Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

الشخصية التوافق البيولوجي في الحيوية لتجديد العظام

doi: 10.3791/58077 Published: November 16, 2018

Summary

على توسيع عدد الحيوية رواية هندسيا لإصلاح آفات العظام الكبيرة بشكل مستمر بهدف تعزيز شفاء العظام والتغلب على التعقيدات المرتبطة بزرع العظام. وهنا، نقدم استراتيجية متعددة التخصصات للتجارب قبل الإكلينيكية توافق مع الحياة الحيوية لإصلاح العظام.

Abstract

كسور العظام الكبيرة غير الاتحاد تحديا كبيرا في جراحة العظام. على الرغم من السيارات وترقيع العظام متمكنة ممتازة لشفاء هذه الآفات، هناك المضاعفات المحتملة مع استخدامها. وهكذا، وضع العلماء المواد الحيوية الاصطناعية، متوافق حيويا للتغلب على هذه المشاكل. في هذه الدراسة، نقدم منصة متعددة التخصصات لتقييم المواد الحيوية لإصلاح العظام. ونحن يجمع بين الخبرة من عظم علم الأحياء وعلم المناعة وضع النظام الأساسي بما في ذلك في المختبر اوستيوكلاست (OC) وفحوصات osteoblast (OB) و في فيفو نماذج الماوس إصلاح العظام، الاستمناع وتحسسيه. ونحن لشرح كيفية إجراء التجارب وتلخيص النتائج وتقرير عن مادة بيولوجية توافق مع الحياة. على وجه الخصوص، نحن اختبار صلاحية المكشوف والتمايز، وتمعدن وصلاحية قائد والتمايز في سياق الأقراص β-tricalcium الفوسفات (β-TCP). نحن أيضا اختبار رغوة (β-TCP/ج) β-TCP/الكولاجين الذي مادة متوفرة تجارياً تستخدم سريرياً لإصلاح العظام في نموذج ماوس عيب العظام كالفاريال الحجم الحرج لتحديد الآثار في المرحلة المبكرة من التئام العظام. في تجارب موازية، يمكننا تقييم الاستجابات المناعية والحساسية في الفئران. نهجنا ينشئ ملف تعريف توافق البيولوجي لمادة بيولوجية العظام مع مجموعة من المعلمات اللازمة للتنبؤ بتوافق مع الحياة الحيوية المستخدمة لشفاء العظام وإصلاح في المرضى.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

إصلاح العظام هو عملية معقدة تبدأ بتشكيل ورم دموي، التهاب، callus تشكيل وثم يعيد البناء1،2. تجديد العظام المحتملة غير محدود بحجم1،3كسر العظام. على سبيل المثال، قد لا تشفي كسور العظام الكبيرة الناجمة عن الصدمات النفسية أو السرطان أو مرض هشاشة العظام وتسمى كسور العظام غير الأعضاء في الاتحاد. غالباً ما تتطلب هذه الآفات العظام العلاج تعزيز إصلاح صحي العظام الفسيولوجية وتجديدها. حاليا، هو زرع العظام أوتوجرافت و allograft نهج خيار4 مع إجراءات استبدال العظام 2.2 مليون سنوياً5. على الرغم من أن هذه الإجراءات قد ارتفاع نسبة نجاح، قد يكون هناك مضاعفات، على سبيل المثال، التوافر المحدود للعظام والإصابة، والجهات المانحة الموقع الاعتلال، ورفض4. بدائل جديدة لهندسة الأنسجة العظام يجري التصدي لهذه التحديات.

تصميم الحيوية على أساس البوليمرات الطبيعية أو الاصطناعية أو bioceramics أو المعادن في تركيبة مع الخلايا والجزيئات النشطة بيولوجيا في ارتفاع6. فهمنا الحالي للعظام الفسيولوجية الشفاء والشفاء في سياق الحيوية يعتمد على عوامل متعددة مثل الخصائص الميكانيكية والعوامل المحلية والنظم متعددة بما في ذلك الخلايا من التداول وكسر موقع7 ،،من89. الحيوية لتجديد العظام وتهدف إلى تعزيز أوستيوجينيسيتي ويندمج10 ومثالي متوافق حيويا والقابلة للتحلل، والمساميه (تشجيع الهجرة الخلية والأكسجين والمواد الغذائية). أنهم أيضا بحاجة إلى أن تكون قوية بما فيه الكفاية لدعم موقع الكسر لتخفيف الألم. بالإضافة إلى ذلك، العوامل التحريضية المطلوبة للشروع في عملية الشفاء. ومع ذلك، إذا كان يدفع مادة بيولوجية التهاب المفرط واستجابات حساسية، هذا قد تحد من أو تمنع العظام شفاء11،12. وهكذا، نهج متعدد التخصصات اللازمة لتقييم المواد الحيوية المتقدمة لإصلاح العظام.

في هذه الدراسة، ونحن تقديم تقييم قبل الإكلينيكية للمواد التمثيلية، فيتس 1) أورثوفيتا الرغوة وبديل الاختلاس عظم اسفنجي متاحة تجارياً يتألف من tricalcium الفوسفات تتكون من الحجم نانومتر نقية β-tricalcium جزيئات الفوسفات (β-TCP) و 1 نوع الكولاجين البقري (ج) (β-TCP/C رغوة) و 2) الأقراص β-TCP. هنا، نحن توضيح اختبار توافق مع الحياة الحيوية هذه استخدام osteoblast الأولية (OB) وفحوصات اوستيوكلاست (OC)، نموذجا في فيفو لإصلاح العظام، تقييما مناعية تتألف في المختبر انتشار اللمفاويات T و إنتاج سيتوكين، و في فيفو الاستمناع وتحسسيه، كما ذكر سابقا13.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

الإجراءات التي تم القيام به مع الفئران بالب/ج جميع المبادئ التوجيهية التالية لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية لوزارة التعليم والعلوم والأبحاث النمساوي وأقرتها اللجنة المعنية بأخلاقيات وزارة التعليم والعلوم النمساوية والبحوث.

1-الأساسي للماوس OB الثقافة

  1. الحريق المكشوف في معزل عن الماوس الولدان كالفاريا استخدام الهضم الأنزيمي
    1. Euthanize 1-2 اليوم القديمة الجراء الولدان (60 في المجموع) بقطع الرأس والرؤساء في طبق بتري مع العقيمة 1 × مخزنة الفوسفات المالحة (PBS).
    2. عقد الرئيس بمؤخر العنق، وقطع الجلد باستخدام مقص معقم بعيداً. جداً كالفاريوم واسطة خارقة لأنها (حوالي 0.1 – 0.3 مم) مع زوج من مقص ثم إدراجها تحت كالفاريوم في مؤخرة الرأس عند قاعدة الجمجمة، وقطع على طول حافة كالفاريال أفقياً من الخلف إلى الأمام فوق الأذنين ومن ثم abov (ه) جسر الآنف (الشكل 1).
    3. احتضان كالفاريا تشريح مع 8 مل من محلول الهضم تصفية تعقيم (300 وحدة/مل كولاجيناز النوع الرابع و 2.14 وحدة/مل ديسباسي الثاني حله في α-الحد الأدنى الأساسية المتوسطة (α-MEM)) في أنبوب 50 مل مخروطية في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة في حاضنة تهتز في يهز 200 دور/دقيقة.
    4. تجاهل المادة طافية الأولى وكرر الإجراء الهضم ثلاث مرات مع 8 مل من محلول الهضم. جمع المادة طافية تحتوي على الخلايا بعد كل خطوة من خطوات عملية الهضم وإضافته إلى أنبوب مخروطي 50 مل. تخزين 50 مل الأنبوبة المخروطية مع الخلايا في حمام الماء المثلج حتى يتم إكمال عملية الهضم (حوالي 40 دقيقة).
    5. الطرد المركزي الخلايا في 300 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية، ونضح المادة طافية (مع تعلق على فراغ مضخة ماصة باستور) وريسوسبيند في 40 مل من العظام النمو المتوسطة (BGM) التي تتضمن α-الفنزويلية مع 10% معطل الحرارة الجنيني البقري المصل (FBS)، و 1% الحل البنسلين والستربتوميسين. ثم أضف 10 مل تعليق خلية إلى 4 لوحات زراعة الأنسجة (10 سم).
    6. ثقافة الخلايا في 37 درجة مئوية و 5% CO2 حتى التقاء (2 – 3 أيام).
    7. في التقاء، نضح المتوسطة القديمة وغسل الأطباق زراعة الأنسجة مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني 1 x (37 درجة مئوية). ثم نضح برنامج تلفزيوني وإضافة 2 مل محلول التربسين 1 x يحتوي على 0.5% حمض الإيثيلين (يدتا) لكل لوحة زراعة الأنسجة 10 سم.
    8. احتضان ثقافة 4 اللوحات في 37 درجة مئوية و 5% CO2 لمدة 5 دقائق ومن ثم تحقق اللوحات مع مجهر مقلوب خفيفة لضمان أن يتم فصل الخلايا من البلاستيك. ثم نقل جميع خلايا المعلقات (مجموع 8 مل) إلى أنبوب 50 مل مخروطية التي تحتوي على 10 مل BGM الطازجة. تغسل كل لوحة مع 5 مل الطازجة BGM ونقل إلى أنبوب مخروطي 50 مل نفسه.
    9. الطرد المركزي الخلايا في 300 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية، ونضح المادة طافية وريسوسبيند الخلايا في 16 مل BGM الطازجة. إعداد 16 10 سم زراعة الأنسجة لوحات جديدة (تقسيم 1:4) التي تحتوي على 9 مل BGM. أضف 1 مل تعليق خلية لكل لوحة.
    10. كرر الخطوات 1.1.6. ل 1.1.8.
    11. الطرد المركزي الخلايا في 300 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية، ونضح المادة طافية وريسوسبيند في 10 مل BGM الطازجة. عد الخلايا وحساب تركيز الخلية.
      ملاحظة: هذا الإجراء بإنشاء حوالي 7.5 – 8.3 × 105 خلايا/ألجرو.
    12. الطرد المركزي في 300 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية، ونضح المادة طافية وريسوسبيند في تجميد المتوسطة التي تحتوي على 10% ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس]), α-الفنزويلية 40% و 50% FBS. نقل 1.5 مل تعليق خلية إلى كريوفيالس 2 مل بإجمالي 2 × 106 خلايا للقنينة الواحدة.
    13. فلاش تجميد القنينات في النتروجين السائل للتخزين على المدى الطويل في خزان النتروجين سائل. استخدام الخلايا في غضون سنة للتأكد من الأداء الوظيفي الكامل. استخدم هذه OBs الأولية لتقييم انتشار (الخطوة 1، 2)، التمايز (فحوصات الب: الخطوة 1، 4.، 1.5.) والتمعدن (الخطوة 1.6.) حضور الحيوية. تستخدم هذه الخلايا لنضوج السلائف OC المشتقة من نخاع العظام في ثقافة المشارك (الخطوة 2، 3).
  2. تحليل انتشار الحريق المكشوف
    1. احتضان الأقراص β-TCP قطر 14 مم في 1 مل BGM في لوحة ثقافة تعليق 24-جيدا في 37 درجة مئوية و 5% CO2 ل 24 ساعة قبل إضافة لوحات قياسية زراعة الأنسجة استخدام هذه الأولية لعناصر التحكم وتعليق لوحات الثقافة للعينات مادة بيولوجية لما قبل تجنب مرفق الخليوي للبلاستيك.
    2. نضح المتوسطة ما قبل الحضانة وثم ريسوسبيند OBs الماوس الأساسي في BGM. إضافة 4.4 × 104 OBs/سم2 على أقراص قبل المحتضنة β-برنامج التعاون الفني في لوحة ثقافة تعليق 24-جيدا ومجموعة مراقبة، في لوحة زراعة الأنسجة 24-جيدا (1 مل/جيد). سوف نعلق بس للوحة زراعة الأنسجة أو مادة بيولوجية.
    3. احتضان لمدة 14 يوما في 37 درجة مئوية و 5% CO2. خلال فترة الحضانة، تغيير في المتوسط كل 2 – 3 أيام وإضافة 1 مل BGM جديدة لكل بئر.
    4. لتقييم انتشار الحريق المكشوف، نقل الأقراص β--برنامج التعاون الفني في أيام 7 و 14 لآبار جديدة لاستبعاد الإشارات من الخلايا المزروعة في لوحة الثقافة تعليق.
    5. نضح المتوسطة القديمة، وإضافة 0.5 مل BGM (37 درجة مئوية)، واحتضان ثقافة لوحات لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية و 5% CO2. ثم قم بإضافة ميليلتر 55 10 × خلية انتشار كاشف (01:10 إضعاف) مباشرة إلى ثقافة جيدا. الفراغات، بإعداد ثلاثة آبار المحتوية على 0.5 مل BGM وميليلتر 55 من الكاشف انتشار الخلية 10 x. احتضان كل الألواح لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية و 5% CO2.
    6. سحب ونقل 150 ميليلتر من المادة طافية من كل بئر في لوحة سوداء 96-جيدا وقراءة الأسفار مع الإثارة في 560 نانومتر والانبعاثات في 590 نانومتر. طرح قراءات فارغة من قراءات العينة.
  3. فحوصات والتمايز والتمعدن OB
    1. قبل احتضان الأقراص β-TCP قطر 14 ملم في 1 مل BGM في لوحة ثقافة تعليق 24-جيدا في 37 درجة مئوية و 5% CO2 ل 24 ساعة قبل إضافة لوحات قياسية زراعة الأنسجة استخدام هذه لضوابط وتعليق لوحات الثقافة للعينات مادة بيولوجية لتجنب مرفق خلية للبلاستيك.
    2. نضح المتوسطة ما قبل الحضانة وثم ريسوسبيند OBs الماوس الأساسي في BGM. إضافة 8.8 × 104 OBs/سم2 على أقراص قبل المحتضنة β-برنامج التعاون الفني في لوحة ثقافة تعليق 24-جيدا ومجموعة مراقبة، في لوحة زراعة الأنسجة 24-جيدا (1 مل/جيد). سوف نعلق بس للوحة زراعة الأنسجة أو العينة مادة بيولوجية.
    3. استبدال BGM مع 1 مل من التمعدن osteogenic المتوسطة (مم) التي تحتوي على BGM و 50 ميكروغرام/ملليلتر حمض الأسكوربيك و 5 مم β-جليسيروفوسفاتي 24 ساعة بعد إضافة OBs واحتضان لمدة 14 يوما في 37 درجة مئوية و 5% CO2. قم بتغيير كل 2 – 3 أيام مع 1 مل مم الطازجة المتوسطة لكل بئر.
  4. تمايز OB يقيمها النشاط الفوسفاتيز القلوية (حزب العمال الأسترالي) من خلية ليساتيس
    1. لقياس نشاط حزب العمال الأسترالي في اليوم السابع بعد إضافة مم، نضح المتوسطة الثقافة من الآبار ويغسل مع 1 مل من س 1 العقيمة PBS (37 درجة مئوية). نضح بعناية برنامج تلفزيوني للسماح للخلايا المرفقة لتبقى على زراعة الأنسجة من البلاستيك أو مادة بيولوجية وتجميد الألواح في-80 درجة مئوية.
    2. بعد 24 ساعة (أو ما يصل إلى 2 أسابيع)، ذوبان الجليد في لوحة التحكم زراعة الأنسجة ومادة بيولوجية تعليق لوحة الثقافة في درجة حرارة الغرفة (RT) للتحضير لتحلل OB. لعينات مادة بيولوجية، نقل الأقراص β--برنامج التعاون الفني في صفيحة تعليق ثقافة جديدة لاستبعاد الخلايا تعلق على اللوحة. إضافة ميليلتر 75 الواحدة من 1 × العازلة تحلل الخلية جيدا لكل اللوحات. اهتز لوحات لمدة 5 دقائق على شاكر في 400 يهز/دقيقة.
    3. نقل الخلية ليستي إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي 0.5 مل وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ز لمدة 6 دقيقة في RT لإزالة الحطام. إضافة 50 ميكروليتر من عينة خلية المادة طافية ليستي لوح أسود 96-جيدا، ثم قم بإضافة 50 ميليلتر حل تتألف من 200 ميكرومتر فوسفات 6,8-ديفلورو-4-ميثيلومبيليفيريل (ديفموب) فلوروجينيك الركازة المذاب في 2 × الب المخزن المؤقت (الرقم الهيدروجيني 10) لكل بئر. إعداد بئرين فارغة مع 100 ميليلتر من محلول 1:1 يحتوي على المخزن المؤقت لتحلل الخلية x 1 و x 2 الب المخزن المؤقت.
    4. إعداد معايير مرجعية 8 مع 100 ميكروليتر/جيدا مع 6,8-difluoro-7-hydroxy-4-methylcoumarin (ديفمو) تتراوح بين 0.5 إلى 200 ميكرومتر المذابة في محلول 1:1 يحتوي على المخزن المؤقت لتحلل الخلية x 1 و 2 x الب العازلة لإنشاء منحنى مرجعية قياسية.
    5. احتضان اللوحة السوداء في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ومن ثم قراءة الأسفار مع الإثارة في 358 نيوتن متر والانبعاثات في 455 نانومتر. طرح قراءات فارغة من المعايير المرجعية وقراءات العينة.
    6. تطبيع نشاط إنزيم الب من ليساتيس الخلية إلى المبلغ الإجمالي للبروتين باستخدام مقايسة اللونية لتركيز البروتين. إعداد ألبومين المصل البقري معايير مرجعية البروتين (BSA) في طائفة من 0.05 – 2.5 ميكروغرام/ميليلتر حله في 1 × العازلة تحلل الخلية لتوليد منحنى قياسي.
    7. إعداد نموذج الخلية ليساتيس ومستويات البروتين جيش صرب البوسنة في التكرارات. إضافة 5 ميليلتر من الخلية عينة ليستي أو 5 ميليلتر من البروتين جيش صرب البوسنة الموحدة في لوحة 96-جيدا ثم قم بإضافة 25 ميليلتر من الكاشف A ' و 200 ميليلتر من كاشف المجموعة باء عن بئرين فارغة مع 5 ميليلتر من 1 × العازلة تحلل الخلية. احتضان اللوحات على RT لمدة 15 دقيقة ومن ثم قراءة امتصاص في 690 نانومتر. طرح قراءات فارغة من المعايير المرجعية وقراءات العينة.
  5. OB التمايز تلطيخ الب في خلية ثقافة تقييم
    1. وصمة عار الب في OBs المستزرعة في اليوم السابع بعد إضافة ملم في لوحة تحكم زراعة الأنسجة ومادة بيولوجية في لوحة ثقافة تعليق.
    2. نضح المتوسطة الثقافة من الآبار واستبدله 0.5 مل من س 1 برنامج تلفزيوني (37 درجة مئوية). نضح في برنامج تلفزيوني وإصلاح الخلايا التي تفرخ لهم في 0.5 مل فورمالين 10% مخزنة في RT لمدة 1 دقيقة.
    3. نضح الفورمالين 10% مخزنة مع بيبيت تستخدم مرة واحدة وإضافة 0.5 مل من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي (0.05% Tween20 في برنامج تلفزيوني س 1).
    4. حل تيترازوليوم (بسب/NBT) فوسفات 5-bromo-4-chloro-3-indolyl/نيترو الأزرق واحد الركازة الكمبيوتر اللوحي في 10 مل من الماء عالي النقاوة ودوامه حتى يذوب تماما. يجب حمايته من الضوء الحل واستخدامها ضمن ح 2.
    5. نضح في المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي واستبدال مع 0.5 مل من محلول الركازة بسب/NBT واحتضان اللوحة في RT في الظلام لأدنى 10 Aspirate الحل المصبوغة واستبدال مع 0.5 مل من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي.
    6. نقل الأقراص β-TCP الملون في بئر جديدة وتفحص لوحات ملطخة بحزب العمال الأسترالي مع ماسح ضوئي مسطح تقليدية إلى تلطيخ الب السجل.
  6. التمعدن OB يقيمها تلطيخ مع الأليزارين الأحمر S (جمعية الإغاثة اﻷرمنية)
    1. نضح المتوسطة الثقافة من الآبار التي تحتوي على أيام OBs 14 الابتدائي بعد إضافة ملم وشطف مرتين مع 0.5 مل من س 1 برنامج تلفزيوني في الرايت أسبيراتي برنامج تلفزيوني وإصلاح الخلايا عن طريق إضافة مخزنة 0.5 مل من ال 10% فورمالين الحل في RT لمدة 10 دقائق.
    2. نضح الفورمالين 10% مخزنة مع بيبيت تستخدم مرة واحدة، ويغسل مرتين مع 0.5 مل من الماء عالي النقاوة.
    3. ل OBs الثابتة، إضافة 0.25 مل من 40 مم أرس المصبوغة الحل (pH 4.2) المذابة في الماء عالي النقاوة واحتضان اللوحة على RT لمدة 10 دقيقة على شاكر في يهز 100/دقيقة.
    4. نضح الحل المصبوغة مع بيبيت تستخدم مرة واحدة والشطف مع 1 مل من الماء عالي النقاوة. كرر هذه الخطوة 5 – 10 مرات لإزالة غير محدد تلطيخ.
      ملاحظة: ينبغي أن يكون الحل الشطف دون لون.
    5. نضح الماء عالي النقاوة وإضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني الباردة. احتضان اللوحة على RT لمدة 10 دقيقة على شاكر في يهز 100/دقيقة.
    6. نضح برنامج تلفزيوني ونقل الأقراص β-TCP الملون إلى بئر جديد وفحص اللوحات مع الماسح ضوئي مسطح التمعدن سجل.
    7. إضافة 0.25 مل محلول كلوريد سيتيلبيريدينيوم 10% واحتضان اللوحة على RT لمدة 15 دقيقة على شاكر في يهز 100/دقيقة لاستخراج الصبغة جمعية الإغاثة اﻷرمنية.
    8. نقل سوبيرناتانتس إلى أنبوب 1.5 مل وأجهزة الطرد المركزي في 17,000 س ز لمدة 5 دقائق في الرايت
    9. إضافة 10% محلول كلوريد سيتيلبيريدينيوم إلى المقتطفات بتخفيف نسبة 01:10 – 01:20 وإضافة العينات (300 ميليلتر) في لوحة 96-جيدا بما في ذلك بئرين فارغة تحتوي على كلوريد سيتيلبيريدينيوم 10% فقط.
    10. إعداد 7 معايير مرجعية ARS تتراوح بين 4 إلى 400 ميكرون بتمييع ARS 40 مم تلطيخ الحل (pH 4.2) مع محلول كلوريد سيتيلبيريدينيوم 10% لإنشاء منحنى قياسي.
    11. إضافة 300 ميليلتر من معيار مرجعي في التكرارات للوحة 96-جيدا.
    12. قراءة امتصاص عينات، فراغات، والإشارة إلى المعايير على 520 نانومتر.
    13. طرح قراءات فارغة من المعايير المرجعية وقراءات العينة.

2. الماوس OB OC ثقافة المشارك لاشتقاق ناضجة مكتب الدعم الدستوري

  1. الإعداد والتعقيم لشرائح البقر العظام القشرية
    1. تنظيف الأجزاء من العظام من الأنسجة المحيطة وإزالة trabecular العظام ونخاع العظام.
    2. الجاف للعظام عند 50 درجة مئوية ح 24.
    3. شريحة العظم إلى قطع أصغر وقطع إلى شرائح (حوالي 300 – 350 ميكرون سميكة) باستخدام سرعة منخفضة وشهد مع شفرة الماس.
    4. مقطعة شرائح 300 – 350 ميكرون الأقراص التربيعية (1 سم2).
    5. لتنظيف محرك الأقراص العظام (1 سم2)، وضعها في قنينة زجاجية قابلة للقفل، وملء مع الماء المقطر. نقل القنينة الزجاجية المشغولة في حمام الموجات فوق الصوتية، و sonicate للحد الأدنى 5 كرر هذه الخطوة ثلاث مرات.
    6. من أجل إيقاف الماء المقطر وإضافة الإيثانول 70% sonicate لمدة 5 دقائق.
    7. من أجل إيقاف الإيثانول 70% واستبدال مع الإيثانول 100%.
      ملاحظة: تخزين الشرائح العظام في الإيثانول 100% عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 4 أسابيع.
    8. تشعيع شرائح العظام مع الأشعة فوق البنفسجية لمدة 15 دقيقة على كل جانب تحت ظروف معقمة. تخزين الشرائح العظام المعقم في لوحة ثقافة عقيمة في الرايت حتى استخدامها مرة أخرى.
  2. عزل سلائف OC نخاع العظام
    1. Euthanize 8 – 12 أسبوع القديمة السذاجة بالب/ج الفئران باستخدام حقنه داخل (القائمة) لحل xylazine الكيتامين و 24 ملغم/كغ 200 مغ/كغ.
    2. عزل السلائف OC نخاع العظام من قصبة الماوس وتايبي.
    3. إزالة الساقين مع مقص معقم من أقرب نقطة إلى الهيئة في الورك وقطعت أطرافه في مفاصل الركبة والكاحل وإزالة الأنسجة اللينة مع مشرط معقم والملقط. قطع في epiphyses. طرد وتعليق النخاع مع 1 مل BGM إلى طبق بتري معقم 6 سم استخدام إبرة ز 27 تعلق بحقنه 1 مل للحصول على تعليق خلية.
    4. إضافة تعليق خلية أنبوب مخروطي 50 مل، يغسل سم 6 طبق بيتري مع 5 مل من BGM ونقل إلى أنبوب مخروطي 50 مل نفسه. أجهزة الطرد المركزي في 350 x ز عند 4 درجة مئوية للحد الأدنى 5 ريسوسبيند الخلايا في OC التمايز المتوسطة (مارك ألماني) تحتوي على BGM، 1 نانومتر 1,25-(OH)2-فيتامين D3 و 1 ميكرومتر بروستاغلاندين ه2 (1 مل/جيد).
      ملاحظة: واحد بالب/ج الماوس توفر إعداد كافية من السلائف قائد لوحة الثقافة 24-بئر واحدة.
  3. إعداد الماوس OB OC ثقافة المشارك مع مادة بيولوجية
    1. قبل احتضان الأقراص β-TCP قطر 14 مم أو العظم البقري شرائح (1 سم2) في 1 مل من BGM في لوحة ثقافة تعليق 24-جيدا في 37 درجة مئوية و 5% CO2 ل 24 ساعة قبل إضافة الخلايا.
      ملاحظة: شرائح العظم البقري مجموعة مراقبة الركازة الفسيولوجي لدراسة التمايز OC حضور الحيوية.
    2. إضافة 8.8 × 104 خلايا/سم2 من الابتدائي بس علقت في BGM على الحيوية أو العظام التحكم في لوحة ثقافة تعليق 24-جيدا أو لوح زراعة الأنسجة 24-جيدا. احتضان في 37 درجة مئوية و 5% CO2 ل 24 ساعة.
      ملاحظة: إرفاق OBs البلاستيك أو العظم مادة بيولوجية أو الأبقار.
    3. إضافة طازجة معزولة نخاع العظام OC السلائف إلى ح 24 مثقف الابتدائي OBs والثقافة في 37 درجة مئوية و 5% CO2 لمدة 5 أيام. استبدال المتوسطة مع "مارك ألماني قائد" الطازجة كل يوم. ثم وصمة عار مكتب الدعم الدستوري طرطرات مقاومة حمض الفوسفاتيز (TRAP) لتقييم التمايز OC.
  4. تمييز قائد يقيمها تلطيخ فخ
    1. وصف OCs مولتينوكليتيد الناضجة، التي تم الحصول عليها من الخطوة 2.3.3، نضح المتوسطة الثقافة من لوحة التحكم زراعة الأنسجة ولوحة الثقافة تعليق مادة بيولوجية وإضافة 1 مل من س 1 برنامج تلفزيوني (37 درجة مئوية). نضح في برنامج تلفزيوني وإصلاح الخلايا التي تفرخ لهم في 1 مل من محلول فورمالين 10% مخزنة في RT لمدة 10 دقائق.
    2. نضح الحل الفورمالين 10% مخزنة مع بيبيت تستخدم مرة واحدة وإضافة 1 مل من س 1 برنامج تلفزيوني في الرايت كرر هذه الخطوة ثلاث مرات، ثم نضح برنامج تلفزيوني، واستبدال مع 1 مل من فخ المخزن المؤقت (درجة الحموضة 5) واحتضان اللوحات في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    3. نضح فخ المخزن المؤقت وإضافة 1 مل إيثانول الأسيتون و 100% 1:1. احتضان اللوحة في الرايت 30 س بسرعة حل aspirate الأسيتون-الإيثانول مع بيبيت تستخدم مرة واحدة وجاف تماما اللوحات في الرايت
    4. لفخ تلطيخ الحل، وإعداد 10 ملغ/مل الحل فوسفات نافثول-AS-MX الأسهم في حل N، N-dimethylformamide، 0.6 ملغ/مل بنفسجي الأحمر سريع الملح في فخ المخزن المؤقت، وإضافة 0.1 مل من محلول مخزون فوسفات نافثول-AS-MX إلى 10 مل ملح البنفسجي الأحمر سريع في فخ المخزن المؤقت.
    5. أضف 1 مل فخ تلطيخ الحل واحتضان لوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، ثم نضح في فخ تلطيخ الحل، وإضافة 1 مل من الماء عالي النقاوة التوقف عن رد فعل.
    6. نقل الأقراص β--برنامج التعاون الفني وشرائح العظم البقري بعد تلطيخ في بئر جديدة، مراقبة مكتب الدعم الدستوري الملون الأحمر استخدام مجهر ضوء (التكبير: 10 X) وتعداد فخ + ناضجة مكتب الدعم الدستوري مع نويات ثلاثة أو أكثر.

3-الحرجة الحجم الماوس عيب كالفاريال النموذجي

  1. حقن البوبرينورفين 0.1 مغ/كغ تحت الجلد (الليبي) في الفئران بالب/ج 8-الأسبوع القديمة للتسكين.
  2. تخدير الفئران بخليط من 100 مغ/كغ الكيتامين و 5 ملغ/كغ إكسيلازيني القائمة، وإضافة جل أو مرهم للعين الحفاظ عليها رطبة وضع الماوس على لوحة تدفئة في 37 درجة مئوية خلال الإجراء بأكمله لمنع انخفاض حرارة الجسم. تقييم عمق التخدير عن طريق رشة أخمص القدمين والذيل.
  3. يحلق الفراء على قمة الرأس بين الأذنين وتنظيف السطح مع البوفيدون 7.5 ٪ اليود الحل و 70% إيثانول.
  4. جعل شق خط الوسط السهمي على رأس الجمجمة بين الأذنين مع مشرط معقم فضح كالفاريوم وإزالة الأنسجة الضامة بيريكرانيوم أعلاه العظم الجداري الأيمن بإلغاء ذلك مع مشرط.
  5. إنشاء عيب الحجم الحرج في العظم الجداري الأيمن باستخدام تريفيني أسنان عقيمة التي يبلغ قطرها 4 مم (2000 لفة في الدقيقة) تحت الري المستمر مع المحلول الملحي العادي تحقيقها العظم الجداري الأيمن وقطع طريق اكتوكورتيكس وبعض اندوكورتيكس.
  6. لمنع الأضرار الأم الجافية، استخدام مصعد periosteal صغيرة لاختراق اندوكورتيكس المتبقية، بعناية ورفع العظم كالفاريال وإزالته بالملقط. ينبغي أن يكون الخلل الناجم عن ذلك التعميم، وحوالي 3.5 ملم في القطر.
  7. ملء العيب كالفاريال مع غارقة قبل (PBS العقيمة 1 x في RT) رغوة β-TCP/C باستخدام الملقط.
  8. إعداد العدد المناسب من مطابقة العمر، الشام والضوابط السلبية مع عيب فارغة.
  9. للاحتفاظ مادة بيولوجية في مكان، وضع 0.5 ميليلتر من لاصق الأنسجة عند حافة العيب في نقطتين المعاكس.
  10. إغلاق الجلد خياطة غير امتصاص.
  11. قم بتنظيف جميع الأدوات الجراحية بالتعقيم البارد للحفاظ على ظروف معقمة قبل إجراء الجراحة القادم المعني ماوس أنيسثيتيزيد.
  12. لتلقي العلاج بعد الجراحة، ضع الحيوانات على لوحة تدفئة نظيفة وجافة في 37 درجة مئوية في مجال الجراحة للرصد المناسبة خلال فترة الانتعاش. مراقبة معدل التنفس ودرجة حرارة الجسم ولون الأغشية المخاطية وعيون كل 10 دقائق حتى أنها تنبيه.
  13. نقل الفئران واعية تعمل في قفص مع الغذاء والماء يفصل بين الحيوانات الأخرى حتى الشفاء التام. حقن البوبرينورفين 0.1 مغ/كغ الليبي للعلاج مسكن بعد الجراحة مرتين يوميا ل 72 حاء عودة تعافي تماما الفئران في اقفاصها.
  14. لتحديد مدى فعالية مادة بيولوجية، euthanize القائمة الفئران مع حل xylazine الكيتامين و 24 ملغم/كغ 200 مغ/كغ.
  15. في غرس ما بعد الأسابيع 8-12، قطع رأس الماوس euthanized مع مقص حاد.
  16. إصلاح الماوس مقطوعة الرأس في 30 مل من 4.5% مخزنة الحل الفورمالين 1-2 أسابيع لضمان كامل اختراق مثبت الأنسجة.
  17. نقل الرؤساء إلى إيثانول 70% للتخزين على المدى الطويل عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى سنة واحدة.
  18. يحسب الدقيقة استخدام تقنيات نسيجية أونديكالسيفيد موحدة لتقييم التجدد العظام أو التصوير المقطعي (ميكروكت). فمن الممكن لاستخدام ميكروكت المسح على عينات تشريح الجثة بدقة عالية (90 كيلو فولت، 4 دقيقة) في 2D و 3D السهمي وطائرات أمامي.
  19. لعلم الأنسجة أونديكالسيفيد، يذوي الرؤساء في ترتيب تصاعدي درجات الإيثانول وتضمين في ميثاكريلات الميثيل غليكول.
  20. قص القطع جزءا لا يتجزأ من ميتاكريليت الميثيل غليكول مع رأي الماس وطحن الأقسام لسمك حوالي 80 – 100 ميكرون.
  21. تقييم لاكزكو ليفي الملون أقسام العظام لتحديد تكوين العظام الجديدة14.

4. في المختبر الاستجابات المناعية

  1. Euthanize السذاجة 8-الأسبوع القديمة بالب/ج الفئران القائمة مع حل xylazine الكيتامين و 24 ملغم/كغ 200 مغ/كغ.
  2. ضع الماوس على الجانب الأيمن والفراء على الجانب الأيسر للحلاقة وتنظيف الجلد على الجانب الأيسر من البطن مع الإيثانول 70%.
  3. جعل 10 مم طويل وشق عميق 1 ملم في جلد الماوس على الجانب الأيسر من الخلف بعد الأضلاع حول المعدة باستخدام مقص معقم.
  4. فتح الجلد وتكشف ثم الصفاق. جعل 10 مم طويل وأقل من 1 ملم الشق العميق في الصفاق استخدام مقص تحت ظروف معقمة.
  5. دفع المعدة بروكسيمالي لفضح الطحال.
  6. عقد الطحال بلطف مع ملقط معقم وإزالته عن طريق قطع الأنسجة والأوعية المرفقة أدناه.
  7. ضع الطحال سليمة في أنبوب 50 مل تحتوي على 10 مل من البرد 1 × PBS العقيمة.
  8. إعداد تعليق خلية مفردة تنميق الطحال باستخدام ملقط معقم 2 أو 2 شرائح زجاجية معقمة.
  9. إزالة الأنقاض التي يمر مصفاة خلية 40 ميكرومتر عقيمة مع برنامج تلفزيوني الباردة 1 x باستخدام المكبس لحقنه 1 مل.
  10. الطرد المركزي من تعليق خلية مفردة في 300 x ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية في أنبوب 50 مل مخروطية ونضح وتجاهل المادة طافية. ثم ريسوسبيند بيليه الخلية في 5 مل من المخزن المؤقت لتحلل خلايا الدم الحمراء (RBC).
  11. احتضان تعليق خلية لمدة 14 دقيقة على RT ووقف رد الفعل بإضافة 45 مل متوسطة معهد ميموريال بارك في روزويل (ربمي).
  12. الطرد المركزي في الخلايا بعد تحلل الخلية في 300 x ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية وثم تجاهل المادة طافية.
  13. سبلينوسيتيس ريسوسبيند في ربمي المتوسطة التي تحتوي على 10% الحرارة-إبطال FBS الحل البنسلين والستربتوميسين 1%، 0.1% الجنتاميسين، 0.2% ß-mercaptoethanol والأحماض الأمينية غير الأساسية 1%.
  14. قبل احتضان الرغوة β-TCP/C في لوحة ثقافة عقيمة 96-كذلك يتضمن المتوسطة ربمي عن 24 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5% CO2 قبل البذر الخلية.
  15. إضافة سبلينوسيتيس في معاير الأرقام، على سبيل المثال.، 1.25 × 105، 2.5 × 105 و 5 × 105/well للآبار في صفيحة زراعة الأنسجة 96-كذلك يتضمن ربمي المتوسطة وإضافات، مع أو بدون الرغوة β-TCP/ج المحتضنة مسبقاً.
  16. إضافة 10 ميكروغرام/مل كونكانافالين (Con A) الذائبة في المتوسطة لما مجموعة 100 ميليلتر/بئر إلى الآبار المناسبة واحتضان ثم في 37 درجة مئوية و 5% CO2 لح 72.
  17. قياس انتشار الخلايا مع الإنزيم بروموديوكسيوريديني (بردو). إضافة 10 ميليلتر/جيدا لحل وضع العلامات بردو في ح 48 خلية الثقافة واحتضان ثم لوحة 24 ساعة إضافية.
  18. في ح 72، جمع المادة طافية وتخزينها في-20 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى.
  19. إضافة 200 ميليلتر/بئر الحل التثبيت لكل بئر واحتضان لمدة 30 دقيقة في الرايت أسبيراتي ثم تثبيت الحل. إضافة 100 ميليلتر/بئر الحل بردو مكافحة جسم العامل واحتضان لمدة 90 دقيقة.
  20. نضح الحل جسم وشطف الآبار ثلاث مرات مع 200-300 ميليلتر/جيد للغسيل حل وإزالة الحل الغسيل.
  21. إضافة 100 ميليلتر من الركازة الحل واحتضان لمدة 3-10 دقيقة في الرايت، ثم قياس امتصاص 450 نانومتر.
  22. قياس انترلوكين-1β (إيل-1β)، interleukin-2 (إيل-2)، 4-انترلوكين (إيل-4) والانترفيرون γ (IFN-γ) في supernatants جمعها استخدام أليسا قياسية.

5-ارتفاع الإنتاجية داخل نموذج

  1. تخدير الإناث القديمة 6-8-أسبوع بالب/ج الفئران بخليط من 100 مغ/كغ الكيتامين و 5 ملغ/كغ إكسيلازيني القائمة وإضافة جل أو مرهم للعين الحفاظ عليها رطبة وضع الماوس على لوحة تدفئة في 37 درجة مئوية خلال الإجراء بأكمله لمنع انخفاض حرارة الجسم. تقييم عمق التخدير عن طريق رشة أخمص القدمين والذيل.
  2. يحلق الفراء البطن وتنظيف مع 7.5% البوفيدون اليود الحل و 70% إيثانول.
  3. جعل شق خط الوسط طويلة 8 مم من خلال الجلد على طول ينيا ألبا. إجراء شق صغير في الغشاء البريتوني باستخدام مشرط.
  4. مكان PBS العقيمة غارقة الطعوم الرغوة β-TCP/C (2 × 2 × 2 مم3) في التجويف الصفاقى أو دون إضافة مواد للفئران التحكم مطابقة العمر الشام.
  5. خياطة الصفاق والجلد بخياطة قابلة للامتصاص وعدم الامتصاص، على التوالي.
  6. قم بتنظيف جميع الأدوات الجراحية بالتعقيم البارد للحفاظ على ظروف معقمة قبل إجراء الجراحة القادم المعني ماوس أنيسثيتيزيد.
  7. لتلقي العلاج بعد الجراحة، ضع الحيوانات على لوحة تدفئة نظيفة وجافة في 37 درجة مئوية في مجال الجراحة للرصد المناسبة خلال فترة الانتعاش. مراقبة معدل التنفس ودرجة حرارة الجسم ولون الأغشية المخاطية وعيون كل 10 دقائق حتى أنها تنبيه.
  8. نقل الفئران واعية تعمل في قفص مع الغذاء والماء يفصل بين الحيوانات الأخرى حتى الشفاء التام. العودة الفئران تعافي تماما إلى اقفاصها.
    ملاحظة: هذا الإجراء يدفع الحد الأدنى من الألم. عادة العلاج مسكن بعد الجراحة ليست ضرورية. إذا كانت تعمل الحيوانات تظهر علامات الألم، حقن البوبرينورفين 0.1 مغ/كغ الليبي أو دواء مسكن ملائم آخر لتخفيف الألم.
  9. Euthanize الفئران غرس ما بعد 7 أيام، مع إيجاد حل للقائمة xylazine الكيتامين و 24 ملغم/كغ 200 مغ/كغ
  10. في غرس ما بعد 7 أيام، الغسل التجويف الصفاقى 1 مل باستخدام المحاقن بإبرة ز 25 لما مجموعة 3 مل من برنامج تلفزيوني الباردة بضغط رأس الماوس وإدخال الإبرة في الربع البطني السفلي الأيسر وتهدف بروكسيمالي.
    ملاحظة: يجب أن يكون السائل البريتوني خالية من كرات الدم الحمراء.
  11. الطرد المركزي الغسل البريتوني السوائل في 300 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية، وجمع السائل البريتوني لتخزين في-20 درجة مئوية للقياسات أليسا السيتوكينات إيل-1β، وايل-2، وايل-4.
  12. نضح المادة طافية، ريسوسبيند بيليه الخلية في 1 مل من برنامج تلفزيوني، ومن عد الخلايا البريتوني باستخدام تريبان الأزرق في هيموسيتوميتير.
  13. سيتوسينتريفوجي تعليق خلية في 5 × 105 خلايا إلى الشرائح الزجاجية، السماح للشرائح لتجف ووصمة عار لعدد خلايا المتمايزة.
  14. استخدام مجهر ضوء، عد كحد أدنى من 300 الخلايا في المجموع والتفريق بين الضامة، الحمضات، العَدلات واللمفاويات.

6-الفمية النموذجي تحت الجلد

  1. تخدير الإناث الأسبوع 6-8 القديمة بالب/ج الفئران بخليط من 100 مغ/كغ الكيتامين و 5 ملغ/كغ إكسيلازيني القائمة، إضافة جل أو مرهم للعين الحفاظ عليها رطبة وضع الماوس على لوحة تدفئة في 37 درجة مئوية خلال الإجراء بأكمله لمنع انخفاض حرارة الجسم. تقييم عمق التخدير عن طريق رشة أخمص القدمين والذيل.
  2. ضع الماوس على ظهرها ويحلق الفراء البطن وتنظيف سطح حلق مع البوفيدون 7.5 ٪ اليود الحل و 70% إيثانول.
  3. جعل شق خط الوسط طويلة 8 مم من خلال الجلد على طول ينيا ألبا البطن باستخدام المبضع وزرع برنامج تلفزيوني ثم غارقة مادة بيولوجية (2 × 2 × 2 مم3) تحت الجلد أو إضافة أية مواد للفئران التحكم مطابقة العمر الشام.
  4. خياطة الجلد مع خياطة غير امتصاص.
  5. قم بتنظيف جميع الأدوات الجراحية بالتعقيم البارد للحفاظ على ظروف معقمة قبل إجراء الجراحة القادم المعني ماوس أنيسثيتيزيد.
  6. لتلقي العلاج بعد الجراحة، ضع الحيوانات على لوحة تدفئة نظيفة وجافة في 37 درجة مئوية في مجال الجراحة للرصد المناسبة خلال فترة الانتعاش. مراقبة معدل التنفس ودرجة حرارة الجسم ولون الأغشية المخاطية وعيون كل 10 دقائق حتى أنها تنبيه.
  7. نقل الفئران واعية تعمل في قفص مع الغذاء والماء يفصل بين الحيوانات الأخرى حتى الشفاء التام. العودة الفئران تعافي تماما إلى اقفاصها.
    ملاحظة: هذا الإجراء يدفع الحد الأدنى من الألم. عادة العلاج مسكن بعد الجراحة ليست ضرورية. إذا كانت تعمل الحيوانات تظهر علامات الألم، حقن البوبرينورفين 0.1 مغ/كغ الليبي أو مسكن مناسب آخر.
  8. عندما تكون جاهزاً لدراسة الموقع غرس، euthanize القائمة الفئران مع حل xylazine الكيتامين و 24 ملغم/كغ 200 مغ/كغ.
  9. غرس ما بعد ثمانية أسابيع، المكوس الموقع غرس مع المحيطة بالانسجة (1 سم2).
  10. إصلاح النسيج في محلول الفورمالين 4.5% معزولة بين عشية وضحاها، وتضمين في البارافين ومقطعة 4 ميكرومتر المقاطع.
  11. وصمة عار 4 أقسام الأنسجة جزءا لا يتجزأ من البارافين ميكرومتر والهيماتوكسيلين ويوزين (H & E) لالتهاب أو Masson's trichrome لترسيب الكولاجين والتليف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

تقييم β-TCP لفعاليته مادة بيولوجية لإصلاح العظام، استخدمنا في المختبر و في فيفو فحص الطرق. أولاً، قمنا بقياس ردود المكشوف على الأقراص β--برنامج التعاون الفني بالمقارنة مع خط الأساس الضوابط وحدها متوسطة. يوضح الشكل 2 صلاحية OB ردا على الأقراص β--برنامج التعاون الفني في 7 و 14 يوما للثقافة. بقاء الخلية تقاس من الخلايا النشطة أيضي في آبار الثقافة هي نفسها بالنسبة OBs مع المتوسط في زراعة الأنسجة من البلاستيك وكذلك مع الأقراص β--برنامج التعاون الفني التي تشير إلى أن هذا مادة بيولوجية لا تحسين ولا قمع انتشار الحريق المكشوف.

لمواصلة تقييم في OBs، قمنا بقياس نشاط حزب العمال الأسترالي كعلامة للتمييز بين استخدام النهج الكمية والنوعية. ويبين الشكل 2 نشاط إنزيم الب في آبار الثقافة بعد 7 أيام للثقافة. كان بس في الآبار مع المتوسط وحدها الأساس نشاط حزب العمال الأسترالي، بينما OBs المتوسطة (مم) في تمعدن الأمثل الب مكثفة تلطيخ، الأمر الذي يعكس درجة عالية من التمايز OB. على النقيض من ذلك، OBs مطلي على الأقراص β-TCP متباينة أقل من OBs المحتضنة في مم. وكان تركيز الب في تحليل كمي، 77% أعلى بالنسبة للآبار التي تحتوي على مقارنة مع المتوسط الأساس وحدها، في حين كان تركيز الب 40% انخفاض في الخلايا المستزرعة على الأقراص β-TCP مقارنة بضوابط مم مم. على الرغم من أن هذه النتائج تظهر أن الخلايا المزروعة في الأقراص β-TCP متباينة أقل من ذوي الظروف المثلى من البلاستيك مع مم، أنها متباينة بما فيه الكفاية على الحيوية.

ميزة حاسمة أخرى من OBs هو قدرتها على حمل التمعدن، وخطوة أساسية في شفاء العظام. ونحن الملون مثقف OB الخلايا مع جمعية الإغاثة اﻷرمنية بعد 14 يوما ووجدت أن التمعدن كانت أعلى بالنسبة لضوابط مم OBs مثقف في المتوسط وحدها وعلى الأقراص β--برنامج التعاون الفني في الثقافة الآبار (الشكل 2) بالمقارنة. عندما قمنا بقياس تركيز جمعية الإغاثة اﻷرمنية، وجدنا أن الضوابط ملم بأكثر من 45 في المائة أعلى من مجموعة بيتا--برنامج التعاون الفني. هذه البيانات توضح أن OBs مثقف البلاستيك حضور مم الناضجة على التفريق وطاغية أفضل من تلك التي مع المتوسطة وحدها وعلى الأقراص β-TCP.

لتحديد كيفية استجابة مكتب الدعم الدستوري للأقراص β--برنامج التعاون الفني، قمنا باستخدام تقنية تثقيف التي تستزرع OBs اشتركت مع السلائف OC نخاع العظام تليها دراسة مورفولوجيا OC. لاحظ في 5 أيام OB OC المشارك الثقافات وتختلف اختلافاً جوهريا بين الخلايا المزروعة في البلاستيك مع "قائد ألماني" والخلايا المزروعة في شرائح العظام وبيتا--برنامج التعاون الفني. البلاستيك، تم مكتب الدعم الدستوري كبيرة وعلى نطاق واسع حين كانت أصغر حجماً وأقل-انتشار خارج مكتب الدعم الدستوري على ركائز الفسيولوجية وغير منتظمة على شكل (الشكل 3). إلى قوانتيتاتي مكتب الدعم الدستوري، تعداد فخ + "مكتب الدعم الدستوري" ووجد أن هناك أرقام أعلى عند المحتضنة مع β-TCP (1755 ± 21.41/سم2) مقارنة بضوابط زراعة الأنسجة (1140 ± 15.71/سم2) وشرائح العظام (709 ± 59.69/سم2)، وقد يوحي تعزيز التمايز OC على الأقراص β-TCP (الشكل 3).

لتحديد متاحة تجارياً β-TCP/C رغوة في فيفو، استخدمنا نموذج الحجم الحرج عيب كالفاريال في الفئران. نعرض مقاطع نسيجية الممثل معالجتها بواسطة أسلوب النسيجي أونديكالسيفيد غليكول ميثاكريلات الميثيل التضمين ولاكزكو ليفاي تلطيخ. قد تستعمل لتقييم تكوين العظام الجديدة داخل منطقة عيب ميكروكت وعلم الأنسجة. هنا، نحن إظهار مثال مع مقاطع نسيجية في الشكل 4. عند الخلل الناجم عن جراحي العظام تركت فارغة (الشام)، لاحظنا طبقة رقيقة تغطي عيب كاملة، ولكن لا تكوين العظام كبيرة كان حاضرا في 12 أسبوعا بعد العملية يؤكد حجم حاسم لكسر العظام التي تم إنشاؤها. على النقيض من ذلك، عندما العيب الواردة الرغوة β-TCP/ج، كانت هناك بقايا الرغوة β-TCP/ج محاطة بالنسيج الليفي الكثيف بما في ذلك بعض الأوعية الدموية والخلايا الملتهبة سد منطقة عيب دون أدلة لتكوين العظام.

لتقييم استجابة جسم غريب، قمنا بتقييم ردود الفعل المناعية والحساسية للمواد الحيوية، باستخدام فحص في المختبر . يوضح الشكل 5 أن عندما كانت المحتضنة السذاجة sبلينوسيتيس المتوسطة وحدها أو مع الرغوة β-TCP/ج، لم يستجب خلايا الطحال السذاجة التي تنتشر أو إنتاج إيل-2، إيل-4، و IFN-γ السيتوكينات. وفي المقابل، في كونا المحتوية على الثقافات وتكاثر الخلايا وإنتاج سيتوكين زادت باستثناء إيل-1β. وكانت الردود الخلية عندما لا تتأثر مثقف يشترك مع كونا والرغوة β-TCP/C بالمقارنة مع كونا وحدها، مما يشير إلى أن الرغوة β-TCP/ج الردود أي زيادة أو نقصان في المختبر .

لتحديد ما إذا كانت الرغوة β-TCP/ج الناجمين عن استجابة مناعية في الجسم الحي ، ونحن مزروع 1) إينترابيريتونيلي وقياس تركيزات الخلية الملتهبة التهم وسيتوكين في السائل البريتوني الغسل و 2) تحت الجلد وتقييمها التهاب وتليف في أقسام الموقع غرس النسيجي. ويكشف الخلية المتمايزة في السائل البريتوني الغسل في الجدول 1، أن العدد الإجمالي للخلايا الملتهبة كان أعلى بكثير في الفئران بيتا--برنامج التعاون الفني/C رغوة مزروع بالمقارنة مع عناصر تحكم الشام. وعلاوة على ذلك، كانت هناك زيادة في إعداد جميع أنواع الخلايا. في الشكل 6A، هناك تركيزات أعلى من السيتوكينات إيل-1β، وايل-2، وايل-4 في الرغاوي β-TCP/C بالمقارنة مع عناصر تحكم الشام. في الرغوة β-TCP/ج الفئران الليبي مزروع، لاحظنا استجابة التهابات مع هيئة أجنبية الخلايا العملاقة على ح & أبواب الملون ه (الشكل 6B) والأدلة من التليف في تريتشرومي ماسون الملون المقاطع (الشكل 6) في 8 أسابيع. وفي المقابل، كان الموقع غرس الضوابط الشام التهاب الحد الأدنى ولا التليف (الشكل 6).

Figure 1
رقم 1: إزالة كالفاريا للابتدائي الرسم التخطيطي لعزل الخلية OB. يوضح الرسم التخطيطي كيفية إزالة كالفاريوم مع التخفيضات 4 (خط متقطع أحمر) باستخدام مقص منحنى. أول خطوة من نوعها عمودي على محجر العين اليمنى (R) من X1 إلى X 2، والثاني عمودي على اليسار تجويف العين (L) من X3 إلى X 4. الخفض الثالث لفصل كالفاريوم في الجزء الأمامي من X4 إلى X 2، والخفض الرابع لفصل الجزء الخلفي من X3 إلى X 1. ومن ثم كالفاريوم مجاناً إزالة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: TCP المستحثة بيتا في المختبر OB التمايز والنضج- OB البقاء والانتشار في أيام 7 و 14 للخلايا المزروعة في المتوسط وحدها (أشرطة) أو β-TCP (الحانات مفتوحة) (يعني ± ووزارة شؤون المرأة؛ n = 3). الب النشاط الكمي للخلية ليساتيس والتطبيع لمحتوى البروتين (ميكرومتر ديفمو/ميكروغرام من البروتين، يعني ± ووزارة شؤون المرأة، n = 3) مع الممثل الصور التي توضح آبار الثقافة الب الملون من يوم 7. التمعدن كمياً من الثقافات الملطخة بجمعية الإغاثة اﻷرمنية بطريقة استخراج كلوريد سيتيلبيريدينيوم كما هو موضح التركيز من جمعية الإغاثة اﻷرمنية (ن أرس، يعني ± ووزارة شؤون المرأة، ميكرومتر = 3) مع ثقافة الممثل الملون ARS الآبار في يوم 14. وتشمل الفئات المتوسطة النمو العظام وحدها (BGM)؛ التمعدن المتوسطة (مم)؛ Β--برنامج التعاون الفني. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: TCP المستحثة بيتا في المختبر OC التمايز. إظهار photomicrographs الممثل فخ + "الشركات المتعددة الجنسيات" في يوم 5 بعد استزراع شارك بس الماوس والسلائف OC نخاع العظام. تحليل نقطة النهاية لفخ + الخلايا مولتينوكليتيد (الشركات المتعددة الجنسيات) يوضح العدد المطلق لفخ + "الشركات المتعددة الجنسيات" (إيه ثري نوى) كل سم2 (يعني ± ووزارة شؤون المرأة، n = 3) * * *ف < 0.001. وتشمل المجموعات التمايز OC المتوسطة وحدها (ألماني)؛ العظام؛ Β--برنامج التعاون الفني. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: ترقيع في فيفو التقييم العظام الرغوة β-TCP/C في نموذج الحجم الحرج عيب كالفاريال. عدم شفاء كالفاريال العيوب التي تم إنشاؤها في بالب الإناث 8-الأسبوع القديمة/ج (n = 3) الفئران باستخدام ترفين أسنان 4 مم. معاملة مجموعات الشام تضمين عنصر التحكم (عيب فارغة) وعيوب تعامل مع الرغوة β-TCP/ج. مقاطع نسيجية الممثل أعدت في غرس ما بعد 12 أسبوعا. أقسام جزءا لا يتجزأ من ميتاكريليت الميثيل الأنسجة الثابتة الفورمالين غليكول (80 – 100 ميكرومتر) ملطخة بصبغ ليفاي لاكزكو. Photomicrographs سيظهر في منخفض (يسار) والتكبير عالية (يمين). مثلثات سوداء تشير إلى خلل العظام. أسود * يدل على أنسجة العظام والأبيض * يشير إلى رغوة β-TCP/ج. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الشكل 5: β--برنامج التعاون الفني/ج المستحثة برغوة في المختبر خلية انتشار وسيتوكين الإنتاج. سبلينوسيتيس من السذاجة بالب/ج الفئران مثقف في المتوسطة وحدها، مع رغوة β-TCP/C أو كونا. تكاثر الخلايا طافية (بردو)، وإنتاج إيل-1β، إيل-2، إيل-4، و IFN-γ (● وحدها متوسطة و ○ كونا، ■ الرغوة β-TCP/ج، والرغوة β-TCP/ج وكونا □). انتشار النتائج المعروضة كمتوسط ثلاث عينات (نقلت ± SEM) في مقايسة بردو ومتوسط عينات مكررة (pg/mL ± SEM) لتركيز سيتوكين من تجربتين مستقلة. ف < 0.05 تعتبر هامة بالنسبة لمادة بيولوجية مقابل متوسط ومادة بيولوجية وكونا مقابل كونا وحدها. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 6
الشكل 6: ترقيع في فيفو الاستجابة المناعية للعظام الرغوة β-TCP/C بسرعة عالية الإنتاجية القائمة وطراز الماوس الفمية. (أ) مزروع القائمة مع الرغوة β-TCP/ج الفئران الإناث بالب/c أو دون إضافة المواد (الشام). سبعة أيام في وقت لاحق، البريتوني الغسل تحليل لتركيزات سيتوكين (البيانات المعروضة كما يعني سيتوكين تركيزات pg/mL ± SEM). هذه البيانات هي الممثل لتجربتين مستقلة (n = 5). ف < 0.05 يعتبر كبيرا مقارنة بالشام. (ب-ج) الإناث بالب/ج الفئران (n = 5) مزروع الليبي مع الرغوة β-TCP/C أو دون إضافة المواد (الشام). في 8 أسابيع بعد زرع، الجلد من مواقع غرس ملطخة H & ه (ب) وفي ماسون تريتشرومي (ج) لتقييم التهاب وتليف، على التوالي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

شام فيتس
خلية التهم x 106 (% من مجموع الخلايا)
الضامة 1.240 ± 0.051 (88.1) 3.262 ± 0.380 (70.4) ف < 0.001
الحمضات 0.120 ± 0.011 (8.5) 1.181 ± 0.254 (25.5) ف < 0.01
العَدلات ± 0.002 0.001 (0.2) 0.029 ± 0.011 (0.6) ns
الخلايا اللمفية ± 0.048 0.020 (3.2) ± 0.148 0.041 (3.5) ns
عدد مجموع الخلايا 1.410 ± 0.066 4.620 ± 0.452 ف < 0.001

الجدول 1: في فيفو ترقيع الاستجابة المناعية للعظام الرغوة β-TCP/C في طراز ماوس سريع عالية إنتاجية القائمة. وكانت الإناث بالب/ج الفئران القائمة مزروع برغوة β-TCP/C أو بدون مواد (الشام). سبعة أيام في وقت لاحق، حصل الغسل البريتوني وتحليلها لعدد الخلايا التحريضية وحساب الخلية المتمايزة (البيانات المعروضة كما يعني خلية التهم ± SEM). هذه البيانات هي الممثل لتجربتين مستقلة (n = 5).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

هنا، نعرض نهجاً متعدد التخصصات للتقييم السريري لتوافق مع الحياة للممثل الحيوية المتقدمة لإصلاح وتجديد العظام. وقمنا باختبار ردود OBs، مكتب الدعم الدستوري، ونموذج رد فيفو في الشفاء في عيب حرجة العظام في الفئران، وكذلك في المختبر و في فيفو الاستجابات المناعية. أننا هدف لإظهار كيفية عمل فحوصات وتلخيص البيانات والاستنتاجات المستمدة من دراسة المواد الحيوية. نظهر أن استراتيجيتنا يقوم بإنشاء ملف تعريف قيمة من العظم مادة بيولوجية توافق مع الحياة.

واستخدمت فحوصات الخلايا الأولية لتقييم دالة OB و OC. وبس المسؤولة عن تكوين العظام وإصلاح الفسيولوجية. أنها يجب أن تظل قابلة للتطبيق والتفريق وحمل التمعدن. نحن في هذه الدراسة، يظهر كيفية إجراء فحوصات لبقاء الخلية، وألب، وجمعية الإغاثة اﻷرمنية كعلامات خلايا المتمايزة فسيولوجيا مع القدرة على طاغية. عناصر التحكم لفحوصات شملت المتوسطة وحدها، التي توفر أساس وتمعدن osteogenic المتوسطة (مم)، التي الأمثل التمايز والتمعدن OBs البلاستيك. مجموعة التحكم هذه الأخيرة كانت إشارة قياسية لمادة بيولوجية. لتقييم قائد، نحن مثقف شارك OBs والسلائف OC المشتقة من نخاع العظام، متباينة والسلائف إلى خلايا مولتينوكليتيد، ملطخة لهم فخ، إنزيم أوستيوكلاستيك تستخدم على نطاق واسع لتحديد مكتب الدعم الدستوري في المختبر15 وثم تعداد الخلايا باستخدام الفحص المجهري الخفيفة. هذه الاختبارات هي الدولة من الفن، ولا تتطلب تعديلات. ومع ذلك، لاحظنا وجود قيود تتصل بنوعية OBs الأولية المعزولة طاغية. OBs المحفوظة المخزنة في النتروجين السائل وتستخدم خلال سنة واحدة لتحقيق أفضل النتائج.

المرفق المكشوف والنشاط كانت أعلى في زراعة الأنسجة من البلاستيك من على الأقراص β-TCP اختبارها. عندما قمنا بتقييم مكتب الدعم الدستوري، لاحظنا الخلافات المتوقعة بين الاستجابة للبلاستيك والعظام، وهو الركيزة الفسيولوجية16. وبالمقارنة، العظام، وبيتا--برنامج التعاون الفني الناجم عن التغيرات المورفولوجية مماثلة. تعداد المقايسة فخ مكتب الدعم الدستوري في الاستجابة للأقراص β--برنامج التعاون الفني تبين أن الأرقام تختلف اختلافاً كبيرا بين شرائح العظام وبيتا--برنامج التعاون الفني. Β--برنامج التعاون الفني التي يسببها التمايز قائد أعلى مما في شرائح العظام. OC التفريق، فخ مقايسة راسخة. كانت هناك لا تعديلات كبيرة ضرورية في هذا الأسلوب. ومع ذلك، للحصول على أفضل النتائج، من الضروري عدم احتضان الخلايا لفترة طويلة جداً، أو سوف تصبح جميع خلايا المنشأ مونوسيتيك فخ إيجابية.

لمعالجة الاستجابة في فيفو ، استخدمنا الرغوة β-TCP/C مادة بيولوجية نموذجية لأنه يحتوي على β--برنامج التعاون الفني، الذي تم استخدامه في فحوصات في المختبر والكولاجين ويعزز العظام شفاء13. وبالرغم من الرغوة β-TCP/C المتاحة تجارياً والمستخدمة سريرياً للعظام إصلاح17،18، هو واحد فقط من العديد من أنواع مختلفة من المواد التي ستكون مثيرة للاهتمام للدراسة، على سبيل المثال.، (فوسفات الكالسيوم ثنائية الطور هيدروكسيباتيت/β--برنامج التعاون الفني)، فضلا عن ديمينيراليزيد العظام البشرية في هذه الاختبارات لتحديد الاستجابات البيولوجية كيف تختلف بين المواد. للاستجابة في فيفو ، نحن مزروع الرغوة β-TCP/ج إلى عيب الحرجة الحجم كالفاريال العظام في الفئران وبعد أسابيع 12 تقييم علم الأنسجة وأظهرت الاختلافات مقارنة مع عناصر تحكم الشام. من الممكن أيضا لتقييم الردود مع ميكروكت الذي يوفر معلومات مجانية19. كان العيب في الفئران التحكم الشام لا تكوين العظام كبيرة، كما هو متوقع، بينما الرغوة β-TCP/ج المستحث استجابة الالتهابات والتليف والأوعية، وهو دليل على المرحلة المبكرة من تكوين العظام. قد أثبت هذا الأسلوب سابقا في جوف20. ومع ذلك، تختلف نهجنا في ذلك استخدمنا تقنية معدلة "مصعد" بمصعد بيريوستيل للحد من خطر إصابة الأم الجافية ترفين. نحن مسبب أن الجافية تلعب دوراً هاما في عملية الشفاء من العيوب كالفاريال بإنتاج خلايا أوستيوجينيك والعوامل أوستيويندوكتيفي3،21،،من2223. جدير بالذكر أن المواد التي زرعها، حجم عيب، وأسلوب لإنشاء هذا العيب يؤثر التجدد العظام من العيوب كالفاريال. تعديل آخر في الإجراء ينطوي تحقيق الاستقرار مادة بيولوجية في العيب كالفاريال مع غراء أنسجة متوافق حيويا يستخدم سريرياً بشكل روتيني لإغلاق الجرح. ويضمن هذا التعديل أن المواد في منطقة عيب لا أن تكون شردوا أثناء الشفاء.

التهاب ينظم المرحلة المبكرة من التئام العظام، ولكن الكثير من التهاب أو حساسية الردود قد يقلل من إصلاح11. الاستجابة المناعية مثالية للحيوية هو الشروع في تتالي تحريضية التي تشجع تكوين العظام. ومع ذلك، قد يسبب بعض الحيوية استجابة جسم غريب مما يؤدي إلى صفيف إشارات التحريضية التي تسبب التليف أو التوعية بحساسية. في دراساتنا، نحن تقييم الاستجابات المناعية للرغوة β-TCP/ج ووجدت أنه من غير سامة لخلايا الطحال ساذجة ولا تتداخل مع التوسع اللمفاويات T أو وظيفة (إفراز سيتوكين) عندما تضاف إلى الثقافات مع كونا. في التجارب داخل، الرغوة β-TCP/C التي يسببها التهاب، وكان هناك بعض الأدلة على حدوث زيادة في فرط والضامة مع ما يصاحب ذلك من زيادات في السيتوكينات Th1 و Th2 نوع. في تجارب زرع تحت الجلد، الرغوة β-TCP/C أيضا التي يسببها التهاب، ولكن لا يوجد دليل للردود التهابات أو حساسية مزمنة، والمدمرة، مما يوحي بأن الرغوة β-TCP/C متوافق حيويا. هذه النماذج تقدم معلومات عن الاستجابة المناعية للحيوية. أولاً، النموذجية في المختبر يتناول تأثير مادة بيولوجية على الخلايا المناعية السذاجة حضور mitogen تقديم دليل على وجود لا قمع استجابة ميتوجينيك الناجمة عن مادة بيولوجية. ثانيا، يوفر النموذج داخل قراءات سريعة يوم 7 من نوع الاستجابة المناعية، على سبيل المثال-، وحساسية والتهاب كما لاحظ نوع تسلل خلية التحريضية والشخصية سيتوكين. ثالثا، هذا النموذج تحت الجلد، الفمية يوضح استجابة الأنسجة لفترة أطول ويسمح لتقييم التهاب مزمن، وتليف، وجسم التتر، ويمكن استخدامها لاختبار غرس المتكررة للاستجابات المناعية الذاكرة. هذه النماذج قد نشرت سابقا وتظهر هنا بدون أي تعديلات13. من الأهمية بمكان أن هناك ضوابط ملائمة السلبية والإيجابية لهذه النماذج. أننا نقترح إجراء جميع النماذج الثلاثة لتجنب القيود المفروضة على كل أسلوب. بينما النماذج التي أظهرت راسخة تماما في مجالات أخرى لعلم المناعة، والنهج لاختبار الحيوية الأخيرة.

في ملخص، توفير فحوصات العظام والمناعة ملف تعريف توافق البيولوجي المعني مادة بيولوجية. للعظام، وتقديم الاستجابات OB و OC لمادة بيولوجية البيانات الأولية اللازمة قبل إجراء التجارب على الحيوانات معقدة ومكلفة، والتمسك بمبدأ 3Rs. المناعية في المختبر فحوصات تقديم بيانات عن ه مستضد وسيتوتوكسيسيتي، التي قد تمنع أيضا مواصلة التجارب على الحيوانات. التجارب الإنتاجية العالية السريعة توفر النتائج في التهابات واستجابة سيتوكين (مثلاً.، نوع من استجابات اللمفاويات T)، في حين أن نموذج الفمية مفيدة بسبب البيانات على مدة التهاب والإمكانات لإتلاف التليف. ويوفر هذا النهج متعدد التخصصات رواية الذي يشمل العظام والاستجابات المناعية الحيوية لتقييم ما قبل سريرية ممتازة لتوافق مع الحياة للتطبيقات المستقبلية في مجال المواد.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

هذا المشروع البحثي تلقت تمويلاً من الاتحاد الأوروبي "البرنامج الإطاري السابع" (FP7-2007-2013) في إطار المنحة الاتفاق رقم 263363.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Biomaterials
β-tricalcium phosphate disks (β-TCP, 14 mm) Disks were sintered in a muffle furnace at a temperature of 1150 °C. A detailed description of the production can be found in Zimmer et al (doi: 10.1002/jbm.a.34639). Samples were UV-irradiated (15 min for each side) before using in cell cultures.
Orthovita Vitoss foam (β-TCP/C foam) Orthovita 2102-1405
Mouse osteoblast culture
Alizarin Red S Sigma-Aldrich A5533
ALP assay buffer (2x) pH 10.4 Dissolve 200 mM glycine, 2 mM magnesium chloride, 2 mM zinc chloride in ultrapure water and adjust to pH 10.
Bone growth medium (BGM) α-MEM + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin/streptomycin
Cell lysis buffer: CyQuant cell lysis buffer 20x concentrate Thermo Scientific C7027 Dilute the concentrated cell lysis buffer stock 20-fold in ultrapure water. 
Cell viability reagent: Presto Blue cell viability reagent Invitrogen, Thermo Fisher Scientific A13261
Collagenase type IV from clostridium histolyticum Sigma-Aldrich C5138
DC protein assay kit II Bio Rad 5000112 DC protein assay kit contains reagent A, reagent B, reagent S and BSA for the reference standard. For reagent A', add 20 µL reagent S to 1000 µL reagent A. 
Dimethylsulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D8418 Steril-filter DMSO before usage. 
Dispase II (neutral protease, grade II) Roche 4942078001
EnzCheck Phosphatase Assay Kit for alkaline phosphatase activity  Invitrogen, Thermo Fisher Scientific E12020 EnzCheck Phosphatase Assay Kit contains 6,8-difluoro-4-methylumbelliferyl phosphate (DiFMUP), N,N-dimethylformamide and 6,8-difluoro-7-hydroxy-4-methylcoumarin (DiFMU). 
Fetal bovine serum (FBS) Sigma-Aldrich F7524
Formalin solution neutral buffered 10% Sigma-Aldrich HT501128
Glycine Sigma-Aldrich G8898
Hexadecylpyrdinium (cetylpyridinium) chloride monohydrate Sigma-Aldrich C9002
L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate Sigma-Aldrich A8960
Magnesium chloride hexahydrate Sigma-Aldrich M2670
MEM alpha medium (α-MEM) Gibco Life Technologies  11900-073
Osteogenic mineralization medium (MM) α-MEM + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin-streptomycin + 50 µg/mL ascorbic acid + 5 mM β-glycerophosphate
Penicillin-streptomycin   Sigma-Aldrich P4333
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 Gibco, Thermo Fisher Scientific  10010023
Sigmafast BCIP/NBT Sigma-Aldrich B5655
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red (10x) Gibco, Thermo Fisher Scientific  15400054 Dilute the concentrated stock solution 10-fold in 1x PBS. 
Tween20 Sigma-Aldrich P1379
Ultrapure water: Cell culture water pyrogen free VWR L0970-500
Wash buffer Add  0.05% Tween20 to 1x PBS.
Zinc chloride Sigma-Aldrich 1.08816
β-Glycerophosphate disodium salt hydrate Sigma-Aldrich G5422
24-well suspension culture plate Greiner bio-one 662102
24-well tissue culture plate Greiner bio-one 662160
50 mL conical tube Greiner bio-one 227261
96-well black plate Greiner bio-one 655076
96-well transparent plate Greiner bio-one 655001
Centrifuge: VWR Mega Star 600R VWR
CO2-Incubator: HeraCell 240 Thermo Scientific
Cryovial 2 mL Greiner bio-one 122263
Disposable filter unit FP30/0.2 CA-S GE Healthcare Life Sciences Whatman 10462200 For sterile filtration of enzyme solution.
Flatbed scanner: Epson Perfection 1200 Photo Epson
Infinite M200 Pro microplate reader Tecan
Microcentrifuge tube: Eppendorf tube safe-lock 0.5 mL VWR 20901-505
Microcentrifuge tube: Eppendorf tube safe-lock 1.5 mL VWR 21008-959
Shaker Swip (orbital and horizontal)  Edmund Buehler 
Shaking incubator GFL3032 GFL  3032
Single-use pipet: serum pipet Greiner bio-one 612301
Sterile instruments (scissors, tweezer, curved forceps)
Tissue culture plate (10 cm) Greiner bio-one 664960
Mouse osteoblast-osteoclast co-culture
1α,25-Dihydroxyvitamin D3 Sigma-Aldrich 17936 1000x concentrated stock (10 µM in ethanol 100%)
Acetone VWR Chemicals 22065.327
Bone growth medium (BGM) α-MEM + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin-streptomycin
Distilled water Carl Roth 3478.4
Ethanol (100% vol/vol) VWR Chemicals 20821.365
Ethanol (70% vol/vol) VWR Chemicals 93003.1006
Fast red violet LB salt Sigma-Aldrich F3381
Fetal bovine serum (FBS) Sigma-Aldrich F7524
Formalin solution neutral buffered 10% Sigma-Aldrich HT501128
MEM alpha Medium (α-MEM) Gibco Life Technologies  11900-073
N,N-Dimethylformamide Sigma-Aldrich D4551
Naphthol AS-MX phosphate Sigma-Aldrich N4875
Osteoclast differentiation medium (DM) α-MEM + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin-streptomycin + 1 nM 1,25-(OH)2-vitamin D3 + 1 µM prostaglandin E2 
Penicillin-streptomycin  Sigma-Aldrich P4333
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 Gibco, Thermo Fisher Scientific  10010023
Prostaglandin E2 (PGE2) Cayman Chemical Company 9003016 1000x concentrated stock (1 mM in ethanol 100%)
Sodium acetate trihydrate Sigma-Aldrich S7670
Sodium tartrate dibasic dihydrate Sigma-Aldrich S8640
Sterile instruments (scissors, forceps, scalpel)
TRAP buffer pH 5.0 Dissolve 40 mM sodium acetate, 10 mM sodium tartrate in ultrapure water and adjust to pH 5.
Ultrapure water: Cell culture water pyrogen free VWR L0970-500
24-well suspension culture plate Greiner bio-one 662102
24-well tissue culture plate Greiner bio-one 662160
50 mL conical tube Greiner bio-one 227261
Centrifuge: VWR Mega Star 600R VWR
CO2-Incubator: HeraCell 240 Thermo Scientific
Diamond wafering blade (10.2 cm x 0.3 cm) Buehler
Isomet low-speed saw Buehler
Petri dish (6 cm) Greiner bio-one 628,161
Screw cap glass bottle 20 mL Carl Roth EXY4.1
Single-use sterile syringe 1 mL Henry Schein Animal Health 9003016
Single-use pipet: serum pipet Greiner bio-one 612301
Sterile needle: Hypodermic needle RW 27 G x 3/4'' Henry Schein Animal Health 9003340
Mouse calvarial defect model
Analgesia: Buprenorphine (Bupaq) Richter Pharma AG
Anesthesia: Ketamine (Ketamidor), Xylazine (Rompun) Richter Pharma AG/Bayer HealthCare
Cold sterilant: SafeSept Max Henry Schein Animal Health 9882765
Ethanol (70% vol/vol) VWR Chemicals 93003.1006
Eye ointment: VitA POS 5 g Ursapharm
Normal saline solution (0.9% sodium chloride solution) Fresenius Kabi
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 Gibco, Thermo Fisher Scientific  10010023
Povidone iodine solution: Braunol 1000 mL B. Braun 3864154
Roti-Histofix 4.5% buffered formalin Carl Roth 2213.6
Tissue adhesive: Histoacryl 5 x 0.5 mL  B. Braun Surgical 1050060
Personal protective equipment: surgical gloves, cap and mask, gown Henry Schein Animal Health 1045073, 1026614, 9009062, 370406
Sterile instruments (scalpel, scissors, forceps, needle holder)
Sterile needles: Hypodermic needles RW 27 G x 3/4'' and 30 G x 1/2''  Henry Schein Animal Health 9003340, 9003630
Single-use sterile syringe 1 mL Henry Schein Animal Health 9003016
Heating plate: Physitemp Rothacher Medical TCAT-2LV
Sterile gauze swabs Henry Schein Animal Health 220192
Sterile disposable scalpel (Figur 20) Henry Schein Animal Health 9008957
Surgical/dental drill: Implantmed SI-923 W&H Dentalwerk Bürmoos GmbH 16929000
Handpiece type S-II W&H Dentalwerk Bürmoos GmbH 30056000
Trephine, diameter 4 mm Hager&Meisinger GmbH 229040
Irrigation tubing set 2.2 m W&H Dentalwerk Bürmoos GmbH 4363600
Periosteal elevator 2 mm / 3 mm Henry Schein Animal Health 472683
Non-resorbable suture: Polyester green, DS19, met. 1.5, USP 4/0 75 cm Henry Schein Animal Health 300715
In vitro immune responses
Anesthesia for euthanasia: Ketamine (Ketamidor), Xylazine (Rompun) Richter Pharma AG/Bayer HealthCare
Cell Proliferation ELISA, BrdU (colorimetric) Assay Kit Sigma-Aldrich 11647229001 The kit contains BrdU labeling solution, fixation solution (FixDenat), Anti-BrdU antibody solution, washing buffer and substrate solution. 
Concanavalin A (ConA) MP Biomedicals 150710
Culture medium splenocytes RPMI medium + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin-streptomycin solution + 0.1% gentamicin + 0.2% ß-mercaptoethanol + 1% non-essential amino acids
Ethanol (70% vol/vol) VWR Chemicals 93003.1006
Fetal bovine serum (FBS) Gibco, Thermo Fisher Scientific  10500064
Gentamicin Gibco, Thermo Fisher Scientific  15750037
Mouse IL-1β ELISA Ready-SET-Go! Invitrogen, Thermo Fisher Scientific 88-7013-88
Mouse IL-2 ELISA MAX Standard BioLegend 431001
Mouse IL-4 ELISA MAX Standard BioLegend 431101
Mouse INF-γ ELISA MAX Standard BioLegend 430801
Non-essential amino acids solution Gibco, Thermo Fisher Scientific  11140050
Penicillin-streptomycin  Gibco, Thermo Fisher Scientific  15140122
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 Gibco, Thermo Fisher Scientific  10010023
Red blood cell (RBC) lysis buffer: BD Pharm Lyse BD Bioscience 555899
RPMI 1640 medium, HEPES Gibco, Thermo Fisher Scientific  52400025
β-Mercaptoethanol Gibco, Thermo Fisher Scientific  31350010
50 mL conical tube Greiner bio-one 227261
96-well tissue culture plate Greiner bio-one 655180
Centrifuge: VWR Mega Star 600R VWR
Cell strainer 40 µm BD Bioscience 352340
Infinite M200 Pro microplate reader Tecan
Single-use sterile syringe 1 mL Henry Schein Animal Health 9003016
Sterile surgical instruments (forceps, glass slides)
High throughput intraperitoneal model
Anesthesia: Ketamine (Ketamidor), Xylazine (Rompun) Richter Pharma AG/Bayer HealthCare
Cold sterilant: SafeSept Max Henry Schein Animal Health 9882765
Ethanol (70% vol/vol) VWR Chemicals 93003.1006
Eye ointment: VitA POS 5 g Ursapharm
Mouse IL-1β ELISA Ready-SET-Go! Invitrogen, Thermo Fisher Scientific 88-7013-88
Mouse IL-2 ELISA MAX Standard BioLegend 431001
Mouse IL-4 ELISA MAX Standard BioLegend 431101
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 Gibco, Thermo Fisher Scientific  10010023
Povidone iodine solution: Braunol 1000 mL B. Braun 3864154
Shandon Rapid-Chrome Kwik-Diff Staining Kit Thermo Scientific 9990700 For differential cell count.
Heating plate: Physitemp Rothacher Medical TCAT-2LV
Hemocytometer: Neubauer chamber Carl Roth PC72.1
Non-resorbable suture: Ethibond Excel 4-0 Ethicon 6683H
Resorbable suture: Polysorb Covidien SL-5628
Shandon centrifuge for cytopsin Thermo Scientific
Single-use sterile syringe 1 mL Henry Schein Animal Health 9003016
Sterile gauze swabs Henry Schein Animal Health 220192
Sterile needles: Hypodermic needles RW 27 G x 3/4'' and 25 G Henry Schein Animal Health 9003340, 420939
Sterile surgical instruments (scalpel, scissors, forceps, needle holder)
Trypan blue solution 0.4% Gibco, Thermo Fisher Scientific  15250061
Subchronic subcutaneous model
Anesthesia: Ketamine (Ketamidor), Xylazine (Rompun) Richter Pharma AG/Bayer HealthCare
Cold sterilant: SafeSept Max Henry Schein Animal Health 9882765
Ethanol (70% vol/vol) VWR Chemicals 93003.1006
Eye ointment: VitA POS 5 g Ursapharm
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 Gibco, Thermo Fisher Scientific  10010023
Povidone iodine solution: Braunol 1000 mL B. Braun 3864154
Roti-Histofix 4.5% buffered formalin Carl Roth 2213.6
Heating plate: Physitemp Rothacher Medical TCAT-2LV
Non-resorbable suture: Ethibond Excel 4-0 Ethicon 6683H
Personal protective equipment: surgical gloves, cap and mask, gown Henry Schein Animal Health 1045073, 1026614, 9009062, 370406
Single-use sterile syringe 1 mL Henry Schein Animal Health 9003016
Sterile gauze swabs Henry Schein Animal Health 220192
Sterile instruments (scalpel, scissors, forceps, needle holder)
Sterile needle: Hypodermic needles RW 27 G x 3/4''  Henry Schein Animal Health 9003340, 420939

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. Fracture healing: mechanisms and interventions. Nature Reviews Rheumatology. 11, (1), 45-54 (2015).
  2. Marsell, R., Einhorn, T. A. The biology of fracture healing. Injury. 42, (6), 551-555 (2011).
  3. Cooper, G. M., et al. Testing the critical size in calvarial bone defects: revisiting the concept of a critical-size defect. Plastic and Reconstructive Surgery. 125, (6), 1685-1692 (2010).
  4. O'Brien, F. J. Biomaterials & scaffolds for tissue engineering. Materials Today. 14, (3), 88-95 (2011).
  5. Stanovici, J., et al. Bone regeneration strategies with bone marrow stromal cells in orthopaedic surgery. Current Research in Translational Medicine. 64, (2), 83-90 (2016).
  6. Anderson, J. M. Future challenges in the in vitro and in vivo evaluation of biomaterial biocompatibility. Regenerative Biomaterials. 3, (2), 73-77 (2016).
  7. Chen, Z., et al. Osteoimmunomodulation for the development of advanced bone biomaterials. Materials Today. 19, (6), 304-321 (2016).
  8. Ono, T., Takayanagi, H. Osteoimmunology in bone fracture healing. Current Osteoporosis Reports. 15, (4), 367-375 (2017).
  9. Tsiridis, E., Upadhyay, N., Giannoudis, P. Molecular aspects of fracture healing: Which are the important molecules? Injury. 38, S11-S25 (2007).
  10. Velasco, M. A., Narvaez-Tovar, C. A., Garzon-Alvarado, D. A. Design, materials, and mechanobiology of biodegradable scaffolds for bone tissue engineering. BioMed Research International. 2015, 729076 (2015).
  11. Bastian, O., et al. Systemic inflammation and fracture healing. Journal of Leukocyte Biology. 89, (5), 669-673 (2011).
  12. El-Jawhari, J. J., Jones, E., Giannoudis, P. V. The roles of immune cells in bone healing; what we know, do not know and future perspectives. Injury. 47, (11), 2399-2406 (2016).
  13. Changi, K., et al. Biocompatibility and immunogenicity of elastin-like recombinamer biomaterials in mouse models. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 106, (4), 924-934 (2018).
  14. Laczko, J., Levai, G. A simple differential staining method for semi-thin sections of ossifying cartilage and bone tissues embedded in epoxy resin. Mikroskopie. 31, (1-2), 1-4 (1975).
  15. Nakayama, T., et al. Polarized osteoclasts put marks of tartrate-resistant acid phosphatase on dentin slices--a simple method for identifying polarized osteoclasts. Bone. 49, (6), 1331-1339 (2011).
  16. Deguchi, T., et al. In vitro model of bone to facilitate measurement of adhesion forces and super-resolution imaging of osteoclasts. Scientific Reports. 6, 22585 (2016).
  17. Epstein, N. E. An analysis of noninstrumented posterolateral lumbar fusions performed in predominantly geriatric patients using lamina autograft and beta tricalcium phosphate. Spine Journal. 8, (6), 882-887 (2008).
  18. Epstein, N. E. Beta tricalcium phosphate: observation of use in 100 posterolateral lumbar instrumented fusions. Spine Journal. 9, (8), 630-638 (2009).
  19. Kallai, I., et al. Microcomputed tomography-based structural analysis of various bone tissue regeneration models. Nature Protocols. 6, (1), 105-110 (2011).
  20. Lo, D. D., et al. Repair of a critical-sized calvarial defect model using adipose-derived stromal cells harvested from lipoaspirate. Jove-Journal of Visualized Experiments. (68), (2012).
  21. Gosain, A. K., et al. Osteogenesis in calvarial defects: contribution of the dura, the pericranium, and the surrounding bone in adult versus infant animals. Plastic and Reconstructive Surgery. 112, (2), 515-527 (2003).
  22. Levi, B., et al. Dura mater stimulates human adipose-derived stromal cells to undergo bone formation in mouse calvarial defects. Stem Cells. 29, (8), 1241-1255 (2011).
  23. Wang, J., Glimcher, M. J. Characterization of matrix-induced osteogenesis in rat calvarial bone defects: II. Origins of bone-forming cells. Calcified Tissue International. 65, (6), 486-493 (1999).
الشخصية التوافق البيولوجي في الحيوية لتجديد العظام
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kampleitner, C., Obi, J., Vassilev, N., Epstein, M. M., Hoffmann, O. Biological Compatibility Profile on Biomaterials for Bone Regeneration. J. Vis. Exp. (141), e58077, doi:10.3791/58077 (2018).More

Kampleitner, C., Obi, J., Vassilev, N., Epstein, M. M., Hoffmann, O. Biological Compatibility Profile on Biomaterials for Bone Regeneration. J. Vis. Exp. (141), e58077, doi:10.3791/58077 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter