Innlemme en cyclopropene derivat av lysin i antistoffer kan områdespesifikke, rask og effektiv sammenhengen av tetrazine-bærende molekyler å generere antistoff-stoff conjugates.
Antistoff-stoff conjugates (ADFS) brukes i dag i klinisk praksis er en blanding av antistoff molekyler forbundet til varierende antall giftstoffer forskjellige posisjoner. Prekliniske studier har vist at terapeutisk indeks av disse tradisjonelle ADCs kan forbedres ved områdespesifikke sammenhengen av giftstoffer. Gjeldende metoder å produsere homogen ADFS har imidlertid flere begrensninger, som lav protein uttrykk og treg reaksjon kinetics. I denne protokollen beskriver vi hvordan du setter opp et uttrykk system å innlemme en cyclopropene derivat av lysin (CypK) i antistoffer bruker genetisk kode ekspansjon. Dette minimale bioorthogonal håndtaket gir rask Bøyning tetrazine derivater gjennom en invers etterspurte Diels-or cycloaddition. Uttrykket systemet her rapportert aktiverer lettvinte produksjon og rensing av trastuzumab bærer CypK i hver av de tunge kjedene. Vi forklarer hvordan du kobler antistoffer til gift monomethyl auristatin E og karakteriserer immunoconjugate hydrofobe samhandling kromatografi og massespektrometri. Til slutt, vi beskrive analyser å vurdere stabiliteten i humant serum av dihydropyridazine koblingen som følge av bøyning og teste den selektive cytotoksisitet av ADC for brystkreft celler med høye nivåer av HER2 reseptor.
Antistoff-stoff conjugates (ADFS) kombinerer selektivitet av biotherapeutics og styrken på små cytotoksiske molekyler. De fleste ADFS mål å redusere bivirkninger av tradisjonelle kjemoterapi ved målretting medikamenter som påvirker DNA eller microtubule polymerisasjon kreft celler1. Første generasjon ADFS godkjent av Food and Drug Administration (FDA) er avhengige av endring av lysines og cysteinene, som genererer blandinger av molekyler endret til forskjellige posisjoner med redusert farmakokinetiske egenskapene2. Derimot kan områdespesifikke Bøyning narkotika antistoffer generere forbindelser med forbedret terapeutiske indeces3,4. Søker å ta utfordringen med å produsere homogen ADFS, er flere selektiv kjemiske og enzymatiske endringer rapportert1,5. Men kan dagens metoder målrette bare viss posisjon på antistoffer, lider av lav protein uttrykk, gi linkers lav stabilitet eller stole på treg og lave gir reaksjoner.
Innlemmelse av ikke-kanoniske aminosyrer (ncAA) gjennom genetiske koden utvidelse muliggjør områdespesifikke installasjon av en overflod av bioorthogonal reaktive grupper i proteiner, potensielt overvinne begrensningene til andre metoder for å generere ADFS. Koding ncAAs svar på et mål (stopp) codon er avhengig av aminoacyl-tRNA synthetase/tRNA par som ortogonale til endogene parene som innlemme kanoniske aminosyrer6. Flere ncAAs har blitt innlemmet i antistoffer til å generere ADFS. Men mest lider av ulike gjeld for programmer i terapeutisk medikament Bøyning. p-acetylphenylalanine (pAcF)7,8 er ikke fullt bioorthogonal, krever lav pH (4.5) og lang reaksjonstid (> 60 h), mens azides som p-azidophenylalanine (pAzF)7,9,10, p-azidomethylphenylalanine (pAMF)11og en azide derivat lysin (AzK)12,13 reduseres i cellen14, og kobber brukes til å katalysere Huisgen sykloaddisjoner kan indusere oksidative skader 15.
Selv om alternative ncAAs basert på trans-cyclooctene (TCO), cyclooctyne (SCO) og bicyclo [6.1.0] nonene (BCN) har nylig blitt kodet i et antistoff for bio-imaging formål, uttrykk systemet lider av svært lav avkastning (0,5 mg/L)16. Videre cyclooctenes og cyclooctynes er store og hydrofobe håndtak som kan øke mottakelighet av ADC for aggregering -ADC nyttelast er tradisjonelt hydrofobe og mekanisk-egenskapene for linker har blitt vist å sterkt påvirke farmakokinetikken og terapeutisk indeks17. Derimot er 1,3-disubstitued cyclopropenes lite reaktive grupper som skal gi minimal endring i protein struktur og physichochemical egenskaper18. Cyclopropenes reagere selektivt og raskt med tetrazines via en omvendt elektron-demand Diels-or cycloaddition19. I denne protokollen vi gjøre bruk av et derivat av lysin (CypK, figur 1b) bærer en metyl-cyclopropene som er mindre påvirket av steric hindring enn større anstrengt umettede sykluser og har en reaksjon hastighet konstant i 1-30 M-1s -1 i vandige media18,20.
Nylig rapporterte vi hvordan å innlemme CypK i antistoffer å generere ADFS ved reagerer dette minimale bioorthogonal håndtaket med tetrazine-bærende molekyler21. Her beskriver vi ADC forberedelse prosedyren nærmere med vekt på de mest utfordrende trinnene. Innlemmelse av CypK er rettet med en pyrrolysyl-tRNA synthetase (PylRS) / tRNACUA(PylT) par svar på et gult codon introdusert i den tunge kjeden antistoff (HC)22. Her bruker vi to plasmider forbigående transfection (figur 1a), en koding tunge kjeden av antistoffer og den andre en koding lys kjeden (Langbane), begge inneholder PylRS/PylT kassetten. Alternativt kan en stabil cellen linje som gir høyere antistoff gir genereres gjennom en mer arbeidskrevende prosedyre21.
De nevnte uttrykk systemene kan produsere terapeutiske anti-HER2 immunglobulin 1 (IgG1) trastuzumab med CypK på lignende nivåer til vill type antistoff. Vi valgte den første plasseringen av CH1 domenet på den tunge kjeden å kode ncAA (HC-118TAG). Dette er vanligvis endret området i ADFS23 og er kjent som HC-118 (EU nummerering) men har også blitt omtalt som HC-121 (sekvens posisjon) og HC-114 (Kabat nummerering)24. Siden denne posisjonen er bevart gjennom alle IgG1s, burde systemene uttrykk være mottakelig for mest terapeutiske antistoffer.
Vi viser trastuzumab(CypK)2 kan enkelt renses protein en etterfulgt av rask protein flytende kromatografi hydrofobe samhandling kolonnen (FPLC-her over). Antistoffer kobles deretter covalently i 3 h å microtubule polymerisasjon hemmer monomethyl auristatin E (MMAE), som brukes i FDA-godkjent ADC Adcetris. Her bruker vi et benzyl-tetrazine derivat av MMAE (tetrazine-vcMMAE) med et linker som består av en glutarate for avstand og en Valin-citrulline protease-labil komponent etterfulgt av en p– aminobenzylalcohol self-immolative enhet; Denne linker er kløyvde av katepsin B i lysosome på internalization ADC resulterer i traceless utgivelsen av giftstoffer25. For å vise det brede omfanget av reaksjonen, er antistoffer også knyttet til fluorophore tetramethylrhodamine (TAMRA). Vi forklare hvordan å bekrefte identiteten til konjugert av flytende kromatografi koblet til massespektrometri (LC-MS) og beregne narkotika til antistoff forholdet (DAR) bruker Væskekromatografi hydrofobe samhandling kolonnen (såkalt HPLC-her over) .
Som del av karakterisering av antistoff ytelsen beskriver vi hvordan å teste stabiliteten i dihydropyridazine sammenhengen i humant serum. Denne parameteren er lettere vurdert i trastuzumab-TAMRA fordi det kan kvantifiseres ved en enkel ELISA og tolkning av resultatene er ikke komplisert av komponenten protease labil av trastuzumab(MMAE)2. Til slutt, det selektivitet og styrken på trastuzumab(MMAE)2 vurderes ved å sammenligne cytoxicity av ADC over cellelinjer uttrykke ulike nivåer av HER2. Denne analysen gir også en funksjonell bevis for ADC stabilitet når utført etter rugende immunoconjugate i humant serum.
Forbigående uttrykk prosedyren for å produsere trastuzumab(CypK)2 beskrevet i denne protokollen er enkel, og gir høy fleksibilitet. Avkastningen oppnådd er de i en akademisk innstillingen27 og stabil cellelinjer kan genereres for å ytterligere øke produksjonen yield21. Under uttrykk lavere konsentrasjoner av CypK enn 5 mM kan resultere i lavere ncAA innlemmelse, og større mengder kan påvirke cellevekst og redusere antistoff avkastning. CypK som en gratis aminosyre har lav vannløselighet, dermed bør være første oppløses 100 mM inne 0.1 M NaOH og deretter lagt til kultur medium. Etter fortynne CypK i medium, og før det legges til celler, er det avgjørende å nøytralisere mediet med HCl og filter å sterilisere. Deretter bruker transfection reagensene angitt i denne protokollen og etter inkubasjon ganger anbefalt av produsenten er viktig for et høytytende uttrykk. For ytterligere informasjon om forbigående uttrykk for menneskelige antistoffer kalles leseren andre publiserte protokoller31,32.
Når antistoffer er renset, er en høy overskudd av protein A harpiks nødvendig som vist for å sikre full antistoff trekke ned fra nedbryting. For å hindre nedbør av trastuzumab under elueringsrør, anbefales det å bruke en løsning med høy bufring kapasitet, fortynnet umiddelbart med PBS og utveksle bufferen unngå overdreven konsentrasjon. Alltid holde antistoffer < 5 mg/mL.
Bøyning av trastuzumab(CypK)2 med tetrazine-vcMMAE er raskere enn de fleste reaksjoner rapportert med andre bioorthogonal håndtak for ADFS. Videre, dette cycladdition oppstår under svært mild forhold: romtemperatur eller lavere og Fysiologiske pH. Det er viktig å fortynne DMSO lager løsninger av reaktantene med acetonitrile før PBS og antistoffer; ellers vil tetrazine derivater utløse. Acetonitrile kreves bare på grunn av den høye hydrophobicity av MMAE og TAMRA, men mindre hydrofobe molekyler kan ikke trenger i tillegg et co løsemiddel. Tetrazine-vcMMAE kan også bli bøyd på uten acetonitrile og bare 2 molar ekvivalenter av tetrazine-vcMMAE i 20 h. Denne liten mengde gift kan omfatte en betydelig reduksjon i produksjonskostnadene for ADC sammenlignet med gjeldende ncAA-baserte teknologier. Trastuzumab(CypK)2 er fullt reaktive for minst 4 måneder når bevart på 4 ° C.
HPLC-HIC gjør en nøyaktig bestemmelse av DAR siden MMAE er svært hydrofobe og gir en utmerket løsning av toppene tilsvarer antistoff conjugates med 0, 1 og 2 giftstoffer. Ureagert tetrazine-vcMMAE elutes rundt 13,7 min og oppdages på 280 nm. Denne teknikken krever en starter materiale med høy renhetsgrad. Dessuten, det er ikke tilrådelig å slukke reaksjon med andre tetrazine-reaktive molekyler som BCN-OH siden de kan endre til tid og form av toppene. Det er viktig at salt konsentrasjonen av prøvene passer den i mobile fase i starten av graderingen for å få en god separasjon, spesielt hvis mer enn 10-20 µL er injisert.
Angående LC-MS analysen er deglycosylation av antistoff prøvene nødvendig for å hente en enkelt topp på deconvolution av rå spekteret. Nøyaktigheten av den totale antistoff og ADC massene kan variere avhengig av callibration av maskinen. Derfor, for å beregne massen for ombygging, trekk massen innhentet for uforandret antistoffer fra den innhentet for ADC. Moderne høyoppløselig masse spektrometre bør gi en relativ feil under 1:10000. Selv om LC-MS kan også brukes til å beregne forholdet mellom de ulike artene, er denne verdien vanligvis en overvurdering fordi endringen kan påvirke ionisering kapasiteten av arten generert og registreres ikke lave mengder urenheter.
Stabiliteten av linker i ADFS er kritisk fordi tidlig utgivelsen av stoffet resulterer i høyere toksisitet og lavere effekt; den gratis cytotoxin skade sunt vev og naken antistoffer konkurrerer med den væpnede for bindingen målområdene på syke celler. En utgivelse under 5%, som er i variasjon av stabilitet analysen, bør forventes.
Til slutt, selektiviteten av en ADC målretting HER2 som trastuzumab(MMAE)2 kan vurderes ved å sammenligne cytotoksisitet i SK-BR-3 celler (HER2 høy) og MCF-7 celler (HER2 lav) siden sistnevnte uttrykke 15-fold mindre HER2 reseptorer enn tidligere28 . Immunoconjugate forventes å resultere i en celle levedyktighet minst 2 størrelsesordener lavere i SK-BR-3 sammenlignet med MCF-7. EF50 i SK-BR-3 bør være et tosifret nanomolar gjenspeiler den høye styrken på denne ADC29,30. Uforandret antistoffer, trastuzumab(MMAE)2 eller trastuzumab, skal vise ingen toksisitet i denne analysen. Tetrazine-vcMMAE bør ha en effekt 3 størrelsesordener lavere enn du ADC siden linker fjerner aktiviteten til peptidomimetic giften. Fordi MMAE kan trenge gjennom cellemembranen30, bør det derimot har en lignende toksisitet for ADC men viser ingen diskriminering mellom HER2 høy og HER2 lav linjer. Videre, hvis denne analysen utføres etter en 5 dagers inkubasjonstiden for ADC i serum, den kan brukes til en funksjonell beviser stabiliteten av kobleren: en versjon av giften vil resultere i enten en nedgang i ADC effektivitet i SK-BR-3 Hvis MMAE ble utgitt med p kunsten å linker eller en nedgang i selektivitet hvis linker var kløyvde i traceless mote.
ADC teknologien beskrevet her kan effektiv og områdespesifikke inkorporering av en cyclopropene derivat av lysin i IgG1s. Etter en lettvinte rensing, antistoffer kan være raskt konjugert med tetrazine inneholder molekyler, gir homogen produkter. På grunn av liten størrelse og høy reaktivitet av cyclopropene minimal håndtaket, bør denne metoden aktivere Bøyning av sterically hindret nyttelast. De resulterende immunoconjugates er stabil i serum og svært potent og selektiv. Samlet muliggjør CypK en rask, områdespesifikke og stabile bioorthogonal kobling for antistoffer og andre protein conjugates som skal brukes i terapi eller diagnose.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av i Medical Research Council, UK. BO-S. har en EMBO fellesskap (ATLF 158-2016) og er takknemlig til H. Pelham og JW haken for støtte, og G. Kym, C. W. Morgan og O. Perisic for hjelp og råd.
Expi293F | ThermoFisher Scientific | A14527 | HEK suspension cells |
Expi293 Expression Medium | ThermoFisher Scientific | A1435101 | Expression medium |
Antibiotic-antimycotic | ThermoFisher Scientific | 15240062 | Penicillin-streptomycin-amphotericin B |
125mL Polycarbonate Erlenmeyer Flask with Vent Cap | Corning | 431143 | Shake flasks |
Brunswick S41i incubator | Eppendorf | S41I230011 | CO2 incubator with a shaker |
Sodium hydroxide 4 mol/l (4 N) in aqueous solution | VWR | 191373M | |
Cyclopropene lysine | Sichem | SC-8017 | In this study it was synthesized as described by Elliot et al. 2014 |
Steriflip-GP, 0.22 µm, polyethersulfone, gamma irradiated | Merck Millipore | SCGP00525 | |
Opti-MEM, Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific | 31985070 | Reduced serum medium |
ExpiFectamine 293 Transfection Kit | ThermoFisher Scientific | A14525 | Transfection reagent |
5810 R centrifuge | Eppendorf | 5811000460 | |
Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm, polyethersulfone, 33 mm, gamma sterilized | Merck Millipore | SLGP033RS | |
Protein A resin | Sino Biological | 10600-P07E-RN-25 | |
Poly-Prep Chromatography Columns, Pkg of 50 | Bio-Rad | 7311550 | Polypropylene chromatography column |
Econo-Column Funnel | Bio-Rad | 7310003 | |
Sodium citrate | Fluka | 71635 | |
ÄKTA explorer FPLC | GE Healthcare | ||
HiTrap HIC Selection Kit | GE Healthcare | 28-4110-07 | Includes HiTrap 1 mL Butyl HP |
Ammonium sulfate | VWR | 2133.296 | |
Isopropanol | Honywell | 34863-2.5L | |
Dymethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418-50ML | |
Tetrazine-vcMMAE | ChemPartner | – | Costum synthesized |
Tetrazine-5-TAMRA | Jena Bioscience | CLK-017-05 | |
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel 1.0mm x 10 well | ThermoFisherScientific | NP0321BOX | |
Xcell SureLock Mini-Cell | ThermoFisherScientific | EI0001 | |
UltiMate 3000 HPLC | ThermoFisherScientific | ||
Thermo Scientific MAbPac, HIC-20, 4.6 x 100 mm, 5 µm | ThermoFisherScientific | 088553 | |
PNGase F | New England BioLabs | P0704S | |
NanoAcquity | Waters | ||
C4 BEH 1-5 µm 1.0 x 100 mm UPLC column | Waters | ||
96-well microplates for cell culture | ThermoFisherScientific | 156545 | |
Human serum | Sigma-Aldrich | H4522-20mL | |
CO2 incubator | Panasonic | ||
HER2 ECD | Sino Biological | 10004-HCCH | |
Anti-TAMRA | Abcam | an171120 | |
Anti-mouse HRP | Santa Cruz | sc-2005 | |
TMB | BioLengend | 421101 | |
Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 84727-500ML | |
PHERAstar FS | BMG Labtech | Plate reader | |
DMEM | Sigma-Aldrich | D5671-500ML | |
SK-BR-3 | ATCC | HTB-30 | |
MCF-7 | ATCC | HTB-22 | |
CellTiterGlo 2.0 Assay | Promega | G9242 | Cell viability assay based on the measurement of ATP released after cell lysis. The output signal is luminscence. |
Monomethyl Auristatin E | Cayman Chemical | 16267 | |
NanoDrop 2000 | ThermoFisherScientific | Microvolume spectrophotometer | |
Human IgG ELISA Quantificaiton Set | Bethyl | E80-104 | |
MaxEnt1 in MassLynx | Waters | Software application for mass spectrum deconvolution | |
IntantBlue | Expedeon | ISB1L | Coomassie-based stain |
Intact MMAE-ADC ELISA Kit (Sandwich Assay) | Epitope Diagnostics, Inc. | KTR 782 | |
Tube 50 mL, 114x28mm, PP | Sarstedt | 62.547.254 | Conical tube |
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units 50,000 NMWL | Merck | UFC905024 | Centrifugal filtration concentrator (after protein A pull down) |
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units 50,000 NMWL | Merck | UFC805024 | Centrifugal filtration concentrators (after FPLC or HPLC purification) |
Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL | ThermoFisherScientific | 89882 | Size exclusion spin columns |
Tube PCR 0.2ml Flat Cap | Thistle Scientific Ltd | AX-PCR-02-C-CS | PCR tubes |
Nunc MaxiSorpª flat-bottom | ThermoFisherScientific | 44-2404-21 | Plates for ELISA |