Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Profil de compatibilité biologique sur les biomatériaux pour la régénération osseuse

Published: November 16, 2018 doi: 10.3791/58077
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 1
1Department of Pharmacology and Toxicology, University of Vienna, 2Laboratory of Experimental Allergy, Division of Immunology, Allergy and Infectious Diseases, Department of Dermatology, Medical University of Vienna

Summary

Le nombre de nouveaux biomatériaux conçus pour réparer les lésions osseuses importantes est en expansion continue dans le but d’améliorer la guérison osseuse et surmonter les complications associées à la transplantation osseuse. Nous présentons ici une stratégie multidisciplinaire pour les tests de biocompatibilité préclinique de biomatériaux pour la réparation osseuse.

Abstract

Fractures osseuses importantes de non syndiqués sont un défi en chirurgie orthopédique. Bien qu’auto - et greffe osseuse allogénique est excellente pour la guérison des lésions, il y a des complications potentielles à leur utilisation. Ainsi, matériels scientifiques mettent au point des biomatériaux synthétiques, biocompatibles pour résoudre ces problèmes. Dans cette étude, nous présentons une plateforme multidisciplinaire pour l’évaluation de biomatériaux pour la réparation osseuse. Nous avons combiné expertise biologie osseuse et d’immunologie de développer une plate-forme y compris in vitro ostéoclastes (OC) et dosages des ostéoblastes (OB) et in vivo de modèles murins de la réparation osseuse, immunogénicité et d’allergénicité. Nous montrent comment réaliser les expériences, résument les résultats et rapport sur la biocompatibilité de biomatériau. En particulier, nous avons testé la viabilité de l’OB, la différenciation et minéralisation et viabilité OC et différenciation dans le contexte des disques de β-tricalcium phosphate (β-TCP). Nous avons aussi testé une mousse (β-TCP/C) de β-TCP/collagène qui est un matériau disponible dans le commerce, utilisé en clinique pour la réparation osseuse dans un modèle murin de taille critique de substance osseuse défaut pour déterminer les effets sur la première phase de cicatrisation osseuse. Dans des expériences parallèles, nous avons évalué les réponses immunitaires et allergiques chez les souris. Notre approche génère un profil de compatibilité biologique d’un biomatériau osseux avec une gamme de paramètres nécessaires pour prédire la biocompatibilité des biomatériaux utilisés pour la guérison osseuse et la réparation chez les patients.

Introduction

La réparation osseuse est un processus complexe qui commence par la formation d’un hématome, une inflammation, Cal formation et remodelage puis1,2. Toutefois, le potentiel de régénération osseuse est limité à la taille de l’OS fracture1,3. Par exemple, les fractures des os grand causées par un traumatisme, le cancer ou l’ostéoporose ne peuvent pas guérir et sont appelées fractures osseuses non syndiqués. Ces lésions osseuses nécessitent souvent des traitements pour promouvoir la régénération et la réparation osseuse physiologique sain. Actuellement, autogreffe et allogreffe osseuse transplantation est l’approche de choix4 avec les procédures de remplacement des OS 2,2 millions par an5. Bien que ces procédures ont un taux de réussite élevé, il peut y avoir des complications, par exemple, la disponibilité limitée des os, infection, morbidité du site donneur et rejet4. De nouvelles alternatives pour l’ingénierie tissulaire osseuse sont recherchés pour relever ces défis.

La conception des biomatériaux à base de polymères naturels ou synthétiques, des biocéramiques ou des métaux en combinaison avec les cellules et molécules bioactives est sur l' élévation6. Notre compréhension actuelle des os physiologiques de guérison et de guérison dans le contexte des biomatériaux dépend de divers facteurs tels que les propriétés mécaniques et de multiples facteurs les et systémiques, y compris les cellules de la circulation et le site de fracture7 ,8,9. Biomatériaux pour la régénération osseuse vise à promouvoir les osteogenicity et ostéointégration10 et est idéalement biocompatible et biodégradable poreux (promotion de nutriments, l’oxygène et la migration cellulaire). Ils doivent également être suffisamment solide pour supporter le site fracture pour soulager la douleur. En outre, des facteurs inflammatoires sont tenus d’engager le processus de guérison. Toutefois, si le biomatériau induit une inflammation excessive et réactions allergiques, cela pourrait limiter ou inhiber l’OS guérison11,12. Ainsi, une approche interdisciplinaire est nécessaire pour évaluer les biomatériaux destinés à la réparation osseuse.

Dans cette étude, nous présentons une évaluation préclinique de matières représentatives, 1) Orthovita Vitoss mousse qui est un substitut de greffe disponible dans le commerce d’os spongieux consistant en phosphate tricalcique composée de taille nanométrique pur β tricalcique les particules de phosphate (β-TCP) et collagène bovin de Type 1 (C) (β-TCP/C mousse) et 2) des disques de β-TCP. Ici, nous illustrons test de biocompatibilité de ces biomatériaux à l’aide des ostéoblastes primaires (OB) et dosages des ostéoclastes (OC), un modèle in vivo de la réparation osseuse, une évaluation immunologique comprenant in vitro la prolifération des lymphocytes T et la production de cytokines et in vivo de l’immunogénicité et l’allergénicité, comme indiqué précédemment13.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Les procédures ont été effectuées avec des souris BALB/c après toutes les directives pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire du Ministère autrichien de l’Education, Science and Research et ont été approuvés par le Comité sur l’éthique du Ministère autrichien de l’Education, Science et de la recherche.

1. primaire souris OB Culture

  1. Isolement d’OB de calotte cranienne de souris néonatales par digestion enzymatique
    1. Euthanasier les chiots nouveau-nés vieux de 1 à 2 jour (60 au total) par décapitation et placez les têtes dans une boîte de Pétri stérile 1 x solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
    2. Maintenez la tête par la nuque et couper la peau suite à l’aide de ciseaux stériles. Inciser la voûte crânienne en perçant il (environ 0,1 à 0,3 mm) avec une paire de ciseaux qui est ensuite insérés sous la voûte crânienne à l’arrière de la tête à la base du crâne et couper le long du bord substance latéralement de l’arrière vers l’avant au-dessus des oreilles et puis abov e l’arête nasale (Figure 1).
    3. Incuber calvaria disséqué avec 8 mL de solution de digestion filtre stérilisé (300 unités/mL collagénase type IV et 2,14 a unités/mL II dissous dans un milieu essentiel minimum α (α-MEM)) dans un tube conique de 50 mL à 37 ° C pendant 10 min dans un incubateur à agitation à 200 shakes / min.
    4. Jeter le surnageant première et répéter le processus de digestion trois fois avec 8 mL de solution de digestion. Récupérer le surnageant contenant les cellules après chaque étape de la digestion et l’ajouter à un tube conique de 50 mL. Ranger le tube conique de 50 mL avec les cellules dans un bain d’eau glacée avant d’avoir terminé la procédure de la digestion (environ 40 min).
    5. Centrifuger les cellules à 300 g pendant 5 min à 4 ° C, aspirer le surnageant (avec une pipette Pasteur attachée à une pompe à vide) et resuspendre dans 40 mL de milieu de croissance osseuse (BGM) contenant des α-MEM avec 10 % inactivés par la chaleur bovine sérum fœtal (SVF) et 1 % solution de pénicilline-streptomycine. Ajouter ensuite 10 mL de la suspension cellulaire aux 4 plaques de culture de tissus (10 cm).
    6. Culture des cellules à 37 ° C et 5 % de CO2 jusqu’au confluent (2 – 3 jours).
    7. Au confluent, aspirer le milieu vieux et laver les plaques de culture de tissu une fois avec du PBS 1 x (37 ° C). Puis aspirer le PBS et ajouter 2 mL de solution de trypsine 1 x contenant 0,5 % d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) pour chaque plaque de culture de tissu de 10 cm.
    8. Incuber les boîtes de 4 culture à 37 ° C et 5 % de CO2 pendant 5 min, puis vérifiez les plaques avec un microscope inversé léger pour s’assurer que les cellules sont détachent de la matière plastique. Puis transférez toutes les suspensions cellulaires (total 8 mL) dans un tube conique de 50 mL contenant 10 mL de BGM fraîche. Lavez chaque plaque avec 5 mL de frais BGM et transfert vers le même tube conique de 50 mL.
    9. Centrifuger les cellules à 300 g pendant 5 min à 4 ° C, aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules de 16 mL de BGM fraîche. Préparer 16 nouvelles 10 cm tissue culture plaques (Division 1:4) contenant 9 mL de BGM. Ajouter 1 mL de la suspension cellulaire dans chaque assiette.
    10. Répétez les étapes 1.1.6. à 1.1.8.
    11. Centrifuger les cellules à 300 g pendant 5 min à 4 ° C, aspirer le surnageant et remettre en suspension dans 10 mL de BGM fraîche. Compter les cellules et calculer la concentration en cellules.
      Remarque : Cette procédure génère environ 7,5 – 8,3 x 105 cellules/chiot.
    12. Centrifuger à 300 x g pendant 5 min à 4 ° C, aspirer le surnageant et remettre en suspension dans de la moyen 10 % contenant du diméthyl sulfoxyde (DMSO), α-MEM de 40 % et 50 % FBS. Transfert en 1,5 mL de la suspension cellulaire à 2 mL cryovials pour un total de 2 x 106 cellules par flacon.
    13. Flash gel les flacons dans l’azote liquide pour le stockage à long terme dans un réservoir d’azote liquide. Utiliser les cellules dans l’année afin d’assurer la pleine fonctionnalité. Utilisent ces OBs primaires pour évaluer la prolifération (étape 1.2), la différenciation (dosages ALP : étape 1.4., 1.5.) et la minéralisation (étape 1.6.) en présence des biomatériaux. Utiliser ces cellules pour la maturation des précurseurs d’OC OS-moelle osseuse en co-culture (étape 2.3).
  2. Essai de prolifération OB
    1. Incuber les disques de β-TCP de diamètre de 14 mm dans 1 mL de BGM dans une plaque 24 puits suspension de culture à 37 ° C et 5 % de CO2 pendant 24 h avant d’ajouter les plaques de vitroplants standard OBs. utilisation primaires pour les contrôles et les plaques de culture de suspension pour les exemples de biomatériau pour éviter la fixation des cellules de la matière plastique.
    2. Aspirer le milieu d’incubation avant et puis remettre en suspension les OBs de souris primaire de BGM. Ajouter 4,4 x 104 OBs/cm2 sur les disques pré-incubées β-TCP dans une plaque de culture 24 puits suspension et pour le groupe témoin, dans une plaque de culture de tissus de 24 puits (1 mL/puits). OBs seront attachera à la plaque de culture tissulaire ou ce biomatériau.
    3. Incuber pendant 14 jours à 37 ° C et 5 % de CO2. Au cours de la période d’incubation, changer le milieu tous les 2-3 jours et ajouter 1 mL de BGM frais dans chaque puits.
    4. Pour évaluer la prolifération de l’OB, transférer les disques de β-TCP 7 et 14 jours à nouveaux puits d’exclure les signaux provenant des cellules cultivées sur la plaque de culture de suspension.
    5. Aspirer le milieu ancien, ajouter 0,5 mL de BGM (37 ° C) et incuber les boîtes de culture pendant 30 min à 37 ° C et 5 % de CO2. Puis ajoutez 55 µL de 10 x réactif de prolifération cellulaire (01:10 dilution) directement dans le puits de la culture. Pour les flans, préparer trois puits contenant 0,5 mL de BGM et 55 µL de la prolifération des hématies 10 x. Incuber les boites pendant 30 min à 37 ° C et 5 % de CO2.
    6. Retirer et de transférer 150 µL de surnageant de chaque puit dans une plaque 96 puits noire et de lire la fluorescence avec excitation à 560 nm et d’émission à 590 nm. Soustraire les lectures vierges d’après les relevés de l’échantillon.
  3. Tests de différenciation et de la minéralisation OB
    1. Incuber les disques de β-TCP de diamètre de 14 mm dans 1 mL de BGM dans une plaque 24 puits suspension de culture à 37 ° C et 5 % de CO2 pendant 24 h avant d’ajouter les plaques de culture de tissus standard OBs. utilisation des contrôles et des plaques de culture de suspension pour les échantillons de biomatériau éviter fixation des cellules de la matière plastique.
    2. Aspirer le milieu d’incubation avant et puis remettre en suspension les OBs de souris primaire de BGM. Ajouter 8,8 x 104 OBs/cm2 sur les disques pré-incubées β-TCP dans une plaque de culture 24 puits suspension et pour le groupe témoin, dans une plaque de culture de tissus de 24 puits (1 mL/puits). OBs seront attachera à la plaque de culture de tissus ou de l’échantillon de biomatériau.
    3. Remplacez le BGM par 1 mL de milieu de minéralisation ostéogénique (MM) contenant des BGM, 50 µg/mL d’acide ascorbique et 5 mM β-glycérophosphate 24h après l’ajout de l’OBs et incuber pendant 14 jours à 37 ° C et 5 % de CO2. Changer le milieu tous les 2 – 3 jours avec 1 mL de MM fraîchement préparée dans chaque puits.
  4. Différenciation d’OB évaluée par l’activité de la phosphatase alcaline (ALP) de lysats cellulaires
    1. Pour mesurer l’activité de l’ALP le 7e jour après l’addition de MM, aspirer le milieu de culture des puits et laver ensuite avec 1 mL de PBS stérile 1 x (37 ° C). Aspirez soigneusement le PBS pour permettre les cellules attachées à rester sur le plastique de culture de tissus ou de biomatériau et figer les plaques à-80 ° C.
    2. Après 24 h (ou jusqu'à 2 semaines), décongeler le contrôle vitroplants plaque et la plaque de culture de suspension de biomatériau à température ambiante (RT) de préparer pour la lyse OB. Pour les échantillons de biomatériau, transférer les disques de β-TCP dans une plaque de culture nouvelle suspension pour exclure les cellules fixés à la plaque. Ajouter 75 µL / puits de la 1 x tampon de lyse cellulaire pour les deux plaques. Agiter les plaques pendant 5 min sur un agitateur à 400 secousses/min.
    3. Transvaser le lysat cellulaire dans un tube à microcentrifugation 0,5 mL et centrifuger à 300 x g pendant 6 min à ta pour enlever les débris. Ajouter 50 µL de surnageant lysat cellulaire échantillon sur une plaque de 96 puits noire et puis ajouter 50 µL d’une solution composée de 200 µM 6,8-difluoro-4-méthylumbelliféryl phosphate (DiFMUP) un substrat fluorogène dissous dans 2 x ALP solution tampon (pH 10 / puits). Mis en place deux puits vides avec 100 µL d’une solution de 1:1, contenant 1 x buffer de lyse cellulaire et 2 x ALP.
    4. Préparer 8 étalons de référence avec 100 μL/puits avec le 6,8-difluoro-7-hydroxy-4-methylcoumarin (DiFMU) variant de 0,5 à 200 μM dissous dans une solution contenant 1 x cellule lysis buffer et 2 x ALP pour générer une courbe de référence standard 1:1.
    5. Incuber les plaques noires à 37 ° C pendant 15 min et puis lire la fluorescence avec l’excitation à 358 nm et d’émission à 455 nm. Soustraire les lectures vides des étalons de référence et des lectures des échantillons.
    6. Normaliser l’activité enzymatique ALP des lysats cellulaires à la quantité totale de protéine à un dosage colorimétrique pour la concentration en protéine. Préparer l’albumine sérique bovine étalons de référence de protéine (BSA) à une plage allant de 0,05 à 2,5 µg/µL dissous dans 1 x tampon de lyse cellulaire pour générer la courbe d’étalonnage.
    7. Préparer les lysats cellulaires échantillon et normes protéique BSA en doublons. Ajouter 5 µL de la cellule lysate ou 5 µL de protéine BSA standard dans une plaque à 96 puits, puis ajouter 25 µL de réactif A' et 200 µL de réactif B. Set up deux puits vides 5 µl de 1 x tampon de lyse cellulaire. Incuber les plaques à RT pendant 15 min et puis lire l’absorbance à 690 nm. Soustraire les lectures vides des étalons de référence et des lectures des échantillons.
  5. Différenciation d’OB évaluée par coloration ALP en culture cellulaire
    1. Tacher ALP en OBs cultivées sur jour 7 après l’addition de MM sur une plaque de culture de tissus de contrôle et le biomatériau dans une plaque de culture de suspension.
    2. Aspirer le milieu de culture des puits et remplacez-le avec 0,5 mL de PBS 1 x (37 ° C). Aspirer le PBS et fixer les cellules en les incubant dans 0,5 mL de formol 10 % tamponnée à ta pendant 1 min.
    3. Aspirer le formol 10 % tamponnée avec une pipette à usage unique et ajouter 0,5 mL de tampon de lavage (0,05 % Tween20 dans du PBS 1 x).
    4. Dissoudre un comprimé de substrat 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate/nitrobleu tétrazolium (BCIP/NBT) dans 10 mL d’eau ultrapure et vortex jusqu'à dissolution complète. La solution doit être protégée de la lumière et utilisée moins de 2 h.
    5. Aspirer le tampon de lavage et remplacez avec 0,5 mL de solution de substrat BCIP/NBT et incuber la plaque à la RT dans l’obscurité pendant 10 min. aspirer la solution colorante et par 0,5 mL de tampon de lavage.
    6. Transférer les disques colorés β-TCP dans un nouveau puits et numériser les plaques ALP tachée avec un scanner à plat conventionnel à la souillure d’ALP record.
  6. Minéralisation OB évaluée par coloration avec l’alizarine rouge S (ARS)
    1. Aspirer le milieu de culture par les puits contenant primaire OBs 14 jours après l’addition de MM et rincer deux fois avec 0,5 mL de PBS 1 x à RT. aspirer le PBS et fixer les cellules en ajoutant 0,5 mL de la 10 % tamponnée solution de formol à RT pendant 10 min.
    2. Aspirer le formol 10 % tamponnée avec une pipette à usage unique et laver deux fois avec 0,5 mL de l’eau ultrapure.
    3. L’OBs fixes, ajouter 0,25 mL de solution de coloration de ARS de 40 mM (pH 4,2) dissous dans l’eau ultrapure et incuber la plaque à RT pendant 10 min sur un agitateur à 100 secousses/min.
    4. Aspirer la solution colorante avec une pipette à usage unique et rincer avec 1 mL d’eau ultrapure. Répéter cette étape 5 à 10 fois pour supprimer non-spécifique de coloration.
      Remarque : La solution de lavage doit être sans couleur.
    5. Aspirer l’eau ultrapure et ajouter 1 mL de PBS froid. Incuber la plaque à RT pendant 10 min sur un agitateur à 100 secousses/min.
    6. Aspirer le PBS, transférer les disques colorés β-TCP dans un nouveau puits et analyser les plaques avec un scanner à plat à la minéralisation record.
    7. Ajouter 0,25 mL de solution de chlorure de cétylpyridinium 10 % et incuber la plaque à RT pendant 15 minutes sur un agitateur à 100 secousses/min pour extraire le colorant à ARS.
    8. Transférer les surnageants dans un tube de 1,5 mL et centrifuger à 17 000 x g pendant 5 min à température ambiante.
    9. Ajouter la solution de chlorure de cétylpyridinium 10 % aux extraits avec un taux de dilution de 01:10:01 : 20 et ajouter les échantillons (300 µL) dans une plaque à 96 puits dont deux puits vides contenant du chlorure de cétylpyridinium 10 % seulement.
    10. Préparer des étalons de référence ARS 7 allant de 4 à 400 µM en diluant l’ARS 40 mM coloration solution (pH 4,2) avec la solution de chlorure de cétylpyridinium de 10 % pour générer la courbe d’étalonnage.
    11. Ajouter 300 µL de l’étalon de référence des doublons à la plaque à 96 puits.
    12. Lire l’absorbance des échantillons, flans et faire référence à des normes à 520 nm.
    13. Soustraire les lectures vides des étalons de référence et des lectures des échantillons.

2. souris OB-OC co-culture de dériver OCs Mature

  1. Préparation et stérilisation des tranches de l’os cortical bovine
    1. Segments d’os de tissu environnant de nettoyer et enlever l’OS trabéculaire et la moelle osseuse.
    2. Sécher l’os à 50 ° C pendant 24 h.
    3. Couper l’OS en plus petits morceaux et couper en tranches (environ 300 – 350 µm d’épaisseur) à l’aide d’une faible vitesse scie avec une lame de diamant.
    4. Couper les tranches de 300 – 350 µm en disques quadratiques (1 cm2).
    5. Pour nettoyer les disques d’OS (1 cm2), les mettre dans un flacon en verre fermant à clé et remplir avec de l’eau distillée. Transférer le flacon en verre rempli dans un bain à ultrasons et laisser agir pendant 5 min. Répétez cette étape trois fois.
    6. Videz l’eau distillée, ajouter de l’éthanol à 70 % et laisser agir pendant 5 min.
    7. Décanter l’éthanol à 70 % et les remplacer par l’éthanol à 100 %.
      NOTE : Stocker les tranches d’os dans l’éthanol à 100 % à 4 ° C pendant 4 semaines.
    8. Irradier les tranches de l’OS avec la lumière UV pour 15 min de chaque côté dans des conditions stériles. Conserver les tranches OS stérilisé dans une plaque de culture stériles à ta jusqu'à l’utilisation ultérieure.
  2. Isolement des précurseurs de la moelle osseuse OC
    1. Euthanasier utilisant une injection intrapéritonéale (i.p.) d’une solution de xylazine kétamine et 24 mg/kg de 200 mg/kg de souris BALB/c de 8 à 12 semaine vieux naïves.
    2. Isoler les précurseurs chimiques OC la moelle osseuse et souris fémur et le tibia.
    3. Retirez les jambes avec des ciseaux stériles du point plus proche à l’organe à l’articulation de la hanche, couper les branches au niveau des genoux et les chevilles et enlever les tissus mous avec bistouri stérile et forceps. Couper les épiphyses. Débusquer et suspendre la moelle avec 1mL de BGM dans un 6 cm boîte de Petri stérile en utilisant une aiguille de 27G, attachée à une seringue de 1mL pour obtenir une suspension de cellules.
    4. Ajouter la suspension de cellules dans un tube conique de 50 mL, laver les 6 cm boîte de Pétri avec 5 mL de BGM et transférer dans le même tube conique de 50 mL. Centrifuger à 350 x g à 4 ° C pendant 5 min. remettre en suspension les cellules dans un milieu de différenciation OC (DM) contenant BGM, 1 nM 1,25-(OH)2-vitamine D3 et 1 µM prostaglandine E2 (1 mL/puits).
      Remarque : Une souris BALB/c fournit un nombre suffisant de précurseurs de l’OC pour une plaque de culture de 24 puits.
  3. Préparation de co-culture souris OB-OC avec le biomatériau
    1. Incuber les disques de β-TCP de diamètre 14 mm ou OS bovin tranches (1 cm2) dans 1 mL de BGM dans une plaque 24 puits suspension de culture à 37 ° C et 5 % de CO2 pendant 24 h avant d’ajouter les cellules.
      NOTE : Tranches d’os bovin sont un groupe de contrôle de substrat physiologique pour l’étude de la différenciation OC en présence de biomatériaux.
    2. Ajouter 8,8 x 104 cellules/cm2 de l’OBs primaires suspendue de BGM sur les biomatériaux ou l’os de contrôle dans une plaque de culture de suspension 24 puits ou sur une plaque de culture de tissus de 24 puits. Incuber à 37 ° C et 5 % de CO2 pendant 24 h.
      NOTE : OBs fixer le plastique ou l’OS biomatériau ou bovin.
    3. Ajouter fraîchement isolées précurseurs OC la moelle osseuse pour les 24 h de culture primaire OBs et culture à 37 ° C et 5 % de CO2 pendant 5 jours. Remplacez le support par fraîchement préparée OC DM tous les deux jours. Puis, détachant OCs pour les phosphatases acides tartrate-résistantes (TRAP) pour évaluer la différenciation OC.
  4. Évalué par coloration au piège de la différenciation OC
    1. Afin de caractériser les matures OCs multinucléées, obtenu à l’étape 2.3.3, aspirer le milieu de culture de la plaque de culture de tissus de contrôle et de la plaque de culture de suspension biomatériau et ajouter 1 mL de PBS 1 x (37 ° C). Aspirer le PBS et fixer les cellules en incubant eux dans 1 mL de solution de formol 10 % mis en mémoire tamponné à la droite pendant 10 min.
    2. Aspirer la solution de formol 10 % tamponnée avec une pipette à usage unique et ajouter 1 mL de PBS 1 x à RT. répéter cette étape trois fois, puis aspirer le PBS, remplacez par 1 mL de tampon de piège (pH 5) et incuber les plaques à 37 ° C pendant 30 min.
    3. Aspirer le tampon de piège et ajouter 1 mL d’éthanol à l’acétone et 100 % 1:1. Incuber la plaque à RT 30 art. rapidement aspirer l’éthanol-acétone solution avec une pipette à usage unique et sécher complètement les plaques à température ambiante.
    4. Pour le piège solution de coloration, préparer un 10 mg/mL solution phosphate de naphtol-AS-MX en dissolution de N, N-diméthylformamide, 0,6 mg/mL de violet rapide rouge sel dans le tampon de piège et ajouter 0,1 mL de solution mère naphtol-AS-MX phosphate à 10 mL de sel violet rapide rouge dans le tampon de piège.
    5. Ajouter 1 mL de piège solution de coloration et incuber les plaques à 37 ° C pendant 10 min, puis aspirer le piège solution de coloration et ajouter 1 mL d’eau ultrapure pour arrêter la réaction.
    6. Transférer les disques de la β-TCP et les tranches de l’OS bovin après coloration dans un nouveau puits, observer rouge OCs teinté à l’aide d’un microscope optique (grossissement : 10 X) et énumérer les TRAP + OCs mature avec trois ou plusieurs noyaux.

3. critique taille souris défaut substance modèle

  1. Injecter la buprénorphine 0,1 mg/kg par voie sous-cutanée (s.c.) à des souris BALB/c 8 - semaine vieux pour l’analgésie.
  2. Anesthésier les souris avec un mélange de 100 mg/kg i.p. de xylazine kétamine et 5 mg/kg, ajouter un gel ou une pommade pour les yeux de les garder humide et placez la souris sur une plaque chauffante à 37 ° C pendant toute la procédure pour éviter l’hypothermie. Évaluer la profondeur de l’anesthésie par pinch orteil et la queue.
  3. Raser la fourrure sur le dessus de la tête entre les oreilles et nettoyer la surface avec 7,5 % povidone iode solution et 70 % d’éthanol.
  4. Faire une incision sagittale médiane sur le dessus du crâne entre les oreilles avec un scalpel stérile pour exposer la voûte crânienne et de retirer les tissus conjonctifs pericranium au-dessus de l’os pariétal droit en grattant avec un scalpel.
  5. Créer un défaut de taille critique dans l’os pariétal droit à l’aide d’un trépan dentaire stérile avec un diamètre de 4 mm (2000 tr/min) sous irrigation constante avec une solution saline normale à encoche dans l’os pariétal droit et couper à travers l’ectocortex et quelques endocortex.
  6. Pour éviter d’endommager la dure-mère, utilisez un petit ascenseur périostique pour percer l’endocortex restant, soigneusement soulevez la substance osseuse et enlevez-le avec une pince. Le vice qui en résulte doit être circulaire et environ 3,5 mm de diamètre.
  7. Remplir le défaut substance préalablement trempées (PBS stérile 1 x à ta) β-TCP/C mousse à l’aide de pinces.
  8. Préparer le nombre approprié de sham, appariés selon l’âge des témoins négatifs avec un défaut vide.
  9. Pour garder ce biomatériau en place, mettre 0,5 µL d’adhésif de tissu au bord du défaut à deux points opposés.
  10. Fermer la peau avec une suture non résorbable.
  11. Nettoyer tous les instruments chirurgicaux avec froid stérilisant pour maintenir des conditions stériles avant d’effectuer l’opération suivante sur une souris anesthésiée.
  12. Pour le traitement post-opératoire, placer les animaux sur une plaque de chauffage propre et sec à 37 ° C dans le domaine de la chirurgie pour une surveillance appropriée au cours de la période de récupération. Surveiller la fréquence respiratoire, la température corporelle et la couleur des muqueuses et des yeux toutes les 10 min jusqu'à ce qu’ils se réveiller.
  13. Transférer les souris conscientes exploités dans une cage avec nourriture et d’eau séparés des autres animaux jusqu'à la guérison complète. Injecter 0,1 mg/kg de buprénorphine s.c. pour traitement analgésique postopératoire deux fois par jour pendant 72 h. retour complètement rétablis souris à leur cage.
  14. Pour déterminer l’efficacité de ce biomatériau, euthanasier les i.p. de souris avec une solution de xylazine kétamine et 24 mg/kg de 200 mg/kg.
  15. À post-implantatoire 8 à 12 semaines, décapiter la souris euthanasiée avec des ciseaux pointus.
  16. Fixer la tête décapitée de la souris dans 30 mL de 4,5 % tamponnée solution de formol pendant 1-2 semaines garantir la pleine pénétration du fixateur dans le tissu.
  17. Transférer les chefs dans l’éthanol à 70 % pour le stockage à long terme à 4 ° C pendant un an.
  18. Utilisation micro calculé tomographie (microCT) ou des techniques histologiques enrobement normalisées pour évaluer la régénération osseuse. Il est possible d’utiliser plus d’analyse sur des échantillons post mortem à haute résolution (90 kV, 4 min) en 2D et 3D sagittal et frontal avions.
  19. Pour histologie enrobement, déshydrater les têtes en croissant des grades d’éthanol et incorporer en glycol méthyl méthacrylate.
  20. Couper des blocs de méthacrylate de méthyle-encastrés de glycol avec une scie à diamant et broyer les sections d’une épaisseur d’environ 80 à 100 µm.
  21. Évaluer le goff Laczko OS coupes coloré afin d’identifier de nouveaux OS formation14.

4. in Vitro les réponses immunitaires

  1. Euthanasier i.p. de souris BALB/c 8 - semaine vieux de naïf avec une solution de xylazine kétamine et 24 mg/kg de 200 mg/kg.
  2. Placez la souris sur son côté droit, se raser la fourrure sur le côté gauche et nettoyer la peau sur le côté gauche de l’abdomen avec l’éthanol à 70 %.
  3. Faire un 10 mm de long et une incision profonde de 1 mm dans la peau de la souris sur le côté gauche vers l’arrière suivant les côtes sur l’estomac à l’aide de ciseaux stériles.
  4. Ouvrir la peau et puis exposer le péritoine. Faire un 10 mm de longueur et moins de 1 mm de profondeur incision dans le péritoine, à l’aide de ciseaux dans des conditions stériles.
  5. Poussez l’estomac proximal pour exposer la rate.
  6. Tenez la rate doucement avec une pince stérile et retirez-le en coupant le tissu et les vaisseaux attachés en dessous.
  7. Placez la rate intacte dans un tube de 50 mL contenant 10 mL de froid 1 x PBS stérile.
  8. Préparer une suspension monocellulaire de hacher la rate à l’aide d’une pince stérile 2 ou 2 lames de verre stérile.
  9. Enlevez les débris en le faisant passer à travers un tamis de cellule de 40 µm stérile avec du PBS 1 x contre le rhume en utilisant le piston d’une seringue de 1 mL.
  10. Centrifuger la suspension monocellulaire à 300 x g pendant 10 min à 4 ° C dans un tube conique de 50 mL, aspirer et éliminer le surnageant. Puis Resuspendre le culot dans 5 mL de tampon de lyse des globules rouges (GR).
  11. Incuber la suspension cellulaire pendant 14 min à RT et arrêter la réaction en ajoutant 45 mL de milieu de Roswell Park Memorial Institute (RPMI).
  12. Centrifuger les cellules après la lyse cellulaire à 300 x g pendant 10 min à 4 ° C et ensuite jeter le surnageant.
  13. Splénocytes de remettre dans un milieu RPMI contenant 10 % inactivés par la chaleur FBS, solution de pénicilline-streptomycine 1 %, 0,1 % de gentamicine, 0,2 % de β-mercaptoéthanol et 1 % des acides aminés non essentiels.
  14. Les incuber β-TCP/C mousse dans une plaque de 96 puits stériles culture contenant du milieu RPMI pendant 24 h à 37 ° C et 5 % de CO2 avant l’ensemencement de la cellule.
  15. Ajouter des splénocytes à titré nombres, par exemple., 1,25 x 105, 2,5 x 105 et 5 x 105/well à Herbert George wells dans une plaque à 96 puits vitroplants contenant du milieu RPMI et additifs, avec ou sans la mousse de β-TCP/C pré-incubées.
  16. Ajouter 10 µg/mL la concanavaline A (Con A) dissous dans le milieu pour un total de 100 µL/puits dans les puits appropriés et puis incuber à 37 ° C et 5 % de CO2 pendant 72 h.
  17. Mesurer la prolifération cellulaire avec un dosage bromodéoxyuridine (BrdU). Ajouter 10 µL/puits de la solution de marquage BrdU après 48 h de culture cellulaire et puis incuber la plaque pendant 24 h supplémentaires.
  18. Après 72 h, récupérer le surnageant et conserver à-20 ° C jusqu'à l’utilisation ultérieure.
  19. Ajouter 200 µL/puits de la solution de fixation à chaque puits et puis incuber 30 min à RT. aspirer la solution de fixation. Ajouter 100 µL/puits de la solution d’anticorps anti-BrdU et incuber pendant 90 min.
  20. Aspirer la solution d’anticorps, rincez les puits trois fois avec 200 à 300 µL/puits de la solution de lavage et enlever la solution de lavage.
  21. Ajouter 100 µL de solution de substrat et incuber pendant 3 à 10 min à la droite, puis mesurer l’absorbance à 450 nm.
  22. Mesurer l’interleukin-1β (IL-1β), interleukine 2 (il-2), interleukine-4 (IL-4) et l’interféron-γ (IFN-γ) dans les surnageants recueillis à l’aide d’un technique ELISA.

5. haut débit modèle intrapéritonéale

  1. Offrir une 6-8 semaines vieilles souris femelles BALB/c avec un mélange de 100 mg/kg i.p. de xylazine kétamine et 5 mg/kg et ajouter un gel ou une pommade pour les yeux de les garder humide et placez la souris sur une plaque chauffante à 37 ° C pendant toute la procédure pour éviter l’hypothermie. Évaluer la profondeur de l’anesthésie par pinch orteil et la queue.
  2. Raser la fourrure abdominale et nettoyer avec 7,5 % povidone iode solution et 70 % d’éthanol.
  3. Faites une incision médiane longue de 8 mm à travers la peau le long de la linea alba. Faire une petite incision dans le péritoine, à l’aide d’un scalpel.
  4. Place PBS stérile imbibé de greffes de β-TCP/C mousse (2 x 2 x 2 mm3) dans la cavité péritonéale ou sans addition de matériaux pour les souris témoins appariés selon l’âge des trompe-l'œil.
  5. Suture du péritoine et la peau avec des sutures résorbables et non résorbables, respectivement.
  6. Nettoyer tous les instruments chirurgicaux avec froid stérilisant pour maintenir des conditions stériles avant d’effectuer l’opération suivante sur une souris anesthésiée.
  7. Pour le traitement post-opératoire, placer les animaux sur une plaque de chauffage propre et sec à 37 ° C dans le domaine de la chirurgie pour une surveillance appropriée au cours de la période de récupération. Surveiller la fréquence respiratoire, la température corporelle et la couleur des muqueuses et des yeux toutes les 10 min jusqu'à ce qu’ils se réveiller.
  8. Transférer les souris conscientes exploités dans une cage avec nourriture et d’eau séparés des autres animaux jusqu'à la guérison complète. Retour souris pleinement récupérés de leurs cages.
    Remarque : Cette procédure induit une douleur minime. Traitement analgésique postopératoire n’est habituellement pas nécessaire. Si la commande animaux montrent des signes de douleur, injecter 0,1 mg/kg de buprénorphine s.c. ou un autre appropriée des médicaments analgésiques pour soulager la douleur.
  9. Euthanasier la souris 7 jours après l’implantation, avec une solution de 200 mg/kg i.p. de xylazine kétamine et 24 mg/kg
  10. À post-implantatoire 7 jours, lavage de la cavité péritonéale à l’aide de 1 mL d’une seringue avec une aiguille 25 G pour un total de 3 mL de PBS froid en maintenant la tête de la souris enfoncé et en insérant l’aiguille dans le quadrant abdominal inférieur gauche et viser dans la partie proximale.
    Remarque : Le liquide péritonéal devrait être libre de globules rouges.
  11. Centrifuger le liquide de lavage péritonéal à 300 x g pendant 5 min à 4 ° C et recueillir le liquide péritonéal à conserver à-20 ° C pour les mesures de ELISA de cytokines IL-1β, il-2 et IL-4.
  12. Aspirer le surnageant, resuspendre le culot dans 1 mL de PBS et compter les cellules péritonéales utilisant le bleu trypan sur un hémocytomètre.
  13. Cytocentrifuge la suspension cellulaire à 5 x 105 cellules sur des lames de verre, laisser les lames à sec et des taches pour un nombre d’éléments différentiels.
  14. À l’aide d’un microscope optique, compter un minimum de 300 cellules au total et différencier les macrophages, les éosinophiles, neutrophiles et lymphocytes.

6. toxicité subchronique modèle sous-cutanée

  1. Anesthésier la souris BALB/c femelle 6 – 8 semaines vieux avec un mélange de 100 mg/kg i.p. de xylazine kétamine et 5 mg/kg, ajouter le gel ou pommade pour les yeux de les garder humide et placez la souris sur une plaque chauffante à 37 ° C pendant toute la procédure pour éviter l’hypothermie. Évaluer la profondeur de l’anesthésie par pinch orteil et la queue.
  2. Placez la souris sur le dos, se raser la fourrure abdominale et nettoyer la surface rasée avec 7,5 % povidone iode solution et 70 % d’éthanol.
  3. Faites une incision médiane longue de 8 mm à travers la peau le long de la linea alba de l’abdomen à l’aide d’un bistouri, puis implant PBS imbibés biomatériau (2 x 2 x 2 mm3) sous la peau ou n’ajouter aucuns matériel pour les souris témoins appariés selon l’âge des trompe-l'œil.
  4. Suture de la peau avec une suture non résorbable.
  5. Nettoyer tous les instruments chirurgicaux avec froid stérilisant pour maintenir des conditions stériles avant d’effectuer l’opération suivante sur une souris anesthésiée.
  6. Pour le traitement post-opératoire, placer les animaux sur une plaque de chauffage propre et sec à 37 ° C dans le domaine de la chirurgie pour une surveillance appropriée au cours de la période de récupération. Surveiller la fréquence respiratoire, la température corporelle et la couleur des muqueuses et des yeux toutes les 10 min jusqu'à ce qu’ils se réveiller.
  7. Transférer les souris conscientes exploités dans une cage avec nourriture et d’eau séparés des autres animaux jusqu'à la guérison complète. Retour souris pleinement récupérés de leurs cages.
    Remarque : Cette procédure induit une douleur minime. Traitement analgésique postopératoire n’est habituellement pas nécessaire. Si la commande animaux montrent des signes de douleur, injecter 0,1 mg/kg de buprénorphine s.c. ou un autre analgésique approprié.
  8. Lorsqu’il est prêt à examiner le site d’implantation, euthanasier les i.p. de souris avec une solution de xylazine kétamine et 24 mg/kg de 200 mg/kg.
  9. Après l’implantation huit semaines, le site d’implantation avec les tissus (1 cm2) environnants de l’accise.
  10. Difficulté le tissu dans une solution de formol 4,5 % mis en mémoire tamponné pendant la nuit, incorporer à la paraffine et coupé en 4 sections de µm.
  11. Tache 4 sections de tissus inclus en paraffine µm à l’hématoxyline et éosine (H & E) pour l’inflammation ou de Masson trichrome de la fibrose et le dépôt de collagène.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Pour évaluer le β-TCP pour son efficacité comme un biomatériau pour la réparation osseuse, nous avons utilisé in vitro et in vivo méthodes de dépistage. Tout d’abord, nous avons mesuré les réponses OB sur les disques de β-TCP comparées aux témoins seul moyen de base. La figure 2 montre la viabilité de l’OB en réponse à des disques de β-TCP à 7 et 14 jours de culture. La viabilité cellulaire mesurée à partir des cellules métaboliquement actives dans les puits de culture est la même pour OBs avec support en plastique de culture de tissus, ainsi qu’avec des disques de β-TCP indiquant que ce biomatériau est ni amélioration ni supprimant la prolifération de l’OB.

