Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Biologiske forenelighed profil på biomaterialer for knogle regenerering

Published: November 16, 2018 doi: 10.3791/58077
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 1
1Department of Pharmacology and Toxicology, University of Vienna, 2Laboratory of Experimental Allergy, Division of Immunology, Allergy and Infectious Diseases, Department of Dermatology, Medical University of Vienna

Summary

Antallet af roman biomaterialer manipuleret til at reparere store knogle læsioner løbende udvide med formålet at forbedre knogleheling og overvinde komplikationer forbundet med knogle transplantation. Vi præsenterer her, en tværfaglig strategi for prækliniske biokompatibilitet testning af biomaterialer for knogle reparation.

Abstract

Store ikke-union knoglebrud er en betydelig udfordring i ortopædisk kirurgi. Selv om auto- og allogene bone podninger er fremragende for at helbrede sådan læsioner, er der potentielle komplikationer med deres anvendelse. Således, materiale forskere udvikler syntetisk, biokompatible biomaterialer for at overvinde disse problemer. I denne undersøgelse præsenterer vi en tværfaglig platform for evaluering af biomaterialer for knogle reparation. Vi kombinerede ekspertise fra knogle biologi og Immunologi at udvikle en platform, herunder in vitro- osteoklast (OC) og osteoblastdannelse (OB) assays og i vivo musemodeller af knogle reparation, immunogenicitet og allergenicitet. Vi demonstrere, hvordan at udføre eksperimenter, opsummere resultaterne og rapportere om biomateriale biokompatibilitet. Navnlig, testede vi OB levedygtighed, differentiering, og mineralisering og OC levedygtighed og differentiering i forbindelse med β-tricalciumphosphat fosfat (β-TCP) diske. Vi har også testet en β-TCP/kollagen (β-TCP/C) skum, som er et kommercielt tilgængelige materiale bruges klinisk til knogle reparation i en kritisk størrelse calvarial knogle defekt musemodel for at fastslå virkningerne på den tidlige fase af knogleheling. I parallel eksperimenter evalueret vi immun og allergiske reaktioner hos mus. Vores tilgang skaber en biologisk forenelighed profil af en knogle biomateriale med en række parametre, der er nødvendige for at forudsige biokompatibilitet af biomaterialer bruges til knogleheling og reparation hos patienter.

Introduction

Knogle reparation er en kompleks proces, der begynder med hæmatom dannelse, betændelse, callus dannelse og derefter remodeling1,2. Knogle regenerering potentielle er dog begrænset til størrelsen af knogle fraktur1,3. For eksempel, store knoglebrud forårsaget af traumer, kræft eller osteoporose kan ikke helbrede og kaldes ikke-union knoglebrud. Disse knogler læsioner kræver ofte behandling for at fremme sunde fysiologiske knogle reparation og regeneration. I øjeblikket, autograft og allograft knogle transplantation er tilgangen i valg4 med 2,2 millioner knogle udskiftning procedurer årligt5. Selvom disse procedurer har en høj succesrate, kan der være komplikationer, for eksempel, begrænset tilgængelighed af knoglen, infektion, donor site sygelighed og afvisning4. Nye alternativer til knogle vævsmanipulering er søges til at løse disse udfordringer.

Design af biomaterialer baseret på naturlige eller syntetiske polymerer, bioceramics eller metaller i kombination med celler og bioaktive molekyler er på rise6. Vores nuværende forståelse af fysiologiske knogle heling og helbredelse i forbindelse med biomaterialer afhænger af flere faktorer som mekaniske egenskaber og flere lokale og systemiske faktorer herunder celler fra omsætning og fraktur site7 ,8,9. Biomaterialer for knogle regenerering har til formål at fremme osteogenicity og osseointegration10 og er ideelt biokompatible, biologisk nedbrydeligt og porøse (fremme celle migration, ilt og næringsstoffer). De skal også være tilstrækkeligt stærke til at støtte fraktur websted for at lindre smerter. Derudover er provokerende faktorer forpligtet til at indlede helingsprocessen. Men hvis en biomateriale inducerer overdreven betændelse og allergiske reaktioner, kan det begrænse eller hæmme knogle heling11,12. Tværfaglighed er således nødvendigt at vurdere biomaterialer udviklet til knogle reparation.

I denne undersøgelse præsenterer vi en præ-klinisk evaluering af repræsentative materialer, 1) Orthovita Vitoss skum, som er et kommercielt tilgængelige spongiosa graft erstatning bestående af tricalciumphosphat sammensat af nanometer-størrelse ren β-tricalciumphosphat fosfat (β-TCP) partikler og Type 1 bovine kollagen (C) (β-TCP/C skum) og 2) β-TCP diske. Her, vi illustrere biokompatibilitet testning af disse biomaterialer ved hjælp af primær osteoblastdannelse (OB) og osteoklast (OC) undersøgelser, en i vivo model af knogle reparation, immunologiske vurdering bestående af in vitro- T-lymfocytter spredning og cytokin produktion, og i vivo immunogenicitet og allergenicitet, som tidligere rapporteret13.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Procedurerne, der var gjort med BALB/c mus efter alle retningslinjer for pleje og anvendelse af forsøgsdyr af østrigske Ministeriet for uddannelse, videnskab og forskning og blev godkendt af Udvalget om etik i det østrigske ministerium for uddannelse, videnskab og forskning.

1. primære mus OB kultur

  1. OB isolation fra neonatal mus calvaria ved hjælp af enzymatiske fordøjelsen
    1. Aflive 1 – 2 dages gamle neonatal unger (60 i alt) ved halshugning og placere lederne i en petriskål med steril 1 x fosfatbufferet saltopløsning (PBS).
    2. Hold hovedet af nakken af halsen, og skære huden væk ved hjælp af steril saks. Incise calvarium ved piercing det (ca 0,1-0,3 mm) med en saks, der derefter indsat under calvarium i hovedet i bunden af kraniet og skære langs calvarial kant lateralt fra tilbage til forsiden over ørerne og derefter abov e næseryggen (figur 1).
    3. Inkuber dissekeret calvaria med 8 mL af filter steriliseret fordøjelsen løsning (300 enheder/mL collagenase type IV og 2.14 enheder/mL dispase II opløst i α-minimum afgørende medium (α-MEM)) i en 50 mL konisk slange ved 37 ° C i 10 min i en rystende inkubator på 200 shakes /min.
    4. Første supernatanten og Gentag proceduren for fordøjelsen tre gange med 8 mL af fordøjelsen. Indsamle supernatanten indeholdende cellerne efter hver fordøjelse trin og føje den til en 50 mL konisk slange. Butik 50 mL konisk slange med celler i en is vandbad indtil vådforaskningen (ca. 40 min.) er afsluttet.
    5. Centrifugeres celler ved 300 x g i 5 min. ved 4 ° C, Aspirér supernatanten (med Pasteur pipette knyttet til en vakuumpumpe) og resuspend i 40 mL af knogle vækstmediet (BGM) der indeholder α-MEM med 10% varme-inaktiverede føtal bovint serum (FBS), og 1% penicillin-streptomycin løsning. Derefter tilsættes 10 mL af cellesuspension til 4 vævskultur plader (10 cm).
    6. Kultur cellerne ved 37 ° C og 5% CO2 indtil sammenløbet (2-3 dage).
    7. På sammenløbet, Opsug den gamle medium og vaske vævskultur pladerne engang med 1 x PBS (37 ° C). Derefter Aspirér PBS og der tilsættes 2 mL 1 x trypsin oploesning indeholdende 0,5% ethylendiamintetra syre (EDTA) til hver 10 cm vævskultur plade.
    8. Inkuber 4 kultur plader på 37 ° C og 5% CO2 i 5 min og derefter kontrollere pladerne med en inverteret lysmikroskop at sikre at cellerne er løsrevet fra plasten. Derefter overføre alle celle suspensioner (samlede 8 mL) til en 50 mL konisk rør indeholdende 10 mL frisk BGM. Vask hver plade med 5 mL frisk BGM og overførsel til den samme 50 mL konisk tube.
    9. Centrifugeres celler ved 300 x g i 5 min. ved 4 ° C, Aspirér supernatanten og resuspend celler i 16 mL frisk BGM. Forberede 16 nye 10 cm vævskultur plader (opsplitning 1:4) indeholder 9 mL af BGM. Der tilsættes 1 mL af cellesuspension til hver plade.
    10. Gentag trin 1.1.6. til 1.1.8.
    11. Centrifugeres celler ved 300 x g i 5 min. ved 4 ° C, Aspirér supernatanten og resuspend i 10 mL frisk BGM. Tælle cellerne og beregne den celle koncentration.
      Bemærk: Denne procedure genererer ca 7.5 – 8.3 x 105 celler/pup.
    12. Der centrifugeres ved 300 x g i 5 min. ved 4 ° C, Aspirér supernatanten og resuspend i frysning medium indeholdende 10% dimethylsulfoxid (DMSO), 40% α-MEM og 50% FBS. Overføre 1,5 mL af cellesuspension til 2 mL cryovials for et samlet beløb på 2 x 106 celler pr. hætteglas.
    13. Flash fryse hætteglassene i flydende nitrogen til langtidsopbevaring under flydende kvælstof tank. Bruge cellerne inden for et år til at sikre fuld funktionalitet. Bruge disse primære OBs til at vurdere spredning (trin 1.2), differentiering (ALP assays: trin 1.4., 1.5.) og mineralisering (trin 1,6.) i nærværelse af biomaterialerne. Brug disse celler til modning af knogle-marv-afledte OC prækursorer i co kultur (trin 2.3).
  2. OB spredning analyse
    1. Pre Inkuber 14 mm diameter β-TCP diske i 1 mL af BGM i en 24-godt suspension kultur plade på 37 ° C og 5% CO2 i 24 timer før du tilføjer primære NB. Brug standard vævskultur plader til kontrol og suspension kultur plader til biomateriale prøver at undgå celle tilknytning til plast.
    2. Opsug den præ-inkubation medium og derefter resuspend primære mus OBs i BGM. Tilføje 4,4 x 104 OBs/cm2 på forhånd rugede β-TCP-diske i et 24-godt suspension kultur plade og til kontrolgruppe, ind i en 24-godt vævskultur plade (1 mL/hul). OBs vil tillægge vævskultur plade eller biomateriale.
    3. Ruger i 14 dage ved 37 ° C og 5% CO2. Under inkubationstiden, ændre mediet hver 2-3 dage og der tilsættes 1 mL af frisk BGM til hver brønd.
    4. For at vurdere OB spredning, overføre β-TCP diske på dage 7 og 14 til nye brønde at udelukke signalerne fra celler dyrkes på suspension kultur plade.
    5. Opsug den gamle medium, der tilsættes 0,5 mL af BGM (37 ° C) og inkuberes kultur plader til 30 minutter ved 37 ° C og 5% CO2. Derefter tilføje 55 µL af 10 x celle spredning reagens (1:10 fortynding) direkte ind i kultur godt. Råemner, forberede tre brønde indeholdende 0,5 mL af BGM og 55 µL 10 x celle spredning reagens. Inkuber alle plader i 30 minutter ved 37 ° C og 5% CO2.
    6. Trække og overføre 150 µL af supernatanten fra hver brønd i en 96-brønd sort plade og læse fluorescens med excitations på 560 nm- og på 590 nm. Fratræk de tomme aflæsninger fra prøven aflæsninger.
  3. OB differentiering og mineralisering assays
    1. Pre Inkuber 14 mm diameter β-TCP diske i 1 mL af BGM i en 24-godt suspension kultur plade på 37 ° C og 5% CO2 i 24 timer før du tilføjer NB. Brug standard vævskultur plader til kontrol og suspension kultur plader til biomateriale prøver at undgå celle tilknytning til plast.
    2. Opsug den præ-inkubation medium og derefter resuspend primære mus OBs i BGM. Tilføje 8,8 x 104 OBs/cm2 på forhånd rugede β-TCP-diske i et 24-godt suspension kultur plade og til kontrolgruppe, ind i en 24-godt vævskultur plade (1 mL/hul). OBs vil tillægge vævskultur plade eller eksemplet biomateriale.
    3. Erstatte BGM med 1 mL osteogenic mineralisering medium (MM) indeholdende BGM, 50 µg/mL ascorbinsyre og 5 mM β-glycerophosphate 24 timer efter tilsætning af OBs og Ruger i 14 dage ved 37 ° C og 5% CO2. Ændre medium hver 2-3 dage med 1 mL af frisklavede MM til hver brønd.
  4. OB differentiering vurderet af alkalisk fosfataseaktivitet (ALP) fra cellelysater
    1. For at måle ALP aktivitet på dag 7 efter tilsætning af MM, Aspirér næringssubstratet fra brøndene og derefter vaske med 1 mL sterilt 1 x PBS (37 ° C). Omhyggeligt Aspirér PBS for at tillade de vedlagte celler til at forblive på vævskultur plast eller biomateriale og fryse plader ved-80 ° C.
    2. Efter 24 timer (eller op til 2 uger), tø den kontrol vævskultur og biomateriale suspension kultur plader ved stuetemperatur (RT) til at forberede OB lysering. Biomateriale prøverne, overføre β-TCP diske til en ny suspension kultur plade til at udelukke de celler, der er knyttet til pladen. Tilføje 75 µL pr. brønd 1 x celle lysisbuffer til begge plader. Ryst plader i 5 min på en shaker på 400 shakes/min.
    3. Overføre cellen lysate til en 0,5 mL microcentrifuge rør og centrifugeres ved 300 x g for 6 min på RT for at fjerne snavs. Tilføje 50 µL af prøven celle lysate supernatanten til en 96-brønd sort plade og derefter tilsættes 50 µL af en løsning bestående af 200 µM 6,8-difluoro-4-methylumbelliferyl fosfat (DiFMUP) fluorogenic substrat opløst i 2 x ALP buffer (pH 10) pr. brønd. Oprettet to blanke brønde med 100 µL af en 1:1 løsning indeholdende 1 x celle lysisbuffer og 2 x ALP buffer.
    4. Forberede 8 referenceopløsninger med 100 μL/brønd med den 6,8-difluoro-7-hydroxy-4-methylcoumarin (DiFMU) lige fra 0,5 til 200 μM opløst i 1:1 løsning indeholdende 1 x celle lysisbuffer og 2 x ALP buffer til at generere en standard reference kurve.
    5. Inkuber sort nummerpladen ved 37 ° C i 15 min og derefter læse fluorescens med excitations på 358 nm- og på 455 nm. Fratræk de tomme aflæsninger fra referenceopløsninger og prøve aflæsninger.
    6. Normalisere ALP enzymaktivitet fra cellelysater til den samlede mængde af protein ved hjælp af en kolorimetrisk assay for proteinkoncentration. Forberede bovint serumalbumin (BSA) protein referencestandarder på et interval fra 0,05 – 2,5 µg/µL opløst i 1 x celle lysisbuffer til at generere en standardkurve.
    7. Forberede prøve cellelysater og BSA protein standarder i dubletter. Tilsæt 5 µL af prøven celle lysate eller 5 µL af BSA protein standard i en 96-brønd plade og derefter tilføje 25 µL af reagens A' og 200 µL af reagens B. sæt op to blanke brønde med 5 µL 1 x celle lysisbuffer. Inkuber plader på RT for 15 min og derefter læse absorbans ved 690 nm. Fratræk de tomme aflæsninger fra referenceopløsninger og prøve aflæsninger.
  5. OB differentiering vurderet ved farvning ALP i cellekultur
    1. Pletten ALP i kulturperler OBs på dag 7 efter tilsætning af MM på en kontrol vævskultur plade og biomateriale i en suspension kultur plade.
    2. Opsug næringssubstratet fra brøndene og erstatte det med 0,5 mL 1 x PBS (37 ° C). Opsug PBS og løse cellerne ved at inkubere dem i 0,5 mL 10% buffered formalin på RT for 1 min.
    3. Opsug 10% buffered formalin med en enkelt-bruger pipette og der tilsættes 0,5 mL vaskebuffer (0,05% Tween20 i 1 x PBS).
    4. Opløse en 5-bromo-4-chloro-3-indolyl fosfat/nitro blå tetrazolium (BCIP/NBT) substrattablet i 10 mL i ultrarent vand og vortex indtil fuldstændig opløst. Løsningen skal være beskyttet mod lys og anvendes inden for 2 h.
    5. Opsug wash buffer og erstatte med 0,5 mL af BCIP/NBT substratopløsning og inkuberes plade på RT i mørket for 10 min. aspirat Farvningsopløsningen og erstatte med 0,5 mL af wash buffer.
    6. Overføre de farvede β-TCP diske i en ny brønd og scanne de ALP-farvede plader med en konventionel flatbedscanner til at optage ALP farvning.
  6. OB mineralisering vurderet ved farvning med Alizarin rød S (ARS)
    1. Opsug næringssubstratet fra brøndene indeholdende primære OBs 14 dage efter tilsætning af MM og skylles to gange med 0,5 mL 1 x PBS på RT. aspirat PBS og rette cellerne ved at tilføje 0,5 mL 10% buffered formalin løsning på RT for 10 min.
    2. Opsug 10% buffered formalin med en enkelt-bruger pipette og vaskes to gange med 0,5 mL i ultrarent vand.
    3. De faste OBs, tilføje 0,25 mL 40 mM ARS Farvningsopløsningen (pH 4.2) opløst i ultrarent vand og inkuberes plade på RT for 10 min på en shaker på 100 shakes/min.
    4. Opsug Farvningsopløsningen med en enkelt-bruger pipette og skyl med 1 mL i ultrarent vand. Gentag dette trin 5 – 10 gange at fjerne uspecifik farvning.
      Bemærk: Den føres løsning bør være uden farve.
    5. Opsug den ultrarent vand og tilsættes 1 mL koldt PBS. Inkuber plade på RT for 10 min på en shaker på 100 shakes/min.
    6. Opsug PBS, overføre farves β-TCP diske til en ny brønd og scanne pladerne med en flatbed-scanner til at optage mineralisering.
    7. Tilføje 0,25 mL 10% cetylpyridinium chloridopløsning og inkuberes plade på RT for 15 min på en shaker 100 shakes/min. til at udtrække ARS farvestof.
    8. Overføre analysere til en 1,5 mL rør og centrifugeres ved 17.000 x g i 5 min på RT.
    9. Tilføje 10% cetylpyridinium chloridopløsning ekstrakter med et fortyndingsforhold på 1:10-1:20 og tilføje prøver (300 µL) til en 96-brønd plade herunder to blanke brønde som indeholder kun 10% cetylpyridinium chlorid.
    10. Forberede 7 ARS referencestandarder spænder fra 4 til 400 µM ved fortynding 40 mM ARS farvning løsning (pH 4.2) med 10% cetylpyridinium chloridopløsning for at generere en standardkurve.
    11. Tilføje 300 µL af referencestandard i dubletter til 96-brønd plade.
    12. Læse absorbans af prøverne, råemner, og henvise til standarder på 520 nm.
    13. Fratræk de tomme aflæsninger fra referenceopløsninger og prøve aflæsninger.

2. mus OB-OC Co kultur at udlede modne OCs

  1. Forberedelse og Sterilisation af kvæg kortikale knogle skiver
    1. Ren segmenter af knogle fra det omgivende væv og fjerne den trabekulær knogle og knoglemarv.
    2. Tørre knogle ved 50 ° C i 24 timer.
    3. Skær knoglen i mindre stykker og skær det i skiver (ca. 300-350 µm tykt) ved hjælp af en lav hastighed så med en diamant klinge.
    4. Skåret 300-350 µm skiver i kvadratiske diske (1 cm2).
    5. For at rengøre knogle diske (1 cm2), læg dem i en aflåselig hætteglasset og fyld med destilleret vand. Overføre den udfyldte hætteglasset i et ultralydsbad og Læg instrumenterne i ultralydsbad i 5 min. Gentag dette trin tre gange.
    6. Hæld destilleret vand, tilføje 70% ethanol, og Rens med ultralyd i 5 min.
    7. Hæld 70% ethanol og erstatte med 100% ethanol.
      Bemærk: Gemme knogle skiver i 100% ethanol ved 4 ° C i op til 4 uger.
    8. Bestråle knogle skiver med UV lys i 15 min. på hver side under sterile forhold. Gemme steriliseret knogle skiver i en steril kultur plade på RT indtil videre anvendelse.
  2. Isolering af knoglemarven OC prækursorer
    1. Aflive naive 8-12 uge gammel BALB/c mus ved hjælp af en intraperitoneal (i.p.) injektion af en opløsning af 200 mg/kg ketamin og 24 mg/kg xylazin.
    2. Isolere knoglemarv OC prækursorer fra mus lårben og skinneben.
    3. Fjerne benene med steril saks fra det nærmeste punkt på kroppen på hofteleddet, skar lemmerne i leddene, knæ og ankel og fjerne det bløde væv med steril skalpel og pincet. Afbrød epifyserne. Skylle ud og suspendere marv med 1mL BGM i en 6 cm steril petriskål ved hjælp af en 27G kanyle tilknyttes en 1mL sprøjte til at opnå en cellesuspension.
    4. Tilføje cellesuspension til en 50 mL konisk slange, vaske 6 cm petriskål med 5 mL af BGM og overførsel til den samme 50 mL konisk tube. Der centrifugeres ved 350 x g ved 4 ° C i 5 min. Resuspend celler i OC differentiering medium (DM), der indeholder BGM, 1 nM 1,25-(OH)2-vitamin D3 og 1 µM prostaglandin E2 (1 mL/hul).
      Bemærk: En BALB/c musen giver tilstrækkeligt antal OC prækursorer for en 24-godt kultur plade.
  3. Forberedelse af mus OB-OC Co kultur med biomateriale
    1. Pre Inkuber 14 mm diameter β-TCP diske eller bovin knogle skiver (1 cm2) i 1 mL af BGM i en 24-godt suspension kultur plade på 37 ° C og 5% CO2 i 24 timer før du tilføjer cellerne.
      Bemærk: Bovin knogle skiver er en fysiologisk substrat kontrolgruppe for at studere OC differentiering i overværelse af biomaterialer.
    2. Tilføje 8,8 x 104 celler/cm2 af primære OBs suspenderet i BGM på biomaterialerne eller kontrol ben i en 24-godt suspension kultur plade eller til en 24-godt vævskultur plade. Der inkuberes ved 37 ° C og 5% CO2 i 24 timer.
      Bemærk: OBs tillægger plast eller biomateriale eller kvæg knoglen.
    3. Tilføj frisk isoleret knoglemarv OC forløbere for 24 h kulturperler primære OBs og kultur på 37 ° C og 5% CO2 i 5 dage. Udskift mediet med frisklavede OC DM hver anden dag. Derefter pletten OCs til tartrat-resistente sur fosfatase (FÆLDE) at evaluere OC differentiering.
  4. OC differentiering vurderet af TRAP farvning
    1. For at karakterisere modne multinucleated OCs, fremstillet af trin 2.3.3, Aspirér næringssubstratet fra den kontrol vævskultur og biomateriale suspension kultur plader og tilsættes 1 mL af 1 x PBS (37 ° C). Opsug PBS og løse cellerne ved at inkubere dem i 1 mL 10% buffered formalin løsning på RT for 10 min.
    2. Opsug 10% buffered formalin løsningen med en enkelt-bruger pipette og tilsættes 1 mL af 1 x PBS på RT. Gentag dette trin tre gange, derefter Aspirér PBS, erstatte med 1 mL af TRAP buffer (pH 5) og inkuberes plader ved 37 ° C i 30 min.
    3. Opsug den FÆLDE buffer og tilsættes 1 mL af 1:1 acetone og 100% ethanol. Inkuber plade på RT for 30 s. hurtigt aspirat acetone-ethanol løsning med en enkelt-bruger pipette og helt tørre plader på RT.
    4. For FÆLDEN farvning løsning, forberede en 10 mg/mL naphthol-AS-MX fosfat stamopløsning i N, N-dimethylformamid, opløses 0,6 mg/mL hurtigt rød violet salt i TRAP buffer, og tilsættes 0,1 mL af naphthol-AS-MX fosfat stamopløsning 10 mL hurtigt rød violet salt i TRAP buffer.
    5. Tilsættes 1 mL af TRAP farvning løsning og inkuberes plade ved 37 ° C i 10 min, så Aspirér FÆLDEN farvning løsning, og der tilsættes 1 mL i ultrarent vand at stoppe reaktionen.
    6. Overføre β-TCP diske og bovin knogle skiver efter farvning i en ny brønd, observere rød farvede OCs ved hjælp af et lysmikroskop (forstørrelse: 10 X) og optælle FÆLDE + modne OCs med tre eller flere kerner.

3. kritisk-sized mus Calvarial defekt Model

  1. Injicere 0,1 mg/kg buprenorphin subkutant (s.c.) til 8 - uger gammel BALB/c mus for analgesi.
  2. Bedøver mus med en blanding af 100 mg/kg ketamin og 5 mg/kg xylazin i.p., tilføje en gel eller salve øjnene at holde dem fugtige og Placer musen på en varme plade ved 37 ° C under hele proceduren at forhindre hypotermi. Vurdere anæstesi dybde af tå og hale knivspids.
  3. Barbere pels på toppen af hovedet mellem ørerne, og Rengør overfladen med 7,5% povidon jod løsning og 70% ethanol.
  4. Gøre en midterlinjen sagittal snit på toppen af kraniet mellem ørerne med en steril skalpel til at afsløre calvarium og fjerne pericranium bindevævet over den højre parietal knogle ved at skrabe det med en skalpel.
  5. Oprette en kritisk størrelse defekt i den højre parietal knogle ved hjælp af en steril dental trephine med en diameter på 4 mm (2000 rpm) under konstant vanding med normal saltopløsning til hak den højre parietal knogle og skære igennem ectocortex og nogle endocortex.
  6. For at forhindre skader på dura mater, bruge en lille periosteal elevator til at bryde gennem de resterende endocortex, omhyggeligt løft calvarial knoglen og fjerne det med pincet. Den resulterende mangel bør være cirkulære og ca 3,5 mm i diameter.
  7. Fyld den calvarial defekt med pre gennemblødt (steril 1 x PBS på RT) β-TCP/C skum med pincet.
  8. Klargør den passende antal alder-matchede, forlorne negative kontroller med en tom defekt.
  9. For at holde biomateriale på plads, skal du sætte 0,5 µL af væv lim på kanten af defekten i to modsatte punkter.
  10. Lukke huden med en ikke-resorberbare sutur.
  11. Ren alle kirurgiske instrumenter med kolde sterilant at opretholde sterile forhold før den næste operation på en bedøvede mus.
  12. Post-kirurgisk behandling, at placere dyr på en tør og ren varme plade ved 37 ° C i området kirurgi for passende overvågning i restitutionsperioden. Overvåge respirationsfrekvens, kropstemperatur og farven på slimhinder og øjne hver 10 min, indtil de vågner.
  13. Overføre de opererede bevidst mus i et bur med mad og vand adskilt fra andre dyr indtil fuld helbredelse. Injicere 0,1 mg/kg buprenorphin s.c. til post-operative smertestillende behandling to gange om dagen for 72 h. tilbagevenden fuldt tilbagebetalt mus til deres bure.
  14. For at bestemme effektiviteten af biomateriale, aflive mus i.p. med en opløsning på 200 mg/kg ketamin og 24 mg/kg xylazin.
  15. På 8-12 uger efter implantation, halshugge de aflivede mus med en skarp saks.
  16. Fix musen hovedet i 30 mL af 4,5% buffered formalin løsning for 1-2 uger til at sikre fuld indtrængen i fiksativ i vævet.
  17. Overføre hovedet i 70% ethanol til langtidsopbevaring ved 4 ° C i op til et år.
  18. Brug mikro beregnet tomografi (microCT) eller standardiseret undecalcified histologiske teknikker til at evaluere knogle regenerering. Det er muligt at bruge microCT scanning på postmortem prøver med høj opløsning (90 kV, 4 min) i 2D og 3D sagittal og frontal fly.
  19. For undecalcified histologi, dehydrere hoveder i stigende kvaliteter af ethanol og integrere i glycol methylmethacrylat.
  20. Skære glycol methylmethacrylat-embedded blokke med en diamant sav og slibe dele til en tykkelse af ca 80-100 µm.
  21. Evaluere Lévais Lorenzen farves ben sektioner for at identificere ny knogle dannelse14.

4. in Vitro immunrespons

  1. Aflive naive 8 - uger gammel BALB/c mus i.p. med en opløsning på 200 mg/kg ketamin og 24 mg/kg xylazin.
  2. Placer musen på sin højre side, barbere pels på venstre side og rense huden over i venstre side af maven med 70% ethanol.
  3. Gøre en 10 mm lange og 1 mm dybe snit i huden på musen på den venstre side posteriort efter ribbenene over maven ved hjælp af steril saks.
  4. Åbne huden og så udsætte bughinden. Gøre en 10 mm lang og mindre end 1 mm dybe snit i bughinden ved hjælp af saks under sterile forhold.
  5. Skubbe maven proksimalt at udsætte milten.
  6. Hold milten forsigtigt med steril pincet og fjerne det ved at skære væv og fartøjer, der er fastgjort under den.
  7. Placere intakt milten i en 50 mL tube, som indeholder 10 mL koldt 1 x steril PBS.
  8. Forberede en enkelt cellesuspension af hakning milten ved hjælp af 2 steril pincet eller 2 sterilt glas lysbilleder.
  9. Fjerne snavs af passerer en steril 40 µm celle si med koldt 1 x PBS ved hjælp af stemplet en 1 mL sprøjte.
  10. Centrifugeres enkelt cellesuspension ved 300 x g i 10 min. ved 4 ° C i et 50 mL konisk rør, Aspirér og supernatanten. Derefter resuspenderes celle i 5 mL af røde blodlegemer (RBC) lysisbuffer.
  11. Inkuber cellesuspension til 14 min. ved RT og stoppe reaktionen ved at tilføje 45 mL af Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium.
  12. Der centrifugeres cellerne efter celle lysis ved 300 x g i 10 min. ved 4 ° C og derefter supernatanten.
  13. Resuspend splenocytes i RPMI medium som indeholder 10% inaktiverede varme-FBS, 1% penicillin-streptomycin løsning, 0,1% gentamicin, 0,2% β-mercaptoethanol og 1% ikke-essentielle aminosyrer.
  14. Pre Inkuber β-TCP/C skum i en 96-brønd sterile kultur plade indeholdende RPMI medium i 24 timer ved 37 ° C og 5% CO2 før celle såning.
  15. Tilføj splenocytes på titreret tal, fx., 1,25 x 105, 2,5 x 105 og 5 x 105/well brønde i en 96-brønd vævskultur plade indeholdende RPMI medium og tilsætningsstoffer, med eller uden den pre rugede β-TCP/C skum.
  16. Tilføje 10 µg/mL concanavalin en (Con A) opløst i medium for i alt 100 µL/brønd passende brønde og derefter inkuberes ved 37 ° C og 5% CO2 i 72 timer.
  17. Måle celledelingen med en bromodeoxyuridine (BrdU) assay. Tilsæt 10 µL/brønd af BrdU mærkning løsning på 48 timer i cellekultur og derefter inkuberes plade for en yderligere 24 h.
  18. På 72 h, indsamle supernatanten og opbevares ved-20 ° C indtil videre anvendelse.
  19. Tilføje 200 µL/brønd af fiksering løsning til hver brønd og derefter inkuberes i 30 min. ved RT. aspirat fiksering løsning. Tilsæt 100 µL/brønd af anti-BrdU antistof brugsopløsning og Inkuber i 90 min.
  20. Opsug antistof løsning, skyl wells tre gange med 200 – 300 µL/brønd af vask løsning og fjerne vask løsning.
  21. Tilsæt 100 µL af substratopløsning og Inkuber i 3-10 min. ved RT og derefter måle absorbans ved 450 nm.
  22. Måle interleukin-1β (IL-1β), interleukin-2 (IL-2), interleukin-4 (IL-4) og interferon-γ (IFN-γ) i de indsamlede analysere ved hjælp af en standard ELISA.

5. høj overførselshastighed Intraperitoneal Model

  1. Bedøver kvindelige 6-8-uge gamle BALB/c mus med en blanding af 100 mg/kg ketamin og 5 mg/kg xylazin i.p. og tilføje en gel eller salve øjnene at holde dem fugtige og Placer musen på en varme plade ved 37 ° C under hele proceduren at forhindre hypotermi. Vurdere anæstesi dybde af tå og hale knivspids.
  2. Barbere abdominal pels og rene med 7,5% povidon jod løsning og 70% ethanol.
  3. Gøre et 8 mm lang midterlinjen snit gennem huden langs linea alba. Gør et lille snit i bughinden ved hjælp af en skalpel.
  4. Sted steril PBS tilsat uden materialer til alder-matchede sham kontrol mus eller gennemblødt β-TCP/C skum grafts (2 x 2 x 2 mm3) ind i bughulen.
  5. Sutur bughinden og hud med resorberbare og ikke-resorberbare sutur, henholdsvis.
  6. Ren alle kirurgiske instrumenter med kolde sterilant at opretholde sterile forhold før den næste operation på en bedøvede mus.
  7. Post-kirurgisk behandling, at placere dyr på en tør og ren varme plade ved 37 ° C i området kirurgi for passende overvågning i restitutionsperioden. Overvåge respirationsfrekvens, kropstemperatur og farven på slimhinder og øjne hver 10 min, indtil de vågner.
  8. Overføre de opererede bevidst mus i et bur med mad og vand adskilt fra andre dyr indtil fuld helbredelse. Vende tilbage fuldt gendannede mus til deres bure.
    Bemærk: Denne procedure inducerer minimal smerte. Post-operative smertestillende behandling er som regel ikke nødvendigt. Hvis den opererede dyr viser tegn på smerter, injicere 0,1 mg/kg buprenorphin s.c. eller en anden passende smertestillende stof til smertelindring.
  9. Aflive mus 7 dage efter implantation, med en opløsning på 200 mg/kg ketamin og 24 mg/kg xylazin i.p.
  10. På 7 dage efter implantation, lavage bughulen bruger en 1 mL sprøjten med en 25 G kanyle til ialt 3 mL koldt PBS ved at holde musen hovedet og indsætte nålen i den venstre nedre abdominal kvadrant og sigte proksimalt.
    Bemærk: Peritonealvæske bør være fri af røde blodlegemer.
  11. Centrifugeres peritoneal lavage væske ved 300 x g i 5 min. ved 4 ° C og indsamle peritonealvæske til opbevares ved-20 ° C for ELISA målinger af IL-1β, IL-2 og IL-4 cytokiner.
  12. Opsug supernatanten, celle resuspenderes i 1 mL PBS, og tælle de peritoneal celler benytter trypan blå på en hemocytometer.
  13. Cytocentrifuge cellesuspension på 5 x 105 celler på glas dias, tillade dias at tørre og plet til en differentieret celletal.
  14. Ved hjælp af et lysmikroskop tæller mindst 300 celler i alt og differentiere mellem makrofager, eosinofile, neutrofiler og lymfocytter.

6. subkronisk subkutane Model

  1. Bedøver kvindelige 6-8 uge gamle BALB/c mus med en blanding af 100 mg/kg ketamin og 5 mg/kg xylazin i.p., tilføje gel eller salve til øjnene at holde dem fugtige og Placer musen på en varme plade ved 37 ° C under hele proceduren at forhindre hypotermi. Vurdere anæstesi dybde af tå og hale knivspids.
  2. Placer musen på ryggen og barbere abdominal pels ren glatbarberet overfladen med 7,5% povidon jod løsning og 70% ethanol.
  3. Gøre et 8 mm lang midterlinjen snit gennem huden langs linea alba af maven ved hjælp af en skalpel og derefter implantat PBS gennemblødt biomateriale (2 x 2 x 2 mm3) under huden eller tilføje ingen materialer til alder-matchede sham kontrol mus.
  4. Sutur i huden med en ikke-resorberbare sutur.
  5. Ren alle kirurgiske instrumenter med kolde sterilant at opretholde sterile forhold før den næste operation på en bedøvede mus.
  6. Post-kirurgisk behandling, at placere dyr på en tør og ren varme plade ved 37 ° C i området kirurgi for passende overvågning i restitutionsperioden. Overvåge respirationsfrekvens, kropstemperatur og farven på slimhinder og øjne hver 10 min, indtil de vågner.
  7. Overføre de opererede bevidst mus i et bur med mad og vand adskilt fra andre dyr indtil fuld helbredelse. Vende tilbage fuldt gendannede mus til deres bure.
    Bemærk: Denne procedure inducerer minimal smerte. Post-operative smertestillende behandling er som regel ikke nødvendigt. Hvis den opererede dyr viser tegn på smerter, injicere 0,1 mg/kg buprenorphin s.c. eller en anden passende smertestillende.
  8. Når du er klar til at undersøge implantering site, aflive mus i.p. med en opløsning på 200 mg/kg ketamin og 24 mg/kg xylazin.
  9. Otte uger efter implantation, punktafgifter webstedet implantation med omkringliggende væv (1 cm2).
  10. Fix væv i 4,5% buffered formalin løsning natten, indkapsle i paraffin og skæres i 4 µm sektioner.
  11. Pletten 4 µm paraffin-embedded væv sektioner med hæmatoxylin og Eosin (H & E) for betændelse eller Masson's trichrome for kollagen deposition og fibrose.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For at vurdere β-TCP for dens effektivitet som en biomateriale for knogle reparation, brugte vi i in vitro og i vivo screening-metoder. For det første, vi målte OB svar til β-TCP diske sammenlignet med Oprindelig plan mellemlang alene kontrollerer. Figur 2 viser OB levedygtighed som svar på β-TCP diske på 7 og 14 dage af kultur. Cellernes levedygtighed målt fra metabolisk aktive celler i kultur wells var den samme for OBs med medium i vævskultur plast og β-TCP diske der angiver at denne biomateriale hverken styrke eller undertrykke OB spredning.

Yderligere evaluering af OBs, målte vi ALP aktivitet som en markør for differentiering ved hjælp af kvalitative og kvantitative tilgange. Figur 2 illustrerer ALP enzymaktivitet i kultur brønde efter 7 dage af kultur. OBs i brønde med medium alene havde baseline ALP aktivitet, mens i optimal mineralisering medium (MM) OBs havde intense ALP farvning, og som afspejler et højt niveau af OB differentiering. I modsætning hertil belagt OBs på β-TCP diske opdelte mindre end OBs inkuberes i MM. I en kvantitativ analyse var ALP koncentration 77% højere for de brønde, der indeholder MM sammenlignet med det oprindelige medie alene, mens ALP koncentration var 40% lavere i de celler, der dyrkes på β-TCP diske i forhold til MM kontrol. Selv om disse resultater viser, at celler dyrkes på β-TCP diske opdelte mindre end dem, der har optimale betingelser i plast med MM, opdelte de tilstrækkeligt på biomaterialerne.

En anden kritisk indslag i OBs er deres evne til at fremkalde mineralisering, hvilket er et vigtigt skridt i knogleheling. Vi farvede kulturperler OB celler med ARS efter 14 dage og fandt denne mineralisering var højere for MM kontrol i forhold til OBs kulturperler i medium alene og på β-TCP diske i kultur wells (figur 2). Da vi målte ARS koncentration, fandt vi, at kontrolelementerne MM var mere end 45% højere end β-TCP-gruppen. Disse data illustrere denne OBs kulturperler på plastik i overværelse af MM modne, differentiere og mineralize bedre end dem med medium alene og på β-TCP diske.

For at bestemme, hvordan OCs reagere på β-TCP diske, brugte vi en dyrkningsbaserede teknologi som OBs Co kulturperler med knoglemarv OC prækursorer efterfulgt af undersøgelsen af OC morfologi. OB-OC Co kulturer blev observeret på 5 dage og varierede betydeligt mellem celler dyrkes på plast med OC DM og celler dyrkes på knogle skiver og β-TCP. Plast, OCs var store og udbredte OCs på fysiologiske substrater blev mindre og mindre-spredt ud og uregelmæssigt formet (figur 3). For at kvantificere OCs, vi optalt FÆLDE + OCs og fandt, at der var højere tal når inkuberes med β-TCP (1755 ± 21.41/cm2) i forhold til vævskultur kontrolelementer (1140 ± 15,71/cm2) og knogle skiver (709 ± 59.69/cm2), foreslår forbedret OC differentiering på β-TCP diske (figur 3).

For at bestemme en kommercielt tilgængelig β-TCP/C skum i vivo, brugte vi en kritisk størrelse calvarial defekt model i mus. Vi viser repræsentative histologiske afsnit behandles af en undecalcified histologisk teknik med glykol methylmethacrylat indlejring og Lévais Laczko farvning. MicroCT og histologi kan bruges til at evaluere nye knogledannelse inden for området defekt. Her viser vi et eksempel med histologiske sektioner i figur 4. Når kirurgisk induceret knogle defekten blev efterladt tomme (falsk), vi observeret et tyndt lag, der dækker hele defekten, men ingen væsentlig knogledannelse var til stede ved 12 uger post-handlingen bekræfter den kritiske størrelse af den oprettede knoglebrud. Derimod når defekten indeholdt β-TCP/C skum, der var β-TCP/C skum resterne omgivet af tæt fibrøst væv herunder nogle blodkar og inflammatoriske celler bridging området defekt uden beviser af knogledannelse.

For at evaluere fremmedlegeme svar, vurderet vi immunologiske og allergiske reaktioner på biomaterialer, ved hjælp af en i vitro assay. Figur 5 viser, at når naive splenocytes var inkuberes med medium alene eller med β-TCP/C skum, naive milt celler ikke reagerer ved prolifererende eller producerer IL-2, IL-4, og IFN-γ cytokiner. Derimod indeholdende i ConA kulturer, celleproliferation og cytokin produktion steg med undtagelse af IL-1β. Celle svar var upåvirket når Co kulturperler med ConA og β-TCP/C skum sammenlignet med ConA alene, der angiver, at β-TCP/C skum hverken øget eller nedsat in vitro- svar.

For at afgøre, om β-TCP/C skum induceret en i vivo immunrespons, vi implanteret det 1) intraperitoneal og målte inflammatoriske celle tæller og cytokin koncentrationer i peritoneal lavage væske og 2) subcutaneously og vurderes inflammation og fibrose på histologiske dele af webstedet implantation. I tabel 1afslører cellen differentieret i peritoneal lavage væske, at det samlede antal af inflammatoriske celler var betydeligt højere i β-TCP/C skum implanterede mus sammenlignet med fingeret kontrol. Derudover var der øgede antallet af alle celletyper. I figur 6Aer der højere koncentrationer af IL-1β, IL-2 og IL-4 cytokiner i β-TCP/C skum sammenlignet med fingeret kontrol. I β-TCP/C skum s.c. implanterede mus konstaterede vi en inflammatorisk reaktion med fremmedlegeme kæmpe celler på H & E-farvede sektioner (fig. 6B) og dokumentation af fibrose på Masson's Trichrome farves sektioner (figur 6 c) på 8 uger. Derimod havde webstedet implantation af kontrolelementerne sham minimal inflammation og ingen fibrose (figur 6 c).

Figure 1
Figur 1: Calvaria fjernelse for primære OB celle isolation diagram. Diagrammet illustrerer, hvordan du fjerner calvarium med 4 stykker (rød stiplet linje) med buet saks. Den første skæring er vinkelret på højre (R) øjenhulen fra X1 til X 2, og andet er vinkelret på venstre (L) øjenhulen fra X3 til X 4. Den tredje klip er at adskille calvarium foran fra X4 til X 2, og den fjerde cut er at adskille bagsiden fra X3 til X 1. Calvarium er så gratis at blive fjernet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: β-TCP-induceret in vitro- OB differentiering og modning. OB levedygtighed og spredning på dage 7 og 14 for cellerne kulturperler i medium alene (barer) eller β-TCP (åben bar) (gennemsnit ± SEM; n = 3). ALP aktivitet kvantificering af cellelysater og normalisering at proteinindholdet (µM DIFMU/µg protein, gennemsnit ± SEM, n = 3) med repræsentative billeder illustrerer ALP-farvede kultur wells fra dag 7. Mineralisering kvantificeret fra ARS-farvede kulturer ved en cetylpyridinium chlorid ekstraktion metode vist som koncentrationen af ARS (µM ARS, gennemsnit ± SEM, n = 3) med repræsentative ARS-farvede kultur brønde på dag 14. Grupper omfatter knogle vækstmedium alene (BGM); Mineralisering medium (MM); Β-TCP. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: β-TCP-induceret i vitro OC differentiering. Repræsentative mikrofotografier Vis FÆLDE + multinationale selskaber på dag 5 efter Co dyrkning mus OBs og knoglemarv OC prækursorer. Slutpunkt analyse af FÆLDE + multinucleated celler (multinationale selskaber) viser det absolutte antal FÆLDE + Middelhavspartnerlandene (≥3 kerner) per cm2 (betyde ± SEM, n = 3) ***p < 0,001. Grupper omfatter OC differentiering medium alene (DM); Knoglen; Β-TCP. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: In vivo evaluering af β-TCP/C skum bone podninger i en kritisk størrelse calvarial defekt model. Ikke-healing calvarial defekter skabt i 8 - uger gammel kvindelige BALB/c (n = 3) mus ved hjælp af en 4 mm dental trephine. Behandling grupper inkluderet sham kontrol (Tom defekt) og defekter behandles med β-TCP/C skum. Repræsentative histologiske snit forberedt på 12 uger efter implantation. Formalin-fast væv glycol methylmethacrylat-embedded sektioner (80-100 µm) farves med Lévais Laczko farvestof. Mikrofotografier vist på lav (venstre) og høj (højre) forstørrelse. Sorte trekanter indikerer knoglen defekt. Sort * betegner knoglevæv og hvid * henviser til β-TCP/C skum. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: β-TCP/C skum-induceret i vitro celle spredning og cytokin produktion. Splenocytes fra naiv BALB/c mus kulturperler i medium alene, med β-TCP/C skum eller ConA. Supernatanten celleproliferation (BrdU), og produktionen af IL-1β, IL-2, IL-4, og IFN-γ (medium alene ●, ConA ○, β-TCP/C skum ■, β-TCP/C skum og ConA □). Spredning resultater præsenteret som middelværdi af tredobbelt prøver (OD ± SEM) i BrdU analysen og middelværdien af identiske prøver (pg/mL ± SEM) til cytokin koncentration fra to uafhængige forsøg. p < 0,05 anses for væsentlige for biomateriale vs medium og biomateriale og ConA vs ConA alene. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: In vivo immunresponset af β-TCP/C skum bone podninger i en hurtig høj overførselshastighed i.p. og subkronisk musemodel. (A) kvindelige BALB/c mus implanteret i.p. med β-TCP/C skum eller uden tilføjet materialer (falsk). Syv dage senere, peritoneal lavage analyseret for cytokin koncentrationer (data præsenteres som betyder cytokin koncentrationer pg/mL ± SEM). Disse data er repræsentative for to uafhængige eksperimenter (n = 5). p < 0,05 anses betydelige i forhold til humbug. (B-C) BALB/c hunmus (n = 5) implanteret s.c. med β-TCP/C skum eller uden tilføjet materialer (falsk). 8 uger efter implantation, hud fra implantation steder plettet med H & E (B) og Masson's Trichrome (C) at evaluere inflammation og fibrose, henholdsvis. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Fingeret Vitoss
Celle tæller x 106 (% af samlede celler)
Makrofager 1.240 ± 0.051 (88.1) 3.262 ± 0.380 (70,4) p < 0,001
Eosinofile 0.120 ± 0.011 (8,5) 1.181 ± 0.254 (25,5) p < 0,01
Neutrofiler 0.002 ± 0,001 (0,2) 0.029 ± 0.011 (0,6) ns
Lymfocytter 0,048 ± 0.020 (3.2) 0.148 ± 0.041 (3,5) ns
Samlede celletal 1.410 ± 0.066 4.620 ± 0.452 p < 0,001

Tabel 1: In vivo immunresponset af β-TCP/C skum bone podninger i en hurtig høj overførselshastighed i.p. musemodel. BALB/c hunmus blev implanteret i.p. med β-TCP/C skum eller uden materialer (falsk). Syv dage senere, peritoneal lavage var indhentet og analyseret for inflammatoriske celle nummer og differentieret celle tæller (data præsenteres som betyder celle tæller ± SEM). Disse data er repræsentative for to uafhængige eksperimenter (n = 5).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her viser vi en tværfaglig tilgang til prækliniske vurdering af biokompatibilitet for repræsentative biomaterialer udviklet til knogle regenerering og reparation. Vi testede svarene fra OBs, OCs, og in vivo helbredende reaktion i en kritisk knogle defekt model i mus samt in vitro og i vivo immunrespons. Vi havde til formål at demonstrere hvordan assays arbejde og opsummere data og konklusioner stammer fra en undersøgelse af biomaterialerne. Vi viser, at vores strategi genererer et værdifuldt profil af knogle biomateriale biokompatibilitet.

Primære celle assays blev anvendt til at evaluere OB og OC funktion. OBs er ansvarlig for knogledannelse og fysiologiske reparation. De skal forblive levedygtige, differentiere og fremkalde mineralisering. I denne undersøgelse viser vi hvordan man udfører assays til cellernes levedygtighed, ALP og ARS som markører for fysiologisk differentierede celler med kapacitet til mineralize. Kontrolelementerne til assays inkluderet medium alene, som giver en baseline og osteogenic mineralisering medium (MM), hvilke optimeret differentiering og mineralisering af OBs på plastik. Sidstnævnte kontrolgruppen var en referencestandard for biomateriale. OC evaluering, vi Co kulturperler OBs og knoglemarv-afledte OC prækursorer, differentieret forstadier til multinucleated celler, plettet dem med FÆLDE, et osteoclastic enzym udbredt at identificere OCs in vitro-15 og derefter optalt cellerne bruger lysmikroskopi. Disse assays er state-of-the-art og kræver ikke ændringer. Dog bemærkede vi en begrænsning vedrører kvaliteten af isolerede primære OBs at mineralize. Bevarede OBs opbevares i flydende nitrogen og anvendes inden for et år for optimale resultater.

OB udlæg og aktivitet var højere på vævskultur plastik end på β-TCP diske testet. Når vi vurderet OCs, observeret vi de forventede forskelle mellem svar på plast og knogle, som er fysiologisk substrat16. I sammenligning fremkaldt knogle og β-TCP lignende morfologiske ændringer. FÆLDE assay tælling af OCs svar på β-TCP diske viste, at tallene var signifikant forskellig mellem knogle skiver og β-TCP. Β-TCP induceret højere OC differentiering end på knogle skiver. OC differentiering er TRAP en veletableret assay. Der var ingen væsentlige ændringer i denne metode. Men for at opnå de bedste resultater, er det vigtigt ikke at udruge celler for længe, eller alle celler af monocytic oprindelse vil blive TRAP-positive.

For at løse i vivo svar, brugte vi β-TCP/C skum som en eksemplarisk biomateriale fordi det indeholder β-TCP, som blev anvendt i in vitro- assays og kollagen og fremmer knogle heling13. Selvom β-TCP/C skum er kommercielt tilgængelige og anvendes klinisk for knogle reparation17,18, det er kun en af mange forskellige typer af materialer, der ville være interessant at studere, fx., bifasisk calciumphosphat ( hydroxyapatit/β-TCP) såvel som demineraliseret menneskelige knogler i disse assays til at bestemme, hvordan biologiske reaktioner er forskellige materialer. For svar i vivo vi implanteret β-TCP/C skum ind i en kritisk størrelse calvarial knogle defekt i mus og 12 uger senere vurderet histologi og viste forskelle sammenlignet med fingeret kontrol. Det er også muligt at vurdere svarene med microCT, som giver gratis information19. Defekten i sham kontrol mus havde ingen signifikant knogledannelse, som forventet, β-TCP/C skum fremkaldte en inflammatorisk reaktion, fibrose og angiogenese, hvilket er bevis for den tidlige fase af knogledannelse. Denne metode har vist tidligere i JOVE20. Men vores tilgang adskilte sig ved at vi brugte en modificeret "elevator" teknik med en periosteal elevator til at reducere risikoen for sårede dura mater af trephine. Vi begrundede, at dura mater spiller en væsentlig rolle i helingsprocessen af calvarial defekter ved at producere osteogenic celler og osteoinduktive faktorer3,21,22,23. Navnlig påvirker materiale implanteret, defekt, og metode til at skabe defekten størrelse knogle regenerering af calvarial mangler. En anden ændring i proceduren involverede stabilisering af biomateriale i den calvarial defekt med et biokompatibelt væv lim, der rutinemæssigt anvendes klinisk sår lukning. Denne ændring garanteret, at materialet i området defekt ikke ville blive fordrevet under healing.

Betændelse regulerer den tidlige fase af knogleheling, men for meget betændelse eller allergiske reaktioner kan reducere reparation11. Det ideelle immunresponset biomaterialer er at indlede en inflammatoriske kaskade, der fremmer knogledannelse. Dog kan visse biomaterialer forårsage et fremmedlegeme svar fører til en bred vifte af inflammatoriske signaler, der forårsager fibrose eller allergisk sensibilisering. I vores undersøgelser, vi evalueret immunrespons til β-TCP/C skum og fandt, at det ikke var giftige for naiv milt celler og ikke forstyrre T-lymfocytter ekspansion eller funktion (cytokin sekretion) når føjet til kulturer med ConA. I intraperitoneal eksperimenter, β-TCP/C skum induceret inflammation, og der var nogle beviser på en stigning i eosinofili og makrofager med samtidige stigninger i Th1 og Th2 type cytokiner. I de subkutane implantation eksperimenter, β-TCP/C skum også induceret inflammation, men der var ingen bevis for kronisk, destruktive inflammatoriske eller allergiske reaktioner, hvilket tyder på, at β-TCP/C skum er biokompatible. Disse modeller indeholder oplysninger om biomaterialer immunresponset. For det første omhandler i vitro model effekten af biomateriale på naive immunceller i overværelse af en mitogen at bevise, at der ikke er nogen undertrykkelse af den mitogenic reaktion skyldes biomateriale. For det andet den intraperitoneal model giver en hurtig 7 dag udlæsning af typen af immunrespons, fx., allergiske og betændelse som observeret af typen af inflammatoriske celler infiltration og cytokin-profil. For det tredje den subkutane, subkronisk model illustrerer væv svar over en længere periode, giver mulighed for evaluering af kronisk inflammation, fibrose, antistof titers, og kan bruges til at teste gentagne implantation for immunologisk hukommelse svar. Disse modeller har offentliggjort tidligere og er vist her uden nogen ændringer13. Det er afgørende, at der er passende negative og positive kontrol for disse modeller. Vi foreslår, klarer alle tre modeller for at undgå begrænsningerne ved hver metode. Mens de viste modeller er veletableret i andre områder af immunologi, er tilgang til test biomaterialer de seneste.

I Resumé give knogle og immun assays en biologisk forenelighed profil på en biomateriale. Til knogle give OB og OC svar til biomateriale foreløbige data, der er nødvendige, før du udfører komplicerede og dyre dyreforsøg og 3R-princip. Immunologiske in vitro- assays give oplysninger om antigen krydsreaktivitet og cytotoksicitet, som kan også udelukke yderligere dyreforsøg. Hurtig høj overførselshastighed eksperimenter giver resultater på inflammatoriske og cytokin respons (fx., type af T-lymfocytter svar), mens den subkronisk model er nyttig på grund af data om varighed af betændelse og potentiale for at beskadige fibrose. Denne roman tværfaglig tilgang, der omfatter knogle og immunrespons til biomaterialer tilbyder en fremragende præ-klinisk vurdering af biokompatibilitet for fremtidige ansøgninger i feltet materialer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Dette forskningsprojekt har modtaget støtte fra EUs syvende rammeprogram (FP7/2007-2013) under grant aftale nr. 263363.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Biomaterials
β-tricalcium phosphate disks (β-TCP, 14 mm) Disks were sintered in a muffle furnace at a temperature of 1150 °C. A detailed description of the production can be found in Zimmer et al (doi: 10.1002/jbm.a.34639). Samples were UV-irradiated (15 min for each side) before using in cell cultures.
Orthovita Vitoss foam (β-TCP/C foam) Orthovita 2102-1405
Mouse osteoblast culture
Alizarin Red S Sigma-Aldrich A5533
ALP assay buffer (2x) pH 10.4 Dissolve 200 mM glycine, 2 mM magnesium chloride, 2 mM zinc chloride in ultrapure water and adjust to pH 10.
Bone growth medium (BGM) α-MEM + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin/streptomycin
Cell lysis buffer: CyQuant cell lysis buffer 20x concentrate Thermo Scientific C7027 Dilute the concentrated cell lysis buffer stock 20-fold in ultrapure water. 
Cell viability reagent: Presto Blue cell viability reagent Invitrogen, Thermo Fisher Scientific A13261
Collagenase type IV from clostridium histolyticum Sigma-Aldrich C5138
DC protein assay kit II Bio Rad 5000112 DC protein assay kit contains reagent A, reagent B, reagent S and BSA for the reference standard. For reagent A', add 20 µL reagent S to 1000 µL reagent A. 
Dimethylsulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D8418 Steril-filter DMSO before usage. 
Dispase II (neutral protease, grade II) Roche 4942078001
EnzCheck Phosphatase Assay Kit for alkaline phosphatase activity  Invitrogen, Thermo Fisher Scientific E12020 EnzCheck Phosphatase Assay Kit contains 6,8-difluoro-4-methylumbelliferyl phosphate (DiFMUP), N,N-dimethylformamide and 6,8-difluoro-7-hydroxy-4-methylcoumarin (DiFMU). 
Fetal bovine serum (FBS) Sigma-Aldrich F7524
Formalin solution neutral buffered 10% Sigma-Aldrich HT501128
Glycine Sigma-Aldrich G8898
Hexadecylpyrdinium (cetylpyridinium) chloride monohydrate Sigma-Aldrich C9002
L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate Sigma-Aldrich A8960
Magnesium chloride hexahydrate Sigma-Aldrich M2670
MEM alpha medium (α-MEM) Gibco Life Technologies  11900-073
Osteogenic mineralization medium (MM) α-MEM + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin-streptomycin + 50 µg/mL ascorbic acid + 5 mM β-glycerophosphate
Penicillin-streptomycin   Sigma-Aldrich P4333
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 Gibco, Thermo Fisher Scientific  10010023
Sigmafast BCIP/NBT Sigma-Aldrich B5655
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red (10x) Gibco, Thermo Fisher Scientific  15400054 Dilute the concentrated stock solution 10-fold in 1x PBS. 
Tween20 Sigma-Aldrich P1379
Ultrapure water: Cell culture water pyrogen free VWR L0970-500
Wash buffer Add  0.05% Tween20 to 1x PBS.
Zinc chloride Sigma-Aldrich 1.08816
β-Glycerophosphate disodium salt hydrate Sigma-Aldrich G5422
24-well suspension culture plate Greiner bio-one 662102
24-well tissue culture plate Greiner bio-one 662160
50 mL conical tube Greiner bio-one 227261
96-well black plate Greiner bio-one 655076
96-well transparent plate Greiner bio-one 655001
Centrifuge: VWR Mega Star 600R VWR
CO2-Incubator: HeraCell 240 Thermo Scientific
Cryovial 2 mL Greiner bio-one 122263
Disposable filter unit FP30/0.2 CA-S GE Healthcare Life Sciences Whatman 10462200 For sterile filtration of enzyme solution.
Flatbed scanner: Epson Perfection 1200 Photo Epson
Infinite M200 Pro microplate reader Tecan
Microcentrifuge tube: Eppendorf tube safe-lock 0.5 mL VWR 20901-505
Microcentrifuge tube: Eppendorf tube safe-lock 1.5 mL VWR 21008-959
Shaker Swip (orbital and horizontal)  Edmund Buehler 
Shaking incubator GFL3032 GFL  3032
Single-use pipet: serum pipet Greiner bio-one 612301
Sterile instruments (scissors, tweezer, curved forceps)
Tissue culture plate (10 cm) Greiner bio-one 664960
Mouse osteoblast-osteoclast co-culture
1α,25-Dihydroxyvitamin D3 Sigma-Aldrich 17936 1000x concentrated stock (10 µM in ethanol 100%)
Acetone VWR Chemicals 22065.327
Bone growth medium (BGM) α-MEM + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin-streptomycin
Distilled water Carl Roth 3478.4
Ethanol (100% vol/vol) VWR Chemicals 20821.365
Ethanol (70% vol/vol) VWR Chemicals 93003.1006
Fast red violet LB salt Sigma-Aldrich F3381
Fetal bovine serum (FBS) Sigma-Aldrich F7524
Formalin solution neutral buffered 10% Sigma-Aldrich HT501128
MEM alpha Medium (α-MEM) Gibco Life Technologies  11900-073
N,N-Dimethylformamide Sigma-Aldrich D4551
Naphthol AS-MX phosphate Sigma-Aldrich N4875
Osteoclast differentiation medium (DM) α-MEM + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin-streptomycin + 1 nM 1,25-(OH)2-vitamin D3 + 1 µM prostaglandin E2 
Penicillin-streptomycin  Sigma-Aldrich P4333
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 Gibco, Thermo Fisher Scientific  10010023
Prostaglandin E2 (PGE2) Cayman Chemical Company 9003016 1000x concentrated stock (1 mM in ethanol 100%)
Sodium acetate trihydrate Sigma-Aldrich S7670
Sodium tartrate dibasic dihydrate Sigma-Aldrich S8640
Sterile instruments (scissors, forceps, scalpel)
TRAP buffer pH 5.0 Dissolve 40 mM sodium acetate, 10 mM sodium tartrate in ultrapure water and adjust to pH 5.
Ultrapure water: Cell culture water pyrogen free VWR L0970-500
24-well suspension culture plate Greiner bio-one 662102
24-well tissue culture plate Greiner bio-one 662160
50 mL conical tube Greiner bio-one 227261
Centrifuge: VWR Mega Star 600R VWR
CO2-Incubator: HeraCell 240 Thermo Scientific
Diamond wafering blade (10.2 cm x 0.3 cm) Buehler
Isomet low-speed saw Buehler
Petri dish (6 cm) Greiner bio-one 628,161
Screw cap glass bottle 20 mL Carl Roth EXY4.1
Single-use sterile syringe 1 mL Henry Schein Animal Health 9003016
Single-use pipet: serum pipet Greiner bio-one 612301
Sterile needle: Hypodermic needle RW 27 G x 3/4'' Henry Schein Animal Health 9003340
Mouse calvarial defect model
Analgesia: Buprenorphine (Bupaq) Richter Pharma AG
Anesthesia: Ketamine (Ketamidor), Xylazine (Rompun) Richter Pharma AG/Bayer HealthCare
Cold sterilant: SafeSept Max Henry Schein Animal Health 9882765
Ethanol (70% vol/vol) VWR Chemicals 93003.1006
Eye ointment: VitA POS 5 g Ursapharm
Normal saline solution (0.9% sodium chloride solution) Fresenius Kabi
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 Gibco, Thermo Fisher Scientific  10010023
Povidone iodine solution: Braunol 1000 mL B. Braun 3864154
Roti-Histofix 4.5% buffered formalin Carl Roth 2213.6
Tissue adhesive: Histoacryl 5 x 0.5 mL  B. Braun Surgical 1050060
Personal protective equipment: surgical gloves, cap and mask, gown Henry Schein Animal Health 1045073, 1026614, 9009062, 370406
Sterile instruments (scalpel, scissors, forceps, needle holder)
Sterile needles: Hypodermic needles RW 27 G x 3/4'' and 30 G x 1/2''  Henry Schein Animal Health 9003340, 9003630
Single-use sterile syringe 1 mL Henry Schein Animal Health 9003016
Heating plate: Physitemp Rothacher Medical TCAT-2LV
Sterile gauze swabs Henry Schein Animal Health 220192
Sterile disposable scalpel (Figur 20) Henry Schein Animal Health 9008957
Surgical/dental drill: Implantmed SI-923 W&H Dentalwerk Bürmoos GmbH 16929000
Handpiece type S-II W&H Dentalwerk Bürmoos GmbH 30056000
Trephine, diameter 4 mm Hager&Meisinger GmbH 229040
Irrigation tubing set 2.2 m W&H Dentalwerk Bürmoos GmbH 4363600
Periosteal elevator 2 mm / 3 mm Henry Schein Animal Health 472683
Non-resorbable suture: Polyester green, DS19, met. 1.5, USP 4/0 75 cm Henry Schein Animal Health 300715
In vitro immune responses
Anesthesia for euthanasia: Ketamine (Ketamidor), Xylazine (Rompun) Richter Pharma AG/Bayer HealthCare
Cell Proliferation ELISA, BrdU (colorimetric) Assay Kit Sigma-Aldrich 11647229001 The kit contains BrdU labeling solution, fixation solution (FixDenat), Anti-BrdU antibody solution, washing buffer and substrate solution. 
Concanavalin A (ConA) MP Biomedicals 150710
Culture medium splenocytes RPMI medium + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin-streptomycin solution + 0.1% gentamicin + 0.2% ß-mercaptoethanol + 1% non-essential amino acids
Ethanol (70% vol/vol) VWR Chemicals 93003.1006
Fetal bovine serum (FBS) Gibco, Thermo Fisher Scientific  10500064
Gentamicin Gibco, Thermo Fisher Scientific  15750037
Mouse IL-1β ELISA Ready-SET-Go! Invitrogen, Thermo Fisher Scientific 88-7013-88
Mouse IL-2 ELISA MAX Standard BioLegend 431001
Mouse IL-4 ELISA MAX Standard BioLegend 431101
Mouse INF-γ ELISA MAX Standard BioLegend 430801
Non-essential amino acids solution Gibco, Thermo Fisher Scientific  11140050
Penicillin-streptomycin  Gibco, Thermo Fisher Scientific  15140122
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 Gibco, Thermo Fisher Scientific  10010023
Red blood cell (RBC) lysis buffer: BD Pharm Lyse BD Bioscience 555899
RPMI 1640 medium, HEPES Gibco, Thermo Fisher Scientific  52400025
β-Mercaptoethanol Gibco, Thermo Fisher Scientific  31350010
50 mL conical tube Greiner bio-one 227261
96-well tissue culture plate Greiner bio-one 655180
Centrifuge: VWR Mega Star 600R VWR
Cell strainer 40 µm BD Bioscience 352340
Infinite M200 Pro microplate reader Tecan
Single-use sterile syringe 1 mL Henry Schein Animal Health 9003016
Sterile surgical instruments (forceps, glass slides)
High throughput intraperitoneal model
Anesthesia: Ketamine (Ketamidor), Xylazine (Rompun) Richter Pharma AG/Bayer HealthCare
Cold sterilant: SafeSept Max Henry Schein Animal Health 9882765
Ethanol (70% vol/vol) VWR Chemicals 93003.1006
Eye ointment: VitA POS 5 g Ursapharm
Mouse IL-1β ELISA Ready-SET-Go! Invitrogen, Thermo Fisher Scientific 88-7013-88
Mouse IL-2 ELISA MAX Standard BioLegend 431001
Mouse IL-4 ELISA MAX Standard BioLegend 431101
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 Gibco, Thermo Fisher Scientific  10010023
Povidone iodine solution: Braunol 1000 mL B. Braun 3864154
Shandon Rapid-Chrome Kwik-Diff Staining Kit Thermo Scientific 9990700 For differential cell count.
Heating plate: Physitemp Rothacher Medical TCAT-2LV
Hemocytometer: Neubauer chamber Carl Roth PC72.1
Non-resorbable suture: Ethibond Excel 4-0 Ethicon 6683H
Resorbable suture: Polysorb Covidien SL-5628
Shandon centrifuge for cytopsin Thermo Scientific
Single-use sterile syringe 1 mL Henry Schein Animal Health 9003016
Sterile gauze swabs Henry Schein Animal Health 220192
Sterile needles: Hypodermic needles RW 27 G x 3/4'' and 25 G Henry Schein Animal Health 9003340, 420939
Sterile surgical instruments (scalpel, scissors, forceps, needle holder)
Trypan blue solution 0.4% Gibco, Thermo Fisher Scientific  15250061
Subchronic subcutaneous model
Anesthesia: Ketamine (Ketamidor), Xylazine (Rompun) Richter Pharma AG/Bayer HealthCare
Cold sterilant: SafeSept Max Henry Schein Animal Health 9882765
Ethanol (70% vol/vol) VWR Chemicals 93003.1006
Eye ointment: VitA POS 5 g Ursapharm
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 Gibco, Thermo Fisher Scientific  10010023
Povidone iodine solution: Braunol 1000 mL B. Braun 3864154
Roti-Histofix 4.5% buffered formalin Carl Roth 2213.6
Heating plate: Physitemp Rothacher Medical TCAT-2LV
Non-resorbable suture: Ethibond Excel 4-0 Ethicon 6683H
Personal protective equipment: surgical gloves, cap and mask, gown Henry Schein Animal Health 1045073, 1026614, 9009062, 370406
Single-use sterile syringe 1 mL Henry Schein Animal Health 9003016
Sterile gauze swabs Henry Schein Animal Health 220192
Sterile instruments (scalpel, scissors, forceps, needle holder)
Sterile needle: Hypodermic needles RW 27 G x 3/4''  Henry Schein Animal Health 9003340, 420939

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. Fracture healing: mechanisms and interventions. Nature Reviews Rheumatology. 11 (1), 45-54 (2015).
  2. Marsell, R., Einhorn, T. A. The biology of fracture healing. Injury. 42 (6), 551-555 (2011).
  3. Cooper, G. M., et al. Testing the critical size in calvarial bone defects: revisiting the concept of a critical-size defect. Plastic and Reconstructive Surgery. 125 (6), 1685-1692 (2010).
  4. O'Brien, F. J. Biomaterials & scaffolds for tissue engineering. Materials Today. 14 (3), 88-95 (2011).
  5. Stanovici, J., et al. Bone regeneration strategies with bone marrow stromal cells in orthopaedic surgery. Current Research in Translational Medicine. 64 (2), 83-90 (2016).
  6. Anderson, J. M. Future challenges in the in vitro and in vivo evaluation of biomaterial biocompatibility. Regenerative Biomaterials. 3 (2), 73-77 (2016).
  7. Chen, Z., et al. Osteoimmunomodulation for the development of advanced bone biomaterials. Materials Today. 19 (6), 304-321 (2016).
  8. Ono, T., Takayanagi, H. Osteoimmunology in bone fracture healing. Current Osteoporosis Reports. 15 (4), 367-375 (2017).
  9. Tsiridis, E., Upadhyay, N., Giannoudis, P. Molecular aspects of fracture healing: Which are the important molecules? Injury. 38, S11-S25 (2007).
  10. Velasco, M. A., Narvaez-Tovar, C. A., Garzon-Alvarado, D. A. Design, materials, and mechanobiology of biodegradable scaffolds for bone tissue engineering. BioMed Research International. 2015, 729076 (2015).
  11. Bastian, O., et al. Systemic inflammation and fracture healing. Journal of Leukocyte Biology. 89 (5), 669-673 (2011).
  12. El-Jawhari, J. J., Jones, E., Giannoudis, P. V. The roles of immune cells in bone healing; what we know, do not know and future perspectives. Injury. 47 (11), 2399-2406 (2016).
  13. Changi, K., et al. Biocompatibility and immunogenicity of elastin-like recombinamer biomaterials in mouse models. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 106 (4), 924-934 (2018).
  14. Laczko, J., Levai, G. A simple differential staining method for semi-thin sections of ossifying cartilage and bone tissues embedded in epoxy resin. Mikroskopie. 31 (1-2), 1-4 (1975).
  15. Nakayama, T., et al. Polarized osteoclasts put marks of tartrate-resistant acid phosphatase on dentin slices--a simple method for identifying polarized osteoclasts. Bone. 49 (6), 1331-1339 (2011).
  16. Deguchi, T., et al. In vitro model of bone to facilitate measurement of adhesion forces and super-resolution imaging of osteoclasts. Scientific Reports. 6, 22585 (2016).
  17. Epstein, N. E. An analysis of noninstrumented posterolateral lumbar fusions performed in predominantly geriatric patients using lamina autograft and beta tricalcium phosphate. Spine Journal. 8 (6), 882-887 (2008).
  18. Epstein, N. E. Beta tricalcium phosphate: observation of use in 100 posterolateral lumbar instrumented fusions. Spine Journal. 9 (8), 630-638 (2009).
  19. Kallai, I., et al. Microcomputed tomography-based structural analysis of various bone tissue regeneration models. Nature Protocols. 6 (1), 105-110 (2011).
  20. Lo, D. D., et al. Repair of a critical-sized calvarial defect model using adipose-derived stromal cells harvested from lipoaspirate. Jove-Journal of Visualized Experiments. (68), (2012).
  21. Gosain, A. K., et al. Osteogenesis in calvarial defects: contribution of the dura, the pericranium, and the surrounding bone in adult versus infant animals. Plastic and Reconstructive Surgery. 112 (2), 515-527 (2003).
  22. Levi, B., et al. Dura mater stimulates human adipose-derived stromal cells to undergo bone formation in mouse calvarial defects. Stem Cells. 29 (8), 1241-1255 (2011).
  23. Wang, J., Glimcher, M. J. Characterization of matrix-induced osteogenesis in rat calvarial bone defects: II. Origins of bone-forming cells. Calcified Tissue International. 65 (6), 486-493 (1999).

Tags

Bioteknologi sag 141 regenerativ medicin biomaterialer skeletmuskulatur væv reparation immunogenicitet fremmedlegeme reaktion in vitro in vivo
Biologiske forenelighed profil på biomaterialer for knogle regenerering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kampleitner, C., Obi, J., Vassilev,… More

Kampleitner, C., Obi, J., Vassilev, N., Epstein, M. M., Hoffmann, O. Biological Compatibility Profile on Biomaterials for Bone Regeneration. J. Vis. Exp. (141), e58077, doi:10.3791/58077 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter