Summary
Denne protokollen beskriver en metode å påføre en slitasje på okulær overflaten av musen, og følge såret helbredelsesprosessen etter. Protokollen utnytter en okulær burr delvis fjerne overflaten epitel i øyet i anaesthetized mus.
Abstract
Murine hornhinnen gir en utmerket modell for å studere sårtilheling. Hornhinnen er det ytterste laget av øyet, og dermed er den første forsvaret til skade. Den vanligste typen øye skade i klinikken er faktisk en hornhinnen avsliting. Her benytter vi en okulær burr å indusere en slitasje resulterer i fjerning av hornhinnen epitel i vivo på bedøvet mus. Denne metoden gir mulighet for målrettet og reproduserbar epithelial avbrudd, røres andre områder. I tillegg vi beskrive visualisering av abraded epitel med fluorescein flekker og gi konkrete råd om hvordan å visualisere abraded hornhinnen. Deretter følger vi tidslinjen i sårheling 0, 18 og 72 h etter slitasje, inntil såret er re epithelialized. Epitel slitasje modell av hornhinnen skade er ideell for studier av epitelial celle spredning, migrasjon og nytt epithelialization av hornhinnen lag. Denne metoden er imidlertid ikke optimalt å studere stromal aktivisering under sårheling, fordi den okulær burr ikke trenge til stromal cell lag. Denne metoden er også egnet for klinisk bruk, for eksempel pre-klinisk test av narkotika.
Introduction
Epiteliale lag mange organer er utsatt for skader. Men inneholder de også muligheten til å kompensere for vev tap gjennom sårtilheling. Hornhinnen tilbyr en utmerket modell for å studere sårtilheling. Den danner den eksterne overflaten gir et beskyttende lag for følsom okulær maskiner. Dermed fungerer hornhinnen som en fysisk barriere mot patogener og vanntap. Det består av tre lag. epitel, stroma og endotelet. Epitel i hornhinnen utgjør det ytterste laget av hornhinnen. Epitelceller opprettholde funksjonen barriere av hornhinnen ved holdt seg strengt til hverandre gjennom tett veikryss1,2,3. En acellular hornhinnen kjelleren membran, Bowmans membran, skiller epitel fra det omfattende stroma, som inneholder ildfaste keratocytes. Under stroma kanal endotelceller næringsstoffer, vann og oksygen til øvre laget.
Hornhinnen avsliting er svært vanlig i klinikken4. Skader på hornhinnen er forskjellige, men skyldes hovedsakelig små partikler som støv eller sand, riper eller andre fremmedelementer. Protokollen beskrevet her tar sikte på å gjengi en klinisk relevant type hornhinnen epithelial slitasje. Dermed gir denne protokollen en kontrollerbar og banebrytende metode for klinikere og hornhinnen forskere i egne studier. Vi har utført i vivo skade reparasjon analysen på murine hornhinnen ved slipeenhet vev med en sløv okulær burr, den Algerbrush II. Her vi målrette slitasje bare til sentrale hornhinnen epitel og la de andre delene av orgelet uten skade. Dermed protokollen er ideelt å studere hornhinnen tarmepitelet dynamics eller kjelleren membranen under re epithelialization, celle migrasjon, spredning og differensiering i vivo5. Nylig, denne modellen ble brukt til å analysere stamfar celle dynamikk i murine hornhinnen samt å avsløre kapasiteten til differensiert hornhinnen epitelceller med å opprette hornhinnen stamcelleforskningen nisje etter skade6,7. Etter slitasje, hornhinnen returnerer til normal åpenhet og strekkfasthet. Interessant, viste en studie utført i vitro at re epithelialization skjer uten økt celle spredning8. Denne protokollen beskriver tidslinjen uavbrutt healing i murine hornhinnen. Metoden gjelder dermed å teste effekten av legemidler på healing mønstre og hastighet.
Hornhinnen er mye brukt for sårheling studier. Men har mange studier stolt på andre modeller av skade. En veletablert modell av hornhinnen skade er alkalisk brenne som utføres ved å bruke natriumhydroksid (NaOH) med eller uten filter papir på hornhinnen overflaten9. Alkaliske eksponering resulterer i en stor og diffus skade som påvirker ikke bare hornhinnen epitel, men også conjunctiva og stroma9,10. Sterke alkaliske løsninger har vist å indusere hornhinnen sår, opacification og neovascularization9. Inflammatoriske celler invadere stroma vanligvis innen 6 h og forblir der til 24 h11. Dermed er alkaliske skade en tilrådelig metode i studier knyttet til stromal aktivisering. En annen type kjemisk skade kan bli påført ved å bruke dimethyl sulfoxide (DMSO) på hornhinnen9,10. Andre vanlige skader modeller inkluderer incisional sår som trenger gjennom stroma og keratectomy sår, som er begrenset til den øvre delen av stroma14,15. Disse metodene er også nyttig å svare på spørsmål om stromal sårtilheling. Ulike skader modeller har sine egne fordeler og ulemper. Slitasje eller rensing, av hornhinnen epitel ble først utviklet bruker sløv skalpeller eller blader på ex vivo hornhinner16. Denne metoden har senere vært brukt i vivo på mus, rotte og kanin17,18,19,20,21,22. Bruker den okulær burr (figur 1), fjerne vi bare en valgt region av epitel, la resten av epitel upåvirket. På denne måten er det mulig å målrette epithelial fjerning til forskjellige deler av hornhinnen. I tillegg kan slitasje størrelsen vurderes med fluorescein flekker. Videre følger her vi slitasje nedleggelse i helbredende perioden.
Denne metoden utgjør flere fordeler i) inkludert svært presis plassering av slitasje området, som ikke er mulig med kjemisk skade, ii) avsliting er raske til å utføre og iii) det er ikke-invasiv. Her beskriver vi metoden med outbred NMRI musen som modell, men dette kan brukes til det store utvalget av musen genetisk modeller og rotte og hare, og dette er vanlige modeller brukes til å studere menneskelig hornhinnen avbrudd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter er godkjent av nasjonale dyr eksperiment board.
1. forberedelser
- Forberede alle løsninger og oppbevares i romtemperatur, med mindre annet er angitt. Følg forskriftene kast brukt og løsninger.
- Bruk NMRI og ICR outbred aksjer, mellom ages 4-12 uker og begge kjønn. Hvis bruker C57BL/6 belastningen, følger du metoden ketamin-medetomidine forberedelse i trinn 1.3.2. For andre trinn, følger du instruksjonene som er beskrevet i 1.3.3.-1.3.5.
- Forberede veterinærmedisin frisk og i tid før du starter operasjonen. Carprofen skal brukes senere, derfor er det ikke nødvendig å forberede den på dette punktet.
- For å forberede en løsning av ketamin-medetomidine anestesi, bland 0.375 mL (lager konsentrasjon 50 mg/mL) av ketamin (Ketaminol Vet) med 0,25 mL (lager konsentrasjon 1 mg/mL) av medetomidine (Cepetor Vet) og legge 1,25 mL steril 0,9% NaCl. Administrere 0,15 mL/20 g av musen vekt (7.5 mg/kg, ketamin og 1 mg/kg, medetomidine).
- For å forberede en mer fortynne løsning av ketamin-medetomidine anestesi på C57BL/6 mus, bland 0.375 mL (lager konsentrasjon 50 mg/mL) av ketamin med 0,25 mL (lager konsentrasjon 1 mg/mL) av medetomidine og legge til 2,5 mL steril 0,9% NaCl. Administrere 0,15 mL/20 g av musen vekt (3.75 mg/kg, ketamin og 0,5 mg/kg, medetomidine).
Merk: Dette er en alternativ skritt, bare for voksne C57BL/6 mus. - For å forberede buprenorfin analgesi, legger du til 0,1 mL (lager konsentrasjon 0,3 mg/mL) av buprenorfin til 1,9 mL steril 0,9% NaCl. Administrere 0,2 mL/20 g musen vekt (0,15 mg/kg).
- For å forberede atipamezole nedlagte anestesi, legger du til 0,1 mL (lager konsentrasjon 5 mg/mL) av atipamezole til 4,9 mL 0,9% NaCl. Administrere 0,15 mL/20 g musen vekt (0.75 mg/kg).
- Bruke carprofen analgesi under etter anestesi. Legge til 0,1 mL (lager konsentrasjon 50 mg/mL) av carprofen til 4,9 mL 0,9% NaCl. Administrere 0,15 mL/20 g av musen vekt (7.5 mg/kg).
- Forberede fluorescerende flekker løsning
- Visualisere slitasje under kobolt blå lys (figur 1), bruke en fluorescerende løsning. Forberede en 0,1% fluorescein løsning av første måler 10 mg fluorescein salt med fine skala og deretter legge den til 10 mL i fosfat-bufret saltvannsoppløsning (PBS).
- Beskytte fluorescein løsningen fra lys og riste i 5 minutter på en shaker.
Merk: Fluorescein løsningen er lys-sensitive; holde løsningen dekket fra lys. Denne løsningen kan lagres i 4 ° C i 2-3 dager. For bruk er det nyttig å plassere fluorescein løsningen i en dropper flaske som brukes for øyedråper. Bruke et sterilt-filter når du flytter løsningen til dropper flasken.
- Rengjør okulær burr spissen før og etter bruk. først med PBS og deretter med 70% EtOH. Hvis gjør en slitasje flere mus i samme operasjon, kan du utføre rengjøring trinn mellom hver musen.
- Sette oppvarmet platen på (+37 ° C), og plassere et papirhåndkle på den.
2. hornhinnen avsliting
Advarsel: Bruk beskyttende slitasje (hansker, laboratoriefrakk) når håndtere mus. Vei for å beregne volumet av medisiner for å administrere.
- Bruk én hånd scruffing metoden for å håndtere musen23. Administrere ketamin-medetomidine blanding intraperitoneally (IP) til venstre nedre del av magen. Plasser musen til en individuell buret og vente å sovne. Dette tar vanligvis mindre enn 5 minutter. Deretter administrere første buprenorfin og atipamezole via IP injeksjoner. Bruke samme håndtering teknikk.
Merk: Når anestesi er gitt, protokollen bør ikke stoppes midlertidig når som helst. - Før du fortsetter, kontroller at oppvarmet platen er varme. Plass bedøvet musen på oppvarmet platen. Nivået av anestesi er bra hvis det hale refleks mangler, men det tå refleks finnes. Sjekk disse reflekser ved pinching halen og en tå eller tang. Bruk ikke overdreven kraft. Anestesi vil siste 20-25 minutter.
- Bruk den renset okulær burr for å gjøre en slitasje. Roter foten av burr aktivere vibrasjoner som er viktig å gjøre slitasje. Føle vibrasjoner i hånden, når burr fungerer.
- Åpne ett øye samtidig ved å holde øyelokkene separat med fingrene. Deretter fast touch burr til hornhinnen og bevege apparatet og tilbake så vel som sidelengs på okulær overflaten. Burr vibrasjon vil utføre scratch; ikke trykk, riste eller rive hornhinnen. I sentrale hornhinnen er 20 slipeenhet bevegelser på overflaten tilstrekkelig til å indusere såret. Ikke løft i burr og prøve å bo i regionen av hornhinnen for å være abraded. Anskaffe en standardstørrelse slitasje vil kreve flere runder med praksis.
Merk: Hornhinnen asepsis kan oppnås før slitasje ved hjelp av betadine ophthalmica løsning.
3. imaging slitasje
- Belyse abraded regionen kobolt blå pennen lyset (figur 1) og fluorescein løsning. Okulære overflaten vises fargeløs i omgivelseslyset. Etter fluorescein program fluoresces regionen abraded i grønt når belyse øyet med pennen lys.
- Om nødvendig åpne abraded øyet på samme måte som 2.3 og administrere en dråpe fluorescein løsning fra dropper flasken. Vask øyet når PBS eller 0,9% NaCl å redusere bakgrunnen i fluorescein. Bruk en dropper flaske eller en pipette for vask. Sug opp væske unna med en myk tørk og rengjør øyevippene, hvis nødvendig. Overflødig væske samler vanligvis på nese kanten av øyet, nær åpningen av tåre kanalen.
FORSIKTIG: Ikke ta hornhinnen mens cleaining som mindre slitasje kan bli indusert.
- Om nødvendig åpne abraded øyet på samme måte som 2.3 og administrere en dråpe fluorescein løsning fra dropper flasken. Vask øyet når PBS eller 0,9% NaCl å redusere bakgrunnen i fluorescein. Bruk en dropper flaske eller en pipette for vask. Sug opp væske unna med en myk tørk og rengjør øyevippene, hvis nødvendig. Overflødig væske samler vanligvis på nese kanten av øyet, nær åpningen av tåre kanalen.
- Ta bilder av hornhinnen avsliting.
- For å få lignende bilder i hver tenkelig økten, bruk jevn vedlegg verktøy for kobolt blå pennen lyset og SLR kameraet (figur 2). Denne protokollen gir et oppsett som er lett å gjenta (figur 2).
- Hvis du vil knytte pennen lyset og kameraet, bruk en bordlampe med en fleksibel arm og klemme og en justerbar kameraet arm med en klemme, henholdsvis. Kabel-tie pennen lyset bordlampe og posisjon rett over musen øyet. Posisjonering lyset annerledes kan endre visualisering av slitasje. Et forslag for plassering disse verktøyene er beskrevet i figur 2.
- Bruk SLR kameraet å ta bilder av øyet. Sett dyr i ønsket avstand og plassering og fokusere kameraet (1:12) i lysforholdene. Etter det, lukker du alle andre lys unntatt kobolt blå pennen lyset.
Merk: Tape penn lys håndtaket ned eller bruk en gummi band for å holde lyset på hele tiden under bildebehandling. Denne kunne hjelpe hvis bildet blir uskarpt. Det er enklest å utføre tenkelig trinnet med en kollega.
- For å få lignende bilder i hver tenkelig økten, bruk jevn vedlegg verktøy for kobolt blå pennen lyset og SLR kameraet (figur 2). Denne protokollen gir et oppsett som er lett å gjenta (figur 2).
4. våkne opp etter hornhinnen avsliting
- Administrere første buprenorfin og atipamezole via IP injeksjoner. Bruke samme håndtering teknikk som 2.1.
- Plass en dråpe antibakterielle, fucidin syre øye ointment (Isathal) både abraded og ikke-abraded øynene å fukte og holde okulær overflaten ren fra bakterier etter anestesi.
- Som musen ville våkne opp etter 5-20 minutter på oppvarmet plate, observere musen i post bedøvende vekker perioden. Når det blir mobil, plasserer den i en individuell buret.
Merk: Hvis det tar lengre tid å våkne opp, plasserer musen i buret med en oppvarmet pute eller plassere det hel bur på oppvarmet platen og overvåke musen regelmessig. Mens anestesi slites av, musen vanligvis rister og når oppover med fremre kroppen. Dette bør gå tilbake til normal i 3-4 timer og deretter kan du plassere musen tilbake til en delt bur. - Administrere carprofen IP for analgesi og øye salve på to påfølgende dager etter slitasje, på samme måte som i trinn 2.2. og 4.2.
5. imaging under sårheling
- I denne protokollen punkter bruk tid 18 h og 72 h etter slitasje å observere såret nedleggelsen.
- For påfølgende bildebehandling, bedøve musene som forklart i 2.2.
- Ta bilder som forklart i 3.
- Våkn opp til dyr med atipamezole IP og overvåke vekker perioden som forklart i 4.3.
Merk: Hvis ikke fortsette oppfølgingen euthanize musen rett etter 5.1.2. Eutanasi beskrives 6.1.
6. hornhinnen innsamling og parafininnstøper
- Etter den siste tid, ofre dyr. Plass musen i et kammer som kan fylles med CO2. Fylle kammer luften med CO2. Når Dyret er immobile, dislocate cervical ryggsøylen ved dra fast fra bunnen av halen og trykke nakken regionen ned samtidig.
Advarsel: Følg alltid retningslinjene i lokale dyrevelferd kroppen. - Samle hele øyeeplet ved å kutte en åpning i huden ved siden av øyet med disseksjon saks. Plasser saksen under øyeeplet og kutte okulær nerve til pop øyeeplet av bane. Bruk tang hvis øyet ikke kommer ut lett.
- Lage et hull på baksiden av øyet, på netthinnen side, med en 26G nål tillate gratis gjennomtrengning av løsninger i øyet.
Merk: Ikke la øyet blir tørr, i stedet, plasserer den i PBS til fortsetter med protokollen.
- Lage et hull på baksiden av øyet, på netthinnen side, med en 26G nål tillate gratis gjennomtrengning av løsninger i øyet.
- Samle øyeeplet i en 2 mL tube med PBS. Ikke stoppe eksperimentet på dette punktet.
- Fjern PBS og fastsette øyeepler i 4% paraformaldehyde (PFA) i 4 ° C for 4-5 timer.
- Flytt fast øyeeplet kassetteninn vev for vev behandling. Bruk en vev maskin og følgende program:
- Skyll med PBS.
- Inkuber 2 x 45 min med 70% etanol ved romtemperatur.
- Inkuber 2 x 1 h i 94% etanol ved romtemperatur.
- Inkuber 3 x 45 min i absolutt etanol ved romtemperatur.
- Inkuber 3 x 1 h i xylen, ved romtemperatur og siste xylen på 37 ° C.
- Inkuber 3 x 1 h i parafin voks på 60 ° C.
- Etter vev behandling, kan du bygge inn øyeeplet i flytende parafin (+ 60 ° C) med en vev innebygging blokk. Sett øyet i blokken slik at det ser sidelengs og eksterne grensen er vendt oppover. La blokken stivne på en kul plate i 5-10 minutter.
7. parafinsnitt i hornhinnen
- Forberede mikrotomen ved snitting ifølge institusjon eller produsentens instruksjoner.
FORSIKTIG: Vær forsiktig ved håndtering av skarpe mikrotomen bladet. - Sted en vannbad med romtemperatur ultrapure vann ved mikrotomen og en annen med ultrapure vann oppvarmet til 50 ° C.
- Gjør 5 µm tykk deler av øyeeplet.
Merk: Linsen bryter lett under snitting. For å unngå dette, tørk kutte overflaten med en fuktig vev hver gang en ny rad av delene er startet. Bruk vann fra springen til å fukte vevet. - Plasser delene ved siden av hverandre i vannbad romtemperatur og flytte dem til varmt vannbad ved hjelp av et glass lysbilde. Strekke avsnittene i varmt vannbad til alle rynker slappe av og til delene bli matte.
- Tørr glass lysbilder med deler overnatter i +37 ° C.
- Fest delene til lysbildene ved å holde lysbildet i 1 minutt på en oppvarmet plate i + 60 ° C. Etter dette kan delene direkte behandlet for flekker, immunohistological metoder eller lagret i 4 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dette beskriver en modell for å påføre en slitasje skade musen hornhinnen og antyder hvordan å følge og visualisere helbredelsesprosessen etter slitasje. Nylig ansatt vi denne metoden til å studere rollen til hornhinnen epithelial progenitor celler under sårheling6. Bruk av etablerte verktøy er nøkkelen til en vellykket slitasje eksperiment. Vi, og andre, har brukt Algerbrush II okulær burr (figur 1) for å utføre slitasje6,7,24. Dette verktøyet har en sløv burr spissen av 0,5 mm i størrelse som børster øvelser eller sakser hornhinnen epitel bort. Dermed er verktøyet anbefalt valg for slitasje skade på hornhinnen.
En sentral del av denne modellen er at den berørte regionen kan visualiseres uanstrengt med ønskede intervaller. I figur 3Apresenterer vi bruk av fluorescein flekker i kombinasjon med kobolt blå lyskilde (figur 1) til å vise webområdet slitasje. I dette eksperimentet utført vi et stort sår i sentrale hornhinnen og forlot perifere hornhinnen urørt (figur 3A). Videre vi abraded bare venstre øye hver mus og holdt rett, bilaterale øyet som en ikke-abraded. Bilaterale øye prøvene forble negativ for fluorescein signal, som antyder at de ikke gjennomgå celle tap under eksperimentet og dermed fungere godt som kontroll prøver. Grønt signal på kantlinjene på øyet vises imidlertid fluorescein løsningen som samlet seg i krysset mellom øyet og øyelokket. Slitasje var største på 0 h, umiddelbart etter skaden (figur 3A). Det var betydelig mindre etter 18 h, og i dette tilfellet ligger nær den øvre grensen av øyet. Imidlertid lukker epitel eksponert regionen med en lik hastighet fra alle sider av slitasje. Spesielt på 72 h etter såret, var ingen grønt signal synlig. Dette indikerer at hornhinnen epitel var helt nytt epithelialized av 72 h etter slitasje.
Med denne metoden å vi fokusere avsliting på hornhinnen epitel, slik at dypere lag av hornhinnen forblitt intakt. Fjerning av hornhinnen epitel var tydelig fra histologiske deler i figur 3B. På 0 h vises kanten av slitasje som en smal, acellular hylle kontinuerlig fra en vanlig, 4-5 celle lag tykk hornhinnen epitel. Limbus, eksterne grensen av hornhinnen epitel, presenterer et eksempel område som ikke ble påvirket av slitasje under hele eksperimentelle tidslinjen (72 h). I tillegg indikerte histologiske deler at de dypere lag av hornhinnen, stroma og endotelet, ikke ble skadet av okulære burr. Disse to vev dukket opp lignende abraded og bilaterale øye prøver. Helbredelsesprosessen er aktiv på 18 h etter skade, og re epithelialization pågår. Dette ble foreslått av utseendet på en ledende. Forkanten inneholder bare 1-2 tarmepitelet lag og dekker regionen utsatt før re lagdeling kan skje25. I tråd med resultatene på figur 3Avar overflaten fullt re epithelialized av 72 h, når migrere frontene hadde dekket såret og alle epiteliale lag fantes igjen. Histologiske deler fra bilaterale øye bekreftet (figur 3A) at kontroll øynene forble intakt i observasjon perioden.
Til slutt, vi gir bevis på at slitasje modellen er begrenset til hornhinnen epitel og ikke påberope stromal svar på skader, neovascularization. Figur 4 viser murine hornhinnen på 18 h når gnidd. Basert på makroskopisk visning, vise dette tidspunkt ikke stromal svar, noe som indikerer at våre protokollen ikke forstyrre de dypere hornhinnen lag. Sammenligning indusert alkaliske skade med 0,75 mol/L NaOH umiddelbart neovascularization i stroma. Gitt den raske neovascularization i alkalisk skade, gir tidspunkt i vår metode bevis å utelukke muligheten for respons i stroma.
Figur 1: viktige verktøy for hornhinnen epithelial slitasje. Til venstre er en vibrerende okulær burr. Kobolt blå pennen lyset i retten til å bringe fluorescein flekken synlig. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Imaging hornhinnen avsliting. (A) verktøy for bildebehandling er en justerbar kameraet arm med klemme (venstre), SLR kameraet (midten) og en bordlampe med fleksibel arm og klemme (høyre). Kobolt blå pennen lyset er knyttet til kuppelen på lampen med to kabel-bånd. (B) en generell visning av tenkelig; avstanden mellom hvert vedlegg verktøy er merket i bildet i cm. Begge klemmer 6 cm fra den varme platen og musen er plassert 10 cm fra varme platen kanten. (C) en nærmere titt på slitasje bildebehandling med foreslåtte avstand og plassering for musen øyet i cm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: deteksjon og lokalisering av hornhinnen avsliting. (A) musen øynene på 0, 18 og 72 h når gnidd. Fluorescein signalet markerer abraded regionen i lys grønn, mens alle andre regioner i epitel forblir mørk. Bilaterale øyne tjene som kontroller. Stiplet linje grensene av såret og den hvite flekken i hvert øye er refleksjon fra kameraet. (B) delt histologisk og hematoxylin og eosin farget prøver av musen øynene på 0, 18 og 72 h når gnidd. Limbus er rammen som omgir hornhinnen epitel fra alle kanter. Asterix markerer kanten av slitasje. Skala bar er 100 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: hornhinnen avsliting er ikke aktivere stromal svar. Alkaliske eksponering med 0,75 mol/L NaOH etterfulgt av vanning med 0,9% NaCl produserer hornhinnen neovascularization (øyet samlet etter behandling). Slitasje med okulær burr viser ingen neovascularization selv etter 18 h. slitasje området merkes med en stiplet linje. Skalere bar 1 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Såret er populære verktøy å studere ulike aspekter av hornhinnen homeostase og patologi. Slitasje modellen tilbyr en godt kontrollert metode for å løse aktuelle problemer i Oftalmologi. Visse kritiske punkter i protokollen er imidlertid verdt å vektlegge. Spesielt detaljene beskrevet om veterinærmedisin, sår helbredelse tidslinjen og resultatet er optimalisert for bruk med outbred NMRI og ICR aksjer, men kan variere mellom stammer mus26. Med denne protokollen forblir forsøksdyr bedøvet i ca 20 minutter. Dette gir en kort, men tilstrekkelig vindu av tid til å utføre slitasje. Men når du bruker den okulær burr, gjør slitasje selv er en svært rask drift og bør være mulig å utføre i dette tidsrommet.
Enkel og tilgjengelig visualisering er en av de viktigste fordelene med slitasje modellen. Kombinert med molekylærbiologi metoder, åpner dette muligheter for å studere epitelceller i stor detalj. Abraded hornhinner kan behandles til histologiske eller immunologiske farging og proteiner eller nukleinsyrer kan samles og undersøkt ytterligere. Pajoohesh-Ganji et al. viste det genet uttrykk mønstre i hornhinnen epitelceller endre på hornhinnen fornærmelse med en sløv kniv27. For å sikre kontrollert prøvetaking, anbefaler vi at bilder av slitasje tas umiddelbart etter operasjonen og prøvekolleksjoner følger nøyaktig planlagte tidslinjene.
Denne protokollen har bruker utover undersøkelse av hornhinnen epithelialization. Slitasje av hornhinnen limbus, Stamcelle nisje av hornhinnen, kan for eksempel brukes til å studere stamcelleforskningen dynamics7. Vi viste at området ikke abraded epitel forble normalt under helbredelsesprosessen, men noen forfattere hevder at kjelleren membranen og den underliggende stromal keratocytes påvirkes av okulære burr24,28. Fjerning av kjelleren membranen kan anslås med bestemte kjelleren membran flekker. Videre kunne gjentatte slitasje over en lengre tidslinje avsløre interessant helbredende mønstre. I denne protokollen observerer vi ikke arkitektur epitel over en langsiktig jage. Begge sløv skalpell og okulær burr skader har vist økt forekomst til hornhinnen erosjoner etter flere uker etter skade24,29,30. Dette bør holdes i bakhodet når du bruker slitasje modell for langsiktige studier. Men kan studier med fokus på hornhinnen erosjoner finne denne protokollen nyttig.
Andre såret modeller er beskrevet i lengden av Stepp et al. i en gjennomgang5. Denne protokollen og eksisterende tilnærminger utgjør sammen allsidig alternativer å undersøke både grunnleggende biologisk spørsmål så vel som praktiske klinisk problemer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Vi vil gjerne takke Kaisa Ikkala for henne uvurderlig kundestøtte og innsiktsfulle hjelp når virkeliggjøre denne metoden og senere implementering til våre sentrale problemstillinger. Vi vil også gjerne takke laboratorium dyr senter og Anna Meller hennes hjelp med retningslinjer av veterinær arbeidet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NMRI mouse | Envigo | 275 | |
| 0.9% NaCl | use sterile | ||
| Medetomidine | Vetmedic | Vnr087896 | Market name: Cepetor Vet |
| Ketamine | Intervet | Vnr511485 | Market name: Ketaminol Vet |
| Buprenorfin | Invidior | 3015248 | Market name: Temgesic |
| Atipamezol | Orion Pharma | Vnr471953 | Market name: Antisedan Vet |
| Carprofen | Norbrook | Vnr027579 | Market name: Norocarp Vet |
| 1% fucidin acid eye ointment | Dechra | Vnr080899 | Market name: Isathal |
| Fluorescein salt | Sigma-Aldrich | F6377 | |
| Phosphate-buffered saline solution | PBS | ||
| Algerbrush ii ocular burr (0.5 mm tip) | Algerbrush | 6.39768E+11 | |
| Cobalt Blue pen light | SP Services | DE/003 | |
| Hot plate | Kunz Instruments | 2007-0217 | |
| Digital SLR camera | Nikon | D80 | |
| Adjustable camera arm and clamp | Neewer | 10086132 | Height 28 cm |
| Table lamp with a flexible arm and a clamp | Prisma | ||
| Soft wipe | KimtechScience | 7552 | |
| CO2 chamber | |||
| Dissection toolset | Fine Science Tools | ||
| Syringes | Beckton Dickinson | 303172 | |
| 26G needles | Beckton Dickinson | 303800 | |
| 2 mL Eppendorf tube | Sarstedt | 689 | |
| Tissue casette | Sakura Finetech | 4118F | |
| Tissue processing machine ASP200S | Leica | ||
| Xylene | VWR | UN1307 | |
| Paraffin wax | Millipore | K95523361 | |
| Tissue embedding mold 32 x 25 x 6 mm | Sakura Finetech | 4123 | |
| Microtome | Microm | HM355 | |
| Water bath for sectioning | Orthex | 60591 | |
| Water bath for sectioning | Leica | HI1210 | |
| Microtome blade | Feather | S35 | |
| Glass slide | Th.Geyer GmbH & Co. | 7,695,019 | |
| Ultrapure water | Millipore | MPGP04001 | MilliQ |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | PFA |
References
- Yi, X., Wang, Y., Yu, F. S. Corneal epithelial tight junctions and their response to lipopolysaccharide challenge. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (13), 4093-4100 (2000).
- Wang, Y., Chen, M., Wolosin, J. M. ZO-1 In Corneal Epithelium; Stratal Distribution and Synthesis Induction by Outer Cell Removal. Experimental Eye Research. 57 (3), 283-292 (1993).
- Sugrue, S. P., Zieske, J. D. ZO1 in Corneal Epithelium: Association to the Zonula Occludens and Adherens Junctions. Experimental Eye Research. 64 (1), 11-20 (1997).
- Jackson, H. Effect of eye-pads on healing of simple corneal abrasions. British Medical Journal. 2 (5200), 713 (1960).
- Stepp, M. A., et al. Wounding the cornea to learn how it heals. Experimental Eye Research. 121, 178-193 (2014).
- Kalha, S., Shrestha, B., Sanz Navarro, M., Jones, K. B., Klein, O. D., Michon, F. Bmi1+ Progenitor Cell Dynamics in Murine Cornea During Homeostasis and Wound Healing. Stem Cells. , (2018).
- Nasser, W., et al. Corneal-Committed Cells Restore the Stem Cell Pool and Tissue Boundary following Injury. Cell Reports. 22 (2), 323-331 (2018).
- Kaplan, N., Fatima, A., Peng, H., Bryar, P. J., Lavker, R. M., Getsios, S. EphA2/Ephrin-A1 Signaling Complexes Restrict Corneal Epithelial Cell Migration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (2), 936 (2012).
- Bai, J. -Q., Qin, H. -F., Zhao, S. -H. Research on mouse model of grade II corneal alkali burn. International Journal of Ophthalmology. 9 (4), 487-490 (2016).
- Chan, M. F., et al. Protective effects of matrix metalloproteinase-12 following corneal injury. Journal of Cell Science. 126, 3948-3960 (2013).
- Byeseda, S. E., Burns, A. R., Dieffenbaugher, S., Rumbaut, R. E., Smith, C. W., Li, Z. ICAM-1 is necessary for epithelial recruitment of gammadelta T cells and efficient corneal wound healing. American Journal of Pathology. 175 (2), 571-579 (2009).
- Amitai-Lange, A., et al. A Method for Lineage Tracing of Corneal Cells Using Multi-color Fluorescent Reporter Mice. Journal of Visualized Experiments. (106), e53370 (2015).
- Amitai-Lange, A., Altshuler, A., Bubley, J., Dbayat, N., Tiosano, B., Shalom-Feuerstein, R. Lineage Tracing of Stem and Progenitor Cells of the Murine Corneal Epithelium. Stem Cells. 33 (1), 230-239 (2015).
- Blanco-Mezquita, J. T., Hutcheon, A. E. K., Stepp, M. A., Zieske, J. D. αVβ6 Integrin Promotes Corneal Wound Healing. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (11), 8505 (2011).
- Blanco-Mezquita, J. T., Hutcheon, A. E. K., Zieske, J. D. Role of Thrombospondin-1 in Repair of Penetrating Corneal Wounds. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (9), 6262 (2013).
- Gipson, I. K., Kiorpes, T. C. Epithelial sheet movement: Protein and glycoprotein synthesis. Developmental Biology. 92 (1), 259-262 (1982).
- Danjo, Y., Gipson, I. K. Actin "purse string" filaments are anchored by E-cadherin-mediated adherens junctions at the leading edge of the epithelial wound, providing coordinated cell movement. Journal of Cell Science. 111, 3323-3332 (1998).
- Lyu, J., Joo, C. -K. Wnt-7a up-regulates matrix metalloproteinase-12 expression and promotes cell proliferation in corneal epithelial cells during wound healing. Journal of Biological Chemistry. 280 (22), 21653-21660 (2005).
- Nagata, M., Nakamura, T., Hata, Y., Yamaguchi, S., Kaku, T., Kinoshita, S. JBP485 promotes corneal epithelial wound healing. Science Reports. 5, 14776 (2015).
- Stepp, M. A., Zhu, L., Cranfill, R. Changes in beta 4 integrin expression and localization in vivo in response to corneal epithelial injury. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 37 (8), 1593-1601 (1996).
- Stepp, M. A., Zhu, L. Upregulation of alpha 9 integrin and tenascin during epithelial regeneration after debridement in the cornea. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 45 (2), 189-201 (1997).
- Pal-Ghosh, S., Tadvalkar, G., Jurjus, R. A., Zieske, J. D., Stepp, M. A. BALB/c and C57BL6 mouse strains vary in their ability to heal corneal epithelial debridement wounds. Experimental Eye Research. 87 (5), 478-486 (2008).
- JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Rodent Handling and Restraint Techniques. , Available from: https://www.jove.com/science-education/10221/rodent-handling-and-restraint-techniques (2018).
- Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. Removal of the basement membrane enhances corneal wound healing. Experimental Eye Research. 93 (6), 927-936 (2011).
- Suzuki, K. Cell-matrix and cell-cell interactions during corneal epithelial wound healing. Progress in Retinal and Eye Research. 22 (2), 113-133 (2003).
- Sato, Y., Seo, N., Kobayashi, E. Genetic background differences between FVB and C57BL/6 mice affect hypnotic susceptibility to pentobarbital, ketamine and nitrous oxide, but not isoflurane. Acta Anaesthesiologica Scandinavica. 50 (5), 553-556 (2006).
- Pajoohesh-Ganji, A., Pal-Ghosh, S., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. K14 + Compound niches are present on the mouse cornea early after birth and expand after debridement wounds. Developmental Dynamics. 245 (2), 132-143 (2016).
- Boote, C., et al. Quantitative Assessment of Ultrastructure and Light Scatter in Mouse Corneal Debridement Wounds. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (6), 2786 (2012).
- Pal-Ghosh, S., et al. MMP9 cleavage of the β4 integrin ectodomain leads to recurrent epithelial erosions in mice. Journal of Cell Science. 124 (Pt 15), 2666-2675 (2011).
- Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Brown, M., Stepp, M. A. A mouse model for the study of recurrent corneal epithelial erosions: alpha9beta1 integrin implicated in progression of the disease. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (6), 1775-1788 (2004).