Pour continuer à évaluer l’OBs, nous avons mesuré l’activité ALP comme marqueur de différenciation en utilisant des approches qualitatives et quantitatives. La figure 2 illustre l’activité enzymatique ALP dans les puits de culture après 7 jours de culture. OBs dans les puits avec le milieu seul avaient activité ALP basale, tandis que dans la minéralisation optimale moyen (MM) OBs avaient ALP intense coloration, reflétant un niveau élevé de différenciation de l’OB. En revanche, l’OBs plaqué sur des disques de β-TCP différenciées à moins que l’OBs incubés en MM. Dans un test quantitatif, ALP concentration était de 77 % plus élevé pour les puits contenant MM comparé avec le milieu de base seulement, alors que ALP concentration était 40 % plus faible dans les cellules cultivées sur des disques de β-TCP par rapport aux témoins MM. Bien que ces résultats démontrent que les cellules cultivées sur des disques de β-TCP différenciées inférieures à celles des conditions optimales de plastique avec MM, on distingue suffisamment sur les biomatériaux.

Une autre caractéristique essentielle de l’OBs est leur capacité à induire la minéralisation, qui est une étape essentielle de la guérison osseuse. Nous colorées des cellules cultivées d’OB avec ARS après 14 jours et constaté que la minéralisation était plus élevée pour les contrôles MM par rapport à l’OBs cultivées dans un milieu seul et sur des disques de β-TCP dans les puits de culture (Figure 2). Quand nous avons mesuré la concentration d’ARS, nous avons constaté que les contrôles MM ont été plus de 45 % de plus que le groupe β-TCP. Ces données illustrent cette OBs cultivés sur le plastique en présence de MM mature, différencient et minéralisent mieux que ceux avec un seul moyen et sur des disques de β-TCP.

Pour déterminer comment OCs répondre aux disques de β-TCP, nous avons utilisé une technologie de culture dans lequel OBs sont conjointement mis en culture avec des précurseurs OC de la moelle osseuse suivies de l’examen de la morphologie de l’OC. Co-cultures OB-OC ont été observées à 5 jours et diffèrent sensiblement entre les cellules cultivées sur plastique avec OC DM et les cellules cultivées sur des tranches de l’os et β-TCP. Sur plastique, l’OCs étaient grandes et très répandue alors que l’OCs sur substrats physiologiques étaient plus petites et moins-étalée et forme irrégulière (Figure 3). Pour quantifier l’OCs, nous avons énumérée piège + OCs et constaté que là étaient des nombres plus élevés lorsque incubées en présence de β-TCP (1755 ± 21.41/cm2) par rapport aux contrôles (1140 ± 15,71/cm2) de la culture de tissus et des os tranches (709 ± 59,69/cm2), suggérant différenciation de OC renforcée sur des disques de β-TCP (Figure 3).

Pour déterminer une mousse de β-TCP/C disponible dans le commerce en vivo, nous utilisons un modèle de taille critique substance défaut chez la souris. Nous montrons des coupes histologiques représentatives, traitées par une technique histologique enrobement avec incorporation de glycol méthyl méthacrylate et Levai Laczko coloration. MicroCT et l’histologie peuvent servir à évaluer néo-formation osseuse au sein de la zone de défaut. Ici, nous montrons un exemple avec des coupes histologiques dans la Figure 4. Lorsque l’anomalie osseuse induite chirurgicalement a été laissée vide (sham), nous avons observé une couche mince qui couvre tout défaut, mais aucune formation osseuse importante n’était présente à 12 semaines post opération confirmant la taille critique de la fracture de l’OS créé. En revanche, lorsque l’irrégularité contenue β-TCP/C mousse, il y avait des restes de β-TCP/C mousse entourés d’un tissu fibreux dense dont certains vaisseaux sanguins et des cellules inflammatoires combler l’espace de défaut sans preuve de la formation osseuse.

Pour évaluer la réaction au corps étranger, nous avons évalué les réactions immunologiques et allergiques pour les biomatériaux, à l’aide d’un test in vitro . La figure 5 montre que quand naïf splenocytes sont incubés avec moyen seul ou avec de la mousse de β-TCP/C, les cellules de rate naïve ne répondaient pas de prolifération ou de production d’il-2, IL-4 et IFN-γ cytokines. En revanche, à ConA contenant des cultures, la prolifération cellulaire et la production de cytokines a augmenté à l’exception de l’IL-1β. Les réponses des cellules ont été affecté quand co cultivées avec ConA et β-TCP/C mousse par rapport aux ConA seul, indiquant que β-TCP/C mousse ni augmentation ni diminution le in vitro les réponses.

Pour déterminer si β-TCP/C mousse induit une immunoréaction in vivo , nous avons implanté il 1) par voie intrapéritonéale et mesuré les concentrations de comtes et de cytokine de cellules inflammatoires dans le liquide de lavage péritonéal et 2) par voie sous-cutanée et évaluées l’inflammation et la fibrose sur coupes histologiques du site d’implantation. Dans le tableau 1, la cellule différentielle dans le liquide de lavage péritonéal révèle que le nombre total de cellules inflammatoires était significativement plus élevé chez les souris de β-TCP/C mousse implanté par rapport avec les contrôles. En outre, il y avait un nombre accru de tous les types de cellules. Dans la Figure 6 a, il y a des concentrations plus élevées de cytokines IL-1β, il-2 et IL-4 dans la mousse de β-TCP/C par rapport à des contrôles. Chez les souris de β-TCP/C mousse de l.c. implantés, nous avons observé une réaction inflammatoire à corps étranger cellules géantes sur H & E-teint sections (Figure 6 b) et preuve de la fibrose sur Trichrome de Masson coupes (Figure 6) coloré à 8 semaines. En revanche, le site d’implantation des contrôles imposture avait inflammation minime et sans fibrose (Figure 6).

Figure 1
Figure 1 : suppression de calotte cranienne pour diagramme d’isolement primaire OB cell. Le diagramme illustre comment faire pour supprimer la voûte crânienne avec 4 coupes (ligne rouge pointillée) à l’aide de ciseaux courbes. La première coupe est perpendiculaire à l’orbite droite (R) du X1 x 2 et le second est perpendiculaire à l’orbite gauche (L) du X3 x 4. La troisième coupe est de séparer la voûte crânienne à l’avant de la X4 à X 2 et la quatrième coupe consiste à séparer le dos du X3 à X 1. La voûte crânienne est alors libre d’être retiré. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : induite par la β-TCP dans vitro OB de différenciation et de maturation. Viabilité de l’OB et prolifération des 7 et 14 jours pour les cellules cultivées en moyennes seuls (barres) ou β-TCP (bars ouverts) (moyenne ± SEM ; n = 3). Quantification de l’activité ALP de lysats cellulaires ainsi que la normalisation de la teneur en protéines (µM DIFMU/µg de protéines, moyenne ± SEM, n = 3) avec des images représentatives illustrant des puits de culture colorés à l’ALP du jour 7. Minéralisation quantifiée de cultures colorés à l’ARS par une méthode d’extraction de cétylpyridinium chlorure, montrée que la concentration d’ARS (µM ARS, moyenne ± SEM, n = 3) avec puits de culture de ARS colorés représentant le 14e jour. Les groupes comprennent le milieu de croissance osseuse seul (BGM) ; Moyenne de minéralisation (MM) ; Β-TCP. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : de la différenciation induite par la β-TCP dans vitro OC. Photomicrographies représentant montrent TRAP + multinationales au jour 5 après co-culture souris OBs et précurseurs de la moelle osseuse OC. Analyse du point de terminaison du piège + des cellules multinucléées (PTM) montre le nombre absolu de piège + PTM (≥ 3 noyaux) par cm2 (moyenne ± SEM, n = 3) ***p < 0,001. Les groupes comprennent différenciation OC seul moyen (DM) ; Osseuse ; Β-TCP. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : In vivo l’évaluation de l’os de la β-TCP/C mousse greffes dans un modèle de taille critique substance défaut. Défauts de substance non-guérison créés en 8 - semaine vieux femelle BALB/c (n = 3) souris à l’aide d’un trépan dentaires de 4 mm. Traitement groupes contrôle inclus sham (défaut de vide) et défauts traité avec de la mousse de β-TCP/C. Coupes histologiques représentatifs établis à post-implantatoire 12 semaines. Sections de méthacrylate de méthyle-encastrées de glycol tissus fixés au formol (80 – 100 µm) teint avec colorant Levai Laczko. Photomicrographies montrées à basse (à gauche) et grossissement élevé (à droite). Triangles noirs indiquent le défect osseux. Noir * désigne le tissu osseux et blanc * se réfère à la mousse de β-TCP/C. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : β-TCP/C mousse-induit in vitro la prolifération et cytokine production de cellules. Splénocytes de souris BALB/c de naïves cultivées dans un milieu seul, avec la β-TCP/C mousse ou ConA. La prolifération des cellules surnageante (BrdU) et la production d’IL-1β, il-2, IL-4 et IFN-γ (moyenne ● seul, ConA ○, β-TCP/C mousse ■, β-TCP/C mousse et ConA □). Résultats de prolifération présentés comme la moyenne des échantillons en triple (D.E. ± SEM) lors de l’essai de BrdU et la moyenne des échantillons en double (pg/mL ± SEM) pour la concentration de cytokine de deux expériences indépendantes. p < 0,05 est jugé important de biomatériau vs ConA vs ConA, biomatériau et moyenne seul. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : In vivo la réponse immunitaire de l’os de la β-TCP/C mousse greffes dans un rapide haut débit i.p. et modèle murin subchronique. (A) souris femelles BALB/c implanté i.p. avec β-TCP/C mousse ou sans addition de matériaux (sham). Sept jours plus tard, péritonéale lavage analysés pour les concentrations de cytokine (données présentées comme moyenne des concentrations de cytokines pg/mL ± et). Ces données sont représentatives des deux expériences indépendantes (n = 5). p < 0,05 est jugé important par rapport à l’imposture. (B-C) Des souris femelles BALB/c (n = 5) implanté s.c. avec β-TCP/C mousse ou sans addition de matériaux (sham). À 8 semaines après l’implantation, la peau de coloration H & E (B) et de Masson Trichrome (C) pour évaluer l’inflammation et la fibrose, respectivement les sites d’implantation. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Sham Vitoss
Cellule comtes x 106 (% des cellules totales)
Macrophages 1.240 ± 0,051 (88,1) 3.262 ± 0,380 (70,4) p < 0,001
Éosinophiles 0,120 ± 0,011 (8,5) 1,181 ± 0,254 (25,5) p < 0,01
Neutrophiles ± 0,002 0,001 (0,2) 0,029 ± 0,011 (0,6) NS
Lymphocytes 0,048 ± 0,020 (3.2) 0,148 ± 0,041 (3.5) NS
Nombre total de cellules 1.410 ± 0,066 4.620 ± 0.452 p < 0,001

Tableau 1 : In vivo la réponse immunitaire de l’os de la β-TCP/C mousse greffes dans un modèle de souris i.p. rapide à haut débit. Des souris femelles BALB/c ont été implantés i.p. avec β-TCP/C mousse ou sans matériel (sham). Sept jours plus tard, lavage péritonéal a été obtenu et analysé pour le nombre de cellules inflammatoires et les numérations différentielle (données présentées comme signifie cellule comtes ± SEM). Ces données sont représentatives des deux expériences indépendantes (n = 5).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ici, nous montrons une approche multidisciplinaire pour l’évaluation préclinique de la biocompatibilité des biomatériaux représentatif mis au point pour la réparation et la régénération osseuse. Nous avons testé les réponses de l’OBs, OCs, et la réponse de guérison in vivo dans un défaut critique OS modèle de souris ainsi que in vitro et in vivo des réponses immunitaires. L’étude visait à démontrer comment les tests fonctionnent et résument les données et les conclusions tirées de l’examen des biomatériaux. Nous montrons que notre stratégie génère un profil précieux de biocompatibilité biomatériau osseux.

Essais cellulaires primaires ont été utilisés pour évaluer la fonction OB et OC. OBs sont responsables de la formation osseuse et la réparation physiologique. Ils doivent demeurer viables, différencier et induire la minéralisation. Dans cette étude, nous montrons comment effectuer des essais pour la viabilité des cellules, ALP et ARS comme des marqueurs de cellules différenciées physiologiquement capables de minéraliser. Les contrôles pour les essais incluaient support seul, qui constitue une base et milieu de minéralisation ostéogénique (MM), optimisé la différenciation et la minéralisation de l’OBs sur plastique. Le groupe de contrôle de ce dernier a été une référence standard pour ce biomatériau. Pour l’évaluation de l’OC, nous cultivées co OBs et la moelle osseuse OC précurseurs, différencié les précurseurs en cellules multinucléées, leur teint avec siphon, une enzyme ostéoclastique largement utilisé pour identifier l’OCs en vitro15 et ensuite énuméré les cellules au microscope photonique. Ces tests sont state-of-the-art et ne nécessitent pas de modifications. Cependant, nous avons remarqué une limitation liée à la qualité des isolés OBs primaires à minéraliser. OBs conservés sont stockés dans l’azote liquide et utilisés dans l’année pour des résultats optimaux.

L’activité et l’attachement de l’OB étaient plus élevés sur culture de tissus plastiques que sur les disques de β-TCP testés. Lorsque nous avons évalué l’OCs, nous avons observé des différences attendues entre la réponse au plastique et des os, qui est le substrat physiologique16. En comparaison, les os et β-TCP provoqué des changements morphologiques similaires. L’énumération de dosage du piège des contraceptifs oraux en réponse aux disques β-TCP a montré que les nombres étaient significativement différents entre les tranches de l’os et β-TCP. Β-TCP induit la différenciation OC plus élevée que sur des tranches de l’OS. Pour la différenciation de l’OC, piège est un dosage bien établi. Il n’y a aucune modification importante nécessaire à cette méthode. Toutefois, pour obtenir les meilleurs résultats, il est essentiel de ne pas Incuber les cellules pendant trop longtemps, ou toutes les cellules d’origine monocytaire vont devenir séropositifs au piège.

Pour répondre à la réponse en vivo , nous avons utilisé β-TCP/C mousse comme un biomatériau exemplaire car il contient des β-TCP, qui a été utilisé dans les essais in vitro sur et le collagène et favorise les os guérison13. Bien que les β-TCP/C mousse est commercialement disponible et utilisé cliniquement pour OS réparation17,18, ce n'est qu’un des nombreux types de matériaux qui seraient intéressants à étudier, par exemple., biphasique phosphate de calcium () hydroxyapatite/β-TCP) ainsi que déminéralisée os humains dans ces essais pour déterminer les réponses Comment biologiques diffèrent entre les matériaux. Pour la réponse en vivo , nous avons implanté des β-TCP/C mousse dans un défaut de taille critique de substance osseuse chez la souris et 12 semaines plus tard évalué histologie et montrent des différences par rapport aux contrôles. Il est également possible d’évaluer les réponses avec microCT qui fournit des informations complémentaires19. L’anomalie de l’imposture des souris témoins n’avait aucune formation osseuse importante, tel que prévu, tandis que β-TCP/C mousse induit une réaction inflammatoire, la fibrose et l’angiogenèse, qui est la preuve de la première phase de formation osseuse. Cette méthode a été démontrée précédemment JOVE20. Cependant, notre approche diffère en ce que nous avons utilisé une technique mis à jour le « elevator » avec un ascenseur périostique pour réduire le risque de nuire à la dure-mère par le trépan. Nous avons pensé que la dure-mère joue un rôle important dans le processus de guérison des défauts substance en produisant des cellules ostéogéniques et ostéo-inducteurs facteurs3,21,22,23. Notamment, le matériel implanté, la taille du défaut et méthode pour créer le défaut influe sur la régénération osseuse des défauts calvarial. Une autre modification dans la procédure en cause la stabilisation de ce biomatériau dans le défaut de substance avec une colle à tissu biocompatible qui est couramment utilisé en clinique pour refermer les plaies. Cette modification garantit que le matériel dans la zone de défaut ne serait pas déplacé durant la cicatrisation.

L’inflammation réglemente la première phase de cicatrisation osseuse, mais trop d’inflammation ou de réactions allergiques peuvent réduire réparation11. La réponse immunitaire idéale aux biomatériaux est d’initier une cascade inflammatoire qui favorise la formation osseuse. Toutefois, certains biomatériaux pourrait provoquer une réaction au corps étranger conduisant à un tableau des signaux inflammatoires qui causent la fibrose ou la sensibilisation allergique. Dans nos études, nous évalué les réponses immunitaires aux β-TCP/C mousse et trouvé qu’il n’était pas toxique pour les cellules de rate naïf et ne pas interférer avec l’expansion des lymphocytes T ou fonction (sécrétion de cytokines) quand ajouté aux cultures avec ConA. Dans les expériences intrapéritonéales, β-TCP/C mousse induite par l’inflammation, et il y avait des preuves d’une augmentation de l’éosinophilie et macrophages avec augmentation concomitante des cytokines de type Th1 et Th2. Dans les expériences de l’implantation sous-cutanée, β-TCP/C mousse a aussi induit une inflammation, mais il n’y avait aucune preuve pour les réponses inflammatoires ou allergiques chroniques, destructrices, qui suggère que les β-TCP/C mousse est biocompatible. Ces modèles fournissent des informations sur la réponse immunitaire aux biomatériaux. Tout d’abord, le modèle in vitro porte sur l’effet de ce biomatériau sur les cellules immunitaires naïve en présence d’un mitogène de fournir la preuve qu’il n’y a aucune suppression de la réponse mitogène causée par ce biomatériau. Deuxièmement, le modèle intrapéritonéal fournit une lecture rapide 7 jour du type de réponse immunitaire, par exemple., allergiques et l’inflammation comme le fait remarquer le type d’infiltration de cellules inflammatoires et du profil des cytokines. Troisièmement, le modèle sous-cutanée, subchronique illustre la réaction tissulaire sur une plus longue période, permet l’évaluation de l’inflammation chronique, fibrose, les titres d’anticorps et peut être utilisé pour tester l’implantation répétée des réponses de la mémoire immunologique. Ces modèles ont déjà été publiés et ne sont montrées ici sans aucune modification13. Il est essentiel qu’il y a des contrôles positifs et négatifs appropriés pour ces modèles. Nous vous suggérons d’effectuer tous les trois modèles pour éviter les limites de chaque méthode. Alors que les modèles présentés sont bien établis dans d’autres domaines de l’immunologie, l’approche pour tester les biomatériaux est récente.

En résumé, OS et immunitaire essais fournissent un profil de compatibilité biologique sur un biomatériau. Pour OS, OB et OC réponses à ce biomatériau fournissent des données préliminaires nécessaires avant de procéder à l’expérimentation animale compliquées et coûteuse et de respecter le principe des 3R. Immunologique in vitro tests fournissent des données sur la réactivité de l’antigène et de cytotoxicité, qui peut aussi empêcher plus loin l’expérimentation animale. Les expériences de rapide haut débit offrent des résultats sur inflammatoires et réponse cytokine (e.g., type de lymphocyte T réponses), alors que le modèle subchronique est utile en raison de données sur la durée de l’inflammation et le potentiel pour avoir endommagé fibrose. Cette nouvelle approche interdisciplinaire qui comprend des os et des réponses immunitaires aux biomatériaux offre une excellente évaluation préclinique de biocompatibilité pour de futures applications dans le domaine des matériaux.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Ce projet de recherche a reçu financement du septième Programme-cadre (7e PC/2007-2013) de l’Union européenne au titre de la subvention contrat no 263363.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Biomaterials
β-tricalcium phosphate disks (β-TCP, 14 mm) Disks were sintered in a muffle furnace at a temperature of 1150 °C. A detailed description of the production can be found in Zimmer et al (doi: 10.1002/jbm.a.34639). Samples were UV-irradiated (15 min for each side) before using in cell cultures.
Orthovita Vitoss foam (β-TCP/C foam) Orthovita 2102-1405
Mouse osteoblast culture
Alizarin Red S Sigma-Aldrich A5533
ALP assay buffer (2x) pH 10.4 Dissolve 200 mM glycine, 2 mM magnesium chloride, 2 mM zinc chloride in ultrapure water and adjust to pH 10.
Bone growth medium (BGM) α-MEM + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin/streptomycin
Cell lysis buffer: CyQuant cell lysis buffer 20x concentrate Thermo Scientific C7027 Dilute the concentrated cell lysis buffer stock 20-fold in ultrapure water. 
Cell viability reagent: Presto Blue cell viability reagent Invitrogen, Thermo Fisher Scientific A13261
Collagenase type IV from clostridium histolyticum Sigma-Aldrich C5138
DC protein assay kit II Bio Rad 5000112 DC protein assay kit contains reagent A, reagent B, reagent S and BSA for the reference standard. For reagent A', add 20 µL reagent S to 1000 µL reagent A. 
Dimethylsulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D8418 Steril-filter DMSO before usage. 
Dispase II (neutral protease, grade II) Roche 4942078001
EnzCheck Phosphatase Assay Kit for alkaline phosphatase activity  Invitrogen, Thermo Fisher Scientific E12020 EnzCheck Phosphatase Assay Kit contains 6,8-difluoro-4-methylumbelliferyl phosphate (DiFMUP), N,N-dimethylformamide and 6,8-difluoro-7-hydroxy-4-methylcoumarin (DiFMU). 
Fetal bovine serum (FBS) Sigma-Aldrich F7524
Formalin solution neutral buffered 10% Sigma-Aldrich HT501128
Glycine Sigma-Aldrich G8898
Hexadecylpyrdinium (cetylpyridinium) chloride monohydrate Sigma-Aldrich C9002
L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate Sigma-Aldrich A8960
Magnesium chloride hexahydrate Sigma-Aldrich M2670
MEM alpha medium (α-MEM) Gibco Life Technologies  11900-073
Osteogenic mineralization medium (MM) α-MEM + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin-streptomycin + 50 µg/mL ascorbic acid + 5 mM β-glycerophosphate
Penicillin-streptomycin   Sigma-Aldrich P4333
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 Gibco, Thermo Fisher Scientific  10010023
Sigmafast BCIP/NBT Sigma-Aldrich B5655
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red (10x) Gibco, Thermo Fisher Scientific  15400054 Dilute the concentrated stock solution 10-fold in 1x PBS. 
Tween20 Sigma-Aldrich P1379
Ultrapure water: Cell culture water pyrogen free VWR L0970-500
Wash buffer Add  0.05% Tween20 to 1x PBS.
Zinc chloride Sigma-Aldrich 1.08816
β-Glycerophosphate disodium salt hydrate Sigma-Aldrich G5422
24-well suspension culture plate Greiner bio-one 662102
24-well tissue culture plate Greiner bio-one 662160
50 mL conical tube Greiner bio-one 227261
96-well black plate Greiner bio-one 655076
96-well transparent plate Greiner bio-one 655001
Centrifuge: VWR Mega Star 600R VWR
CO2-Incubator: HeraCell 240 Thermo Scientific
Cryovial 2 mL Greiner bio-one 122263
Disposable filter unit FP30/0.2 CA-S GE Healthcare Life Sciences Whatman 10462200 For sterile filtration of enzyme solution.
Flatbed scanner: Epson Perfection 1200 Photo Epson
Infinite M200 Pro microplate reader Tecan
Microcentrifuge tube: Eppendorf tube safe-lock 0.5 mL VWR 20901-505
Microcentrifuge tube: Eppendorf tube safe-lock 1.5 mL VWR 21008-959
Shaker Swip (orbital and horizontal)  Edmund Buehler 
Shaking incubator GFL3032 GFL  3032
Single-use pipet: serum pipet Greiner bio-one 612301
Sterile instruments (scissors, tweezer, curved forceps)
Tissue culture plate (10 cm) Greiner bio-one 664960
Mouse osteoblast-osteoclast co-culture
1α,25-Dihydroxyvitamin D3 Sigma-Aldrich 17936 1000x concentrated stock (10 µM in ethanol 100%)
Acetone VWR Chemicals 22065.327
Bone growth medium (BGM) α-MEM + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin-streptomycin
Distilled water Carl Roth 3478.4
Ethanol (100% vol/vol) VWR Chemicals 20821.365
Ethanol (70% vol/vol) VWR Chemicals 93003.1006
Fast red violet LB salt Sigma-Aldrich F3381
Fetal bovine serum (FBS) Sigma-Aldrich F7524
Formalin solution neutral buffered 10% Sigma-Aldrich HT501128
MEM alpha Medium (α-MEM) Gibco Life Technologies  11900-073
N,N-Dimethylformamide Sigma-Aldrich D4551
Naphthol AS-MX phosphate Sigma-Aldrich N4875
Osteoclast differentiation medium (DM) α-MEM + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin-streptomycin + 1 nM 1,25-(OH)2-vitamin D3 + 1 µM prostaglandin E2 
Penicillin-streptomycin  Sigma-Aldrich P4333
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 Gibco, Thermo Fisher Scientific  10010023
Prostaglandin E2 (PGE2) Cayman Chemical Company 9003016 1000x concentrated stock (1 mM in ethanol 100%)
Sodium acetate trihydrate Sigma-Aldrich S7670
Sodium tartrate dibasic dihydrate Sigma-Aldrich S8640
Sterile instruments (scissors, forceps, scalpel)
TRAP buffer pH 5.0 Dissolve 40 mM sodium acetate, 10 mM sodium tartrate in ultrapure water and adjust to pH 5.
Ultrapure water: Cell culture water pyrogen free VWR L0970-500
24-well suspension culture plate Greiner bio-one 662102
24-well tissue culture plate Greiner bio-one 662160
50 mL conical tube Greiner bio-one 227261
Centrifuge: VWR Mega Star 600R VWR
CO2-Incubator: HeraCell 240 Thermo Scientific
Diamond wafering blade (10.2 cm x 0.3 cm) Buehler
Isomet low-speed saw Buehler
Petri dish (6 cm) Greiner bio-one 628,161
Screw cap glass bottle 20 mL Carl Roth EXY4.1
Single-use sterile syringe 1 mL Henry Schein Animal Health 9003016
Single-use pipet: serum pipet Greiner bio-one 612301
Sterile needle: Hypodermic needle RW 27 G x 3/4'' Henry Schein Animal Health 9003340
Mouse calvarial defect model
Analgesia: Buprenorphine (Bupaq) Richter Pharma AG
Anesthesia: Ketamine (Ketamidor), Xylazine (Rompun) Richter Pharma AG/Bayer HealthCare
Cold sterilant: SafeSept Max Henry Schein Animal Health 9882765
Ethanol (70% vol/vol) VWR Chemicals 93003.1006
Eye ointment: VitA POS 5 g Ursapharm
Normal saline solution (0.9% sodium chloride solution) Fresenius Kabi
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 Gibco, Thermo Fisher Scientific  10010023
Povidone iodine solution: Braunol 1000 mL B. Braun 3864154
Roti-Histofix 4.5% buffered formalin Carl Roth 2213.6
Tissue adhesive: Histoacryl 5 x 0.5 mL  B. Braun Surgical 1050060
Personal protective equipment: surgical gloves, cap and mask, gown Henry Schein Animal Health 1045073, 1026614, 9009062, 370406
Sterile instruments (scalpel, scissors, forceps, needle holder)
Sterile needles: Hypodermic needles RW 27 G x 3/4'' and 30 G x 1/2''  Henry Schein Animal Health 9003340, 9003630
Single-use sterile syringe 1 mL Henry Schein Animal Health 9003016
Heating plate: Physitemp Rothacher Medical TCAT-2LV
Sterile gauze swabs Henry Schein Animal Health 220192
Sterile disposable scalpel (Figur 20) Henry Schein Animal Health 9008957
Surgical/dental drill: Implantmed SI-923 W&H Dentalwerk Bürmoos GmbH 16929000
Handpiece type S-II W&H Dentalwerk Bürmoos GmbH 30056000
Trephine, diameter 4 mm Hager&Meisinger GmbH 229040
Irrigation tubing set 2.2 m W&H Dentalwerk Bürmoos GmbH 4363600
Periosteal elevator 2 mm / 3 mm Henry Schein Animal Health 472683
Non-resorbable suture: Polyester green, DS19, met. 1.5, USP 4/0 75 cm Henry Schein Animal Health 300715
In vitro immune responses
Anesthesia for euthanasia: Ketamine (Ketamidor), Xylazine (Rompun) Richter Pharma AG/Bayer HealthCare
Cell Proliferation ELISA, BrdU (colorimetric) Assay Kit Sigma-Aldrich 11647229001 The kit contains BrdU labeling solution, fixation solution (FixDenat), Anti-BrdU antibody solution, washing buffer and substrate solution. 
Concanavalin A (ConA) MP Biomedicals 150710
Culture medium splenocytes RPMI medium + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin-streptomycin solution + 0.1% gentamicin + 0.2% ß-mercaptoethanol + 1% non-essential amino acids
Ethanol (70% vol/vol) VWR Chemicals 93003.1006
Fetal bovine serum (FBS) Gibco, Thermo Fisher Scientific  10500064
Gentamicin Gibco, Thermo Fisher Scientific  15750037
Mouse IL-1β ELISA Ready-SET-Go! Invitrogen, Thermo Fisher Scientific 88-7013-88
Mouse IL-2 ELISA MAX Standard BioLegend 431001
Mouse IL-4 ELISA MAX Standard BioLegend 431101
Mouse INF-γ ELISA MAX Standard BioLegend 430801
Non-essential amino acids solution Gibco, Thermo Fisher Scientific  11140050
Penicillin-streptomycin  Gibco, Thermo Fisher Scientific  15140122
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 Gibco, Thermo Fisher Scientific  10010023
Red blood cell (RBC) lysis buffer: BD Pharm Lyse BD Bioscience 555899
RPMI 1640 medium, HEPES Gibco, Thermo Fisher Scientific  52400025
β-Mercaptoethanol Gibco, Thermo Fisher Scientific  31350010
50 mL conical tube Greiner bio-one 227261
96-well tissue culture plate Greiner bio-one 655180
Centrifuge: VWR Mega Star 600R VWR
Cell strainer 40 µm BD Bioscience 352340
Infinite M200 Pro microplate reader Tecan
Single-use sterile syringe 1 mL Henry Schein Animal Health 9003016
Sterile surgical instruments (forceps, glass slides)
High throughput intraperitoneal model
Anesthesia: Ketamine (Ketamidor), Xylazine (Rompun) Richter Pharma AG/Bayer HealthCare
Cold sterilant: SafeSept Max Henry Schein Animal Health 9882765
Ethanol (70% vol/vol) VWR Chemicals 93003.1006
Eye ointment: VitA POS 5 g Ursapharm
Mouse IL-1β ELISA Ready-SET-Go! Invitrogen, Thermo Fisher Scientific 88-7013-88
Mouse IL-2 ELISA MAX Standard BioLegend 431001
Mouse IL-4 ELISA MAX Standard BioLegend 431101
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 Gibco, Thermo Fisher Scientific  10010023
Povidone iodine solution: Braunol 1000 mL B. Braun 3864154
Shandon Rapid-Chrome Kwik-Diff Staining Kit Thermo Scientific 9990700 For differential cell count.
Heating plate: Physitemp Rothacher Medical TCAT-2LV
Hemocytometer: Neubauer chamber Carl Roth PC72.1
Non-resorbable suture: Ethibond Excel 4-0 Ethicon 6683H
Resorbable suture: Polysorb Covidien SL-5628
Shandon centrifuge for cytopsin Thermo Scientific
Single-use sterile syringe 1 mL Henry Schein Animal Health 9003016
Sterile gauze swabs Henry Schein Animal Health 220192
Sterile needles: Hypodermic needles RW 27 G x 3/4'' and 25 G Henry Schein Animal Health 9003340, 420939
Sterile surgical instruments (scalpel, scissors, forceps, needle holder)
Trypan blue solution 0.4% Gibco, Thermo Fisher Scientific  15250061
Subchronic subcutaneous model
Anesthesia: Ketamine (Ketamidor), Xylazine (Rompun) Richter Pharma AG/Bayer HealthCare
Cold sterilant: SafeSept Max Henry Schein Animal Health 9882765
Ethanol (70% vol/vol) VWR Chemicals 93003.1006
Eye ointment: VitA POS 5 g Ursapharm
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 Gibco, Thermo Fisher Scientific  10010023
Povidone iodine solution: Braunol 1000 mL B. Braun 3864154
Roti-Histofix 4.5% buffered formalin Carl Roth 2213.6
Heating plate: Physitemp Rothacher Medical TCAT-2LV
Non-resorbable suture: Ethibond Excel 4-0 Ethicon 6683H
Personal protective equipment: surgical gloves, cap and mask, gown Henry Schein Animal Health 1045073, 1026614, 9009062, 370406
Single-use sterile syringe 1 mL Henry Schein Animal Health 9003016
Sterile gauze swabs Henry Schein Animal Health 220192
Sterile instruments (scalpel, scissors, forceps, needle holder)
Sterile needle: Hypodermic needles RW 27 G x 3/4''  Henry Schein Animal Health 9003340, 420939

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. Fracture healing: mechanisms and interventions. Nature Reviews Rheumatology. 11 (1), 45-54 (2015).
  2. Marsell, R., Einhorn, T. A. The biology of fracture healing. Injury. 42 (6), 551-555 (2011).
  3. Cooper, G. M., et al. Testing the critical size in calvarial bone defects: revisiting the concept of a critical-size defect. Plastic and Reconstructive Surgery. 125 (6), 1685-1692 (2010).
  4. O'Brien, F. J. Biomaterials & scaffolds for tissue engineering. Materials Today. 14 (3), 88-95 (2011).
  5. Stanovici, J., et al. Bone regeneration strategies with bone marrow stromal cells in orthopaedic surgery. Current Research in Translational Medicine. 64 (2), 83-90 (2016).
  6. Anderson, J. M. Future challenges in the in vitro and in vivo evaluation of biomaterial biocompatibility. Regenerative Biomaterials. 3 (2), 73-77 (2016).
  7. Chen, Z., et al. Osteoimmunomodulation for the development of advanced bone biomaterials. Materials Today. 19 (6), 304-321 (2016).
  8. Ono, T., Takayanagi, H. Osteoimmunology in bone fracture healing. Current Osteoporosis Reports. 15 (4), 367-375 (2017).
  9. Tsiridis, E., Upadhyay, N., Giannoudis, P. Molecular aspects of fracture healing: Which are the important molecules? Injury. 38, S11-S25 (2007).
  10. Velasco, M. A., Narvaez-Tovar, C. A., Garzon-Alvarado, D. A. Design, materials, and mechanobiology of biodegradable scaffolds for bone tissue engineering. BioMed Research International. 2015, 729076 (2015).
  11. Bastian, O., et al. Systemic inflammation and fracture healing. Journal of Leukocyte Biology. 89 (5), 669-673 (2011).
  12. El-Jawhari, J. J., Jones, E., Giannoudis, P. V. The roles of immune cells in bone healing; what we know, do not know and future perspectives. Injury. 47 (11), 2399-2406 (2016).
  13. Changi, K., et al. Biocompatibility and immunogenicity of elastin-like recombinamer biomaterials in mouse models. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 106 (4), 924-934 (2018).
  14. Laczko, J., Levai, G. A simple differential staining method for semi-thin sections of ossifying cartilage and bone tissues embedded in epoxy resin. Mikroskopie. 31 (1-2), 1-4 (1975).
  15. Nakayama, T., et al. Polarized osteoclasts put marks of tartrate-resistant acid phosphatase on dentin slices--a simple method for identifying polarized osteoclasts. Bone. 49 (6), 1331-1339 (2011).
  16. Deguchi, T., et al. In vitro model of bone to facilitate measurement of adhesion forces and super-resolution imaging of osteoclasts. Scientific Reports. 6, 22585 (2016).
  17. Epstein, N. E. An analysis of noninstrumented posterolateral lumbar fusions performed in predominantly geriatric patients using lamina autograft and beta tricalcium phosphate. Spine Journal. 8 (6), 882-887 (2008).
  18. Epstein, N. E. Beta tricalcium phosphate: observation of use in 100 posterolateral lumbar instrumented fusions. Spine Journal. 9 (8), 630-638 (2009).
  19. Kallai, I., et al. Microcomputed tomography-based structural analysis of various bone tissue regeneration models. Nature Protocols. 6 (1), 105-110 (2011).
  20. Lo, D. D., et al. Repair of a critical-sized calvarial defect model using adipose-derived stromal cells harvested from lipoaspirate. Jove-Journal of Visualized Experiments. (68), (2012).
  21. Gosain, A. K., et al. Osteogenesis in calvarial defects: contribution of the dura, the pericranium, and the surrounding bone in adult versus infant animals. Plastic and Reconstructive Surgery. 112 (2), 515-527 (2003).
  22. Levi, B., et al. Dura mater stimulates human adipose-derived stromal cells to undergo bone formation in mouse calvarial defects. Stem Cells. 29 (8), 1241-1255 (2011).
  23. Wang, J., Glimcher, M. J. Characterization of matrix-induced osteogenesis in rat calvarial bone defects: II. Origins of bone-forming cells. Calcified Tissue International. 65 (6), 486-493 (1999).

Tags

Bio-ingénierie numéro 141 médecine régénérative biomatériaux la réparation des tissus squelettiques immunogénicité réaction à corps étranger in vitro in vivo
Profil de compatibilité biologique sur les biomatériaux pour la régénération osseuse
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kampleitner, C., Obi, J., Vassilev,… More

Kampleitner, C., Obi, J., Vassilev, N., Epstein, M. M., Hoffmann, O. Biological Compatibility Profile on Biomaterials for Bone Regeneration. J. Vis. Exp. (141), e58077, doi:10.3791/58077 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter