eine Version des Toxins würde entweder in einem Rückgang der ADC Effizienz in SK-BR-3 führen, wenn MMAE mit p veröffentlicht wurde Kunst der Linker oder einen Rückgang der Selektivität wenn der Linker auf spurlose Weise gespalten war.
Die hier beschriebene ADC-Technologie ermöglicht die effiziente und ortsspezifische Einbindung der ein Cyclopropen Derivat von Lysin in IgG1s. Im Anschluss an eine einfache Reinigung können Antikörper schnell mit kurz-haltige Moleküle, nachgiebig homogene Produkten konjugiert werden. Aufgrund der geringen Größe und hohe Reaktivität der Cyclopropen minimal Griff sollte diese Methode die Konjugation von sterisch gehinderten Nutzlasten ermöglichen. Die sich daraus ergebenden immunokonjugate sind stabil im Serum und sind sehr potent und selektive. Insgesamt ermöglicht CypK eine schnelle, ortsspezifische und stabile Bioorthogonal Verbindung für Antikörper und andere Protein Konjugate in Therapie oder Diagnose verwendet werden.
Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der Medical Research Council, UK unterstützt. B.O.-S. hat ein EMBO-Stipendium (ATLF 158-2016) und H. Pelham und j.w. Kinn für Unterstützung und G. Kym, C. W. Morgan und O. Perisic für Rat und Hilfe dankbar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Expi293F | ThermoFisher Scientific | A14527 | HEK suspension cells |
| Expi293 Expression Medium | ThermoFisher Scientific | A1435101 | Expression medium |
| Antibiotic-antimycotic | ThermoFisher Scientific | 15240062 | Penicillin-streptomycin-amphotericin B |
| 125mL Polycarbonate Erlenmeyer Flask with Vent Cap | Corning | 431143 | Shake flasks |
| Brunswick S41i incubator | Eppendorf | S41I230011 | CO2 incubator with a shaker |
| Sodium hydroxide 4 mol/l (4 N) in aqueous solution | VWR | 191373M | |
| Cyclopropene lysine | Sichem | SC-8017 | In this study it was synthesized as described by Elliot et al. 2014 |
| Steriflip-GP, 0.22 µm, polyethersulfone, gamma irradiated | Merck Millipore | SCGP00525 | |
| Opti-MEM, Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific | 31985070 | Reduced serum medium |
| ExpiFectamine 293 Transfection Kit | ThermoFisher Scientific | A14525 | Transfection reagent |
| 5810 R centrifuge | Eppendorf | 5811000460 | |
| Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm, polyethersulfone, 33 mm, gamma sterilized | Merck Millipore | SLGP033RS | |
| Protein A resin | Sino Biological | 10600-P07E-RN-25 | |
| Poly-Prep Chromatography Columns, Pkg of 50 | Bio-Rad | 7311550 | Polypropylene chromatography column |
| Econo-Column Funnel | Bio-Rad | 7310003 | |
| Sodium citrate | Fluka | 71635 | |
| ÄKTA explorer FPLC | GE Healthcare | ||
| HiTrap HIC Selection Kit | GE Healthcare | 28-4110-07 | Includes HiTrap 1 mL Butyl HP |
| Ammonium sulfate | VWR | 2133.296 | |
| Isopropanol | Honywell | 34863-2.5L | |
| Dymethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418-50ML | |
| Tetrazine-vcMMAE | ChemPartner | - | Costum synthesized |
| Tetrazine-5-TAMRA | Jena Bioscience | CLK-017-05 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel 1.0mm x 10 well | ThermoFisherScientific | NP0321BOX | |
| Xcell SureLock Mini-Cell | ThermoFisherScientific | EI0001 | |
| UltiMate 3000 HPLC | ThermoFisherScientific | ||
| Thermo Scientific MAbPac, HIC-20, 4.6 x 100 mm, 5 µm | ThermoFisherScientific | 088553 | |
| PNGase F | New England BioLabs | P0704S | |
| NanoAcquity | Waters | ||
| C4 BEH 1-5 µm 1.0 x 100 mm UPLC column | Waters | ||
| 96-well microplates for cell culture | ThermoFisherScientific | 156545 | |
| Human serum | Sigma-Aldrich | H4522-20mL | |
| CO2 incubator | Panasonic | ||
| HER2 ECD | Sino Biological | 10004-HCCH | |
| Anti-TAMRA | Abcam | an171120 | |
| Anti-mouse HRP | Santa Cruz | sc-2005 | |
| TMB | BioLengend | 421101 | |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 84727-500ML | |
| PHERAstar FS | BMG Labtech | Plate reader | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5671-500ML | |
| SK-BR-3 | ATCC | HTB-30 | |
| MCF-7 | ATCC | HTB-22 | |
| CellTiterGlo 2.0 Assay | Promega | G9242 | Cell viability assay based on the measurement of ATP released after cell lysis. The output signal is luminscence. |
| Monomethyl Auristatin E | Cayman Chemical | 16267 | |
| NanoDrop 2000 | ThermoFisherScientific | Microvolume spectrophotometer | |
| Human IgG ELISA Quantificaiton Set | Bethyl | E80-104 | |
| MaxEnt1 in MassLynx | Waters | Software application for mass spectrum deconvolution | |
| IntantBlue | Expedeon | ISB1L | Coomassie-based stain |
| Intact MMAE-ADC ELISA Kit (Sandwich Assay) | Epitope Diagnostics, Inc. | KTR 782 | |
| Tube 50 mL, 114x28mm, PP | Sarstedt | 62.547.254 | Conical tube |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units 50,000 NMWL | Merck | UFC905024 | Centrifugal filtration concentrator (after protein A pull down) |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units 50,000 NMWL | Merck | UFC805024 | Centrifugal filtration concentrators (after FPLC or HPLC purification) |
| Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL | ThermoFisherScientific | 89882 | Size exclusion spin columns |
| Tube PCR 0.2ml Flat Cap | Thistle Scientific Ltd | AX-PCR-02-C-CS | PCR tubes |
| Nunc MaxiSorpª flat-bottom | ThermoFisherScientific | 44-2404-21 | Plates for ELISA |
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