Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

骨再生のための生体材料の生物学的互換性プロファイル

Published: November 16, 2018 doi: 10.3791/58077
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 1
1Department of Pharmacology and Toxicology, University of Vienna, 2Laboratory of Experimental Allergy, Division of Immunology, Allergy and Infectious Diseases, Department of Dermatology, Medical University of Vienna

Summary

大きな骨病変を修復するために設計された、新しいバイオマテリアルの数は骨の治癒を高め、骨移植に関連する合併症を克服することを目的と継続的に拡大しています。骨修復のためのバイオマテリアルの前臨床生体適合性テストのための学際的な戦略を紹介します。

Abstract

大きな非組合骨骨折は、整形外科で重要な課題です。自動車と同種骨移植は、このような病変を治癒に優れている、彼らの使用の潜在的な合併症があります。したがって、材料の科学者は、これらの問題を克服するために合成、生体適合性バイオマテリアルを開発しています。本研究では骨修復のためのバイオマテリアルの評価のための学際的なプラットフォームを提案する.我々 は骨の生物学と免疫学培養破骨細胞 (OC) と骨芽細胞 (OB) アッセイと骨修復、免疫原性、アレルゲン性のマウス モデル体内を含むプラットフォームを開発する専門知識を組み合わせます。実験を実行し、結果を要約、生体材料の生体適合性に関する報告方法を示します。特に、β-リン酸三カルシウム (β-TCP) リン酸ディスクのコンテキストで OB 生存・分化と鉱化作用と OC 生存分化をテストします。また、骨の治癒の初期段階に及ぼす影響を決定するための重要なサイズの頭蓋骨骨欠損マウス モデルにおける骨修復用臨床的に市販材料である β-TCP/コラーゲン (β-TCP/C) フォームをテストしました。並列実験マウスにおける免疫・ アレルギー反応を評価されます。我々 のアプローチは、骨の治癒と修復術に使用する生体材料の生体適合性を予測するために必要なパラメーターの範囲で骨生体材料の生物学的互換性のプロファイルを生成します。

Introduction

骨修復は血腫形成、炎症から始まる複雑なプロセス、カルスの形成と、1,2を改造します。ただし、潜在的な骨再生は骨破壊1,3のサイズに制限されます。例えば、大きな骨骨折外傷、癌や骨粗鬆症による癒すことができない、非組合骨折と呼ばれます。これらの骨病変は、健康な生理学的な骨の修復と再生を促進する治療を必要があります。現在、自家および同種骨移植は 220 万骨交換の手順と選択4のアプローチ毎年5。これらの手順は、高い成功率を持っている、しかし拒絶4ドナー サイト罹患率や感染骨の限られた可用性などの合併症がある可能性があります。骨再生のための新たな選択肢は、これらの課題に対処するために求められています。

天然または合成高分子、セラミックスや金属細胞と生体分子との組み合わせでのバイオマテリアルの設計は上昇6。生理学的骨治癒と生体材料のコンテキストで癒しの私達の現在の理解は機械的性質など複数の要因と循環と骨折部位7 から細胞を含む複数の局所的・全身的要因によって異なります ,8,9。骨再生のための生体材料は、10 osteogenicity、オッセオインテグレーションを促進することを目指して、理想的に生体適合性、生分解性多孔質 (栄養素、酸素、細胞遊走を促進) です。彼らはまた十分に痛みを和らげるために骨折部位をサポートする強力なする必要があります。さらに、炎症性因子は、癒しのプロセスを開始する必要があります。ただし、生体材料は、過剰な炎症やアレルギー反応を誘発する場合、これを制限または骨11,12の治癒を阻害します。したがって、学際的なアプローチは評価生体材料の骨修復のために開発されなければなりません。

本研究で提案する代表的な材料は、1) Orthovita Vitoss 第三リン酸カルシウムから成る市販海綿骨移植代用品である泡から成るナノサイズ純粋な β-リン酸三カルシウムの前臨床評価リン酸 (β-TCP) 粒子とタイプ 1 コラーゲン (C) (β-TCP/C フォーム) と 2) β TCP ディスク。ここでは、主骨芽細胞 (OB) を使用してこれらの生体材料の生体適合性のテストを示すし、破骨細胞 (OC) 試金、骨修復、T リンパ球増殖培養を含む免疫学的評価の体内モデルとサイトカイン産生と生体内での免疫原性とアレルゲン性、以前に報告された13。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

手順ケアと教育・科学・研究省オーストリアの実験動物の使用のすべてのガイドラインに従う BALB/c マウスで行われた、オーストリア文部省、科学の倫理委員会で承認されました。・研究。

1. プライマリ マウス OB 文化

  1. 新生児マウス頭蓋冠由来酵素消化を使用してから OB の分離
    1. 斬首で 1-2 日古い新生児子犬 (合計 60) を安楽死させるし、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) x 滅菌 1 ペトリ皿に頭を配置します。
    2. 滅菌はさみを使って皮膚をカットして、首の首筋で頭部を保持します。それをピアスで、calvarium を切開 (約 0.1-0.3 mm)、頭蓋底で頭の後ろに calvarium の下に挿入し、耳し abov 上の正面に後ろから横方向に頭蓋骨の縁に沿ってカットするはさみのペアで電子鼻橋 (図 1)。
    3. 滅菌フィルター分解酵素液 8 mL で切り裂かれた頭蓋骨を孵化させなさい (300 単位/mL コラゲナーゼ タイプ IV と 2.14 単位/ml 当期 II α 最小値必要な媒体 (α-MEM) に溶解) 200 揺れに揺れのインキュベーターで 10 分の 37 ° C で 50 mL の円錐管に最低。
    4. 最初の上澄みを廃棄し、消化液 8 mL を 3 回消化手順を繰り返します。各消化手順後セルを含む上清を収集し、50 mL の円錐管にそれを追加します。消化手順 (約 40 分) が完了するまでは、氷の水のお風呂にセルで 50 mL の円錐管を格納します。
    5. 4 ° C で 5 分間 300 x gで細胞を遠心分離機 (真空ポンプに接続するパスツール ピペット)、上清を吸引、1% と 10% 熱不活化ウシ胎児血清 (FBS)、α MEM を含む骨培 (BGM) 40 mL で再懸濁しますペニシリン-ストレプトマイシン液。4 組織培養プレート (10 cm) に細胞懸濁液 10 mL を加えます。
    6. 合流 (2-3 日間) まで 37 ° C および 5% の CO2の細胞を培養します。
    7. 合流、古い培地を吸引、1 × PBS (37 ° C) で一度組織培養皿を洗います。PBS を吸引し、1 x トリプシン溶液 0.5% エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) 各 10 cm 組織培養プレートに 2 mL を追加します。
    8. 5 分の CO2を 37 ° C、5% で 4 培養皿をインキュベートし、セルがプラスチックから切り離されるように倒立顕微鏡とプレートをチェックします。新鮮な BGM の 10 ml、50 mL の円錐管にすべての細胞懸濁液 (合計 8 mL) を転送します。5 ml の新鮮な BGM と同じ 50 mL のコニカル チューブへの転送の各プレートを洗います。
    9. 4 ° C で 5 分間 300 x gで細胞を遠心、上清を吸引、新鮮な BGM の 16 mL の細胞を再懸濁します。16 新しい 10 cm 組織培養 (分割 1:4) を含んでいる版 BGM の 9 mL を準備します。各プレートに細胞懸濁液の 1 mL を追加します。
    10. 1.1.6 の手順を繰り返します。1.1.8 を。
    11. 4 ° C で 5 分間 300 x gで細胞を遠心、上清を吸引、新鮮な BGM の 10 mL で再懸濁します。セルをカウントし、細胞濃度を計算します。
      注: この手順は、約 7.5 – 8.3 x 105セル/子犬を生成します。
    12. 4 ° C で 5 分間 300 × gで遠心、上清を吸引、凍結媒体含む 10% ジメチルスルホキシド (DMSO)、40% α-MEM と 50% で再懸濁します FBS。細胞懸濁液 1.5 mL を 2 mL バイアルあたり 2 x 10 の6セルの合計クリオバイアルに転送します。
    13. フラッシュは、液体窒素タンクで長期保存用液体窒素でバイアルを凍結します。1 年以内に完全な機能を確保するためのセルを使用します。増殖 (ステップ 1.2)、分化の評価にこれらのプライマリ OBs を使用 (ALP の試金: 手順 1.4。、1.5。) と生体材料の存在下で鉱化作用 (1.6 ステップします。)。共培養 (ステップ 2.3) で骨骨髄由来 OC 前駆体の成熟のためのこれらの細胞を使用します。
  2. OB 拡散の試金
    1. BGM コントロールの主な観測使用標準的な組織培養プレートを追加する前に 24 h の CO2を 37 ° C、5% で 24 ウェル懸濁培養プレートおよび生体材料のサンプルを懸濁液培養皿に 1 mL の 14 mm 径 β TCP ディスクをあらかじめインキュベートします。プラスチックに細胞接着を避けるため。
    2. 前培養液を吸引し、BGM でプライマリ マウス OBs を再懸濁します。24 ウェル培養プレート (1 mL/ウェル) に 4.4 × 104 OBs/cm2を前培養 β TCP ディスク 24 ウェル懸濁培養プレート、コントロール グループを追加します。OBs は、組織培養プレートや生体材料にアタッチされます。
    3. 37 ° C、5% CO2で 14 日間孵化させなさい。潜伏期間中に 2-3 日ごとに媒体を変更し、新鮮な BGM の 1 mL を各ウェルに追加します。
    4. OB 増殖を評価するために懸濁液の培養プレート上に成長した細胞からの信号を除外する新しい井戸に 7, 14 日に β TCP ディスクを転送します。
    5. 古い培地を吸引、BGM (37 ° C) の 0.5 mL を追加し、37 ° C、5% CO2で 30 分間培養皿を孵化させなさい。細胞増殖試薬 x 10 の 55 μ L を追加 (1:10 希釈) も文化に直接。空白セルを BGM の 0.5 mL と 10 倍の細胞増殖の試薬の 55 μ L を含む 3 つの井戸を準備します。37 ° C、5% CO2で 30 分のすべての版を孵化させなさい。
    6. 撤回し上澄みの 150 μ L を各ウェルから黒 96 ウェル プレートに転送し、560 nm 励起と 590 で発光蛍光を読み取る nm。サンプルの測定値から空白の測定値を減算します。
  3. OB の分化ならびに石灰化の試金
    1. BGM コントロールの観測使用標準的な組織培養プレートを追加する前に 24 h の CO2を 37 ° C、5% で 24 ウェル懸濁培養プレートとを避けるために生体試料の懸濁液の培養皿に 1 mL の 14 mm 径 β TCP ディスクをあらかじめインキュベートします。プラスチックに付着。
    2. 前培養液を吸引し、BGM でプライマリ マウス OBs を再懸濁します。24 ウェル培養プレート (1 mL/ウェル) に前培養 β TCP ディスクに 10 の4 OBs/cm2 x 8.8 24 ウェル懸濁培養プレート、コントロール グループを追加します。OBs は、組織培養プレートや生体サンプルにアタッチされます。
    3. BGM に置き換えて OBs の付加の後で BGM、50 μ G/ml アスコルビン酸および 5 mM の β-グリセロリン酸 24 h を含む骨無機培地 (ミリメートル) の 1 mL、37 ° C、5% CO2で 14 日間孵化させなさい。媒体の作りたての MM の 1 mL で 2-3 日を各ウェルに変更します。
  4. OB 分化セル lysates からアルカリ性ホスファターゼ (ALP) 活性評価
    1. MM の付加の後で 7 日、ALP 活性を測定するには、井戸から培養液を吸引、1 mL の滅菌 1 × PBS (37 ° C) で洗います。慎重に添付細胞培養プラスチックや生体材料に残り、-80 ° C でプレートを固定できるように PBS を吸引します。
    2. 24 h 後 (または最大 2 週間)、コントロール組織培養プレートと室温 (RT) OB の換散のため準備する生体材料懸濁液培養プレートを解凍します。生体材料のサンプル プレートに取り付けセルを除外する新しい懸濁液培養プレートに β TCP ディスクを転送します。両方のプレートに x のセル換散バッファー 1 ウェルあたり 75 μ L を追加します。400 揺れ/分でシェーカーの 5 分板を振る。
    3. 0.5 mL 遠心チューブにがれき撤去を RT で 6 分間 300 × gで遠心分離細胞ライセートを転送します。黒 96 ウェル プレートにサンプル細胞ライセート上澄みの 50 μ L を追加し、ALP バッファー (pH 10) ウェルあたり x 2 に溶解 200 μ M 6, 8-フッ素-メチルウンベリフェリルグリコシド酸 (DiFMUP) 蛍光基板から成るソリューションの 50 μ L を追加します。1 x セル換散バッファーと 2 x ALP バッファーの 1:1 の溶液 100 μ L を 2 つの空井戸を設定します。
    4. 6,8-difluoro-7-hydroxy-4-methylcoumarin (DiFMU) に至るまで 0.5 から 1:1 溶液 1 x セル換散バッファーと標準曲線を生成する 2 x ALP バッファーに溶解 200 μ M、100 μ L/ウェルつき 8 基準を準備します。
    5. 15 分の 37 ° C で黒のプレートをインキュベートし、358 nm 励起と 455 発光蛍光を読み取る nm。参照基準からブランク測定値とサンプルの測定値を減算します。
    6. 蛋白濃度の比色定量法を用いたタンパク質の総量にセル lysates から ALP 酵素活性を正常化します。準備のウシ血清アルブミン (BSA) 蛋白質基準 0.05 – 2.5 からの範囲で標準的な曲線を生成するためのセル換散バッファー x 1 μ g/μ L 解散。
    7. サンプル セル lysates と重複で BSA 蛋白質の標準を準備します。96 ウェル プレートに 5 μ L のサンプル細胞ライセートや標準 BSA 蛋白質の 5 μ L を追加し、試薬 A の 25 μ L を追加 ' と 2 つの空白の井戸を試薬 b セル換散バッファー x 1 の 5 μ L で 200 μ L。15 分間常温プレートをインキュベートし、吸光度 690 を読む nm。参照基準からブランク測定値とサンプルの測定値を減算します。
  5. OB 分化細胞培養で ALP の汚損によって評価
    1. コントロール組織培養プレートの懸濁液の培養プレートの生体材料 MM 添加後 7 日培養 OBs の ALP を染色します。
    2. 井戸から培養液を吸引し、0.5 mL の 1x PBS (37 ° C) で置き換えます。PBS を吸引し、1 分間常温 10% ホルマリン 0.5 mL にそれらをインキュベートしセルを修正します。
    3. 使い捨てのピペットを使い、10% ホルマリンを吸引し、0.5 mL の洗浄バッファー (1 × PBS では 0.05 %tween20) を追加します。
    4. 10 mL の純水と渦を完全に溶解するまでに 1 つの 5-bromo-4-chloro-3-indolyl リン酸/ニトロ ブルー テトラゾリウム (BCIP/NBT) 基板タブレットを溶解します。ソリューションは、光から保護されて、2 時間以内に使用する必要があります。
    5. 吸引洗浄バッファーと BCIP/NBT 基質溶液 0.5 mL に置き換えるとインキュベート 10 分吸引のため暗闇の中で常温プレート染色液、0.5 mL の洗浄バッファーで置き換えます。
    6. 新しい井戸にステンド グラス β TCP ディスクを転送し、レコード ALP 染色に従来のフラット ベッド スキャナーで ALP 染色プレートをスキャンします。
  6. アリザリン赤 S (ARS) との汚損によって評価 OB 鉱化作用
    1. MM の付加の後のプライマリの OBs 14 日を含む井戸から培養液を吸引洗浄した吸引で 1 × PBS の 0.5 mL で 2 回、PBS と 10 %0.5 mL が 10 分間常温ホルマリンをバッファーを追加してセルを修正します。
    2. 使い捨てのピペットを使い、10% ホルマリンを吸引し、純水の 0.5 mL で 2 回洗浄します。
    3. 固定 OBs 40 mM アルス染色液 (pH 4.2) の 0.25 mL 純水に溶解し、100 揺れ/分でシェーカー上で 10 分間常温プレートをインキュベートを追加します。
    4. 使い捨てのピペットを使い、染色液を吸引、1 mL の純水ですすいでください。不特定を削除するこの手順 5-10 回繰り返すの汚損。
      注: 洗浄ソリューションは、色なしする必要があります。
    5. 超純水水を吸引し、1 mL の冷 PBS を追加します。10 分 100 揺れ/分でシェーカーの RT でプレートを孵化させなさい。
    6. PBS を吸引、新しい井戸にステンド グラス β TCP ディスクを転送およびレコード鉱化作用するフラットベッドスキャナーでプレートをスキャンします。
    7. 10% セチルピリジ ニウム塩化物溶液 0.25 mL を追加し、アルス色素を抽出する 100 揺れ/分でシェーカーで 15 分間室温でプレートを孵化させなさい。
    8. 1.5 mL チューブ、室温 5 分 17,000 × gで遠心培養上清を転送します。
    9. 1:10-1:20 の希釈倍率で抽出物を 10% セチルピリジ ニウム塩化物溶液と塩化セチルピリジ ニウムだけ 10% を含む 2 つの空白の井戸を含む 96 ウェル プレートにサンプル (300 μ L) を追加します。
    10. 7 アルス基準標準曲線を生成する 40 mM アルス染色液 (pH 4.2) 10% セチルピリジ ニウム塩化物溶液を希釈することによって、4 から 400 μ M に至るまでを準備します。
    11. 96 ウェル プレートに重複参照標準 300 μ L を追加します。
    12. ブランク、試料の吸光度を読み取り、520 で基準を参照 nm。
    13. 参照基準からブランク測定値とサンプルの測定値を減算します。

2. マウス OB OC 共培養成熟した OCs を派生させる

  1. 準備とウシ皮質骨スライスの滅菌
    1. 周囲の組織から骨のセグメントをきれいにし、海綿骨と骨髄を削除します。
    2. 24 h 50 ° C で骨を乾燥させます。
    3. 小さな塊に骨をスライスし、スライス (約 300-350 μ m 厚) にカット ダイヤモンドの刃で見た低速を使用して。
    4. 二次ディスク (1 cm2) に 300-350 μ m のスライスをカットします。
    5. 骨ディスク (1 cm2) をきれいにロック可能なガラスの瓶と蒸留水でいっぱいに入れます。超音波風呂に満たされたガラスの瓶を転送し、5 分は、この手順を繰り返します 3 回の超音波を照射します。
    6. 蒸留水を注ぐ、70% エタノールを追加し、5 分間超音波。
    7. 70% エタノールを注ぎ、100% エタノールに置き換えます。
      注: は、4 週間、4 ° C、100% エタノールで骨スライスを保存します。
    8. 生殖不能の条件の下でそれぞれの側に 15 分間の紫外線と骨スライスを照射します。常温無菌培養プレートにさらに使用するまで滅菌骨スライスを格納します。
  2. 骨髄 OC 前駆物質の分離
    1. 200 mg/kg 24 mg/kg とケタミン ・ キシラジンのソリューションの腹腔注入による素朴な 8-12 週齢 BALB/c マウスを安楽死させます。
    2. マウスの大腿骨および脛骨の骨髄 OC 前駆体を分離します。
    3. 股関節で体に最も近いポイントから滅菌ハサミ脚を外し、膝と足首の関節で手足を切断、滅菌メスと鉗子軟部組織。骨端を切った。洗い流すし、1 mL の注射器に付いている 27 G 針を使用して細胞懸濁液を取得する 6 cm 滅菌シャーレに 1 mL の BGM で骨髄を中断します。
    4. 6 cm シャーレの BGM と同じ 50 mL の円錐管に伝達 5 ml を洗い、50 mL のコニカル チューブに細胞懸濁液を追加します。4 ° C で 350 x gで 5 分間遠心する BGM、1 nM 1,25-(OH)2を含む OC 分化培地 (DM) で細胞を再懸濁します-ビタミン D3 と 1 μ M プロスタグランジン E2 (1 mL/よく)。
      注: 1 つ BALB/c マウス 1 つ 24 ウェル培養プレートの OC 前駆体の十分な数を提供します。
  3. 生体マウス OB OC 共培養の準備
    1. セルを追加する前に、β TCP ディスク径は 14 mm や牛骨スライス (1 cm2) 1 mL に BGM の 24 h の CO2を 37 ° C、5% で 24 ウェル懸濁培養プレートで事前孵化させなさい。
      注: 牛骨スライスは、生理学的基質制御グループを生体材料の存在下での OC の分化を研究するため。
    2. 8.8 × 104セル/cm2プライマリ OBs 生体材料や制御骨 24 ウェル懸濁培養プレートまたは 24 ウェル培養プレートに上に BGM の停止を追加します。37 ° C と 5% CO2 24 時間で孵化させなさい。
      注記: OBs をプラスチックや生体材料や牛の骨に接続します。
    3. 24 h の骨髄 OC 前駆体主の OBs と 37 ° C、5% CO2で文化 5 日間培養分離された新鮮なを追加します。毎日作りたての OC DM で媒体を置き換えます。その後、酒石酸耐性酸フォスファターゼ (TRAP) OC 分化を評価するための OCs を染色します。
  4. OC 分化トラップの汚損によって評価
    1. 2.3.3, ステップから取得された、成熟した多核巨細胞の OCs を特徴付けるコントロール組織培養プレートと生体材料懸濁液培養プレートから培養液を吸引し、1 mL の 1x PBS (37 ° C) を追加します。PBS を吸引し、10 分間常温 10% ホルマリン溶液 1 mL にそれらをインキュベートしセルを修正します。
    2. 使い捨てのピペットを使い、10% ホルマリンを吸引 1 mL の 1x PBS で追加した繰り返しこの手順 3 回、PBS を吸引、1 mL のトラップ バッファー (pH 5) に置き換え、37 ° C、30 分で版を孵化させなさい。
    3. トラップ バッファーを吸引し、1:1 のアセトンと 100% エタノール 1 mL を追加します。30 秒すぐに使い捨てのピペットで吸引アセトン エタノール ソリューションと室温プレートを完全に乾燥、RT でプレートを孵化させなさい
    4. 染色液トラップ、準備 10 mg/mL ナフトール AS MX リン酸 N, N-ジメチルホルムアミド、ディゾルブ 0.6 mg/mL 速い赤紫のトラップ バッファーで塩し、ナフトール AS MX リン酸原液 0.1 mL を加える速い赤紫塩の 10 mL の原液トラップ バッファー。
    5. トラップ染色液 1 mL を加えると 10 分の 37 ° C でプレートをインキュベートし、染色液、トラップを吸引し、反作用を停止する超純水の 1 つの mL を追加します。
    6. 新しい井戸に染色後 β TCP ディスクと牛骨のスライスを転送観察光学顕微鏡を使用して赤いステンド グラス OCs (倍率: 10 X) およびトラップ + 3 以上の核の成熟した OCs を列挙します。

3. 重要な大きさのマウス頭蓋骨欠損モデル

  1. ブプレノルフィン 0.1 mg/kg を皮下注射 (皮下) 麻酔のための 8 週間の古い BALB/c マウスに。
  2. 100 mg/kg ケタミン 5 mg/kg とキシラジン i. p. の混合物を持つマウスを麻酔、湿潤を保つため、低体温症を防ぐために全体の手順中に 37 ° C で加熱プレートにマウスの目にゲルや軟膏を追加します。足と尾のピンチによって麻酔深度を評価します。
  3. 耳の間の頭の上に毛を剃るし、7.5% ポピドン ヨード ソリューションと 70% エタノールで表面をきれいにします。
  4. 滅菌メス、calvarium を公開し、それをメスで削って右頭頂骨の上の頭蓋骨膜結合組織を削除すると耳の間の頭蓋骨の上に正中矢状切開を確認します。
  5. ワンランク上の右頭頂骨、ectocortex といくつかの endocortex をカットして生理食塩水を一定の灌漑下滅菌歯科トレフィンの直径 4 mm (2000 rpm) を用いた右頭頂骨の重要なサイズの欠陥を作成します。
  6. 硬膜への損傷を防ぐため、残りの endocortex を突破、慎重に頭蓋骨の骨を持ち上げて、ピンセットでそれを削除する小さな骨膜エレベーターを使用します。結果の欠陥は、円形、直径約 3.5 mm にする必要があります。
  7. 漬けで頭蓋骨の欠損を埋める (常温無菌 1 × PBS) 鉗子を用いた β-TCP/C 泡。
  8. 空欠陥を有する年齢をマッチさせた、偽否定的なコントロールの適切な数を準備します。
  9. 生体材料を場所において、2 つの反対ポイントで欠陥の端に組織接着剤の 0.5 μ L を入れてください。
  10. 非吸収性縫合糸で皮膚を閉じます。
  11. 麻酔下のマウスの次の手術を実行する前に無菌状態を維持するために冷滅菌剤ですべての手術器具をきれいに。
  12. 手術後の治療のためには、手術の回復期間中に適切な監視地区 37 ° C で乾燥した清潔な暖房プレートに動物を配置します。彼らが目を覚ますまで、呼吸数、体温、粘膜と 10 分毎の目の色を監視します。
  13. 食品と水の完全復旧まで他の動物から分離でケージに運営意識下マウスを転送します。ブプレノルフィン 0.1 mg/kg を注入 72 h リターンの一日二回の手術後の鎮痛療法のサウスカロライナが檻にマウスを完全に回復します。
  14. 生体材料の有効性を判断するには、200 mg/kg 24 mg/kg とケタミン ・ キシラジンの溶液でマウス i. p. を安楽死させます。
  15. 8-12 週間後移植で鋭いハサミで euthanized マウスの首をはねます。
  16. 修正 4.5% の 30 mL で首のないマウスの頭は、ホルマリン固定組織に完全に浸透を保証する 1-2 週間をバッファリングします。
  17. 1 年間、70% のエタノールの長期的なストレージ 4 ° C でに頭を転送します。
  18. 使用マイクロ ct によりまたは骨再生を評価する標準化された頭骨病理組織学的手法で計算されました。:Microct の高解像度で死後のサンプルのスキャンを使用することが可能だ (90 kV、4 分) 2 D および 3 D 矢状および前頭平面で。
  19. 頭骨の組織学のためエタノールの等級を昇順でヘッドを退避し、メタクリル酸メチル グリコールに埋め込みます。
  20. ダイヤモンド見たグリコール メタクリル酸メチルに埋め込まれたブロックをカットし、約 80-100 μ m の厚さにセクションを挽きます。
  21. 新しい骨形成14を識別する Levai Laczko 染色骨標本を評価します。

4.体外免疫応答

  1. 素朴な 8 週間の古い BALB/c マウス i. p. 200 mg/kg 24 mg/kg とケタミン ・ キシラジンのソリューションを安楽死させます。
  2. 右側にマウスを置き、左側に毛を剃る、70% エタノールで腹部の左側にある上、肌をきれい。
  3. 次滅菌はさみを使用して胃の上肋骨の後方左側にマウスの皮膚で長さ 10 mm、1 mm 深く切開を行います。
  4. 皮膚を開くし、腹膜を公開します。長いと 1 mm の深い無菌条件下ではさみを使って腹膜切開未満 10 mm を作る。
  5. 脾臓を公開する近位胃を押してください。
  6. 滅菌ピンセットで脾臓を優しく保持し、組織とそれ以下に添付の血管を切断することによって削除します。
  7. 10 ml 滅菌 PBS x 冷 1 の 50 mL チューブにそのまま脾臓を配置します。
  8. 2 滅菌鉗子または 2 滅菌ガラス スライドを使用して脾臓をミンチして単一細胞懸濁液を準備します。
  9. 破片を削除するには、1 mL シリンジのプランジャーを使用して冷 1x PBS で滅菌 40 μ m の細胞のストレーナー通過します。
  10. 50 mL の円錐管に 4 ° C で 10 分の 300 x gで単一細胞懸濁液を遠心分離、吸引、上澄みを廃棄します。その後、赤血球 (RBC) 換散バッファーの 5 mL の細胞ペレットを再懸濁します。
  11. RT で 14 分の細胞懸濁液をインキュベートし、ロズウェル パーク記念研究所 (RPMI) 媒体の 45 mL の追加によって反作用を停止します。
  12. 4 ° C で 10 分間 300 x gでセル換散後セルを遠心し、上澄みを廃棄します。
  13. RPMI 培 10% の脾細胞を再懸濁します熱非動化政府短期証券、1% ペニシリン ストレプトマイシン溶液、0.1% ゲンタマイシン、0.2% β-メルカプトエタノール、および 1% 非必須アミノ酸。
  14. あらかじめ細胞播種する前に 37 ° C、5% CO2で 24 h RPMI 培地を含む 96 ウェル無菌培養プレート内で β TCP/C の泡を孵化させなさい。
  15. 例えば滴定された番号で脾細胞を追加。 1.25 × 10、5、2.5 x 105と 5 x 10 の5RPMI 培地・添加物、前培養 β TCP/C 発泡の有無を含む 96-well ティッシュの培養皿の井戸に/well。
  16. 追加 10 μ G/ml コンカナバリン a (Con A) 適切な井戸を 100 μ L/ウェルの合計のための媒体に溶解し、37 ° C、5% CO2 72 h で孵化させなさい。
  17. ブロモデオキシウリジン (BrdU) アッセイと細胞増殖を測定します。細胞培養の 48 h で BrdU 標識溶液 10 μ L/ウェルを追加し、さらに 24 時間プレートをインキュベーションしています。
  18. 72 h で、上清を収集し、さらに使用するまで-20 ° C で保存します。
  19. 各ウェルに固定溶液 200 μ L/ウェルを追加し、固定の解決した吸引で 30 分間インキュベートします。抗 BrdU 抗体作業ソリューションの 100 μ L/ウェルを追加し、90 分間インキュベートします。
  20. 抗体溶液を吸引、すすぎ 3 回で 200-300 μ L/ウェル洗浄ソリューションの井戸洗浄ソリューションを削除します。
  21. 基質溶液 100 μ L を追加し、RT で 3-10 分の間孵化させなさい、450 で吸光度を測定 nm。
  22. インターロイキン 1 β (il-1)、インターロイキン 2 (IL-2)、インターロイキン 4 (IL-4) とインターフェロン γ (IFN-γ) を標準的な ELISA を使用して収集した上清中に測定します。

5. 高スループット腹腔内モデル

  1. 100 mg/kg ケタミン 5 mg/kg とキシラジン i. p. の混合物と女性の 6 ~ 8 週間古い BALB/c マウスを麻酔し、ゲルまたは軟膏を湿潤を保つため、低体温症を防ぐために全体の手順中に 37 ° C で加熱板の上にマウスを置くと目に追加します。足と尾のピンチによって麻酔深度を評価します。
  2. 腹部の毛を剃るし、7.5% ポピドン ヨード ソリューションと 70% エタノールできれい。
  3. 白線に沿って皮膚切開 8 mm 長い正中線を作るアルバ。メスを用いた腹膜に小さな切開を行います。
  4. 場所滅菌 PBS は腹腔内に β TCP/-c フォーム移植 (2 mm3x 2 x 2) を浸したまたは偽の年齢をマッチさせたコントロール マウスのための材料を追加なし。
  5. 腹膜の縫合、それぞれの吸収性と非吸収性縫合糸で皮膚します。
  6. 麻酔下のマウスの次の手術を実行する前に無菌状態を維持するために冷滅菌剤ですべての手術器具をきれいに。
  7. 手術後の治療のためには、手術の回復期間中に適切な監視地区 37 ° C で乾燥した清潔な暖房プレートに動物を配置します。彼らが目を覚ますまで、呼吸数、体温、粘膜と 10 分毎の目の色を監視します。
  8. 食品と水の完全復旧まで他の動物から分離でケージに運営意識下マウスを転送します。完全に回復したマウスをケージに戻ります。
    注: この手順は、最小限の痛みを誘発します。手術後の鎮痛療法は通常必要ありません。運営ブプレノルフィン 0.1 mg/kg を注入動物は痛みの兆候を示す場合皮下または別の適切な鎮痛薬の痛みを軽減します。
  9. マウス 7 日後注入、200 mg/kg 24 mg/kg とケタミン キシラジン i. p. の解決を安楽死させる
  10. 7 日後注入、洗浄液 1 mL を用いた腹膜キャビティ マウスの頭を押しと、左下腹部腹部に針を挿入、3 mL の冷 PBS の合計のための 25 G 針と注射器、近位を目指しています。
    注: 腹腔液は赤血球の無料する必要があります。
  11. 4 ° C で 5 分間 300 x gで腹腔洗浄液を遠心分離し、il-1、IL-2 と il-4 によるサイトカインの ELISA の測定のための-20 ° C で保存する腹水を収集します。
  12. 上清を吸引、1 mL の PBS で細胞ペレットを再懸濁します、トリパン ブルー色素を用いた診断腹腔細胞をカウントします。
  13. 収集スライド ガラスに 5 x 10 の5セルの細胞懸濁液を乾燥させると差動細胞数のスライドを許可します。
  14. 光学顕微鏡を使用すると、合計で 300 のセルの最小値をカウントし、マクロファージ、好酸球、好中球とリンパ球との間を区別するため。

6. 亜慢性皮下モデル

  1. 100 mg/kg ケタミン 5 mg/kg とキシラジン i. p. の混合物と女性 6-8 週古い BALB/c マウスを麻酔、湿潤を保つため、低体温症を防ぐために全体の手順中に 37 ° C で加熱プレートにマウスの目にゲルや軟膏を追加します。足と尾のピンチによって麻酔深度を評価します。
  2. その裏にマウスを置くと、腹部の毛を剃るし、7.5% ポピドン ヨード ソリューションと 70% エタノールで剃毛の表面をきれいに。
  3. 8 mm 正中切開する白線に沿って皮膚をメスと、インプラントの PBS を使用して腹部のアルバは皮膚の下生体材料 (2 mm3x 2 x 2) を浸したまたは偽の年齢をマッチさせたコントロール マウスのための材料を追加しません。
  4. 非吸収性縫合糸で皮膚を縫合します。
  5. 麻酔下のマウスの次の手術を実行する前に無菌状態を維持するために冷滅菌剤ですべての手術器具をきれいに。
  6. 手術後の治療のためには、手術の回復期間中に適切な監視地区 37 ° C で乾燥した清潔な暖房プレートに動物を配置します。彼らが目を覚ますまで、呼吸数、体温、粘膜と 10 分毎の目の色を監視します。
  7. 食品と水の完全復旧まで他の動物から分離でケージに運営意識下マウスを転送します。完全に回復したマウスをケージに戻ります。
    注: この手順は、最小限の痛みを誘発します。手術後の鎮痛療法は通常必要ありません。運営ブプレノルフィン 0.1 mg/kg を注入動物は痛みの兆候を示す場合皮下または別の適切な鎮痛剤。
  8. 注入のサイトを確認する準備ができたら、200 mg/kg 24 mg/kg とケタミン ・ キシラジンの溶液でマウス i. p. を安楽死させます。
  9. 8 週間後注入、周囲組織 (1 cm2) と移植部位を切除します。
  10. 一晩 4.5% ホルマリン溶液中組織を修正、パラフィンに埋め込む、4 μ m のセクションにカットします。
  11. 炎症またはマッソンのコラーゲン沈着および線維症のヒアリン ヘマトキシリンとエオシン (H & E) と 4 つの μ m パラフィン埋め込まれたティッシュ セクションを染色します。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Β-TCP 骨修復における生体材料としての有効性の評価、体外と体内のスクリーニング方法を使用しました。まず、OB 中単独でコントロール対応ベースラインと比較して β TCP ディスク レスポンスを測定しました。図 2は、文化の 7, 14 日目に β TCP ディスクに対して OB 生存率を示しています。代謝活性の高い細胞文化井戸から測定セル実行可能性は、組織培養プラスチック中、この生体材料は強化でも、OB の増殖を抑制することでもないことを示す β TCP ディスクとともに OBs の同じだった。

OBs をさらに評価するには、定性的、定量的アプローチを使用して分化のマーカーと ALP 活性を測定しました。図 2は、文化の 7 日後文化井戸 ALP 酵素活性を示します。媒体は一人で井戸の海底地震計は、最適な無機培地 (ミリメートル) OBs いた強烈な ALP 染色、OB 分化の高レベルを反映してベースライン ALP 活性を持っていた。対照的に、OBs は MM で孵化 OBs より区別される β TCP ディスクにメッキ。定量法で ALP 濃度 ALP 濃度 MM コントロールに比べて β TCP ディスク上で培養した細胞のより低い 40% であったに対し、ベースライン培と比較して MM を含む井戸の高い 77% であった。これらの結果を示す MM とプラスチックの最適条件とのそれらよりより少なく区別される β TCP ディスク上に成長した細胞が、彼らは生体材料に十分に区別されます。

OBs のもう一つの重要な機能は、骨の治癒に重要なステップである鉱化作用を誘発する能力です。我々 は 14 日後アルス OB 細胞を染色し、わかったその鉱化作用を MM コントロール単独でおよび文化井戸 (図 2) に β TCP ディスク培地中で培養 OBs と比較して高かった。アルス濃度を測定した、MM コントロールした β TCP グループより高い 45% 以上が判明しました。これらのデータは、区別するため、およびそれらの媒体と β-TCP ディスクより石化存在下で成熟した MM プラスチック上で培養したその OBs を示しています。

OCs が β TCP ディスクに応答する方法を確認するのには、OBs が共同培養骨髄 OC 前駆体 OC 形態の検討が続くと養殖技術を使用しました。OB OC 共培養 5 日目の観察・ OC DM とプラスチック上に成長した細胞と骨スライスと β TCP 上に成長した細胞とは異なっていました。プラスチック、OCs が大規模かつ広範な生理基板上に OCs より小さくより少なく-広がる、不規則な形 (図 3) に対し。OCs を量的にはトラップ + OCs を列挙し、あることがわかった β tcp (1755 ± 21.41/cm2) 培養コントロール (1140 ± 割合 15.71/cm2) と骨スライス (709 ± 59.69/cm2) と比較して, 高い数値を示唆強化された OC 分化 β TCP ディスク (図 3)。

決定するため、市販の β-TCP/C 発泡体内マウスの重要なサイズの頭蓋骨欠損モデルを使用しました。グリコール メタクリル酸メチルを埋め込むと染色 Levai Laczko 頭骨病理組織学的手法によって処理される代表的な標本を紹介します。:Microct と組織学は、欠陥領域内で新しい骨形成の評価使用可能性があります。ここでは、図 4に組織学的セクションの例を紹介します。手術による骨の欠損は、空 (偽の) を残っていた、我々 は全体の欠陥を覆う薄い層を観察したが、作成した骨折の重要なサイズを確認する 12 週間ポスト操作に重要な骨形成がなかった。対照的に、欠陥には、β-TCP/C 泡が含まれている場合、いくつかの血管や炎症細胞の骨形成の証拠がない欠陥箇所を埋めるなど緻密な繊維組織に囲まれた β-TCP/C 泡残骸があった。

外国ボディ応答を評価するための in vitroアッセイを用いた生体材料、免疫・ アレルギー反応を評価しました。図 5を示して素朴なsplenocytes 培養培地だけで、β TCP/C 泡とき、ナイーブ脾臓細胞応答しなかったこと増殖や IL-2 の生産によって、il-4, IFN-γ サイトカイン。対照的に、ConA の文化、細胞増殖およびサイトカイン il-1 β を除いて増加を含みます。細胞の反応が影響を受けない場合の共培養 ConA と ConA 単独で β-TCP/C 泡を示すと比較して β-TCP/C 泡のどちらも増加も減少の in vitro反応。

Β-TCP/C 泡が生体内での免疫応答を誘発かどうかを確認するのに留置した 1) 腹腔内や腹腔洗浄液と 2) 皮下炎症細胞数およびサイトカイン濃度を測定し、評価炎症と線維化移植部位の組織切片。テーブル 1、腹腔洗浄液で差分のセルは、炎症細胞の総数は偽のコントロールと比較して β-TCP/C 発泡注入マウスで有意に高値を明らかにします。さらに、すべてのセル型の数の増加があった。図 6Aに偽のコントロールと比較して β-TCP/C 泡の il-1、IL-2 と il-4 によるサイトカインの高い濃度があります。Β-TCP/C 泡皮下移植マウスにおける H & E 染色のセクション (図 6 b) と 8 週目で (図 6) のセクションを染色、マッソンの Trichrome の線維化の証拠に巨細胞異物と炎症反応を見ました。対照的に、偽のコントロールの注入のサイトは、最小限の炎症と線維化がありません (図 6) を持っていた。

Figure 1
図 1: プライマリ OB 細胞分離ダイアグラムの頭蓋骨除去します。曲線はさみを使用して 4 カット (赤点線) と calvarium を削除する方法を示しています。最初のカットは X を X1 から右 (R) 目のソケットに対して垂直 2、および 2 番目は X に X3 から左 (L) 目のソケットに対して垂直 4。3 番目のカットは、X に X4 から前面に calvarium を分離する 2 と 4 番目のカットは、X3 から X に背面を分離する 1。Calvarium は自由に削除します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 2
図 2: β TCP による体外OB 分化と成熟します。OB の生存率および 7 と 14 日中だけで (バー) や β-TCP (白棒) の培養細胞での増殖 (平均 ± SEM; n = 3)。セル lysates と蛋白含量に正規化の ALP 活性定量化 (μ M DIFMU/μ g 蛋白質、平均 ± SEM は、n = 3) 7 日目から ALP 染色文化井戸を示す代表的なイメージで。アルスの濃度として示されているセチルピリジ ニウム塩化物抽出法による定量化アルス染色文化から鉱化作用 (μ M アルス、平均 ± SEM は、n = 3) 14 日アルス染色文化の代表的な井戸で。グループは、骨成長媒体だけで (BGM);無機培地 (MM);Β TCP。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 3
図 3:体外に β TCP による OC 分化します。代表的な顕微鏡写真は、マウス OBs と骨髄 OC 前駆細胞を共培養後 5 日目でトラップ + 多国籍企業を示しています。エンドポイント解析トラップ + 多核巨細胞の細胞 (多国籍企業) は cm2あたりトラップ + 多国籍企業 (3 核) の絶対数を示します (± SEM を意味する n = 3) * * *p < 0.001。グループに含める OC 分化培地だけで (DM);骨;Β TCP。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 4
図 4: 重要なサイズの頭蓋骨欠損モデルにおける移植の β-TCP/C 泡骨のIn vivo評価します。8 週間の古い女性 BALB/c で作成した非治癒頭蓋骨欠損 (n = 3) 4 mm 歯科トレフィンを用いたマウス。治療は含まれて偽のコントロール (空の欠陥) をグループ化し、β TCP/C 泡で扱われる欠陥します。12 週間後注入法で作製した代表的な標本。ホルマリン固定組織リコール メタクリル酸メチル埋め込まれたセクション (80-100 μ m) は、Levai Laczko 染料で染色。顕微鏡写真低 (左) と (右) 高倍率で表示されます。黒の三角形は、骨欠損を示します。ブラック * 骨と白を示します * β-TCP/C 泡を指します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 5
図 5: β-TCP/C 泡による体外細胞増殖とサイトカイン生産。培養中の β-TCP/C 泡や ConA で単独で素朴な BALB/c マウスの脾細胞。培養上清中の細胞増殖 (BrdU) と il-1、IL-2 の生産、il-4, IFN-γ (ConA、β TCP/-c フォーム β TCP/C 泡 ○ ○ ConA 中だけ ● □)。増殖結果 BrdU アッセイの帳票サンプル (外径 ± SEM) の意味と重複するサンプル (pg/mL ± SEM) 2 つの独立した実験からサイトカイン濃度の平均値として提示します。p < 0.05 である対媒体と生体材料と ConA 対 ConA 生体にとって重要なだけで。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 6
図 6: 急速な高スループット i. p. と亜慢性マウス モデルの移植の β-TCP/C 泡骨免疫In vivo 。(A) 女性 BALB/c マウス β TCP/C 泡で i. p. を注入または追加材料 (偽の) なし。7 日後、腹膜の洗浄はサイトカイン濃度 (サイトカイン濃度 pg/mL ± SEM の意味を提示されたデータ) を分析しました。これらのデータは、2 つの独立した実験の代表者 (n = 5)。p < 0.05 は偽に比べて重要視。(B ・ C)女性の BALB/c マウス (n = 5) β-TCP/C 泡皮下注入または追加材料 (偽の) なし。注入後 8 週は、それぞれ炎症や線維化を評価するには、H & E (B)、マッソンのヒアリン (C) で染色着床から肌します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

シャム Vitoss
細胞カウント x 106 (合計セルの %)
マクロファージ 1.240 ± 0.051 (88.1) 3.262 ± 0.380 (70.4) p < 0.001
好酸球 0.120 ± 0.011 (8.5) 1.181 ± 0.254 (25.5) p < 0.01
好中球 0.002 ± 0.001 (0.2) 0.029 ± 0.011 (0.6) ns
リンパ球 0.048 ± 0.020 (3.2) 0.148 ± 0.041 (3.5) ns
総セル数 1.410 ± 0.066 4.620 ± 0.452 p < 0.001

表 1:生体内でβ TCP/C 泡骨の免疫応答が急速な高スループット i. p. マウス モデルにおける移植します。女性 BALB/c マウスが注入された i. p. β-TCP/C 泡または材料 (偽の) なし。7 日後、腹膜灌流は, 炎症細胞数の分析および差動細胞数 (セル数 ± SEM の意味を提示されたデータ)。これらのデータは、2 つの独立した実験の代表者 (n = 5)。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

骨の再生と修復のために開発された代表的な生体材料の生体適合性の前臨床評価のための学際的なアプローチを紹介します。我々 は OCs、海底地震計の応答をテストし、重要な骨欠損内に生体の治癒反応モデル マウスと同様、 in vitroとin vivo免疫応答。法データと生体材料学から派生した結論の要約の作業を示すを目指しました。当社の戦略が骨生体材料の生体適合性の貴重なプロファイルを生成することを示す.

一次電池の試金は、OB、OC 機能の評価に使用されました。OBs は、骨形成と生理学的修復します。実行可能なまま、差別化し、石灰化を誘導する必要があります。本研究では、石化する能力を持つ生理的分化細胞のマーカーとしてアルス、ALP、セル実行可能性の試金を実行する方法を示します。ベースラインを提供するだけで、培地と分化と OBs のプラスチックに無機化に最適化された骨の鉱化作用媒体 (MM)、アッセイするためのコントロールが含まれています。後者のコントロール グループは、生体材料の標準的な参照をしました。OC の評価、我々 は共同 OBs と OC 前駆細胞、骨髄由来培養トラップ、OCs体外15を識別するために広く使用され、列挙された破骨細胞酵素染色多核巨細胞の細胞へ前駆物質と分化光顕微鏡を用いた細胞。これらの試金は芸術の状態、変更を必要としません。しかし、我々 は石化する隔離されたプライマリ OBs の品質に関連して制限を指摘しました。保存された海底地震計は、液体窒素で格納され、最適な結果を得るのため 1 年以内に使用します。

OB の添付ファイルと活性高かったテスト β TCP ディスクよりも組織培養プラスチックに。OCs を評価した、ある生理学的基質16骨とプラスチックへの応答の目的の相違を見ました。比較では、骨と β-TCP と同様の形態学的変化を誘導しました。Β TCP ディスクへの応答で OCs のトラップ アッセイ列挙を示した数字が骨と β-TCP と大幅に異なる。Β TCP は、骨より高い OC 分化を誘導されます。トラップは、OC 分化確立されたアッセイです。この方法では必要大幅な変更はありません。しかし、最良の結果を得るためには、あまりにも長い間、細胞を孵化することが肝要だや単球由来のすべての細胞になる TRAP 陽性。

生体内の反応に対処するため、β TCP、コラーゲンおよび生体外の試金で使用された、13を治癒を促進するが含まれているために模範的な生体材料として β-TCP/C 泡を使用しました。Β-TCP/C 泡は商業的に骨修理17,18に臨床的に使用されるが、研究、例えばは興味深いだろう材料の多くの異なる種類の 1 つだけです、二相性リン酸カルシウム (。どのように生物学的応答を決定するこれらのアッセイのハイドロキシアパ タイト/β-TCP) 同様に脱人間の骨は、材料によって異なります。生体の応答我々 は重要なサイズの頭蓋骨骨欠損マウスにおける β-TCP/C 泡を注入した、12 週間後に組織を評価し、偽のコントロールと比較して差が認められました。また、無料情報19を提供する:microct し、その応答を評価することが可能です。偽コントロール マウスに欠陥がなかった重要な骨形成、予想通り、β TCP/C 泡誘発炎症反応や線維化、血管新生、骨の形成の初期の段階の証拠であるに対し。このメソッドは、以前ゼウス20で実証されています。しかし、我々 のアプローチは、我々、トレフィンで硬膜を傷つけるリスクを軽減する骨膜エレベーターのある変更された「エレベーター」手法で使用されて異なっていた。我々 は硬膜は骨形成系細胞や骨の要因3,21,22,23生産によって頭蓋骨欠損の治癒過程で重要な役割を果たしていることを推論します。特に、注入、材料欠陥と欠陥を作成するためのメソッドのサイズ頭蓋骨欠損の骨再生に影響します。手順で別の変更は定期的に閉創時に臨床的に使用される生体組織接着剤で頭蓋骨欠損部に生体材料の安定化に関与。この変更には、治癒過程に欠陥箇所の材料が転置されないことが保証されています。

炎症が骨の治癒の初期段階を調節するが、修理11を減らすことができますあまりにも多くの炎症やアレルギー反応。生体に理想的な免疫応答は、骨形成を促進する炎症カスケードを開始することです。ただし、特定の生体異物応答線維症またはアレルギー感作を引き起こす炎症性信号の配列につながるがあります。私たちの研究で我々 β TCP/C 泡に免疫応答を評価しナイーブ脾臓細胞への毒性はなかったが見つかりました T リンパ球拡大の妨げもなかったとき (サイトカイン分泌) を機能 ConA のカルチャに追加されます。腹腔内の実験では、β TCP/C 泡による炎症と Th1 および Th2 型サイトカインの付随の増加と好酸球とマクロファージの増加のいくつかの証拠があった。皮下移植実験では β-TCP/C 泡も誘発炎症が慢性的、破壊的な炎症やアレルギー反応する β-TCP/C 泡は生体親和性を示唆している証拠はないです。これらのモデルは、生体に対する免疫応答に関する情報を提供します。まず、体外モデルは、生体材料の生体材料による幼若化能の抑制がないこと証拠を提供するマイトジェン存在下で素朴な免疫細胞に及ぼす影響を対処します。第二に、腹腔内のモデルは、例えば、免疫応答の種類の断食 7 日読み出しを提供します。 アレルギーや炎症炎症性細胞の浸潤とサイトカイン プロファイルの種類によって観測されました。第三に、皮下、亜慢性モデルが慢性的な炎症、線維化、抗体価の評価は、免疫記憶の応答を繰り返し注入をテストするために長い期間にわたって組織の応答を示しています。これらのモデルは、以前公開されているし、任意の変更13なしここで挙げています。これらのモデルの適切な正と負のコントロールがあることが重要です。各メソッドの制限を回避する 3 つすべてのモデルを実行することをお勧めします。示されているモデルは、免疫学の他の領域に確立、生体材料をテストするためのアプローチは最近です。

要約すると、骨と免疫アッセイは、生体材料の生物互換性プロファイルを提供します。骨、OB、OC のレスポンス生体材料は、複雑で高価な動物実験を実行する前に、3 r 原則を遵守するに必要な予備的なデータを提供します。免疫の in vitroアッセイは、交差反応性抗原と細胞毒性は、またさらに動物実験を妨げることがありますデータを提供します。炎症の結果を提供する急速な高スループット実験とサイトカイン応答 (e.g、T リンパ球応答の種類)、亜慢性モデルは損傷の炎症および潜在性の期間のデータがあるため便利です。線維症。この骨と生体免疫応答を含む新規の学際的なアプローチでは、材料分野で未来アプリケーションにおける生体適合性の優れた前臨床評価を提供しています。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgments

この研究プロジェクトは、付与契約第 263363 の下で欧州連合の第 7 フレームワーク プログラム (FP7/2007-2013) から資金を受けています。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Biomaterials
β-tricalcium phosphate disks (β-TCP, 14 mm) Disks were sintered in a muffle furnace at a temperature of 1150 °C. A detailed description of the production can be found in Zimmer et al (doi: 10.1002/jbm.a.34639). Samples were UV-irradiated (15 min for each side) before using in cell cultures.
Orthovita Vitoss foam (β-TCP/C foam) Orthovita 2102-1405
Mouse osteoblast culture
Alizarin Red S Sigma-Aldrich A5533
ALP assay buffer (2x) pH 10.4 Dissolve 200 mM glycine, 2 mM magnesium chloride, 2 mM zinc chloride in ultrapure water and adjust to pH 10.
Bone growth medium (BGM) α-MEM + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin/streptomycin
Cell lysis buffer: CyQuant cell lysis buffer 20x concentrate Thermo Scientific C7027 Dilute the concentrated cell lysis buffer stock 20-fold in ultrapure water. 
Cell viability reagent: Presto Blue cell viability reagent Invitrogen, Thermo Fisher Scientific A13261
Collagenase type IV from clostridium histolyticum Sigma-Aldrich C5138
DC protein assay kit II Bio Rad 5000112 DC protein assay kit contains reagent A, reagent B, reagent S and BSA for the reference standard. For reagent A', add 20 µL reagent S to 1000 µL reagent A. 
Dimethylsulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D8418 Steril-filter DMSO before usage. 
Dispase II (neutral protease, grade II) Roche 4942078001
EnzCheck Phosphatase Assay Kit for alkaline phosphatase activity  Invitrogen, Thermo Fisher Scientific E12020 EnzCheck Phosphatase Assay Kit contains 6,8-difluoro-4-methylumbelliferyl phosphate (DiFMUP), N,N-dimethylformamide and 6,8-difluoro-7-hydroxy-4-methylcoumarin (DiFMU). 
Fetal bovine serum (FBS) Sigma-Aldrich F7524
Formalin solution neutral buffered 10% Sigma-Aldrich HT501128
Glycine Sigma-Aldrich G8898
Hexadecylpyrdinium (cetylpyridinium) chloride monohydrate Sigma-Aldrich C9002
L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate Sigma-Aldrich A8960
Magnesium chloride hexahydrate Sigma-Aldrich M2670
MEM alpha medium (α-MEM) Gibco Life Technologies  11900-073
Osteogenic mineralization medium (MM) α-MEM + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin-streptomycin + 50 µg/mL ascorbic acid + 5 mM β-glycerophosphate
Penicillin-streptomycin   Sigma-Aldrich P4333
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 Gibco, Thermo Fisher Scientific  10010023
Sigmafast BCIP/NBT Sigma-Aldrich B5655
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red (10x) Gibco, Thermo Fisher Scientific  15400054 Dilute the concentrated stock solution 10-fold in 1x PBS. 
Tween20 Sigma-Aldrich P1379
Ultrapure water: Cell culture water pyrogen free VWR L0970-500
Wash buffer Add  0.05% Tween20 to 1x PBS.
Zinc chloride Sigma-Aldrich 1.08816
β-Glycerophosphate disodium salt hydrate Sigma-Aldrich G5422
24-well suspension culture plate Greiner bio-one 662102
24-well tissue culture plate Greiner bio-one 662160
50 mL conical tube Greiner bio-one 227261
96-well black plate Greiner bio-one 655076
96-well transparent plate Greiner bio-one 655001
Centrifuge: VWR Mega Star 600R VWR
CO2-Incubator: HeraCell 240 Thermo Scientific
Cryovial 2 mL Greiner bio-one 122263
Disposable filter unit FP30/0.2 CA-S GE Healthcare Life Sciences Whatman 10462200 For sterile filtration of enzyme solution.
Flatbed scanner: Epson Perfection 1200 Photo Epson
Infinite M200 Pro microplate reader Tecan
Microcentrifuge tube: Eppendorf tube safe-lock 0.5 mL VWR 20901-505
Microcentrifuge tube: Eppendorf tube safe-lock 1.5 mL VWR 21008-959
Shaker Swip (orbital and horizontal)  Edmund Buehler 
Shaking incubator GFL3032 GFL  3032
Single-use pipet: serum pipet Greiner bio-one 612301
Sterile instruments (scissors, tweezer, curved forceps)
Tissue culture plate (10 cm) Greiner bio-one 664960
Mouse osteoblast-osteoclast co-culture
1α,25-Dihydroxyvitamin D3 Sigma-Aldrich 17936 1000x concentrated stock (10 µM in ethanol 100%)
Acetone VWR Chemicals 22065.327
Bone growth medium (BGM) α-MEM + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin-streptomycin
Distilled water Carl Roth 3478.4
Ethanol (100% vol/vol) VWR Chemicals 20821.365
Ethanol (70% vol/vol) VWR Chemicals 93003.1006
Fast red violet LB salt Sigma-Aldrich F3381
Fetal bovine serum (FBS) Sigma-Aldrich F7524
Formalin solution neutral buffered 10% Sigma-Aldrich HT501128
MEM alpha Medium (α-MEM) Gibco Life Technologies  11900-073
N,N-Dimethylformamide Sigma-Aldrich D4551
Naphthol AS-MX phosphate Sigma-Aldrich N4875
Osteoclast differentiation medium (DM) α-MEM + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin-streptomycin + 1 nM 1,25-(OH)2-vitamin D3 + 1 µM prostaglandin E2 
Penicillin-streptomycin  Sigma-Aldrich P4333
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 Gibco, Thermo Fisher Scientific  10010023
Prostaglandin E2 (PGE2) Cayman Chemical Company 9003016 1000x concentrated stock (1 mM in ethanol 100%)
Sodium acetate trihydrate Sigma-Aldrich S7670
Sodium tartrate dibasic dihydrate Sigma-Aldrich S8640
Sterile instruments (scissors, forceps, scalpel)
TRAP buffer pH 5.0 Dissolve 40 mM sodium acetate, 10 mM sodium tartrate in ultrapure water and adjust to pH 5.
Ultrapure water: Cell culture water pyrogen free VWR L0970-500
24-well suspension culture plate Greiner bio-one 662102
24-well tissue culture plate Greiner bio-one 662160
50 mL conical tube Greiner bio-one 227261
Centrifuge: VWR Mega Star 600R VWR
CO2-Incubator: HeraCell 240 Thermo Scientific
Diamond wafering blade (10.2 cm x 0.3 cm) Buehler
Isomet low-speed saw Buehler
Petri dish (6 cm) Greiner bio-one 628,161
Screw cap glass bottle 20 mL Carl Roth EXY4.1
Single-use sterile syringe 1 mL Henry Schein Animal Health 9003016
Single-use pipet: serum pipet Greiner bio-one 612301
Sterile needle: Hypodermic needle RW 27 G x 3/4'' Henry Schein Animal Health 9003340
Mouse calvarial defect model
Analgesia: Buprenorphine (Bupaq) Richter Pharma AG
Anesthesia: Ketamine (Ketamidor), Xylazine (Rompun) Richter Pharma AG/Bayer HealthCare
Cold sterilant: SafeSept Max Henry Schein Animal Health 9882765
Ethanol (70% vol/vol) VWR Chemicals 93003.1006
Eye ointment: VitA POS 5 g Ursapharm
Normal saline solution (0.9% sodium chloride solution) Fresenius Kabi
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 Gibco, Thermo Fisher Scientific  10010023
Povidone iodine solution: Braunol 1000 mL B. Braun 3864154
Roti-Histofix 4.5% buffered formalin Carl Roth 2213.6
Tissue adhesive: Histoacryl 5 x 0.5 mL  B. Braun Surgical 1050060
Personal protective equipment: surgical gloves, cap and mask, gown Henry Schein Animal Health 1045073, 1026614, 9009062, 370406
Sterile instruments (scalpel, scissors, forceps, needle holder)
Sterile needles: Hypodermic needles RW 27 G x 3/4'' and 30 G x 1/2''  Henry Schein Animal Health 9003340, 9003630
Single-use sterile syringe 1 mL Henry Schein Animal Health 9003016
Heating plate: Physitemp Rothacher Medical TCAT-2LV
Sterile gauze swabs Henry Schein Animal Health 220192
Sterile disposable scalpel (Figur 20) Henry Schein Animal Health 9008957
Surgical/dental drill: Implantmed SI-923 W&H Dentalwerk Bürmoos GmbH 16929000
Handpiece type S-II W&H Dentalwerk Bürmoos GmbH 30056000
Trephine, diameter 4 mm Hager&Meisinger GmbH 229040
Irrigation tubing set 2.2 m W&H Dentalwerk Bürmoos GmbH 4363600
Periosteal elevator 2 mm / 3 mm Henry Schein Animal Health 472683
Non-resorbable suture: Polyester green, DS19, met. 1.5, USP 4/0 75 cm Henry Schein Animal Health 300715
In vitro immune responses
Anesthesia for euthanasia: Ketamine (Ketamidor), Xylazine (Rompun) Richter Pharma AG/Bayer HealthCare
Cell Proliferation ELISA, BrdU (colorimetric) Assay Kit Sigma-Aldrich 11647229001 The kit contains BrdU labeling solution, fixation solution (FixDenat), Anti-BrdU antibody solution, washing buffer and substrate solution. 
Concanavalin A (ConA) MP Biomedicals 150710
Culture medium splenocytes RPMI medium + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin-streptomycin solution + 0.1% gentamicin + 0.2% ß-mercaptoethanol + 1% non-essential amino acids
Ethanol (70% vol/vol) VWR Chemicals 93003.1006
Fetal bovine serum (FBS) Gibco, Thermo Fisher Scientific  10500064
Gentamicin Gibco, Thermo Fisher Scientific  15750037
Mouse IL-1β ELISA Ready-SET-Go! Invitrogen, Thermo Fisher Scientific 88-7013-88
Mouse IL-2 ELISA MAX Standard BioLegend 431001
Mouse IL-4 ELISA MAX Standard BioLegend 431101
Mouse INF-γ ELISA MAX Standard BioLegend 430801
Non-essential amino acids solution Gibco, Thermo Fisher Scientific  11140050
Penicillin-streptomycin  Gibco, Thermo Fisher Scientific  15140122
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 Gibco, Thermo Fisher Scientific  10010023
Red blood cell (RBC) lysis buffer: BD Pharm Lyse BD Bioscience 555899
RPMI 1640 medium, HEPES Gibco, Thermo Fisher Scientific  52400025
β-Mercaptoethanol Gibco, Thermo Fisher Scientific  31350010
50 mL conical tube Greiner bio-one 227261
96-well tissue culture plate Greiner bio-one 655180
Centrifuge: VWR Mega Star 600R VWR
Cell strainer 40 µm BD Bioscience 352340
Infinite M200 Pro microplate reader Tecan
Single-use sterile syringe 1 mL Henry Schein Animal Health 9003016
Sterile surgical instruments (forceps, glass slides)
High throughput intraperitoneal model
Anesthesia: Ketamine (Ketamidor), Xylazine (Rompun) Richter Pharma AG/Bayer HealthCare
Cold sterilant: SafeSept Max Henry Schein Animal Health 9882765
Ethanol (70% vol/vol) VWR Chemicals 93003.1006
Eye ointment: VitA POS 5 g Ursapharm
Mouse IL-1β ELISA Ready-SET-Go! Invitrogen, Thermo Fisher Scientific 88-7013-88
Mouse IL-2 ELISA MAX Standard BioLegend 431001
Mouse IL-4 ELISA MAX Standard BioLegend 431101
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 Gibco, Thermo Fisher Scientific  10010023
Povidone iodine solution: Braunol 1000 mL B. Braun 3864154
Shandon Rapid-Chrome Kwik-Diff Staining Kit Thermo Scientific 9990700 For differential cell count.
Heating plate: Physitemp Rothacher Medical TCAT-2LV
Hemocytometer: Neubauer chamber Carl Roth PC72.1
Non-resorbable suture: Ethibond Excel 4-0 Ethicon 6683H
Resorbable suture: Polysorb Covidien SL-5628
Shandon centrifuge for cytopsin Thermo Scientific
Single-use sterile syringe 1 mL Henry Schein Animal Health 9003016
Sterile gauze swabs Henry Schein Animal Health 220192
Sterile needles: Hypodermic needles RW 27 G x 3/4'' and 25 G Henry Schein Animal Health 9003340, 420939
Sterile surgical instruments (scalpel, scissors, forceps, needle holder)
Trypan blue solution 0.4% Gibco, Thermo Fisher Scientific  15250061
Subchronic subcutaneous model
Anesthesia: Ketamine (Ketamidor), Xylazine (Rompun) Richter Pharma AG/Bayer HealthCare
Cold sterilant: SafeSept Max Henry Schein Animal Health 9882765
Ethanol (70% vol/vol) VWR Chemicals 93003.1006
Eye ointment: VitA POS 5 g Ursapharm
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 Gibco, Thermo Fisher Scientific  10010023
Povidone iodine solution: Braunol 1000 mL B. Braun 3864154
Roti-Histofix 4.5% buffered formalin Carl Roth 2213.6
Heating plate: Physitemp Rothacher Medical TCAT-2LV
Non-resorbable suture: Ethibond Excel 4-0 Ethicon 6683H
Personal protective equipment: surgical gloves, cap and mask, gown Henry Schein Animal Health 1045073, 1026614, 9009062, 370406
Single-use sterile syringe 1 mL Henry Schein Animal Health 9003016
Sterile gauze swabs Henry Schein Animal Health 220192
Sterile instruments (scalpel, scissors, forceps, needle holder)
Sterile needle: Hypodermic needles RW 27 G x 3/4''  Henry Schein Animal Health 9003340, 420939

