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JoVE Journal Bioengineering
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Bioengineering

Perfil de compatibilidad biológica de Biomateriales para regeneración ósea

Published: November 16, 2018 doi: 10.3791/58077
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 1
1Department of Pharmacology and Toxicology, University of Vienna, 2Laboratory of Experimental Allergy, Division of Immunology, Allergy and Infectious Diseases, Department of Dermatology, Medical University of Vienna

Summary

El número de nuevos biomateriales ingeniería para reparar las lesiones del hueso grande está en continua expansión con el objetivo de acelerar la cicatrización ósea y superar las complicaciones asociadas con el trasplante de hueso. Aquí, presentamos una estrategia multidisciplinaria para las pruebas de biocompatibilidad preclínico de Biomateriales para la reparación de hueso.

Abstract

Fracturas del hueso grande de la Unión no son un reto importante en cirugía ortopédica. Aunque auto e injertos óseos Alogénicos son excelentes para la curación de estas lesiones, existen posibles complicaciones con su uso. Así, materiales científicos están desarrollando biomateriales sintéticos, biocompatibles para superar estos problemas. En este estudio, presentamos una plataforma multidisciplinar para la evaluación de Biomateriales para la reparación de hueso. Combinamos conocimientos de Biología ósea y de la inmunología para desarrollar una plataforma como en vitro de los osteoclastos (OC) y osteoblastos (OB) ensayos en vivo modelos de ratón de reparación ósea, inmunogenicidad y alergenicidad. Nos muestran cómo realizar los experimentos, resumir los resultados e informar sobre biocompatibilidad de los biomateriales. En particular, hemos probado OB viabilidad, diferenciación y mineralización y viabilidad OC y diferenciación en el contexto de los discos de β-tricálcico fosfato (β-TCP). También probamos una espuma de β-TCP/colágeno (β-TCP/C) que es un material disponible comercialmente utilizado clínicamente para la reparación ósea en un modelo de ratón de defecto hueso calvarial tamaño crítico para determinar los efectos en la fase temprana de la curación del hueso. En experimentos paralelos, se evaluaron las respuestas inmunes y alérgicas en ratones. Nuestro enfoque genera un perfil de compatibilidad biológica de un biomaterial de hueso con una serie de parámetros necesarios para la predicción de la biocompatibilidad de los biomateriales utilizados para la curación del hueso y la reparación en pacientes.

Introduction

Reparación ósea es un proceso complejo que comienza con la formación de hematoma, inflamación, formación y remodelación luego1,2de callos. Sin embargo, potencial de la regeneración ósea se limita al tamaño de la fractura ósea1,3. Por ejemplo, las fracturas del hueso grande causadas por trauma, cáncer u osteoporosis no pueden curar y se denominan fracturas sin unión. Estas lesiones del hueso a menudo requieren tratamiento para promover la regeneración y reparación ósea fisiológica sana. Actualmente, el trasplante de autoinjerto y aloinjerto óseo es el enfoque de opción4 con procedimientos de reemplazo de hueso 2,2 millones anualmente5. Aunque estos procedimientos tienen una alta tasa de éxito, puede haber complicaciones, por ejemplo, la disponibilidad limitada de hueso, la infección, la morbosidad del sitio donante y la rechazo4. Se buscan nuevas alternativas para la ingeniería de tejido óseo para enfrentar estos desafíos.

El diseño de biomateriales basados en polímeros naturales o sintéticos, biocerámica o metales en combinación con las células y moléculas bioactivas está en el lugar6. Nuestra comprensión actual del hueso fisiológico sanación y sanación en el contexto de biomateriales depende de múltiples factores tales como propiedades mecánicas y de múltiples factores locales y sistémicos, incluyendo las células de la circulación y el sitio de la fractura7 ,8,9. Biomateriales para regeneración ósea intentan promover osteogenicity y osteointegración10 y son idealmente biocompatible, biodegradable y poroso (promueve la migración celular, nutrientes y oxígeno). También necesitan ser lo suficientemente fuerte para soportar el sitio de la fractura para aliviar el dolor. Además, factores inflamatorios están obligados a iniciar el proceso de curación. Sin embargo, si el biomaterial induce inflamación excesiva y las respuestas alérgicas, esto podría limitar o inhibir el hueso curativo11,12. Por lo tanto, un enfoque interdisciplinario es necesario evaluar biomateriales desarrollados para la reparación de hueso.

En este estudio, presentamos una evaluación preclínica de los materiales representativos, 1) Orthovita Vitoss espuma que es un sustituto de injerto de hueso esponjoso disponible en el mercado compuesto por fosfato tricálcico se compone de β-tricálcico puro tamaño de nanómetros partículas de fosfato (β-TCP) y colágeno bovino tipo 1 (C) (espuma de β-TCP/C) y 2) discos de β-TCP. Aquí ilustramos pruebas de biocompatibilidad de los biomateriales con osteoblastos primarios (OB) y ensayos de los osteoclastos (OC), un modelo en vivo de la reparación de hueso, una evaluación inmunológica que en vitro proliferación de linfocitos T y producción de citoquinas y en vivo inmunogenicidad y alergenicidad, como previamente divulgados13.

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Protocol

Los procedimientos se realizaron con ratones BALB/c siguiendo todas las pautas para el cuidado y uso de animales de laboratorio del Ministerio de educación, Ciencia e investigación austríaco y fueron aprobados por la Comisión de ética del Ministerio Austriaco de educación, ciencia y la investigación.

1. primario de ratón OB cultura

  1. Aislamiento de OB de calvaria ratón neonatal mediante digestión enzimática
    1. Eutanasia de cachorros neonatales de 1 – 2 días (60 en total) por decapitación y colocar las cabezas en una placa Petri estéril 1 x solución salina tamponada con fosfato (PBS).
    2. Sostener la cabeza por la nuca del cuello y cortar la piel, con unas tijeras estériles. Haga una incisión en la bóveda craneal por lo que (aproximadamente 0.1-0.3 mm) con un par de tijeras que luego son insertados debajo de la bóveda en la parte posterior de la cabeza en la base del cráneo y corte a lo largo del borde calvarial lateralmente de atrás hacia adelante por encima de las orejas y luego encima e el puente nasal (figura 1).
    3. Incubar calvaria disecada con 8 mL de solución de digestión de filtro esterilizado (300 unidades/mL colagenasa tipo IV y 2.14 dispase unidades/mL II disuelven en medio esencial mínimo de α (α-MEM)) en un tubo cónico de 50 mL a 37 ° C durante 10 minutos en un incubador de agitación a 200 batidos / min.
    4. Eliminar el primer sobrenadante y repetir el procedimiento de digestión tres veces con 8 mL de solución de digestión. Recoger el sobrenadante que contiene las células después de cada paso de la digestión y agregar a un tubo cónico de 50 mL. Guarde el tubo cónico de 50 mL con las células en un baño de agua helada hasta que se complete el procedimiento de digestión (aproximadamente 40 min).
    5. Centrifugar las células a 300 x g durante 5 min a 4 ° C, aspirar el sobrenadante (con una pipeta Pasteur conectada a una bomba de vacío) y resuspender en 40 mL de medio de crecimiento de hueso (BGM) que contiene α-MEM con 10% inactivado con calor suero bovino fetal (FBS) y 1% solución de penicilina-estreptomicina. Luego añadir 10 mL de la suspensión de células a 4 placas de cultivo de tejidos (10 cm).
    6. La cultura de las células a 37 ° C y 5% de CO2 hasta confluencia (2 – 3 días).
    7. En confluencia, el viejo medio de aspirar y lavar las placas de cultivo tisular una vez con PBS 1 x (37 ° C). Luego aspirar el PBS y añadir 2 mL de solución de tripsina 1 x que contienen 0.5% ácido de etilendiaminotetracético (EDTA) para cada placa de cultivo de tejidos de 10 cm.
    8. Incubar las placas de 4 cultura a 37 ° C y 5% de CO2 durante 5 minutos y luego verifique las placas con un microscopio de luz invertido para asegurar que las células están separadas del plástico. Luego transferir todo suspensiones celulares (total 8 mL) a un tubo cónico de 50 mL que contiene 10 mL de BGM fresco. Lave cada plato con 5 mL de BGM y transferencia al misma tubo cónico de 50 mL.
    9. Centrifugar las células a 300 x g durante 5 min a 4 ° C, aspirar el sobrenadante y resuspender las células en 16 mL de BGM fresco. Preparar 16 10 cm tejido cultura placas nuevas (División 1:4) que contiene 9 mL de BGM. Añadir 1 mL de la suspensión de células a cada plato.
    10. Repita los pasos 1.1.6. a 1.1.8.
    11. Centrifugar las células a 300 x g durante 5 min a 4 ° C, aspirar el sobrenadante y resuspender en 10 mL de BGM fresco. Contar las células y la concentración de las células.
      Nota: Este procedimiento genera aproximadamente 7.5-8.3 x 105 células/pup.
    12. Centrifugar a 300 x g durante 5 min a 4 ° C, aspirar el sobrenadante y resuspender en medio que contiene 10% dimetil sulfóxido (DMSO), α-MEM 40% y 50% de congelación FBS. Transferir 1,5 mL de la suspensión celular para crioviales de 2 mL para un total de 2 x 106 células por vial.
    13. Flash congelar los frascos en nitrógeno líquido para el almacenamiento a largo plazo en un tanque de nitrógeno líquido. Uso de las células dentro de un año para funcionalidad completa. Utilice estos OBs primarios para evaluar la proliferación (paso 1.2), diferenciación (ensayos ALP: paso 1.4., 1.5.) y mineralización (paso 1.6.) en presencia de los biomateriales. Utilizar estas células para la maduración de los precursores derivados de médula ósea OC en co-cultivo (paso 2.3).
  2. Ensayo de proliferación de OB
    1. Incubar los discos de β-TCP de diámetro de 14 mm en 1 mL de BGM en una placa de cultivo de 24 pocillos suspensión a 37 ° C y 5% de CO2 durante 24 h antes de agregar el principal OBS. uso estándar tejido placas de controles y placas para las muestras de biomaterial para suspensión evitar el accesorio de la célula al plástico.
    2. Aspirar el medio de incubación antes y luego resuspender primario de ratón OBs en BGM. Añadir 4.4 x 104 OBs/cm2 en los discos de β-TCP previamente incubado en una placa de cultivo de 24 pozos suspensión y para el grupo control, en una placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos (1 mL/pocillo). OBs se fije a la placa de cultivo de tejidos o biomaterial.
    3. Incubar durante 14 días a 37 ° C y 5% CO2. Durante el período de incubación, cambiar el medio cada 2-3 días y añadir 1 mL de BGM fresca a cada pocillo.
    4. Para evaluar la proliferación de OB, transferir los discos de β-TCP en los días 7 y 14 a nuevos pozos para excluir a las señales de las células cultivadas en la placa de cultivo de suspensión.
    5. Aspire el medio viejo, Añadir 0,5 mL de BGM (37 ° C) e incubar las placas durante 30 min a 37 ° C y 5% CO2. Luego añadir 55 μl de 10 x reactivo de proliferación celular (1:10 dilución) directamente en el bien de la cultura. Cortes, de preparar tres pozos que contiene 0,5 mL de BGM y 55 μl del reactivo de proliferación de células de 10 x. Incubar todas las placas durante 30 min a 37 ° C y 5% CO2.
    6. Retirar y transferir 150 μL del sobrenadante de cada pozo en una placa de 96 pozos negra y leer fluorescencia con excitación a 560 nm y emisión a 590 nm. Restar las lecturas en blanco de las lecturas de la muestra.
  3. Ensayos de diferenciación y mineralización de OB
    1. Incubar los discos de β-TCP de diámetro de 14 mm en 1 mL de BGM en una placa de cultivo de 24 pocillos suspensión a 37 ° C y 5% de CO2 durante 24 h antes de añadir las placas de cultivo de tejido estándar OBS. uso de controles y placas para las muestras de biomaterial evitar suspensión accesorio de celular al plástico.
    2. Aspirar el medio de incubación antes y luego resuspender primario de ratón OBs en BGM. Añadir 8.8 x 104 OBs/cm2 en los discos de β-TCP previamente incubado en una placa de cultivo de 24 pozos suspensión y para el grupo control, en una placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos (1 mL/pocillo). OBs se fije a la placa de cultivo de tejido o la muestra de biomaterial.
    3. Reemplazar el BGM con 1 mL de medio de mineralización osteogénico (MM) que contiene BGM, 50 μg/mL de ácido ascórbico y β-glicerofosfato de 5 mM 24 h después de la adición de las OBs e incubar durante 14 días a 37 ° C y 5% CO2. Cambiar el medio cada 2-3 días con 1 mL de MM recién preparada para cada pozo.
  4. Diferenciación de OB por la actividad de la fosfatasa alcalina (ALP) de lysates de la célula
    1. Para medir la actividad ALP en el día 7 después de la adición de MM, aspirar el medio de cultivo de los pocillos y lavar con 1 mL de PBS estéril 1 x (37 ° C). Aspirar cuidadosamente el PBS para permitir que las células Unidas a permanecer en el cultivo de tejido plástico o biomaterial y la congelación de las placas a-80 ° C.
    2. Después de 24 h (o hasta 2 semanas), deshielo de la placa de cultivo de tejidos de control y placa de cultivo biomaterial suspensión a temperatura ambiente (RT) para prepararse para la lisis de OB. Para las muestras de biomaterial, transferencia de los discos de β-TCP en una placa de cultivo de suspensión nueva para excluir las células conectadas a la placa. Agregar 75 μl por pozo de 1 x de tampón de lisis celular a ambas placas. Agitar las placas durante 5 min en un agitador a 400 batidos por minuto.
    3. Transferir el lisado de células en un tubo de microcentrífuga de 0, 5 mL y centrifugar a 300 x g durante 6 min a temperatura ambiente para eliminar residuos. Añadir 50 μl del sobrenadante lisado celular muestra a una placa de 96 pozos negra y luego añadir 50 μl de una solución de 200 μm fosfato 6.8-difluoro-4-methylumbelliferyl (DiFMUP) fluorógenos sustrato disuelto en 2 x de buffer de la fosfatasa alcalina (pH 10) por pozo. Configurar dos pozos en blanco con 100 μl de una solución de 1:1 que contiene 2 x fosfatasa alcalina tampón y tampón de lisis de la célula de x 1.
    4. Preparar estándares de referencia de 8 con 100 μL/pozo con el 6,8-difluoro-7-hydroxy-4-methylcoumarin (DiFMU) que van desde 0,5 hasta 200 μM disueltos en solución de 1:1 con buffer de lisis de la célula de x 1 y 2 buffer ALP x para generar una curva de referencia.
    5. Incube la placa negra a 37 ° C durante 15 minutos y luego lee la fluorescencia con excitación a 358 nm y emisión a 455 nm. Restar las lecturas en blanco de los patrones de referencia y lecturas de la muestra.
    6. Normalizar la actividad de la enzima ALP de los lysates de la célula a la cantidad total de proteína mediante un ensayo colorimétrico para la concentración de la proteína. Preparación de albúmina de suero bovino estándares de referencia de proteína (BSA) en un rango de 0.05 – 2,5 μg/μl disueltas en 1 x de tampón de lisis de la célula para generar una curva estándar.
    7. Preparar de los lysates de la célula de muestra y estándares de proteína BSA por duplicado. Añadir 5 μl de la célula de muestra lisada o 5 μl de proteína BSA estándar en una placa de 96 pocillos y luego añadir 25 μl del reactivo ' y 200 μL de reactivo B. conjunto a dos pozos en blanco con 5 μl de 1 x de tampón de lisis celular. Incubar las placas a temperatura ambiente durante 15 minutos y luego leer la absorbancia a 690 nm. Restar las lecturas en blanco de los patrones de referencia y lecturas de la muestra.
  5. Diferenciación de OB evaluada por tinción de fosfatasa alcalina en cultivo celular
    1. Mancha de ALP en OBs cultivadas en el día 7 después de la adición de MM en una placa de cultivo de tejidos de control y el biomaterial en una placa de cultivo de suspensión.
    2. Aspire el medio de cultivo de los pozos y reemplazarlo con 0.5 mL de PBS 1 x (37 ° C). Aspire el PBS y fijar las células por incubación en 0,5 mL de formalina al 10% tamponado a temperatura ambiente durante 1 minuto.
    3. Aspire el formol 10% tamponado con una pipeta de un solo uso y añadir 0,5 mL de tampón de lavado (0.05% Tween20 en PBS 1 x).
    4. Disolver una tableta de sustrato 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato/nitro azul de tetrazolio (NBT/BCIP) en 10 mL de agua ultrapura y agitar hasta que se disuelva completamente. La solución debe ser protegida de la luz y utilizada dentro de 2 h.
    5. Aspirar la solución de lavado y reemplace con 0,5 mL de solución de sustrato BCIP/NBT e incubar la placa a temperatura ambiente en oscuridad durante 10 minutos, aspirar la solución de tinción y reemplace con 0,5 mL de tampón de lavado.
    6. Transferencia de los discos de β-TCP manchada en un nuevo pozo y las placas manchadas de ALP la exploración con un escáner plano convencional para tinción de fosfatasa alcalina récord.
  6. Mineralización de OB evaluada por tinción con alizarina roja S (ARS)
    1. Aspirar el medio de cultivo de los pozos que contienen primarios OBs 14 días después de la adición de MM y enjuague dos veces con 0,5 mL de PBS 1 x a RT. aspirado del PBS y fijar las células añadiendo 0,5 mL de 10% formalina solución amortiguadora a temperatura ambiente durante 10 minutos.
    2. Aspirar el formol 10% tamponado con una pipeta de un solo uso y lavar dos veces con 0,5 mL de agua ultrapura.
    3. A las OBs fijadas, agregar 0,25 mL de solución de tinción de ARS de 40 mM (pH 4.2) disuelto en agua ultrapura e incubar la placa a temperatura ambiente durante 10 min en un agitador a 100 golpes/min.
    4. Aspire la solución de tinción con una pipeta de un solo uso y enjuague con 1 mL de agua ultrapura. Repetir este paso 5 – 10 veces para eliminar inespecíficas de tinción.
      Nota: La solución de lavado debe ser sin color.
    5. Aspire el agua ultrapura y añadir 1 mL de PBS frío. Incubar la placa a temperatura ambiente durante 10 min en un agitador a 100 golpes/min.
    6. Aspire el PBS, transferir los discos manchados de β-TCP a un nuevo pozo y las placas de la exploración con un escáner plano para mineralización de registro.
    7. Añadir 0,25 mL de 10% solución de cloruro de cetilpiridinio e incubar la placa a temperatura ambiente durante 15 min en un agitador a 100 batidos por minuto para extraer el tinte de ARS.
    8. Transferir el sobrenadante a un tubo de 1.5 mL y centrifugar a 17.000 x g durante 5 min a TA.
    9. 10% solución de cloruro de cetilpiridinio para los extractos con una relación de dilución de 1:10 – 1:20 y añadir las muestras (300 μL) en una placa de 96 pocillos, incluyendo dos pozos en blanco que contiene sólo 10% de cloruro de cetilpiridinio.
    10. Preparar 7 estándares de referencia de ARS desde 4 hasta 400 μm diluyendo el ARS 40 mM coloración solución (pH 4.2) con 10% solución de cloruro de cetilpiridinio para generar una curva estándar.
    11. Añadir 300 μL del estándar de referencia por duplicado a la placa de 96 pocillos.
    12. Leer la absorbancia de las muestras, espacios en blanco y referencia a normas a 520 nm.
    13. Restar las lecturas en blanco de los patrones de referencia y lecturas de la muestra.

2. ratón OB-OC cocultivo para derivar OCs maduro

  1. Preparación y esterilización de láminas de hueso cortical bovino
    1. Limpie segmentos del hueso del tejido circundante y quite el hueso trabecular y la médula ósea.
    2. Seca el hueso a 50 ° C durante 24 h.
    3. Cortar el hueso en trozos más pequeños y cortar en rodajas (aproximadamente 300-350 μm de espesor) usando una baja velocidad sierra con hoja de diamante.
    4. Corta las rebanadas de 300-350 μm en discos cuadráticos (1 cm2).
    5. Para limpiar los discos de hueso (1 cm2), ponerlos en un frasco de cristal con llave y llenar con agua destilada. El frasco de cristal lleno de transferencia en un baño de ultrasonidos y someter a ultrasonidos de 5 minutos Repita este paso tres veces.
    6. Vierta el agua destilada, añadir etanol al 70% y someter a ultrasonidos durante 5 minutos.
    7. Quite el etanol al 70% y sustituir con etanol al 100%.
      Nota: Almacene las láminas de hueso en etanol 100% a 4 ° C hasta por 4 semanas.
    8. Irradiar los trozos de hueso con la luz UV durante 15 min a cada lado en condiciones estériles. Almacene las láminas de hueso esterilizado en una placa de cultivo estéril a temperatura ambiente hasta su uso posterior.
  2. Aislamiento de precursores de médula ósea OC
    1. Eutanasia a ratones BALB/c de 8 – 12 semanas viejo ingenuo usando una inyección intraperitoneal (i.p.) de una solución de 200 mg/kg ketamina y 24 mg/kg xilacina.
    2. Aislar a los precursores de la OC de la médula ósea de fémur de ratón y tibias.
    3. Quitar las patas con tijeras estériles desde el punto más cercano al cuerpo en la articulación de la cadera, corte las extremidades en las articulaciones de la rodilla y el tobillo y quitar el tejido blando con bisturí estéril y pinzas. Cortar las epífisis. Eliminar y suspender la médula con 1mL BGM en una Petri estéril de 6 cm con una aguja de 27G conectada a una jeringa de 1mL para obtener una suspensión celular.
    4. Añadir la suspensión de células a un tubo cónico de 50 mL, lavar el 6 cm caja de Petri con 5 mL de BGM y traslado al misma tubo cónico de 50 mL. Centrifugar a 350 x g a 4 ° C por 5 min resuspender las células en medio de la diferenciación de OC (DM) que contiene BGM, 1 nM 1,25-(OH)2-vitamina D3 y 1 μm de prostaglandina E2 (1 mL/pocillo).
      Nota: Un ratón BALB/c proporciona un número suficiente de los precursores OC para una placa de cultivo de 24 pozos.
  3. Preparación de la cultura Co ratón OB-OC con biomaterial
    1. Pre-incubar 14 mm diámetro β-TCP discos o rebanadas hueso bovino (1 cm2) en 1 mL de BGM en una placa de cultivo de 24 pocillos suspensión a 37 ° C y 5% de CO2 durante 24 h antes de añadir las células.
      Nota: Rebanadas de hueso bovino son un grupo de control del sustrato fisiológico para el estudio de diferenciación de OC en presencia de biomateriales.
    2. Añadir 8.8 x 104 células/cm2 de primarias OBs suspendido en BGM en los biomateriales o el hueso de control en una placa de cultivo de 24 pozos suspensión o a una placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos. Incubar a 37 ° C y 5% CO2 durante 24 h.
      Nota: OBs Coloque el plástico o el hueso biomaterial o bovino.
    3. Añadir recién aislado precursores de médula ósea OC a las 24 h cultivan primario OBs y cultivo a 37 ° C y 5% de CO2 durante 5 días. Reemplazar el medio con DM OC recién preparado todos los días. Entonces mancha OCs para fosfatasa ácida tartrato resistente (TRAP) para evaluar la diferenciación OC.
  4. Diferenciación de OC evaluada por tinción de trampa
    1. Para caracterizar la OCs multinucleated maduros, de paso 2.3.3, aspirar el medio de cultivo de la placa de cultivo de tejidos de control y la placa de cultivo de biomaterial suspensión y añadir 1 mL de PBS 1 x (37 ° C). Aspire el PBS y fijar las células por incubación en 1 mL de solución de formalina al 10% tamponado a temperatura ambiente durante 10 minutos.
    2. Aspirar la solución de formalina al 10% tamponada con una pipeta de un solo uso y agregar 1 mL de PBS 1 x a RT. Repita este paso tres veces, luego aspire PBS, reemplazar con 1 mL de tampón (pH 5) de la trampa e incubar las placas a 37 ° C por 30 min.
    3. Aspire el búfer de trampa y añadir 1 mL de acetona y 100% el etanol de 1:1. Incubar la placa a temperatura ambiente por 30 s. rápidamente solución aspirar la acetona etanol con una pipeta de un solo uso y secar completamente las placas a TA.
    4. Para la trampa de coloración de la solución, preparar un 10 mg/mL solución stock de fosfato de naftol AS-MX en disolver N, N-dimetilformamida, 0,6 mg/mL de fast rojo violeta sal en tampón de trampa y añadir 0,1 mL de solución stock de fosfato de naftol AS-MX a 10 mL de fast rojo violeta sal en tampón de trampa.
    5. Añadir 1 mL de solución de tinción de trampa incubar la placa a 37 ° C durante 10 min, luego aspirar la trampa solución de tinción y añadir 1 mL de agua ultrapura para detener la reacción.
    6. Transferencia de los discos de β-TCP y rebanadas de hueso bovino después de la tinción en un nuevo pozo, observar OCs manchado rojo usando un microscopio de luz (aumento: 10 X) y enumerar trampa + OCs madura con tres o más núcleos.

3. crítica tamaño ratón defecto Calvarial modelo

  1. Inyectar 0.1 mg/kg de buprenorfina por vía subcutánea (s.c.) en ratones BALB/c 8 semanas de edad para la analgesia.
  2. Anestesiar los ratones con una mezcla de 100 mg/kg ketamina y 5 mg/kg i.p. de xilacina, agregar un gel o ungüento para los ojos para mantenerlos húmedos y coloque el ratón sobre una placa de calentamiento a 37 ° C durante todo el procedimiento para prevenir la hipotermia. Evaluar la profundidad de la anestesia por presión del dedo del pie y la cola.
  3. Afeitarse la piel en la parte superior de la cabeza entre las orejas y limpie la superficie con 7,5% povidona yodo solución y 70% etanol.
  4. Hacer una incisión sagital de línea media en la parte superior del cráneo entre las orejas con un bisturí estéril para exponer el calvarium y quitar los tejidos finos conectivos de pericráneo sobre el hueso parietal derecho raspando con un bisturí.
  5. Crear un defecto de tamaño crítico en el hueso parietal derecho utilizando un trépano dental estéril con un diámetro de 4 mm (2000 rpm) bajo irrigación constante con solución salina normal a muesca el hueso parietal derecho y cortar a través de la ectocortex y algunos endocortex.
  6. Para evitar daños en el mater del dura, utilice un pequeño elevador perióstico para romper el endocortex restante, cuidadosamente levante el hueso calvarial y sacarla con fórceps. El defecto resultante debe ser circular y aproximadamente 3,5 mm de diámetro.
  7. Llenar el defecto calvarial con previamente remojadas (estéril de 1 x PBS a temperatura ambiente) espuma de β-TCP/C con unas pinzas.
  8. Preparar el número adecuado de controles negativos pareados por edad, simulados con un defecto vacíelo.
  9. Para mantener el biomaterial en el lugar, poner 0,5 μl de adhesivo tisular en el borde del defecto en dos puntos opuestos.
  10. Cierre la piel con una sutura no absorbible.
  11. Limpie todos los instrumentos quirúrgicos con esterilizante frío para mantener las condiciones estériles antes de realizar la cirugía siguiente en un ratón anestesiado.
  12. Para el tratamiento post quirúrgico, colocar los animales en una placa de calefacción limpio y seco a 37 ° C en el área de la cirugía para el control adecuado durante el período de recuperación. Vigilar la frecuencia respiratoria, temperatura corporal y color de las mucosas y los ojos cada 10 minutos hasta que se despiertan.
  13. Transferir los ratones conscientes funcionados en una jaula con comida y agua separados de los otros animales hasta recuperación completa. Inyectar 0.1 mg/kg de buprenorfina s.c. para terapia analgésica postquirúrgica dos veces al día durante 72 h. regreso recuperado ratones a sus jaulas.
  14. Para determinar la eficacia del biomaterial, eutanasia la i.p. de ratones con una solución de 200 mg/kg ketamina y 24 mg/kg xilacina.
  15. En la implantación posterior de 8 – 12 semanas, decapita al eutanasia del ratón con unas tijeras afiladas.
  16. Fijar la cabeza decapitada de ratón en 30 mL de 4.5% tamponada con solución de formalina durante 1-2 semanas garantizar la penetración completa del fijador en el tejido.
  17. Transferir las cabezas en etanol al 70% para el almacenamiento a largo plazo a 4 ° C hasta por un año.
  18. Uso micro computarizada de tomografía (microCT) o técnicas histológicas undecalcified estandarizadas para evaluar la regeneración ósea. Es posible utilizar microCT análisis en muestras post mortem en alta resolución (90 kV, 4 min) en 2D y 3D sagital y frontal planos.
  19. Para histología undecalcified, deshidratar las cabezas en ascendente grados de etanol y embed en glicol metacrilato de metilo.
  20. Corte los bloques de metacrilato de metilo-encajado de glicol con una sierra de diamante y moler las secciones con un grosor de aproximadamente 80 – 100 μm.
  21. Evaluar Levai Laczko hueso secciones manchada para identificar la nueva formación de hueso14.

4. in Vitro la respuesta inmune

  1. Eutanasia el ingenuo 8 semana de edad intraperitoneal de ratones BALB/c con una solución de 200 mg/kg ketamina y 24 mg/kg xilacina.
  2. Coloque el ratón sobre su lado derecho, afeitarse la piel en el lado izquierdo y limpiar la piel sobre el lado izquierdo del abdomen con etanol al 70%.
  3. Hacer una 10 mm larga y profunda incisión de 1 mm en la piel del ratón en el lado izquierdo posteriorly siguiendo las costillas sobre el estómago con tijeras estériles.
  4. Abrir la piel y luego exponer el peritoneo. Hacer una 10 mm de largo y menos de 1 mm de profundidad de incisión en el peritoneo utilizando las tijeras bajo condiciones estériles.
  5. Empujar el estómago proximal para exponer el bazo.
  6. Sujete el bazo suavemente con pinzas estériles y quite cortando el tejido y vasos coloca por debajo de él.
  7. Coloque el bazo intacto en un tubo de 50 mL que contiene 10 mL de frío 1 x PBS estéril.
  8. Preparar una suspensión unicelular por picar el bazo con 2 pinzas estériles o 2 portaobjetos de vidrio estéril.
  9. Retire los residuos pasa por un colador de célula estéril de 40 μm con PBS 1 x fría utilizando el émbolo de una jeringa de 1 mL.
  10. Centrifugue la suspensión de células individuales a 300 x g durante 10 min a 4 ° C en un tubo cónico de 50 mL, aspirar y descartar el sobrenadante. Luego Resuspender el precipitado de células en 5 mL de tampón de lisis de glóbulos rojos (gr).
  11. Incubar la suspensión de células durante 14 minutos a temperatura ambiente y detener la reacción agregando 45 mL de medio de Roswell Park Memorial Institute (RPMI).
  12. Centrifugar las células después de la lisis de la célula a 300 x g durante 10 min a 4 ° C y luego descartar el sobrenadante.
  13. Esplenocitos resuspender en Medio RPMI con 10% había inactivado con calor FBS solución de penicilina-estreptomicina de 1%, 0,1% gentamicina, ß-mercaptoetanol 0,2% y 1% no esenciales aminoácidos.
  14. Incubar la espuma de β-TCP/C en una placa de cultivo de 96 pocillos estériles con Medio RPMI durante 24 h a 37 ° C y 5% de CO2 antes de sembrar células.
  15. Añadir esplenocitos en números titulados, por ejemplo., 1,25 x 105, 2,5 x 105 y 5 x 105/well a pozos de una placa de cultivo de tejidos de 96 pozos con Medio RPMI y aditivos, con o sin la espuma de β-TCP/C previamente incubada.
  16. Añadir 10 μg/mL concanavilina A (estafa A) disuelto en medio de un total de 100 μL/pocillo a los pocillos adecuados y luego incubar a 37 ° C y 5% de CO2 por 72 h.
  17. Proliferación de la célula de medida con un ensayo de bromodeoxiuridina (BrdU). Añadir 10 μL/pocillo de solución etiquetado de BrdU a las 48 h de cultivo celular y luego incubar la placa por una 24 h adicional.
  18. A las 72 h, recoger el sobrenadante y almacenar a-20 ° C hasta su uso posterior.
  19. Añadir 200 μL/pocillo de la solución de fijación a cada pozo y luego incubar durante 30 min a RT. Aspire la solución de fijación. Añadir 100 μL/pocillo de la solución de trabajo de anticuerpos anti-BrdU e incubar durante 90 minutos.
  20. Aspirar la solución de anticuerpo, enjuague los pozos tres veces con 200 – 300 μL/pocillo de solución de lavado y remueva la solución de lavado.
  21. Añada 100 μl de solución de sustrato incubar durante 3-10 min a temperatura ambiente y medir la absorbancia a 450 nm.
  22. Medir la interleucina-1β (IL-1β), interleucina-2 (IL-2), interleucina-4 (IL-4) e interferón-γ (IFN-γ) en los sobrenadantes recogidos usando un ELISA estándar.

5. alto rendimiento modelo Intraperitoneal

  1. Anestesiar ratones BALB/c antiguo de mujer 6-8 semanas con una mezcla de 100 mg/kg ketamina y 5 mg/kg i.p. de xilacina y agregar un gel o ungüento para los ojos para mantenerlos húmedos y coloque el ratón sobre una placa de calentamiento a 37 ° C durante todo el procedimiento para prevenir la hipotermia. Evaluar la profundidad de la anestesia por presión del dedo del pie y la cola.
  2. Afeitarse la piel abdominal y limpie con 7.5% povidona yodo solución y el 70% de etanol.
  3. Hacer una incisión de 8 mm largo de la línea media a través de la piel a lo largo de la linea alba. Hacer una pequeña incisión en el peritoneo con bisturí.
  4. PBS estéril lugar había empapado injertos de la espuma de β-TCP/C (2 x 2 x 2 mm3) en la cavidad peritoneal o sin había agregado de materiales para los ratones de control simulado de edad comparable.
  5. Suturar el peritoneo y la piel con sutura absorbible y no absorbible, respectivamente.
  6. Limpie todos los instrumentos quirúrgicos con esterilizante frío para mantener las condiciones estériles antes de realizar la cirugía siguiente en un ratón anestesiado.
  7. Para el tratamiento post quirúrgico, colocar los animales en una placa de calefacción limpio y seco a 37 ° C en el área de la cirugía para el control adecuado durante el período de recuperación. Vigilar la frecuencia respiratoria, temperatura corporal y color de las mucosas y los ojos cada 10 minutos hasta que se despiertan.
  8. Transferir los ratones conscientes funcionados en una jaula con comida y agua separados de los otros animales hasta recuperación completa. Volver totalmente recuperados ratones a sus jaulas.
    Nota: Este procedimiento induce un dolor mínimo. Terapia analgésica postquirúrgica generalmente no es necesaria. Si la operación los animales muestran signos de dolor, inyecta 0,1 mg/kg de buprenorfina s.c. u otro fármaco analgésico apropiado para aliviar el dolor.
  9. Eutanasia a la ratones 7 días tras la implantación, con una solución de 200 mg/kg ketamina y 24 mg/kg xilacina i.p.
  10. En la implantación después de 7 días, lavado de la cavidad peritoneal con un 1 mL jeringa con una aguja de 25 G para un total de 3 mL de PBS frío sujetando la cabeza de ratón y insertar la aguja en el cuadrante abdominal inferior izquierdo y el objetivo proximalmente.
    Nota: El líquido peritoneal debe estar libre de glóbulos rojos.
  11. Centrifugar el líquido de lavado peritoneal a 300 x g durante 5 min a 4 ° C y recoger el líquido peritoneal para almacenar a-20 ° C para la medición de ELISA de citoquinas IL-1β, IL-2 y IL-4.
  12. Aspirar el sobrenadante, Resuspender el precipitado de células en 1 mL de PBS y contar las células peritoneales con azul tripán en un hemocitómetro.
  13. Citocentrifuga la suspensión de células a 5 x 105 células en portaobjetos de vidrio, deje que los portaobjetos se seque y mancha para un conteo diferencial.
  14. Usando un microscopio de luz, cuenta un mínimo de 300 células en total y diferenciar a los macrófagos, eosinófilos, neutrófilos y linfocitos.

6. subcrónica modelo subcutánea

  1. Anestesiar ratones BALB/c hembra 6 – 8 semanas viejo con una mezcla de 100 mg/kg ketamina y 5 mg/kg i.p. de xilacina, agregar gel o ungüento para los ojos para mantenerlos húmedos y coloque el ratón sobre una placa de calentamiento a 37 ° C durante todo el procedimiento para prevenir la hipotermia. Evaluar la profundidad de la anestesia por presión del dedo del pie y la cola.
  2. Coloque el ratón sobre su espalda, afeitarse la piel abdominal y limpiar la superficie de afeitado con 7,5% povidona yodo solución y 70% etanol.
  3. Hacer una incisión de 8 mm largo de la línea media a través de la piel a lo largo de la línea alba del abdomen utilizando un bisturí y luego implante PBS empapado biomaterial (2 x 2 x 2 mm3) debajo de la piel o no añadir ningún material para los ratones de control simulado de edad comparable.
  4. Sutura la piel con una sutura no absorbible.
  5. Limpie todos los instrumentos quirúrgicos con esterilizante frío para mantener las condiciones estériles antes de realizar la cirugía siguiente en un ratón anestesiado.
  6. Para el tratamiento post quirúrgico, colocar los animales en una placa de calefacción limpio y seco a 37 ° C en el área de la cirugía para el control adecuado durante el período de recuperación. Vigilar la frecuencia respiratoria, temperatura corporal y color de las mucosas y los ojos cada 10 minutos hasta que se despiertan.
  7. Transferir los ratones conscientes funcionados en una jaula con comida y agua separados de los otros animales hasta recuperación completa. Volver totalmente recuperados ratones a sus jaulas.
    Nota: Este procedimiento induce un dolor mínimo. Terapia analgésica postquirúrgica generalmente no es necesaria. Si la operación los animales muestran signos de dolor, inyecta 0,1 mg/kg de buprenorfina s.c. u otro analgésico adecuado.
  8. Cuando esté listo para examinar el sitio de implantación, eutanasia la i.p. de ratones con una solución de 200 mg/kg ketamina y 24 mg/kg xilacina.
  9. Implantación después de ocho semanas, suprimir el sitio de implantación con el tejido (1 cm2) circundante.
  10. Fijar el tejido en solución de formalina al 4.5% tamponado durante la noche, incluir en parafina y cortadas en 4 secciones de μm.
  11. Mancha 4 secciones de tejido parafina-encajado de μm con hematoxilina y eosina (H & E) para la inflamación o el de Masson trichrome de fibrosis y deposición de colágeno.

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Representative Results

Para determinar β-TCP para su efectividad como un biomaterial para la reparación ósea, se utilizan in vitro y en vivo métodos de cribado. En primer lugar, medimos las respuestas OB a los discos de β-TCP en comparación con controles solo medio basal. Figura 2 se muestra la viabilidad de la OB en respuesta a discos de β-TCP a los 7 y 14 días de la cultura. Viabilidad celular de las células metabólicamente activas en los pozos de la cultura era el mismo para OBs con medio de cultivo de tejidos de plástico, así como con los discos de β-TCP que indica que este biomaterial no se mejora ni supresión de la proliferación de OB.

Para evaluar más lejos las OBs, medimos la actividad de la fosfatasa alcalina como marcador de diferenciación utilizando enfoques cualitativos y cuantitativos. La figura 2 ilustra la actividad de la enzima fosfatasa alcalina en los pozos de la cultura después de 7 días de la cultura. OBs en los pozos con el medio sólo tenían actividad de ALP de base, mientras que en mineralización óptima OBs medio (MM) tenían ALP intensa coloración, lo que refleja un alto nivel de diferenciación de OB. En contraste, las OBs platean en discos de β-TCP distinguidos menos que la OBs se incubaron en MM. En un ensayo, concentración de ALP fue 77% mayor para los pozos que contienen en comparación con el medio basal solamente, mientras que la concentración de ALP fue 40% menor en las células cultivadas en discos de β-TCP comparados a los controles MM de MM. Aunque estos resultados demuestran que las células cultivadas en discos de β-TCP distinguidos menos que aquellos con condiciones óptimas de plástico con MM, suficientemente diferenciadas en los biomateriales.

Otra característica crítica de OBs es su capacidad para inducir la mineralización, que es un paso esencial en la curación del hueso. Tinción de las células cultivadas de la OB con el ARS después de 14 días y encontró que la mineralización fue mayor para los controles de la MM en comparación con OBs cultivadas en medio solo y en discos de β-TCP en los pozos de cultivo (figura 2). Cuando medimos la concentración de ARS, nos encontramos con que los controles MM eran más de un 45% más alto que el grupo de β-TCP. Estos datos ilustran OBs cultivadas en plástico en presencia de MM maduro, diferenciaran y mineralizar mejor que aquellos con solo medio y en los discos de β-TCP.

Para determinar cómo OCs responder a discos de β-TCP, se utilizó una tecnología de cultivo en el que OBs se cultivan conjuntamente con precursores OC de la médula ósea seguidas por el examen de la morfología de la OC. Co-cultivos de OB-OC fueron observados a los 5 días y difieren sustancialmente entre las células cultivadas en plástico con OC DM y las células en láminas de hueso y β-TCP. En el plástico, la OCs eran grandes y generalizada que la OCs sobre sustratos fisiológicos eran más pequeños, menos extendido hacia fuera y forma irregular (figura 3). Para cuantificar la OCs, enumeró trampa + OCs y encontramos eran números más altos cuando se incuban con β-TCP (1755 ± 21.41/cm2) comparado con controles (1140 ± 15.71/cm2) de cultivo de tejidos y hueso rebanadas (709 ± 59.69/cm2), sugiriendo mayor diferenciación de OC en los discos de β-TCP (figura 3).

Para determinar una espuma de β-TCP/C disponible en el mercado en vivo, se utilizó un modelo de crítica tamaño defecto calvarial en ratones. Mostramos secciones histológicas representativas procesadas por una técnica histológica undecalcified con incrustación de glicol metacrilato de metilo y Levai Laczko tinción. MicroCT y la histología pueden utilizarse para evaluar la nueva formación de hueso dentro de la zona del defecto. Aquí, mostramos un ejemplo con las secciones histológicas en la figura 4. Cuando el defecto óseo inducida quirúrgicamente fue dejado vacío (simulada), se observó una capa delgada cubriendo el defecto todo, pero ninguna formación de hueso significativa estaba presente en 12 semanas post operación, confirmando el tamaño crítico de la fractura de hueso creado. Por el contrario, cuando el defecto contiene espuma de β-TCP/C, había restos de la espuma de β-TCP/C rodeados de tejido fibroso denso, incluyendo algunos vasos sanguíneos y células inflamatorias que tiende un puente sobre la zona del defecto sin la evidencia de la formación ósea.

Para evaluar la respuesta de cuerpo extraño, se evaluaron las reacciones inmunológicas y alérgicas a los biomateriales, usando un análisis en vitro . Figura 5 se muestra que cuando ingenuo splenocytes se incubaron con medio solo o con la espuma de β-TCP/C, las células de bazo de ingenuo no respondió por la proliferación o la producción de IL-2, IL-4 y las citocinas IFN-γ. En cambio, en ConA que culturas, proliferación celular y producción de citoquinas, aumentado excepto IL-1β. Respuestas celulares fueron afectado cuando cultivadas conjuntamente con ConA y la espuma de β-TCP/C en comparación con ConA solo, lo que indica esa espuma de β-TCP/C ni aumento ni disminución en vitro las respuestas.

Para determinar si la espuma de β-TCP/C inducida por una inmunorespuesta en vivo , hemos implantado 1) por vía intraperitoneal y medido de la célula inflamatoria cuentas y citocinas las concentraciones en el líquido de lavado peritoneal y 2) por vía subcutánea y evaluado inflamación y fibrosis en las secciones histológicas del sitio de implantación. En la tabla 1, la célula diferenciada en el líquido de lavado peritoneal revela que el número total de células inflamatorias fue significativamente mayor en los ratones de la espuma de β-TCP/C implantado en comparación con los controles del impostor. Además, hubo aumento en el número de todos los tipos de la célula. En la figura 6A, hay altas concentraciones de citoquinas IL-1β, IL-2 y IL-4 en la espuma de β-TCP/C en comparación con los controles del impostor. En ratones s.c. implantado de espuma de β-TCP/C, se observó una respuesta inflamatoria con cuerpo extraño células gigantes en H & secciones manchadas de E (Figura 6B) y evidencia de fibrosis en TRICROMICA de Masson secciones (figura 6) manchada en 8 semanas. En contraste, el sitio de implantación de los controles del impostor tenía inflamación mínima y sin fibrosis (figura 6).

Figure 1
Figura 1: extracción de Calvaria principal diagrama de aislamiento de células OB. El diagrama muestra cómo quitar el calvarium con 4 cortes (línea discontinua roja) con unas tijeras curvas. El primer corte es perpendicular al zócalo del ojo (R) derecho de X1 a X 2 y el segundo es perpendicular a enchufe de ojo izquierdo (L) de X3 a X 4. El tercer corte es separar la bóveda en el frente de X4 x 2 y el cuarto corte es separar la parte de atrás de X3 x 1. La bóveda craneal es entonces libre para quitarse. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: β-TCP-inducida en vitro OB diferenciación y maduración. Viabilidad de OB y la proliferación en los días 7 y 14 para las células cultivadas en medio solo (barras) o β-TCP (barras abiertas) (media ± SEM; n = 3). Cuantificación de actividad de fosfatasa alcalina de lysates de la célula y la normalización del contenido de proteína (μm DIFMU/μg proteína, media ± SEM, n = 3) con imágenes representativas que ilustran pozos cultura ALP-manchadas del día 7. Cuantificado de culturas ARS-teñidos por un método de extracción de cloruro de cetilpiridinio como la concentración de ARS la mineralización (μm ARS, media ± SEM, n = 3) con los pozos representante cultura ARS manchado el día 14. Los grupos incluyen hueso medio solo (BGM); Medio de mineralización (MM); Β-TCP. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: la diferenciación inducida por β-TCP en vitro OC. Microfotografías representativas muestran trampa + MNCs en día 5 después de co-cultivo ratón OBs y precursores de la médula ósea OC. Análisis de punto final de la trampa + células multinucleadas (MNCs) demuestra el recuento absoluto de trampa + MNCs (núcleos de la ≥ 3) por cm2 (media ± SEM, n = 3) ***p < 0.001. Los grupos incluyen diferenciación de OC solo medio (DM); Hueso; Β-TCP. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: evaluación In vivo del hueso de la espuma de β-TCP/C injertos en un modelo de crítica tamaño defecto calvarial. No cicatriza calvarial defectos creados en 8 semanas de edad hembra BALB/c (n = 3) ratones utilizando un trépano dental de 4 mm. Tratamiento grupos simulacro incluye control (defecto vacía) y defectos tratado con espuma de β-TCP/C. Secciones histológicas representativas en implantación después de 12 semanas. Las secciones tejido formalina-fijo glicol metacrilato de metilo-encajado (80 – 100 μm) teñido con tinte Levai Laczko. Fotomicrografías que se muestra a la baja (izquierda) y el aumento de alto (derecha). Triángulos negros indican el defecto óseo. Negro * denota el tejido óseo y blanco * se refiere a la espuma de β-TCP/C. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: β-TCP/C inducida por espuma en vitro célula proliferación y del cytokine producción. Esplenocitos de ratones BALB/c de ingenuo cultivadas en medio solo, con la espuma de β-TCP/C o ConA. Proliferación de sobrenadante celular (BrdU) y la producción de IL-1β, IL-2, IL-4 y el IFN-γ (medio ● solo ConA ○, ■ de la espuma de β-TCP/C, espuma de β-TCP/C y ConA □). Resultados de la proliferación presentados como la media de las muestras por triplicado (D.E. ± SEM) en el ensayo de BrdU y la media de las muestras duplicadas (pg/mL ± SEM) para la concentración de citoquinas de dos experimentos independientes. p < 0.05 se consideró significativo de biomaterial vs medio y biomaterial y ConA vs ConA solo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: La respuesta inmune In vivo del hueso de la espuma de β-TCP/C injertos en un modelo de ratón subcrónica y rápido alto rendimiento i.p.. (A) ratones hembra BALB/c implantado i.p. con espuma de β-TCP/C o sin agregar materiales (sham). Siete días después, peritoneal lavado analizados para concentraciones de citocinas (datos presentados como media del cytokine concentraciones pg/mL ± SEM). Estos datos son representativos de dos experimentos independientes (n = 5). p < 0.05 se consideró significativo comparado con el tratamiento simulado. (B-C) Ratones BALB/c femenino (n = 5) implantado s.c. con espuma de β-TCP/C o sin agregar materiales (sham). A las ocho semanas después de la implantación, la piel de los sitios de implantación teñidos con H & E (B) y de Masson Trichrome (C) para evaluar la inflamación y la fibrosis, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Farsa Vitoss
Célula cuenta x 106 (% de células totales)
Macrófagos 1.240 ± 0,051 (88.1) 3.262 ± 0.380 (70.4) p < 0.001
Eosinófilos 0.120 ± 0.011 (8.5) 1.181 ± 0.254 (25.5) p < 0.01
Neutrófilos ± 0.002 0.001 (0.2) ± 0.029 0.011 (0,6) NS
Linfocitos 0.048 ± 0.020 (3.2) 0.148 ± 0,041 (3.5) NS
Recuento de células totales 1.410 ± 0.066 4.620 ± 0.452 p < 0.001

Tabla 1: En vivo respuesta inmune de la espuma de β-TCP/C injertos en un modelo rápido de alto rendimiento del ratón i.p.. Mujer ratones BALB/c fueron implantados i.p. con espuma de β-TCP/C o sin materiales (sham). Siete días más tarde, lavado peritoneal fue obtenido y analizado para el número de células inflamatorias y recuento diferencial (datos presentados como media ± SEM de célula cuentas). Estos datos son representativos de dos experimentos independientes (n = 5).

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Discussion

A continuación, os mostramos un enfoque multidisciplinario para la evaluación preclínica de la biocompatibilidad de biomateriales representativos desarrollado para la reparación y regeneración ósea. Probamos las respuestas de OBs, OCs, y la respuesta curativa en vivo en un defecto óseo importante modelo en ratones, así como in vitro e in vivo las respuestas inmunitarias. El objetivo fue demostrar cómo los análisis del trabajan y resumen los datos y conclusiones derivadas de la examinación de los biomateriales. Mostramos que nuestra estrategia genera un valioso Perfil de biocompatibilidad del biomaterial de hueso.

Estudios de células primarias fueron utilizados para evaluar la función OB y OC. OBs están responsables de la formación del hueso y reparación fisiológica. Deben permanecer viables, diferenciar e inducir la mineralización. En este estudio, mostramos cómo realizar ensayos de viabilidad celular, ALP y ARS como marcadores de células fisiológicamente diferenciadas con capacidad de mineralizar. Los controles de los ensayos incluyeron solamente, que proporciona una línea de base medio osteogénico mineralización (MM), que ha optimizado la diferenciación y mineralización de OBs en el plástico. El grupo de control este último era una referencia estándar para el biomaterial. Para la evaluación de la OC, co cultivadas OBs y médula ósea OC precursores, distinguir los precursores en células multinucleadas, manchado con la trampa, una enzima osteoclástica ampliamente utilizado para identificar los OCs en vitro15 y luego enumerar las células usando microscopia ligera. Estos ensayos son de vanguardia y no requieren modificaciones. Sin embargo, observamos una limitación relacionada con la calidad de OBs primarias aisladas para mineralizar. OBs conservados son almacenados en nitrógeno líquido y utilizados dentro de un año para obtener resultados óptimos.

Actividad y accesorio OB fueron mayores en cultivo de tejidos de plástico que en los discos de β-TCP probado. Cuando se evaluaron las OCs, observamos las diferencias esperadas entre la respuesta al plástico y hueso, que es el sustrato fisiológico16. En comparación, hueso y β-TCP indujeron cambios morfológicos similares. La enumeración de ensayo de trampa de OCs en respuesta a los discos de β-TCP demostró que los números fueron significativamente diferentes entre sectores de hueso y β-TCP. Β-TCP indujo la mayor diferenciación de OC que en segmentos de hueso. Para la diferenciación de OC, trampa es un ensayo bien establecido. No había ninguna modificación importante en este método. Sin embargo, para obtener los mejores resultados, es esencial no incubar las células durante demasiado tiempo, o todas las células de origen monocítica se convertirá en trampa positiva.

Para abordar la respuesta en vivo , utilizamos espuma de β-TCP/C como un biomaterial ejemplar porque contiene β-TCP, que fue utilizado en los ensayos en vitro y colágeno y promueve la curación13del hueso. Aunque la espuma de β-TCP/C es comercialmente disponible y utilizado clínicamente para hueso reparación17,18, es sólo uno de muchos diferentes tipos de materiales que serían interesantes de estudiar, por ejemplo., (de fosfato de calcio bifásico hidroxiapatita-β-TCP), así como desmineralizado del hueso humano en estos ensayos para determinar las respuestas biológicas cómo diferencian entre materiales. Para la respuesta en vivo , hemos implantado la espuma de β-TCP/C en un defecto de tamaño crítico hueso calvarial en ratones y 12 semanas más tarde evaluó la histología y mostraron diferencias en comparación con controles de farsa. También es posible evaluar las respuestas con microCT que proporciona información complementaria19. El defecto en los ratones de control simulado no tenía ninguna formación de hueso significativa, como se esperaba, mientras que la espuma de β-TCP/C había inducido una respuesta inflamatoria, fibrosis y angiogénesis, que es la evidencia de la fase temprana de la formación ósea. Este método ha sido demostrado previamente en JOVE20. Sin embargo, nuestro enfoque diferenció en que utilizamos una técnica modificada "elevator" con un elevador perióstico para reducir el riesgo de lesionar la duramadre por el trépano. Razonamos que la duramadre juega un papel importante en el proceso de curación de defectos calvarial produciendo células osteogénicos y factores osteoinductores3,21,22,23. En particular, el material implantado, el tamaño del defecto y el método para crear el defecto influye en la regeneración ósea de defectos calvarial. Otra modificación en el procedimiento implicó la estabilización del biomaterial en el defecto calvarial con un pegamento de tejido biocompatible que rutinariamente se utiliza clínicamente para el cierre de la herida. Esta modificación garantiza que el material en el área de defecto no sería ser desplazado durante la cura.

Inflamación regula la primera fase de la curación del hueso, pero demasiada inflamación o respuesta alérgica puede reducir reparación11. La respuesta inmune ideal para biomateriales es iniciar una cascada inflamatoria que promueve la formación de hueso. Sin embargo, ciertos biomateriales podrían causar una respuesta de cuerpo extraño conduce a una serie de señales inflamatorias que provocan fibrosis o sensibilización alérgica. En nuestros estudios, evaluaron las respuestas inmunes a la espuma de β-TCP/C y encontró que no era tóxico para las células de bazo de ingenuo y no interferir con la expansión de linfocitos T ni funcionamiento (secreción de cytokine) cuando añadido a culturas con ConA. En los experimentos intraperitoneales, espuma de β-TCP/C inducida por inflamación y hubo algunas pruebas de un aumento de la eosinofilia y macrófagos con aumento concomitante de citoquinas de tipo Th1 y Th2. En los experimentos de implantación subcutánea, espuma de β-TCP/C también inducida por la inflamación, pero no había evidencia para una respuesta inflamatoria o alérgica crónica, destructiva, que sugiere que la espuma de β-TCP/C es biocompatible. Estos modelos proporcionan información sobre la respuesta inmune con biomateriales. En primer lugar, el modelo de vitro aborda el efecto del biomaterial en las células inmunes ingenuas en presencia de un mitógeno para demostrar que no hay ninguna supresión de la respuesta mitogénica causada por el biomaterial. En segundo lugar, el modelo intraperitoneal proporciona una lectura rápida de 7 días del tipo de respuesta inmune, por ejemplo., alérgica y la inflamación como por el tipo de infiltración de células inflamatorias y el perfil del cytokine. En tercer lugar, el modelo subcutáneo, subcrónico ilustra la respuesta tisular a largo plazo, permite la evaluación de la inflamación crónica, fibrosis, títulos de anticuerpos y puede utilizarse para probar la implantación repetida de las respuestas de memoria inmunológica. Estos modelos han sido publicados anteriormente y se muestran aquí sin cualquier modificación13. Es crucial que hay adecuados controles positivos y negativos para estos modelos. Sugerimos realizar los tres modelos para evitar las limitaciones de cada método. Mientras que los modelos que aparecen están bien establecidos en otras áreas de la inmunología, el enfoque para la prueba biomateriales es reciente.

En Resumen, los análisis óseos e inmune proporcionan un perfil de compatibilidad biológica en un biomaterial. Para hueso, OB y OC las respuestas que el biomaterial proporcionan datos preliminares necesarios antes de realizar experimentos con animales complicados y costosos y a respetar el principio de las 3Rs. Inmunológica en vitro ensayos proporcionan datos sobre reactividad cruzada del antígeno y la citotoxicidad, que también puede impedir más experimentos con animales. Los experimentos rápida de alto rendimiento ofrecen resultados en inflamatoria y la respuesta de citocinas (e.g., tipo de respuestas de linfocitos T), mientras que el modelo subcrónico es útil debido a los datos sobre la duración de la inflamación y el potencial para dañar fibrosis. Este nuevo enfoque interdisciplinario que incluye hueso y respuesta inmunitaria a biomateriales ofrece una excelente evaluación preclínica de biocompatibilidad para futuras aplicaciones en el campo de los materiales.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este proyecto de investigación ha recibido financiación del séptimo programa de marco de la Unión Europea (FP7/2007-2013) con beca Convenio núm. 263363.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Biomaterials
β-tricalcium phosphate disks (β-TCP, 14 mm) Disks were sintered in a muffle furnace at a temperature of 1150 °C. A detailed description of the production can be found in Zimmer et al (doi: 10.1002/jbm.a.34639). Samples were UV-irradiated (15 min for each side) before using in cell cultures.
Orthovita Vitoss foam (β-TCP/C foam) Orthovita 2102-1405
Mouse osteoblast culture
Alizarin Red S Sigma-Aldrich A5533
ALP assay buffer (2x) pH 10.4 Dissolve 200 mM glycine, 2 mM magnesium chloride, 2 mM zinc chloride in ultrapure water and adjust to pH 10.
Bone growth medium (BGM) α-MEM + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin/streptomycin
Cell lysis buffer: CyQuant cell lysis buffer 20x concentrate Thermo Scientific C7027 Dilute the concentrated cell lysis buffer stock 20-fold in ultrapure water. 
Cell viability reagent: Presto Blue cell viability reagent Invitrogen, Thermo Fisher Scientific A13261
Collagenase type IV from clostridium histolyticum Sigma-Aldrich C5138
DC protein assay kit II Bio Rad 5000112 DC protein assay kit contains reagent A, reagent B, reagent S and BSA for the reference standard. For reagent A', add 20 µL reagent S to 1000 µL reagent A. 
Dimethylsulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D8418 Steril-filter DMSO before usage. 
Dispase II (neutral protease, grade II) Roche 4942078001
EnzCheck Phosphatase Assay Kit for alkaline phosphatase activity  Invitrogen, Thermo Fisher Scientific E12020 EnzCheck Phosphatase Assay Kit contains 6,8-difluoro-4-methylumbelliferyl phosphate (DiFMUP), N,N-dimethylformamide and 6,8-difluoro-7-hydroxy-4-methylcoumarin (DiFMU). 
Fetal bovine serum (FBS) Sigma-Aldrich F7524
Formalin solution neutral buffered 10% Sigma-Aldrich HT501128
Glycine Sigma-Aldrich G8898
Hexadecylpyrdinium (cetylpyridinium) chloride monohydrate Sigma-Aldrich C9002
L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate Sigma-Aldrich A8960
Magnesium chloride hexahydrate Sigma-Aldrich M2670
MEM alpha medium (α-MEM) Gibco Life Technologies  11900-073
Osteogenic mineralization medium (MM) α-MEM + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin-streptomycin + 50 µg/mL ascorbic acid + 5 mM β-glycerophosphate
Penicillin-streptomycin   Sigma-Aldrich P4333
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 Gibco, Thermo Fisher Scientific  10010023
Sigmafast BCIP/NBT Sigma-Aldrich B5655
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red (10x) Gibco, Thermo Fisher Scientific  15400054 Dilute the concentrated stock solution 10-fold in 1x PBS. 
Tween20 Sigma-Aldrich P1379
Ultrapure water: Cell culture water pyrogen free VWR L0970-500
Wash buffer Add  0.05% Tween20 to 1x PBS.
Zinc chloride Sigma-Aldrich 1.08816
β-Glycerophosphate disodium salt hydrate Sigma-Aldrich G5422
24-well suspension culture plate Greiner bio-one 662102
24-well tissue culture plate Greiner bio-one 662160
50 mL conical tube Greiner bio-one 227261
96-well black plate Greiner bio-one 655076
96-well transparent plate Greiner bio-one 655001
Centrifuge: VWR Mega Star 600R VWR
CO2-Incubator: HeraCell 240 Thermo Scientific
Cryovial 2 mL Greiner bio-one 122263
Disposable filter unit FP30/0.2 CA-S GE Healthcare Life Sciences Whatman 10462200 For sterile filtration of enzyme solution.
Flatbed scanner: Epson Perfection 1200 Photo Epson
Infinite M200 Pro microplate reader Tecan
Microcentrifuge tube: Eppendorf tube safe-lock 0.5 mL VWR 20901-505
Microcentrifuge tube: Eppendorf tube safe-lock 1.5 mL VWR 21008-959
Shaker Swip (orbital and horizontal)  Edmund Buehler 
Shaking incubator GFL3032 GFL  3032
Single-use pipet: serum pipet Greiner bio-one 612301
Sterile instruments (scissors, tweezer, curved forceps)
Tissue culture plate (10 cm) Greiner bio-one 664960
Mouse osteoblast-osteoclast co-culture
1α,25-Dihydroxyvitamin D3 Sigma-Aldrich 17936 1000x concentrated stock (10 µM in ethanol 100%)
Acetone VWR Chemicals 22065.327
Bone growth medium (BGM) α-MEM + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin-streptomycin
Distilled water Carl Roth 3478.4
Ethanol (100% vol/vol) VWR Chemicals 20821.365
Ethanol (70% vol/vol) VWR Chemicals 93003.1006
Fast red violet LB salt Sigma-Aldrich F3381
Fetal bovine serum (FBS) Sigma-Aldrich F7524
Formalin solution neutral buffered 10% Sigma-Aldrich HT501128
MEM alpha Medium (α-MEM) Gibco Life Technologies  11900-073
N,N-Dimethylformamide Sigma-Aldrich D4551
Naphthol AS-MX phosphate Sigma-Aldrich N4875
Osteoclast differentiation medium (DM) α-MEM + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin-streptomycin + 1 nM 1,25-(OH)2-vitamin D3 + 1 µM prostaglandin E2 
Penicillin-streptomycin  Sigma-Aldrich P4333
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 Gibco, Thermo Fisher Scientific  10010023
Prostaglandin E2 (PGE2) Cayman Chemical Company 9003016 1000x concentrated stock (1 mM in ethanol 100%)
Sodium acetate trihydrate Sigma-Aldrich S7670
Sodium tartrate dibasic dihydrate Sigma-Aldrich S8640
Sterile instruments (scissors, forceps, scalpel)
TRAP buffer pH 5.0 Dissolve 40 mM sodium acetate, 10 mM sodium tartrate in ultrapure water and adjust to pH 5.
Ultrapure water: Cell culture water pyrogen free VWR L0970-500
24-well suspension culture plate Greiner bio-one 662102
24-well tissue culture plate Greiner bio-one 662160
50 mL conical tube Greiner bio-one 227261
Centrifuge: VWR Mega Star 600R VWR
CO2-Incubator: HeraCell 240 Thermo Scientific
Diamond wafering blade (10.2 cm x 0.3 cm) Buehler
Isomet low-speed saw Buehler
Petri dish (6 cm) Greiner bio-one 628,161
Screw cap glass bottle 20 mL Carl Roth EXY4.1
Single-use sterile syringe 1 mL Henry Schein Animal Health 9003016
Single-use pipet: serum pipet Greiner bio-one 612301
Sterile needle: Hypodermic needle RW 27 G x 3/4'' Henry Schein Animal Health 9003340
Mouse calvarial defect model
Analgesia: Buprenorphine (Bupaq) Richter Pharma AG
Anesthesia: Ketamine (Ketamidor), Xylazine (Rompun) Richter Pharma AG/Bayer HealthCare
Cold sterilant: SafeSept Max Henry Schein Animal Health 9882765
Ethanol (70% vol/vol) VWR Chemicals 93003.1006
Eye ointment: VitA POS 5 g Ursapharm
Normal saline solution (0.9% sodium chloride solution) Fresenius Kabi
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 Gibco, Thermo Fisher Scientific  10010023
Povidone iodine solution: Braunol 1000 mL B. Braun 3864154
Roti-Histofix 4.5% buffered formalin Carl Roth 2213.6
Tissue adhesive: Histoacryl 5 x 0.5 mL  B. Braun Surgical 1050060
Personal protective equipment: surgical gloves, cap and mask, gown Henry Schein Animal Health 1045073, 1026614, 9009062, 370406
Sterile instruments (scalpel, scissors, forceps, needle holder)
Sterile needles: Hypodermic needles RW 27 G x 3/4'' and 30 G x 1/2''  Henry Schein Animal Health 9003340, 9003630
Single-use sterile syringe 1 mL Henry Schein Animal Health 9003016
Heating plate: Physitemp Rothacher Medical TCAT-2LV
Sterile gauze swabs Henry Schein Animal Health 220192
Sterile disposable scalpel (Figur 20) Henry Schein Animal Health 9008957
Surgical/dental drill: Implantmed SI-923 W&H Dentalwerk Bürmoos GmbH 16929000
Handpiece type S-II W&H Dentalwerk Bürmoos GmbH 30056000
Trephine, diameter 4 mm Hager&Meisinger GmbH 229040
Irrigation tubing set 2.2 m W&H Dentalwerk Bürmoos GmbH 4363600
Periosteal elevator 2 mm / 3 mm Henry Schein Animal Health 472683
Non-resorbable suture: Polyester green, DS19, met. 1.5, USP 4/0 75 cm Henry Schein Animal Health 300715
In vitro immune responses
Anesthesia for euthanasia: Ketamine (Ketamidor), Xylazine (Rompun) Richter Pharma AG/Bayer HealthCare
Cell Proliferation ELISA, BrdU (colorimetric) Assay Kit Sigma-Aldrich 11647229001 The kit contains BrdU labeling solution, fixation solution (FixDenat), Anti-BrdU antibody solution, washing buffer and substrate solution. 
Concanavalin A (ConA) MP Biomedicals 150710
Culture medium splenocytes RPMI medium + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin-streptomycin solution + 0.1% gentamicin + 0.2% ß-mercaptoethanol + 1% non-essential amino acids
Ethanol (70% vol/vol) VWR Chemicals 93003.1006
Fetal bovine serum (FBS) Gibco, Thermo Fisher Scientific  10500064
Gentamicin Gibco, Thermo Fisher Scientific  15750037
Mouse IL-1β ELISA Ready-SET-Go! Invitrogen, Thermo Fisher Scientific 88-7013-88
Mouse IL-2 ELISA MAX Standard BioLegend 431001
Mouse IL-4 ELISA MAX Standard BioLegend 431101
Mouse INF-γ ELISA MAX Standard BioLegend 430801
Non-essential amino acids solution Gibco, Thermo Fisher Scientific  11140050
Penicillin-streptomycin  Gibco, Thermo Fisher Scientific  15140122
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 Gibco, Thermo Fisher Scientific  10010023
Red blood cell (RBC) lysis buffer: BD Pharm Lyse BD Bioscience 555899
RPMI 1640 medium, HEPES Gibco, Thermo Fisher Scientific  52400025
β-Mercaptoethanol Gibco, Thermo Fisher Scientific  31350010
50 mL conical tube Greiner bio-one 227261
96-well tissue culture plate Greiner bio-one 655180
Centrifuge: VWR Mega Star 600R VWR
Cell strainer 40 µm BD Bioscience 352340
Infinite M200 Pro microplate reader Tecan
Single-use sterile syringe 1 mL Henry Schein Animal Health 9003016
Sterile surgical instruments (forceps, glass slides)
High throughput intraperitoneal model
Anesthesia: Ketamine (Ketamidor), Xylazine (Rompun) Richter Pharma AG/Bayer HealthCare
Cold sterilant: SafeSept Max Henry Schein Animal Health 9882765
Ethanol (70% vol/vol) VWR Chemicals 93003.1006
Eye ointment: VitA POS 5 g Ursapharm
Mouse IL-1β ELISA Ready-SET-Go! Invitrogen, Thermo Fisher Scientific 88-7013-88
Mouse IL-2 ELISA MAX Standard BioLegend 431001
Mouse IL-4 ELISA MAX Standard BioLegend 431101
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 Gibco, Thermo Fisher Scientific  10010023
Povidone iodine solution: Braunol 1000 mL B. Braun 3864154
Shandon Rapid-Chrome Kwik-Diff Staining Kit Thermo Scientific 9990700 For differential cell count.
Heating plate: Physitemp Rothacher Medical TCAT-2LV
Hemocytometer: Neubauer chamber Carl Roth PC72.1
Non-resorbable suture: Ethibond Excel 4-0 Ethicon 6683H
Resorbable suture: Polysorb Covidien SL-5628
Shandon centrifuge for cytopsin Thermo Scientific
Single-use sterile syringe 1 mL Henry Schein Animal Health 9003016
Sterile gauze swabs Henry Schein Animal Health 220192
Sterile needles: Hypodermic needles RW 27 G x 3/4'' and 25 G Henry Schein Animal Health 9003340, 420939
Sterile surgical instruments (scalpel, scissors, forceps, needle holder)
Trypan blue solution 0.4% Gibco, Thermo Fisher Scientific  15250061
Subchronic subcutaneous model
Anesthesia: Ketamine (Ketamidor), Xylazine (Rompun) Richter Pharma AG/Bayer HealthCare
Cold sterilant: SafeSept Max Henry Schein Animal Health 9882765
Ethanol (70% vol/vol) VWR Chemicals 93003.1006
Eye ointment: VitA POS 5 g Ursapharm
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 Gibco, Thermo Fisher Scientific  10010023
Povidone iodine solution: Braunol 1000 mL B. Braun 3864154
Roti-Histofix 4.5% buffered formalin Carl Roth 2213.6
Heating plate: Physitemp Rothacher Medical TCAT-2LV
Non-resorbable suture: Ethibond Excel 4-0 Ethicon 6683H
Personal protective equipment: surgical gloves, cap and mask, gown Henry Schein Animal Health 1045073, 1026614, 9009062, 370406
Single-use sterile syringe 1 mL Henry Schein Animal Health 9003016
Sterile gauze swabs Henry Schein Animal Health 220192
Sterile instruments (scalpel, scissors, forceps, needle holder)
Sterile needle: Hypodermic needles RW 27 G x 3/4''  Henry Schein Animal Health 9003340, 420939

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References

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Kampleitner, C., Obi, J., Vassilev, N., Epstein, M. M., Hoffmann, O. Biological Compatibility Profile on Biomaterials for Bone Regeneration. J. Vis. Exp. (141), e58077, doi:10.3791/58077 (2018).

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