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. Fracture healing: mechanisms and interventions. Nature Reviews Rheumatology. 11 (1), 45-54 (2015).
  2. Marsell, R., Einhorn, T. A. The biology of fracture healing. Injury. 42 (6), 551-555 (2011).
  3. Cooper, G. M., et al. Testing the critical size in calvarial bone defects: revisiting the concept of a critical-size defect. Plastic and Reconstructive Surgery. 125 (6), 1685-1692 (2010).
  4. O'Brien, F. J. Biomaterials & scaffolds for tissue engineering. Materials Today. 14 (3), 88-95 (2011).
  5. Stanovici, J., et al. Bone regeneration strategies with bone marrow stromal cells in orthopaedic surgery. Current Research in Translational Medicine. 64 (2), 83-90 (2016).
  6. Anderson, J. M. Future challenges in the in vitro and in vivo evaluation of biomaterial biocompatibility. Regenerative Biomaterials. 3 (2), 73-77 (2016).
  7. Chen, Z., et al. Osteoimmunomodulation for the development of advanced bone biomaterials. Materials Today. 19 (6), 304-321 (2016).
  8. Ono, T., Takayanagi, H. Osteoimmunology in bone fracture healing. Current Osteoporosis Reports. 15 (4), 367-375 (2017).
  9. Tsiridis, E., Upadhyay, N., Giannoudis, P. Molecular aspects of fracture healing: Which are the important molecules? Injury. 38, S11-S25 (2007).
  10. Velasco, M. A., Narvaez-Tovar, C. A., Garzon-Alvarado, D. A. Design, materials, and mechanobiology of biodegradable scaffolds for bone tissue engineering. BioMed Research International. 2015, 729076 (2015).
  11. Bastian, O., et al. Systemic inflammation and fracture healing. Journal of Leukocyte Biology. 89 (5), 669-673 (2011).
  12. El-Jawhari, J. J., Jones, E., Giannoudis, P. V. The roles of immune cells in bone healing; what we know, do not know and future perspectives. Injury. 47 (11), 2399-2406 (2016).
  13. Changi, K., et al. Biocompatibility and immunogenicity of elastin-like recombinamer biomaterials in mouse models. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 106 (4), 924-934 (2018).
  14. Laczko, J., Levai, G. A simple differential staining method for semi-thin sections of ossifying cartilage and bone tissues embedded in epoxy resin. Mikroskopie. 31 (1-2), 1-4 (1975).
  15. Nakayama, T., et al. Polarized osteoclasts put marks of tartrate-resistant acid phosphatase on dentin slices--a simple method for identifying polarized osteoclasts. Bone. 49 (6), 1331-1339 (2011).
  16. Deguchi, T., et al. In vitro model of bone to facilitate measurement of adhesion forces and super-resolution imaging of osteoclasts. Scientific Reports. 6, 22585 (2016).
  17. Epstein, N. E. An analysis of noninstrumented posterolateral lumbar fusions performed in predominantly geriatric patients using lamina autograft and beta tricalcium phosphate. Spine Journal. 8 (6), 882-887 (2008).
  18. Epstein, N. E. Beta tricalcium phosphate: observation of use in 100 posterolateral lumbar instrumented fusions. Spine Journal. 9 (8), 630-638 (2009).
  19. Kallai, I., et al. Microcomputed tomography-based structural analysis of various bone tissue regeneration models. Nature Protocols. 6 (1), 105-110 (2011).
  20. Lo, D. D., et al. Repair of a critical-sized calvarial defect model using adipose-derived stromal cells harvested from lipoaspirate. Jove-Journal of Visualized Experiments. (68), (2012).
  21. Gosain, A. K., et al. Osteogenesis in calvarial defects: contribution of the dura, the pericranium, and the surrounding bone in adult versus infant animals. Plastic and Reconstructive Surgery. 112 (2), 515-527 (2003).
  22. Levi, B., et al. Dura mater stimulates human adipose-derived stromal cells to undergo bone formation in mouse calvarial defects. Stem Cells. 29 (8), 1241-1255 (2011).
  23. Wang, J., Glimcher, M. J. Characterization of matrix-induced osteogenesis in rat calvarial bone defects: II. Origins of bone-forming cells. Calcified Tissue International. 65 (6), 486-493 (1999).

Tags

バイオ エンジニア リング、問題 141、再生医療、生体材料、骨格組織の修復、免疫原性、異物反応、体外、体内
骨再生のための生体材料の生物学的互換性プロファイル
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kampleitner, C., Obi, J., Vassilev,… More

Kampleitner, C., Obi, J., Vassilev, N., Epstein, M. M., Hoffmann, O. Biological Compatibility Profile on Biomaterials for Bone Regeneration. J. Vis. Exp. (141), e58077, doi:10.3791/58077 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter