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Bioengineering

Biologische Verträglichkeit Profil auf Biomaterialien für Knochenregeneration

doi: 10.3791/58077 Published: November 16, 2018

Summary

Die Anzahl der neue Biomaterialien für die Reparatur von großen Knochenläsionen entwickelt wird laufend erweitert, mit dem Ziel zu verbessern, Knochenheilung und Komplikationen im Zusammenhang mit Knochentransplantation überwinden. Hier präsentieren wir Ihnen eine multidisziplinäre Strategie zu Testzwecken vorklinischen Biokompatibilität von Biomaterialien für die Knochen-Reparatur.

Abstract

Großen Pseudarthrose Knochenbrüche sind eine große Herausforderung in der orthopädischen Chirurgie. Obwohl Auto und allogene Knochentransplantate ausgezeichnet zur Heilung solcher Läsionen sind, gibt es mögliche Komplikationen mit deren Einsatz. So entwickeln die Materialwissenschaftler synthetische, biokompatible Biomaterialien um diese Probleme zu überwinden. In dieser Studie stellen wir eine multidisziplinäre Plattform für die Bewertung der Biomaterialien für Knochen-Reparatur. Wir kombinieren Fachwissen aus Knochenbiologie und Immunologie, einschließlich in-vitro- Osteoklasten (OC) und Osteoblasten (OB) Assays und in Vivo Mausmodelle der Knochen-Reparatur, Immunogenität und Allergenität Plattform zu entwickeln. Wir zeigen, wie die Experimente durchführen, Zusammenfassung der Ergebnisse und Bericht über Biomaterial Biokompatibilität. Insbesondere haben wir OB Lebensfähigkeit, Differenzierung, und Mineralisierung und OC Lebensfähigkeit und Differenzierung im Rahmen der β-Tricalcium Phosphat (β-TCP) Festplatten getestet. Wir testeten ebenfalls einen β-TCP/Kollagen (β-TCP/C)-Schaum ist ein handelsübliches Material klinisch für Knochen-Reparatur in eine kritische Größe calvarial Knochen-defekt-Maus-Modell verwendet, um festzustellen, die Auswirkungen auf die frühe Phase der Knochenheilung. In parallelen Experimenten haben wir immun und allergische Reaktionen bei Mäusen ausgewertet. Unser Ansatz erstellt eine biologische Verträglichkeit Profil von Knochen Biomaterial mit einer Reihe von Parametern für die Vorhersage der Biokompatibilität von Biomaterialien für die Knochenheilung und Reparatur bei Patienten erforderlich.

Introduction

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Knochen-Reparatur ist ein komplexer Prozess, der mit Hämatombildung, Entzündung beginnt, Kallus, Bildung und dann Umbau1,2. Knochenregeneration Potenzial ist jedoch beschränkt auf die Größe der Knochenbruch1,3. Zum Beispiel große Knochenbrüche verursacht durch ein Trauma, Krebs oder Osteoporose können nicht heilen und Pseudarthrose Knochenbrüche bezeichnet werden. Diese Knochenveränderungen erfordern oft Behandlung gesunde physiologische Knochen Reparatur und Regeneration zu fördern. Derzeit Autotransplantation und Allograft Knochen-Transplantation ist der Ansatz der Wahl4 mit 2,2 Millionen Knochen Ersatzverfahren jährlich5. Obwohl diese Verfahren eine hohe Erfolgsquote haben, möglicherweise gibt es Komplikationen, z. B. begrenzte Verfügbarkeit von Knochen, Infektion, Spender Website Morbidität und Ablehnung4. Neue Alternativen für das Bone Tissue Engineering werden gesucht, um diese Herausforderungen zu bewältigen.

Das Design von Biomaterialien, basierend auf natürlichen oder synthetischen Polymeren, Biokeramik oder Metalle in Verbindung mit Zellen und bioaktiven Moleküle ist auf dem Aufstieg6. Unser gegenwärtige Verständnis der physiologischen Knochen heilen und Heilung im Zusammenhang mit Biomaterialien hängt von mehrere Faktoren wie mechanische Eigenschaften und mehrere lokale und systemische Faktoren, einschließlich der Zellen aus dem Verkehr und Frakturstelle7 ,8,9. Biomaterialien für Knochenregeneration Osteogenicity und Osseointegration10 fördern und sind im Idealfall biokompatibel, biologisch abbaubar und poröse (Förderung der Zellwanderung, Sauerstoff und Nährstoffe). Sie müssen auch stark genug zur Unterstützung der Frakturstelle, Schmerzen zu lindern. Darüber hinaus sind entzündliche Faktoren erforderlich, um den Heilungsprozess einzuleiten. Jedoch wenn das Biomaterial übermäßige Entzündungen und allergische Reaktionen induziert, könnte dies zu begrenzen oder hemmen Knochenheilung11,12. So ist ein interdisziplinärer Ansatz notwendig, Biomaterialien entwickelt für Knochen-Reparatur zu bewerten.

In dieser Studie stellen wir eine prä-klinischen Bewertung der repräsentativen Materialien (1) Orthovita Vitoss, den Schaum, der im Handel erhältlichen Spongiosa Graft Ersatz bestehend aus Tricalcium Phosphat ist bestehend aus nanometergroßen reines β-tricalcium Phosphat (β-TCP) Teilchen und bovinen Kollagen Typ1 (C) (β-TCP/C-Schaum) und 2) β-TCP-Festplatten. Hier wir illustrieren Biokompatibilität testen diese Biomaterialien mit primären Osteoblasten (OB) und Osteoklasten (OC) assays, eine in Vivo Modell von Knochen zu reparieren, eine immunologische Bewertung bestehend aus in-vitro- Vermehrung der T-Lymphozyten und Produktion von Zytokinen und in Vivo Immunogenität und Allergenität, wie bereits berichtet13.

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Protocol

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Die Verfahren wurden mit BALB/c Mäusen nach allen Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren des Bundesministeriums für Bildung, Wissenschaft und Forschung getan und wurden genehmigt vom Ausschuss für die Ethik des Bundesministerium für Bildung, Wissenschaft und Forschung.

1. primäre Maustaste OB Kultur

  1. OB Isolierung von Neugeborenen Maus Calvaria mit enzymatischen Verdauung
    1. Einschläfern Sie 1 – 2 Tage alten neugeborenen Welpen (insgesamt 60) durch Enthauptung und legen Sie die Köpfe in einer Petrischale mit sterilem 1 x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS).
    2. Halten Sie den Kopf durch den Nacken, und schneiden Sie die Haut mit einer sterilen Schere. Die Calvarium durch piercing es einzuschneiden (ca. 0,1-0,3 mm) mit einer Schere, die dann unter den Calvarium am Hinterkopf bei der Schädelbasis eingefügt und schneiden Sie entlang der calvarial Kante seitlich von hinten nach vorne über die Ohren und dann Abov e der Nasenrücken (Abbildung 1).
    3. Inkubieren Sie seziert Calvaria mit 8 mL sterilisiert Verdauung Filterlösung (300 Einheiten/mL Kollagenase Typ IV und 2.14 Einheiten/mL Dispase II in α-minimale wesentliche Medium (α-MEM) aufgelöst) in einem 50 mL konische Röhrchen bei 37 ° C für 10 min in ein Schütteln Inkubator an 200 Shakes / min.
    4. Verwerfen Sie den erste überstand und wiederholen Sie drei Mal mit 8 mL Aufschlusslösung Verdauung. Den Überstand enthält die Zellen nach jedem Schritt der Verdauung zu sammeln und eine 50 mL konische Rohr hinzufügen. Speichern Sie die 50 mL konische Rohr mit den Zellen in ein Eis-Wasserbad, bis die Verdauung (ca. 40 min) abgeschlossen ist.
    5. Die Zellen bei 300 X g für 5 min bei 4 ° C zentrifugiert, Aspirieren des Überstands (mit einer Pasteurpipette an eine Vakuumpumpe angeschlossen) und Aufschwemmen in 40 mL Knochen Wachstumsmedium (BGM) mit α-MEM mit 10 % Hitze-inaktivierten fetalen bovine Serum (FBS) und 1 % Penicillin-Streptomycin-Lösung. Fügen Sie 10 mL Zellsuspension 4 Gewebekultur Platten (10 cm).
    6. Kulturzellen Sie bei 37 ° C und 5 % CO2 bis zum Zusammenfluss (2 – 3 Tage).
    7. Am Zusammenfluss aspirieren Sie das alte Medium und waschen Sie die Gewebekultur Platten einmal mit 1 X PBS (37 ° C). Dann Aspirieren der PBS und 2 mL 1 X Trypsin Lösung mit 0,5 % Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA) auf jede 10 cm Gewebekultur Platte.
    8. Inkubieren Sie 4 Kultur Platten bei 37 ° C und 5 % CO2 für 5 min und überprüfen Sie dann die Platten mit einem inversen Licht Mikroskop um sicherzustellen, dass die Zellen aus dem Kunststoff gelöst werden. Übertragen Sie dann alle Zellsuspensionen (insgesamt 8 mL) auf ein 50 mL konische Röhrchen mit 10 mL frisches BGM. Jede Platte mit 5 mL frischem BGM und Übertragung auf die gleichen 50 mL konische Rohr zu waschen.
    9. Die Zellen bei 300 X g für 5 min bei 4 ° C zentrifugiert, Aspirieren überstand und Aufschwemmen der Zellen in 16 mL frische BGM. Bereiten Sie 16 neue 10 cm Gewebekultur Platten (splitting 1:4) mit 9 mL BGM vor. Fügen Sie 1 mL Zellsuspension auf jede Platte.
    10. Wiederholen Sie die Schritte 1.1.6. bis 1.1.8.
    11. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 X g für 5 min bei 4 ° C, Aspirieren des Überstands und in 10 mL frisches BGM aufzuwirbeln. Zählen der Zellen und die Zellkonzentration zu berechnen.
      Hinweis: Diese Prozedur generiert ca. 7,5-8,3 x 105 Zellen/Pup.
    12. 300 X g für 5 min bei 4 ° C Zentrifugieren, überstand Aspirieren und Aufschwemmen im eiskalten Medium mit 10 % Dimethyl Sulfoxid (DMSO), 40 % α-MEM und 50 % FBS. Übertragen Sie 1,5 mL Zellsuspension auf 2 mL Cryovials für insgesamt 2 x 106 Zellen pro Vial.
    13. Flash Einfrieren in flüssigem Stickstoff für die langfristige Lagerung in flüssigem Stickstoff-Tank die Fläschchen. Verwenden Sie die Zellen innerhalb eines Jahres, um volle Funktionalität zu gewährleisten. Verwenden Sie diese primäre OBs für die Bewertung der Verbreitung (Schritt 1.2), Differenzierung (ALP-Assays: Schritt 1.4., 1,5.) und Mineralisierung (Schritt 1.6.) im Beisein von Biomaterialien. Verwenden Sie diese Zellen für die Reifung der Bone-Marrow-derived OC Vorstufen in Kokultur (Schritt 2.3).
  2. OB Verbreitung assay
    1. Inkubieren Sie 14 mm Durchmesser β-TCP-Festplatten in 1 mL des BGM in einer 24-Well Aussetzung Kultur Platte bei 37 ° C und 5 % CO2 für 24 h vor dem primären OBS. Verwendung standard Gewebekultur Platten für Steuerelemente hinzufügen und Aussetzung Kultur Platten für die Biomaterial zu Proben vorab vermeiden Sie Zellhaftung auf den Kunststoff.
    2. Aspirieren Sie Vorinkubation Medium und dann aufzuwirbeln Sie primäre Maustaste OBs in BGM. Fügen Sie 4,4 x 104 OBs/cm2 auf den Pre-inkubierten β-TCP-Datenträgern in einer 24-Well-Federung-Kultur-Platte und für die Kontrollgruppe in einer 24-Well-Zellkultur-Platte (1 mL/Na). OBs werden der Gewebekultur-Platte oder das Biomaterial beimessen.
    3. 14 Tage bei 37 ° C und 5 % CO2inkubieren. Während der Inkubationszeit ändern Sie das Medium alle 2 – 3 Tage und 1 mL frisch BGM in jede Vertiefung.
    4. Um zu beurteilen OB Verbreitung, übertragen Sie die β-TCP-Datenträger an den Tagen 7 und 14 zum neuer Brunnen für die Signale aus den Zellen gewachsen auf dem Fahrwerk Kultur Teller ausschließen
    5. Aspirieren Sie das alte Medium, fügen Sie 0,5 mL BGM (37 ° C) und inkubieren Sie die Kultur-Platten für 30 min bei 37 ° C und 5 % CO2. Fügen Sie dann 55 µL 10 x Cell Proliferation Reagenz (01:10 Verdünnung) direkt in die Kultur gut. Bereiten Sie für Zuschnitte drei Brunnen mit 0,5 mL BGM und 55 µL 10 X Cell Proliferation Reagenz. Inkubieren Sie alle Platten für 30 min bei 37 ° C und 5 % CO2.
    6. Zurückziehen und 150 µL des Überstands von jedem Bohrloch in einer 96-Well schwarze Platte übertragen und lesen Fluoreszenz mit Erregung bei 560 nm und Emission bei 590 nm. Subtrahieren Sie die leere Lesungen aus den Probe-Lesungen.
  3. OB Differenzierung und Mineralisierung assays
    1. Pre-inkubieren Sie 14 mm Durchmesser β-TCP-Festplatten in 1 mL des BGM in einer 24-Well Aussetzung Kultur Platte bei 37 ° C und 5 % CO2 für 24 h vor dem Hinzufügen der OBS. Verwendung standard Gewebekultur Platten für Steuerelemente und Aussetzung Kultur Platten für die Biomaterial Proben zu vermeiden Zellhaftung auf den Kunststoff.
    2. Aspirieren Sie Vorinkubation Medium und dann aufzuwirbeln Sie primäre Maustaste OBs in BGM. Fügen Sie 8,8 x 104 OBs/cm2 auf den Pre-inkubierten β-TCP-Datenträgern in einer 24-Well-Federung-Kultur-Platte und für die Kontrollgruppe in einer 24-Well-Zellkultur-Platte (1 mL/Na). OBs werden der Gewebekultur-Platte oder der Biomaterial-Probe beimessen.
    3. Ersetzen Sie die BGM mit 1 mL osteogene Mineralisierung Mittel (MM) mit BGM, 50 µg/mL Ascorbinsäure und 5 mM β-Glycerophosphat 24 h nach der Zugabe der OBs und inkubieren Sie für 14 Tage bei 37 ° C und 5 % CO2. Ändern Sie das Medium alle 2 – 3 Tage mit 1 mL frisch zubereitete MM in jede Vertiefung.
  4. OB Differenzierung von Aktivität der alkalischen Phosphatase (ALP) von Zelle Lysates bewertet
    1. Zur Messung der ALP Aktivität am 7. Tag nach der Zugabe von MM aspirieren Sie das Kulturmedium aus dem Brunnen und dann mit 1 mL sterilen 1 X PBS (37 ° C) waschen. Aspirieren Sie sorgfältig die PBS ermöglichen die angeschlossenen Zellen bleiben auf der Gewebekultur Kunststoff oder Biomaterial und fixieren die Platten bei-80 ° C.
    2. Nach 24 Stunden (oder bis zu 2 Wochen), tauen die Steuerplatte Gewebekultur und Biomaterial Aussetzung Kultur Platte bei Raumtemperatur (RT) OB Lyse vorbereiten. Übertragen Sie für die Proben Biomaterial die β-TCP-Datenträger in eine neue Aufhängung Kultur Platte auszuschließende die Zellen an der Platte befestigt. Beide Platten 75 µL pro Bohrloch von 1 x Zelle Lysis Puffer hinzufügen. Schütteln Sie die Platten für 5 min auf einem Boston-Shaker mit 400 Shakes/min.
    3. Übertragen Sie die Zelle lysate in eine 0,5 mL Microcentrifuge Schlauch und Zentrifuge bei 300 X g für 6 min bei RT, Ablagerungen zu entfernen. Eine schwarze 96-Well Platte 50 µL der Probe Zelle lysate überstand hinzu, und fügen Sie dann 50 µL einer Lösung bestehend aus 200 µM 6,8-Difluoro-4-Methylumbelliferyl-Phosphat (DiFMUP) Fluorogenic Substrat aufgelöst in 2 x ALP-Puffer (pH 10) pro Bohrloch. Richten Sie zwei leere Brunnen mit 100 µL einer 1:1-Lösung, 1 X Zelle Lysis Puffer und 2 X ALP Puffer enthält.
    4. Bereiten Sie 8 Referenzstandards mit 100 μl/Well mit der 6,8-difluoro-7-hydroxy-4-methylcoumarin (DiFMU) zwischen 0,5 bis 200 μM, aufgelöst in 1:1 Lösung mit 1 X Zelle Lysis Puffer und 2 X-ALP-Puffer auf eine standard-Referenz-Kurve zu erzeugen.
    5. Die schwarze Platte bei 37 ° C für 15 min inkubieren und lesen Sie dann die Fluoreszenz der Erregung bei 358 nm mit Emission bei 455 nm. Subtrahieren Sie die leere Lesungen aus den Referenzstandards und Probe Lesungen.
    6. Die ALP-Enzym-Aktivität aus der Zelle Lysates auf den Gesamtbetrag des Proteins mit einer kolorimetrischen Assay für die Proteinkonzentration zu normalisieren. Bereiten Sie Rinderserumalbumin (BSA) Protein Referenzstandards in einem Bereich von 0,05 bis 2,5 µg/µL aufgelöst in 1 x Zelle Lysis Puffer eine Standardkurve zu generieren.
    7. Bereiten Sie die Probe Zelle Lysates und BSA Proteinstandards in Duplikate. 5 µL der Probenzelle lysate oder 5 µL des BSA Protein standard in einer 96-Well-Platte hinzufügen und fügen Sie dann 25 µL des Reagenz A' und 200 µL des Reagenz b Set up zwei leere Brunnen mit 5 µL 1 x Zelle Lysis Puffer. Die Platten bei RT für 15 min inkubieren und lesen Sie dann die Extinktion bei 690 nm. Subtrahieren Sie die leere Lesungen aus den Referenzstandards und Probe Lesungen.
  5. OB Differenzierung anhand der Färbung ALP in der Zellkultur
    1. ALP in kultivierten OBs am 7. Tag nach der Zugabe von MM auf eine Steuerungsplatine Gewebekultur und Biomaterial in einer Suspension Kultur Platte zu beflecken.
    2. Aspirieren Sie das Kulturmedium aus den Brunnen, und ersetzen Sie es mit 0,5 mL 1 X PBS (37 ° C). Aspirieren der PBS und die Zellen zu beheben, indem sie in 0,5 mL 10 % gepuffert Formalin bei RT für 1 min Inkubation.
    3. Aspirieren Sie die 10 % gepuffert Formalin mit einem Einweg-pipettieren und 0,5 mL Waschpuffer (0,05 % Tween20 mit 1 X PBS-Puffer).
    4. Lösen Sie eine 5-bromo-4-chloro-3-indolyl Phosphat/Nitro blau Tetrazoliumsalz (BCIP/NBT) Substrat Tablette in 10 mL Reinstwasser und Wirbel bis vollständig gelöst. Die Lösung muss vor Licht geschützt werden und innerhalb von 2 h verwendet.
    5. Aspirieren der Waschpuffer und ersetzen mit 0,5 mL Substratlösung BCIP/NBT und inkubieren Sie der Platte bei RT in der Dunkelheit für 10 min. Absaugen der Färbelösung und mit 0,5 mL Waschpuffer.
    6. Übertragen Sie die gefärbten β-TCP-Datenträger zu, in einen neuen Brunnen und Scannen Sie die ALP-gefärbten Platten mit einer konventionellen Flachbett-Scanner zu Rekord ALP Färbung.
  6. OB Mineralisierung durch Färbung mit Alizarin Rot S (ARS) bewertet
    1. Aspirieren Sie das Kulturmedium aus den Brunnen mit primären OBs 14 Tage nach der Zugabe von MM und spülen Sie zweimal mit 0,5 mL 1 X PBS bei RT Absaugen der PBS und beheben Sie die Zellen durch Zugabe von 0,5 mL der 10 % Formalin-Lösung für 10 min bei RT gepuffert.
    2. Aspirieren Sie die 10 % gepuffert Formalin mit einem Einweg-pipettieren und zweimal mit 0,5 mL hochreines Wasser waschen.
    3. Die festen OBs fügen Sie hinzu, 0,25 mL 40 mM ARS Färbelösung (pH 4,2) in Reinstwasser gelöst und die Platte bei RT für 10 min auf einem Boston-Shaker mit 100 Shakes/min inkubieren.
    4. Aspirieren Sie der Färbelösung mit einem Einweg-pipettieren und mit 1 mL hochreines Wasser abspülen. Wiederholen Sie diesen Schritt 5 – 10 Mal zu unspezifischen entfernen Flecken.
      Hinweis: Der Spüllösung sollte ohne Farbe.
    5. Anzusaugen Sie hochreine Wasser und 1 mL kaltem PBS. Inkubieren Sie die Platte bei RT für 10 min auf einem Boston-Shaker mit 100 Shakes/min.
    6. Aspirieren der PBS, übertragen die gefärbten β-TCP-Datenträger zu einem neuen Brunnen und Scannen Sie die Platten mit einem Flachbettscanner, Rekord Mineralisierung.
    7. Geben Sie 0,25 mL 10 % Cetylpyridinium Chlorid-Lösung hinzu und inkubieren Sie die Platte bei RT für 15 min auf einem Boston-Shaker mit 100 Shakes/min den ARS-Farbstoff extrahieren.
    8. Übertragen Sie die Überstände auf eine 1,5 mL-Tube und Zentrifuge bei 17.000 X g für 5 min bei RT
    9. Die Extrakte mit einem Verdünnungsverhältnis von 01:10 – 01:20 10 % Cetylpyridinium Chlorid-Lösung hinzu, und fügen Sie die Proben (300 µL) in eine 96-Well-Platte mit zwei leeren Brunnen mit nur 10 % Cetylpyridinium Chlorid.
    10. Bereiten Sie 7 ARS Referenzstandards von 4 bis 400 µM durch Verdünnung der 40 mM ARS Färbelösung (pH 4,2) mit 10 % Cetylpyridinium Chlorid-Lösung um eine Standardkurve zu generieren.
    11. Die 96-Well-Platte 300 µL der Referenzstandard in Duplikate hinzufügen.
    12. Lesen Sie die Absorption der Proben, Rohlinge, und verweisen Sie Standards bei 520 nm.
    13. Subtrahieren Sie die leere Lesungen aus den Referenzstandards und Probe Lesungen.

(2) Maus OB OC Kokultur Reife OCs ableiten

  1. Aufbereitung und Sterilisation der bovinen kortikalen Knochen Scheiben
    1. Reinigen Sie Segmente des Knochens aus dem umgebenden Gewebe zu und entfernen Sie den trabekulären Knochen und Knochenmark.
    2. Trocknen Sie die Knochen bei 50 ° C für 24 h.
    3. Die Knochen in kleinere Stücke schneiden und in Scheiben (ca. 300-350 µm dick) schneiden mit einer niedrigen Geschwindigkeit mit einer Diamant-Trennscheibe sah.
    4. Quadratische Platten (1 cm2) geschnitten Sie 300-350 µm Scheiben.
    5. Um die Knochen-Festplatten (1 cm2) zu reinigen, setzen Sie sie in eine verschließbare Glasflasche und mit destilliertem Wasser füllen. Die gefüllten Glases in ein Ultraschallbad zu übertragen und beschallen für 5 min. Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal.
    6. Das destillierte Wasser abgießen, 70 % igem Ethanol hinzufügen und für 5 min beschallen.
    7. Gießen Sie das 70 % Ethanol und mit 100 % Ethanol zu ersetzen.
      Hinweis: Bewahren Sie die Knochen Scheiben in 100 % igem Ethanol bei 4 ° C für bis zu 4 Wochen.
    8. Die Knochen-Scheiben mit UV-Licht für 15 min auf jeder Seite unter sterilen Bedingungen zu bestrahlen. Speichern Sie die sterilisierten Knochen Scheiben in einer sterilen Kultur-Platte bei RT bis zur weiteren Verwendung.
  2. Isolierung von Knochenmark OC Vorstufen
    1. Einschläfern Sie naive 8 – 12 Wochen alte BALB/c Mäuse mit einer intraperitonealen (i.p.) Injektion einer Lösung von 200 mg/kg Ketamin und 24 mg/kg Xylazin.
    2. Isolieren der Knochenmark-OC-Vorläufern aus dem Maus Oberschenkelknochen und Tibiae.
    3. Die Beine mit einer sterilen Schere an der engsten Stelle am Körper am Hüftgelenk, schneiden Sie die Glieder auf die Knie und Knöchel Gelenke entfernen Sie und das Weichgewebe mit sterilen Skalpell und Pinzette. Schneiden Sie die Epiphysen. Spülen Sie und hängen Sie das Knochenmark mit 1mL BGM in eine sterile Petrischale 6 cm mit einem 27G Nadel eine 1mL Spritze um eine Zellsuspension zu erhalten.
    4. Eine 50 mL konische Rohr die Zellsuspension hinzu, waschen Sie die 6 cm Petrischale mit 5 mL BGM und Übertragung auf die gleichen 50 mL konische Rohr zu. Zentrifuge bei 350 X g bei 4 ° C für 5 min. Aufschwemmen der Zellen in OC Differenzierung Medium (DM) mit BGM, 1 nM 1,25-(OH)2-Vitamin D3 und 1 µM Prostaglandin E2 (1 mL/Na).
      Hinweis: Ein BALB/c Maus bietet OC Grundstoffe in ausreichender Zahl für eine Kultur 24-Well-Platte.
  3. Vorbereitung der Maus OB OC Kokultur mit biomaterial
    1. Pre-inkubieren Sie 14 mm Durchmesser β-TCP-Disketten oder boviner Knochen Scheiben (1 cm2) in 1 mL des BGM in einer 24-Well Aussetzung Kultur Platte bei 37 ° C und 5 % CO2 für 24 h vor dem Hinzufügen der Zellen.
      Hinweis: Boviner Knochen Scheiben sind eine Kontrollgruppe physiologischen Substrat für das Studium OC Differenzierung im Beisein von Biomaterialien.
    2. Fügen Sie 8,8 x 104 Zellen/cm2 der primären OBs angehalten in BGM auf Biomaterialien oder der Kontrolle Knochen in einer 24-Well-Federung-Kultur-Platte oder an einer 24-Well-Zellkultur-Platte hinzu. Inkubation bei 37 ° C und 5 % CO2 für 24 h.
      Hinweis: OBs zuordnen der Kunststoff oder das Biomaterial oder Rind Knochen.
    3. Füge frisch isolierte Knochenmark OC Vorläufer der 24 h primäre OBs und Kultur bei 37 ° C und 5 % CO2 für 5 Tage kultiviert. Ersetzen Sie das Medium mit frisch zubereiteten OC DM jeden zweiten Tag. Dann färben Sie OCs für Tartrat-resistente saure Phosphatase (TRAP), OC Differenzierung zu bewerten.
  4. OC-Differenzierung von TRAP Färbung bewertet
    1. Zur Charakterisierung von Reifen mehrkernigen OCs, gewonnen aus Schritt 2.3.3, aspirieren Sie das Kulturmedium aus Gewebekultur Steuerplatte Biomaterial Aussetzung Kultur Platte und 1 mL 1 X PBS (37 ° C). Aspirieren der PBS und die Zellen zu beheben, indem sie in 1 mL 10 % gepuffert Formalin-Lösung bei RT für 10 min Inkubation.
    2. Aspirieren Sie die 10 % gepuffert Formalin-Lösung mit einem Einweg-pipettieren und fügen Sie 1 mL 1 X PBS am RT. Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal, dann Aspirieren der PBS, mit 1 mL der TRAP-Puffer (pH 5) ersetzen und die Platten bei 37 ° C für 30 min inkubieren.
    3. Aspirieren des TRAP-Puffers und 1 mL Aceton und 100 % Ethanol 1:1. Inkubieren Sie die Platte bei RT, 30 s. schnell Aspirat Aceton-Ethanol-Lösung mit einem Einweg-pipettieren und vollständig trocknen der Platten bei RT
    4. Bereiten Sie für die Falle Färbelösung eine 10 mg/mL Naphthol-AS-MX Phosphat-Stammlösung in N, N-Dimethylformamid lösen 0,6 mg/mL schnell rot violett Salz im Falle Puffer und 0,1 mL der Stammlösung Naphthol-AS-MX Phosphat zu 10 mL schnell rot violett Salz hinzufügen im Falle Puffer.
    5. Fügen Sie 1 mL Färbelösung TRAP und inkubieren Sie die Platte bei 37 ° C für 10 min, dann aspirieren Sie die Falle Färbelösung, und fügen Sie 1 mL Reinstwasser, die Reaktion zu stoppen.
    6. Übertragen der β-TCP-Festplatten und boviner Knochen Scheiben nach dem Färben in einen neuen Brunnen, rot gefärbten OCs mit einem Lichtmikroskop beobachten (Vergrößerung: 10 X) und Auflisten von TRAP + Reifen OCs mit drei oder mehr Kernen.

3. kritische-Size-Maus-Calvarial defekt-Modell

  1. Buprenorphin 0,1 mg/kg subkutan zu injizieren (s.c.) in 8 - Wochen alten BALB/c Mäuse für Analgesie.
  2. Betäuben Sie die Mäuse mit einer Mischung von 100 mg/kg Ketamin und 5 mg/kg Xylazin i.p zu, fügen Sie ein Gel oder Salbe für die Augen feucht zu halten und platzieren Sie den Mauszeiger auf eine Heizplatte bei 37 ° C während des gesamten Verfahrens um Unterkühlung zu verhindern. Bewerten Sie die Tiefe der Narkose, indem Zeh und Tail Prise.
  3. Rasieren Sie das Fell auf der Oberseite des Kopfes zwischen den Ohren zu und reinigen Sie die Oberfläche mit 7,5 % Povidon-Jod-Lösung und 70 % Ethanol.
  4. Machen Sie einen Mittellinie sagittaler Schnitt auf der Oberseite der Schädel zwischen den Ohren mit einem sterilen Skalpell zu entlarven die Calvarium und das Bindegewebe der Schädeldecke oberhalb der rechten parietalen Knochen durch Schaben mit einem Skalpell entfernen.
  5. Erstellen Sie einen kritische Größe defekt im rechten parietalen Knochen mit einer sterilen dental Trephine mit einem Durchmesser von 4 mm (2000 u/min) unter ständiger Bewässerung mit normalen Kochsalzlösung zu verbuchen der rechten parietalen Knochen und Schnitt durch die Ectocortex und einige Endocortex.
  6. Zur Vermeidung von Schäden an der Dura Mater benutzen Sie einen kleine periostalen Aufzug zu durchbrechen die restlichen Endocortex, sorgfältig die calvarial Knochen heben und mit einer Pinzette entfernen. Der daraus resultierende Mangel sollte Rundschreiben und etwa 3,5 mm Durchmesser.
  7. Füllen Sie den calvarial Defekt mit eingeweichter (sterile 1 X PBS bei RT) β-TCP/C Schaum mit Pinzette.
  8. Bereiten Sie die entsprechende Anzahl an Alter abgestimmt, Sham Negativkontrollen mit einem leeren defekt.
  9. Um das Biomaterial in Position zu halten, setzen Sie 0,5 µL Gewebe Klebstoff am Rande des Mangels an zwei gegenüberliegenden Punkten.
  10. Schließen Sie die Haut mit einer nicht resorbierbaren Naht.
  11. Reinigen Sie alle chirurgischen Instrumente mit kalten Sterilisationsmittel zu sterile Bedingungen zu erhalten, bevor Sie die nächste Operation auf einem narkotisierten Maus durchführen.
  12. Für die postoperative Behandlung Platziere die Tiere auf eine trockene und saubere Heizplatte bei 37 ° C im Bereich Chirurgie für angemessene Überwachung während der Erholungsphase. Überwachen Sie die Atemfrequenz, Körpertemperatur und Farbe der Schleimhäute und Augen alle 10 Minuten, bis sie aufwachen.
  13. Übertragen Sie die betriebenen bewusste Mäuse in einen Käfig mit Futter und Wasser getrennt von den anderen Tieren bis zur endgültigen Genesung. Injizieren von Buprenorphin 0,1 mg/kg s.c. für postoperative Schmerztherapie zweimal pro Tag für 72 h Rückkehr vollständig erholt Mäuse in ihren Käfigen.
  14. Um die Wirksamkeit der Biowerkstoff einschläfern Sie Mäuse i.p mit einer Lösung von 200 mg/kg Ketamin und 24 mg/kg Xylazin.
  15. Enthaupten Sie bei 8 – 12 Wochen nach der Implantation euthanasierten Maus mit einer scharfen Schere.
  16. Update der enthaupteten Maus-Kopf in 30 mL von 4,5 % gepuffert Formalin-Lösung für 1-2 Wochen volle Penetration das Fixativ in das Gewebe zu garantieren.
  17. Übertragen Sie die Köpfe in 70 % igem Ethanol für die langfristige Lagerung bei 4 ° C bis zu einem Jahr.
  18. Verwendung Mikro berechnet Tomographie (MicroCT) oder standardisierte undecalcified histologischen Techniken zur Knochenregeneration zu bewerten. Es ist möglich, MicroCT auf Post-mortem Proben mit hoher Auflösung scannen verwenden (90 kV, 4 min) in 2D und 3D sagittalen und frontalen Ebenen.
  19. Für undecalcified Histologie Entwässern Sie die Köpfe in aufsteigender Noten von Ethanol und in Glykol Methylmethacrylat einbetten.
  20. Schneiden Sie Glykol Methylmethacrylat eingebettet Blöcke mit einer Diamant-Säge und Schleifen Sie die Abschnitten bis zu einer Dicke von ca. 80-100 µm.
  21. Bewerten Sie Levai Laczko gebeizt Knochen Abschnitte um neue Knochen Bildung14zu identifizieren.

4. in-vitro- Immunantworten

  1. Naive 8 - Wochen alten BALB/c Mäuse i.p mit einer Lösung von 200 mg/kg Ketamin und 24 mg/kg Xylazin einschläfern.
  2. Platzieren Sie den Mauszeiger auf der rechten Seite, Rasieren Sie das Fell auf der linken Seite zu und reinigen Sie die Haut über der linken Seite des Bauches mit 70 % Ethanol.
  3. Machen Sie einen 10 mm langen und 1 mm tiefen Einschnitt in die Haut der Maus auf der linken Seite nach hinten nach dem Rippen über den Magen mit einer sterilen Schere.
  4. Öffnen Sie die Haut und setzen Sie dann das Bauchfell. Machen Sie eine 10 mm lang und weniger als 1 mm tiefen Einschnitt in das Bauchfell mit einer Schere unter sterilen Bedingungen.
  5. Drücken Sie den Magen nach proximal, die Milz verfügbar zu machen.
  6. Halten Sie die Milz sanft mit der sterilen Pinzette und entfernen Sie sie durch das Schneiden des Gewebes und Schiffe, darunter befestigt.
  7. Legen Sie die intakte Milz in ein 50 mL-Tube mit 10 mL kalten 1 x sterile PBS.
  8. Bereiten Sie ein einzelnes Zellsuspension durch Zerkleinern der Milz mit 2 sterilen Pinzette oder 2 sterilen Objektträger vor.
  9. Entfernen Sie Schmutz, indem man es durch eine sterile 40 µm Zelle Sieb mit kalten 1 X PBS mit dem Kolben eine 1 mL Spritze.
  10. Die einzigen Zellsuspension bei 300 X g für 10 min bei 4 ° C in einem 50 mL konische Röhrchen Zentrifugieren, Aspirieren und überstand verwerfen. Dann erneut die Zelle Pellet in 5 mL Erythrozyten (RBC) Lysis Puffer.
  11. Inkubieren Sie die Zellsuspension für 14 min bei RT und stoppen Sie die Reaktion zu, indem man 45 mL Roswell Park Memorial Institute (RPMI) Medium.
  12. Die Zellen nach der Lyse der Zelle bei 300 X g für 10 min bei 4 ° C zentrifugiert und verwerfen Sie den überstand.
  13. Aufschwemmen Splenocyten in RPMI Medium mit 10 % inaktivierten Hitze-FBS, 1 % Penicillin-Streptomycin Lösung 0,1 % Gentamicin, 0,2 % ß-Mercaptoethanol und 1 % nicht-essentiellen Aminosäuren.
  14. Pre-inkubieren Sie β-TCP/C Schaum in einer 96-Well sterilen Kultur-Platte mit RPMI Medium für 24 h bei 37 ° C und 5 % CO2 vor der Aussaat der Zelle.
  15. Fügen Sie Splenocyten am betitelten zahlen, zB., 1,25 x 105, 2,5 x 105 und 5 x 105/well nach Wells in einer Gewebekultur 96-Well-Platte mit RPMI Medium und Zusatzstoffe, mit oder ohne die Pre inkubierten β-TCP/C-Schaum.
  16. Fügen Sie 10 µg/mL Concanavalin (Con A) im Medium für eine Gesamtmenge von 100 µL/Well in die entsprechenden Vertiefungen aufgelöst und dann Inkubation bei 37 ° C und 5 % CO2 für 72 h.
  17. Zellproliferation mit einem Bromodeoxyuridine (BrdU) Assay zu messen. Fügen Sie 10 µL/Well BrdU Kennzeichnung Lösung bei 48 h von Zellkultur und inkubieren Sie die Platte für weitere 24 h.
  18. Mit 72 h den Überstand zu sammeln und bei-20 ° C bis zur weiteren Verwendung speichern.
  19. Jedes gut 200 µL/Well der Fixierung-Lösung hinzu und dann für 30 min bei RT Aspirat inkubieren Sie Fixierung Lösung. Fügen Sie 100 µL/Well von der Anti-BrdU Antikörper Arbeitslösung und 90 min inkubieren.
  20. Aspirieren Sie der Antikörperlösung, spülen Sie die Brunnen dreimal mit 200 – 300 µL/Well der Waschlösung und entfernen Sie die Waschlösung.
  21. 100 µL Substratlösung hinzufügen und 3 – 10 min bei RT inkubieren, dann messen Sie die Extinktion bei 450 nm.
  22. Interleukin-1β (IL-1β), Interleukin-2 (IL-2), Interleukin-4 (IL-4) und Interferon-γ (IFN-γ) in den gesammelten Überstände mit einem standard ELISA zu messen.

5. hohe Durchsatz intraperitoneale Modell

  1. Betäuben Sie weibliche 6-8-Wochen alten BALB/c Mäuse mit einer Mischung von 100 mg/kg Ketamin und 5 mg/kg Xylazin i.p zu und fügen Sie ein Gel oder Salbe für die Augen feucht zu halten und platzieren Sie den Mauszeiger auf eine Heizplatte bei 37 ° C während des gesamten Verfahrens um Unterkühlung zu verhindern. Bewerten Sie die Tiefe der Narkose, indem Zeh und Tail Prise.
  2. Das Bauch-Fell rasieren und mit 7,5 % Povidon-Jod-Lösung und 70 %-Ethanol reinigen.
  3. Ein 8 mm langen Mittellinie Einschnitt durch die Haut entlang der Linea Alba. Machen Sie einen kleinen Schnitt in das Bauchfell mit einem Skalpell.
  4. Sterile PBS Ort getränkt β-TCP/C Schaum Transplantate (2 x 2 x 2 mm-3) in der Bauchhöhle oder ohne Zusatz von Materialien für die Alter abgestimmt Sham-Kontroll-Mäusen.
  5. Naht das Peritoneum und die Haut mit resorbierbaren und nicht resorbierbaren Naht, beziehungsweise.
  6. Reinigen Sie alle chirurgischen Instrumente mit kalten Sterilisationsmittel zu sterile Bedingungen zu erhalten, bevor Sie die nächste Operation auf einem narkotisierten Maus durchführen.
  7. Für die postoperative Behandlung Platziere die Tiere auf eine trockene und saubere Heizplatte bei 37 ° C im Bereich Chirurgie für angemessene Überwachung während der Erholungsphase. Überwachen Sie die Atemfrequenz, Körpertemperatur und Farbe der Schleimhäute und Augen alle 10 Minuten, bis sie aufwachen.
  8. Übertragen Sie die betriebenen bewusste Mäuse in einen Käfig mit Futter und Wasser getrennt von den anderen Tieren bis zur endgültigen Genesung. Zurück vollständig wiederhergestellten Mäuse in ihren Käfigen.
    Hinweis: Dieses Verfahren führt zu minimalen Schmerzen. Postoperative Schmerztherapie ist in der Regel nicht notwendig. Wenn die operierten Tiere zeigen Anzeichen von Schmerzen, 0,1 mg/kg Buprenorphin injizieren s.c. oder einem anderen geeigneten Analgetikum zur Schmerzlinderung.
  9. Einschläfern der Mäuse 7 Tage nach der Implantation, mit einer Lösung von 200 mg/kg Ketamin und 24 mg/kg Xylazin i.p.
  10. 7 Tage nach der Implantation Lavage der Bauchhöhle mit einer 1 mL Spritze mit einer Nadel 25 G für eine Gesamtmenge von 3 mL kaltem PBS durch Gedrückthalten der Maus-Kopf und einsetzen der Nadel in der linken unteren abdominalen Quadranten und Streben nach proximal.
    Hinweis: Die peritoneale Flüssigkeit sollte frei von Erythrozyten sein.
  11. Zentrifugieren der peritoneal Lavage-Flüssigkeit bei 300 X g für 5 min bei 4 ° C und sammeln die peritoneale Flüssigkeit bei-20 ° C für ELISA Messungen der Zytokine IL-1β, IL-2 und IL-4 zu speichern.
  12. Den Überstand abgesaugt, Aufschwemmen der Zelle Pellet in 1 mL PBS und zählen die peritonealen Zellen verwenden Trypan blau auf einem Hemocytometer.
  13. Cytocentrifuge der Zellsuspension auf 5 x 105 Zellen auf Glas-Objektträger, können die Folien trocknen und für eine differenzierte Zellzahl Flecken.
  14. Mit einem Lichtmikroskop, zählen ein Minimum von 300 Zellen insgesamt und Makrophagen, Eosinophilen, neutrophilen Granulozyten und Lymphozyten unterscheiden.

6. subchronische subkutane Modell

  1. Betäuben Sie weibliche 6 – 8 Wochen alten BALB/c Mäuse mit einer Mischung von 100 mg/kg Ketamin und 5 mg/kg Xylazin i.p zu, fügen Sie Gel oder Salbe für die Augen feucht zu halten und platzieren Sie den Mauszeiger auf eine Heizplatte bei 37 ° C während des gesamten Verfahrens um Unterkühlung zu verhindern. Bewerten Sie die Tiefe der Narkose, indem Zeh und Tail Prise.
  2. Platzieren Sie den Mauszeiger auf dem Rücken, das Bauch-Fell rasieren und rasierte reinigen mit 7,5 % Povidon-Jod-Lösung und 70 % Ethanol.
  3. Ein 8 mm langen Mittellinie Einschnitt durch die Haut entlang der Linea Alba des Bauches mit einem Skalpell und dann Implantat PBS getränkt Biomaterial (2 x 2 x 2 mm-3) unter die Haut oder fügen Sie keine Materialien für das Alter abgestimmt Sham-Kontroll-Mäusen.
  4. Naht der Haut mit einer nicht resorbierbaren Naht.
  5. Reinigen Sie alle chirurgischen Instrumente mit kalten Sterilisationsmittel zu sterile Bedingungen zu erhalten, bevor Sie die nächste Operation auf einem narkotisierten Maus durchführen.
  6. Für die postoperative Behandlung Platziere die Tiere auf eine trockene und saubere Heizplatte bei 37 ° C im Bereich Chirurgie für angemessene Überwachung während der Erholungsphase. Überwachen Sie die Atemfrequenz, Körpertemperatur und Farbe der Schleimhäute und Augen alle 10 Minuten, bis sie aufwachen.
  7. Übertragen Sie die betriebenen bewusste Mäuse in einen Käfig mit Futter und Wasser getrennt von den anderen Tieren bis zur endgültigen Genesung. Zurück vollständig wiederhergestellten Mäuse in ihren Käfigen.
    Hinweis: Dieses Verfahren führt zu minimalen Schmerzen. Postoperative Schmerztherapie ist in der Regel nicht notwendig. Wenn die operierten Tiere zeigen Anzeichen von Schmerzen, 0,1 mg/kg Buprenorphin injizieren s.c. oder eine andere geeignete Schmerzmittel.
  8. Wenn Sie bereit sind, den Implantationsort zu untersuchen, einschläfern Sie die Mäuse i.p mit einer Lösung von 200 mg/kg Ketamin und 24 mg/kg Xylazin.
  9. Acht Wochen nach der Implantation, Verbrauchsteuern Implantationsort mit umgebenden Gewebes (1 cm2).
  10. Fixieren Sie das Gewebe in 4,5 % gepuffert Formalin-Lösung über Nacht, in Paraffin eingebettet und in 4 µm Abschnitte schneiden.
  11. Fleck 4 µm Paraffin-eingebetteten Gewebeschnitten mit Hämatoxylin und Eosin (H & E) für Entzündungen oder Masson trichrome für Kollagen Ablagerung und Fibrose.

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Representative Results

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Um β-TCP für seine Wirksamkeit als Biomaterial für Knochen-Reparatur zu beurteilen, haben wir in Vitro und in Vivo screening-Verfahren verwendet. Erstens haben wir die OB-Antworten auf die β-TCP-Festplatten im Vergleich zu Grundlinie mittlere allein Kontrollen gemessen. Abbildung 2 zeigt OB Rentabilität als Reaktion auf β-TCP-Festplatten auf 7 bis 14 Tage der Kultur. Zellviabilität gemessen von metabolisch aktiven Zellen in der Kultur-Brunnen war das gleiche für OBs mit Medium in Gewebekultur Kunststoff sowie mit β-TCP-Scheiben darauf hinweist, dass dieses Biomaterial ist weder Verbesserung noch OB Verbreitung zu unterdrücken.

Um weiter die OBs zu bewerten, haben wir ALP Aktivität als Marker für die Differenzierung anhand qualitativer und quantitativer Ansätze gemessen. Abbildung 2 veranschaulicht ALP-Enzym-Aktivität in Kultur Brunnen nach 7 Tagen der Kultur. OBs in den Vertiefungen mit dem Medium allein hatte Grundlinie ALP Aktivität, optimale Mineralisierung Mittel (MM) OBs intensive ALP Färbung, ein hohes Maß an Differenzierung OB widerspiegelt. Im Gegensatz dazu vergoldete OBs auf β-TCP-Festplatten differenziert weniger als die OBs in MM inkubiert. In einem quantitativen Assay lag ALP Konzentration 77 % für die Brunnen mit MM verglichen mit dem Ausgangswert Medium allein, während ALP Konzentration 40 % niedriger in den Zellen kultiviert auf β-TCP-Festplatten im Vergleich zu MM Kontrollen war. Obwohl diese Ergebnisse, dass die Zellen gewachsen auf β-TCP-Festplatten weniger als solche mit optimalen Bedingungen aus Kunststoff mit MM unterschieden zeigen, unterschieden sie ausreichend auf Biomaterialien.

Eine weitere wichtige Funktion des OBs ist ihre Fähigkeit, Mineralisierung, induzieren die ist ein wesentlicher Schritt in der Knochenheilung. Wir gebeizt kultivierte OB Zellen mit ARS nach 14 Tagen und fand dass die Mineralisierung höher für MM-Steuerelemente im Vergleich zu OBs in Medium kultiviert, allein und zu β-TCP-Festplatten in Kultur Brunnen (Abbildung 2). Wenn wir die ARS-Konzentration gemessen, fanden wir, dass die MM-Kontrollen mehr als 45 % höher als der β-TCP-Gruppe waren. Diese Daten verdeutlichen, dass OBs auf Kunststoff in Anwesenheit von MM Reifen kultiviert, differenzieren und mineralisieren besser als jene mit mittlerer allein und auf β-TCP-Datenträgern.

Um festzustellen, wie OCs auf β-TCP-Festplatten reagieren, haben wir eine Kultivierung Technologie in der OBs mit dem Knochenmark OC Vorläufern der Nachuntersuchung der OC Morphologie Co kultiviert werden. OB-OC-Ko-Kulturen an 5 Tagen beobachtet und unterschieden sich erheblich zwischen den Zellen auf Kunststoff mit OC DM angebaut und die Zellen auf Knochen Scheiben und β-TCP angebaut. Auf Kunststoff der OCs waren groß und weit verbreitete während der OCs auf physiologische Substrate wurden kleinere, weniger ausgebreitet und unregelmäßig geformten (Abbildung 3). Um die OCs quantitate, wir aufgezählt TRAP + OCs und fand, dass es höhere Zahlen als mit β-TCP (1755 ± 21,41/cm2) im Vergleich zu Gewebekultur Kontrollen (1140 ± 15.71/cm2) und Knochen Scheiben (709 ± 59,69/cm2) inkubiert wurden darauf hindeutet erweiterte OC Differenzierung auf β-TCP-Festplatten (Abbildung 3).

Um eine handelsübliche β-TCP/C Schaum in Vivozu ermitteln, haben wir eine kritische Größe calvarial defekt-Modell bei Mäusen. Wir zeigen repräsentative histologische Abschnitte durch eine undecalcified histologische Technik mit Glykol Methylmethacrylat einbetten und Levai Laczko Färbung verarbeitet. MicroCT und Histologie können verwendet werden, um Knochenneubildung im Bereich defekt zu bewerten. Hier zeigen wir ein Beispiel mit histologischen Schnitten in Abbildung 4. Wenn der chirurgisch induzierten Knochendefekt (Schein) leer war, beobachteten wir eine dünne Schicht deckt den gesamten defekt, aber keine signifikante Knochenbildung war bei 12 Wochen Post-Vorgang bestätigen die kritische Größe der erzeugten Knochenbruch. Im Gegensatz dazu als Mangels β-TCP/C Schaum enthalten, gab es Reste der β-TCP/C Schaum umgeben von dichten Bindegewebe, darunter auch einige Blutgefäße und Entzündungszellen Überbrückung Bereich defekt ohne Beweise der Knochenbildung.

Um den Fremdkörper-Reaktion zu bewerten, beurteilt wir immunologische und allergische Reaktionen auf Biomaterialien, mit einer in-vitro- Assay. Abbildung 5 zeigt, dass wenn naive sPlenocytes mit Medium allein oder mit β-TCP/C Schaum inkubiert wurden, die naiv-Milzzellen nicht reagierte durch vermehren oder Produktion von IL-2, IL-4 und Zytokine IFN-γ. Im Gegensatz dazu enthält in ConA Kulturen, Zellproliferation und Produktion von Zytokinen mit Ausnahme von IL-1β erhöht. Zell-Reaktionen waren unberührt bei mit ConA und β-TCP/C Schaum gegenüber ConA allein darauf hinweist, dass β-TCP/C-Schaum weder erhöht noch verringert in-vitro- Antworten Co kultiviert.

Um festzustellen, ob β-TCP/C Schaum eine Immunantwort in Vivo induziert, implantierten wir es 1) intraperitoneal und entzündlichen Zelle zählt und Zytokin-Konzentrationen in der peritoneal Lavage-Flüssigkeit und 2) subkutan gemessen und ausgewertet Entzündung und Fibrose auf histologischen Abschnitte von den Implantationsort. In Tabelle 1zeigt die Zelle differentielle in der peritoneal Lavage-Flüssigkeit, dass die Gesamtzahl der Entzündungszellen signifikant höher in den β-TCP/C Schaum implantiert Mäusen im Vergleich zu den Schein-Kontrollen war. Darüber hinaus gab es vermehrt alle Zelltypen. In Abbildung 6Asind höhere Konzentrationen von IL-1β, IL-2 und IL-4 Zytokine in der β-TCP/C-Schaum im Vergleich zu den Schein-Kontrollen. Bei β-TCP/C Schaum s.c. implantiert Mäusen beobachteten wir eine entzündliche Reaktion mit Fremdkörper Riesenzellen auf H & E-gefärbten Sektionen (Abb. 6 b) und Nachweis der Fibrose auf Masson Trichrome gebeizt Abschnitte (Abbildung 6) nach 8 Wochen. Im Gegensatz dazu hatte der Implantationsort Schein Steuerelemente minimale Entzündung und keine Fibrose (Abbildung 6).

Figure 1
Abbildung 1: Calvaria Entfernung für primäre OB Zelle isoliert Diagramm. Das Diagramm veranschaulicht die Calvarium mit 4 Schnitten (rote gestrichelte Linie) mit einer gebogenen Schere entfernen. Der erste Schnitt ist senkrecht zur rechten Augenhöhle (R) aus X1, X 2, und die zweite ist senkrecht zur linken (L) Augenhöhle aus X3 x 4. Der dritte Schnitt ist schieden die Calvarium an der Vorderseite X4 x 2 und der vierten Schnitt ist die Rückseite getrennt X3 x 1. Die Calvarium kann dann entfernt werden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: β-TCP-induzierte in-vitro- OB Differenzierung und Reifung. OB Lebensfähigkeit und Verbreitung an den Tagen 7 und 14 für die Zellen in mittlerer allein (Balken) oder β-TCP (offene Balken) kultiviert (Mittelwert ± SEM; n = 3). ALP Aktivität Quantifizierung der Zelle Lysates und Normierung auf den Proteingehalt (µM DIFMU/µg Protein, Mittelwert ± SEM, n = 3) mit repräsentativen Bildern illustriert ALP-gefärbten Kultur Brunnen von Tag 7. Mineralisierung von ARS-gefärbten Kulturen durch eine Cetylpyridinium Chlorid-Extraktions-Verfahren gezeigt als die Konzentration von ARS quantifiziert (µM ARS, Mittelwert ± SEM, n = 3) mit repräsentativen ARS-gefärbten Kultur Brunnen am 14. Tag. Gruppen umfassen Knochen Wachstumsmedium allein (BGM); Mineralisierung Medium (MM); Β-TCP. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: β-TCP-induzierte in Vitro Differenzierung OC. Repräsentative Mikrofotos zeigen TRAP + MNCs am Tag 5 nach der Kultivierung Co Maus OBs und Knochenmark OC Vorstufen. Endpunktanalyse TRAP + mehrkernigen Zellen (MNU) zeigt die absolute Anzahl von TRAP + MNCs (≥3 Kerne) pro cm2 (meine ± SEM, n = 3) ***p < 0,001. Gruppen umfassen OC Differenzierung mittlere allein (DM); Knochen; Β-TCP. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4: In Vivo Evaluierung der β-TCP/C Schaum Knochen Transplantationen in einem kritischen Größe calvarial defekt-Modell. Non-Heilung calvarial Mängel in 8 - Wochen alten weiblichen BALB/c erstellt (n = 3) Mäuse mit einem 4 mm dental gilt. Behandlung Gruppen enthalten Schein Kontrolle (leere defekt) und Mängel mit β-TCP/C Schaum behandelt. Repräsentative histologische Abschnitte auf 12 Wochen nach der Implantation vorbereitet. Formalin fixiert Glykol Methylmethacrylat-eingebetteten Gewebeschnitten (80 – 100 µm) mit Levai Laczko Farbstoff gefärbt. Vergößerung auf Low (links) und hoher (rechts) Vergrößerung gezeigt. Schwarze Dreiecke zeigen den Knochendefekt. Schwarz * Knochengewebe und weißen bezeichnet * bezieht sich auf β-TCP/C Schaum. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5: β-TCP/C Schaum-induzierte in-vitro- Vermehrung und Zytokin Zellproduktion. Splenocyten von naiven BALB/c Mäusen in Medium allein, mit β-TCP/C Schaum oder ConA kultiviert. Überstand Zellproliferation (BrdU) und Produktion von IL-1β, IL-2, IL-4 und IFN-γ (mittlere allein ●, ConA ○, β-TCP/C Schaum ■, β-TCP/C Schaum und ConA □). Verbreitung Ergebnisse dargestellt als Mittelwert von dreifacher Proben (Außendurchmesser ± SEM) in der BrdU-Assay und der Mittelwert der doppelten Proben (Pg/mL ± SEM) für Zytokin-Konzentration von zwei unabhängigen Experimenten. p < 0,05 ist bedeutsam für Biomaterial vs. Mittel- und Biomaterial und ConA vs. ConA allein betrachtet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 6
Abbildung 6: In Vivo Immunantwort des β-TCP/C Schaum Knochen Transplantationen in eine schnelle Hochdurchsatz i.p und subchronischen Mausmodell. (A) weibliche BALB/c Mäuse implantiert i.p mit β-TCP/C Schaum oder ohne Zusatz von Materialien (Schein). Sieben Tage später, peritoneal Lavage auf Zytokin-Konzentrationen (Daten wie Cytokine Konzentrationen Pg/mL ± SEM) analysiert. Diese Daten sind repräsentativ für zwei unabhängigen Experimenten (n = 5). p < 0,05 gilt als bedeutende im Vergleich zur Farce. (B-C) Weiblichen Mäusen BALB/c (n = 5) s.c. mit β-TCP/C Schaum implantiert oder ohne Zusatz von Materialien (Schein). 8 Wochen nach der Implantation die Haut von der Implantation Websites gebeizt mit H & E (B) und Masson Trichrome (C), Entzündung und Fibrose, bzw. zu bewerten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Sham Vitoss
Zelle zählt X 106 (% der gesamten Zellen)
Makrophagen 1.240 ± 0,051 (88,1) 3.262 ± 0.380 (70,4) p < 0,001
Eosinophile 0.120 ± 0,011 (8.5) 1.181 ± 0,254 (25,5) p < 0,01
Neutrophile 0,002 ± 0,001 (0,2) 0,029 ± 0,011 (0,6) NS
Lymphozyten 0,048 ± 0,020 (3.2) 0,148 ± 0,041 (3.5) NS
Insgesamt Zellzahl 1.410 ± 0.066 4.620 ± 0.452 p < 0,001

Tabelle 1: In vivo Immunantwort des β-TCP/C Schaum Knochen Transplantationen in einem Mausmodell schnelle Hochdurchsatz i.p. Weibliche Mäusen BALB/c wurden implantierten i.p mit β-TCP/C Schaum oder ohne Materialien (Schein). Sieben Tage später, peritoneal Lavage wurde gewonnen und analysiert für entzündliche Zellzahl und differenzierte Zelle zählt (Daten wie meine Zelle zählt ± SEM). Diese Daten sind repräsentativ für zwei unabhängigen Experimenten (n = 5).

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Discussion

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Hier zeigen wir einen multidisziplinären Ansatz für die präklinische Bewertung der Biokompatibilität für repräsentative Biomaterialien für die Knochenregeneration und Reparatur entwickelt. Wir testeten die Antworten der OBs, OCs, und die in Vivo heilende Reaktion in einer kritischen Knochendefekt Modell bei Mäusen als auch in Vitro und in Vivo Immunantworten. Wir wollten zeigen, wie die Assays arbeiten und fassen die Daten und Schlussfolgerungen aus der Untersuchung von Biomaterialien. Wir zeigen, dass unsere Strategie ein wertvolles Profil der Knochen Biomaterial Biokompatibilität erzeugt.

Primärzelle Assays wurden verwendet, um OB und OC-Funktion ausgewertet werden soll. OBs sind verantwortlich für die Knochenbildung und physiologische Reparatur. Sie müssen lebensfähig bleiben, zu differenzieren und Mineralisierung zu induzieren. In dieser Studie zeigen wir Assays für Zellviabilität, ALP und ARS als Marker für physiologisch differenzierten Zellen mit einer Kapazität von mineralisieren durchführen. Die Steuerelemente für die Assays enthalten allein bietet einen Basisplan und osteogene Mineralisierung Medium (MM), die Differenzierung und Mineralisierung der OBs auf Kunststoff optimiert. Die letztere Kontrollgruppe wurde eine Referenz für das Biomaterial. Für OC Bewertung wir Co kultiviert OBs und dem Knochenmark stammenden OC Vorstufen, differenziert die Vorläufer in mehrkernigen Zellen mit TRAP, ein osteoclastic Enzym, das häufig verwendet, um OCs in-vitro-15 zu identifizieren und dann aufgezählt befleckt die Zellen mittels Lichtmikroskopie. Diese Tests sind State-of-the-Art und erforderte keine Änderungen. Allerdings haben wir festgestellt, eine Beschränkung in Bezug auf die Qualität der isolierte primäre OBs zu mineralisieren. Erhaltene OBs sind in flüssigem Stickstoff gelagert und innerhalb eines Jahres um optimale Ergebnisse zu erzielen.

OB Anlage und Tätigkeit lagen auf Gewebekultur Kunststoff als auf den β-TCP-Festplatten getestet. Wenn wir OCs bewertet, beobachteten wir die erwartete Unterschiede zwischen der Reaktion auf Kunststoff und Knochen, die die physiologischen Substrat16ist. Im Vergleich dazu induziert Knochen- und β-TCP-ähnliche morphologische Veränderungen. Die TRAP-Assay Aufzählung der OCs als Reaktion auf die β-TCP-Festplatten zeigte, dass die Zahlen deutlich unterschiedlich zwischen Knochen Scheiben und β-TCP. Β-TCP-induzierte höhere OC Differenzierung als auf Knochen Scheiben. Für OC Differenzierung ist TRAP ein gut etabliertes Assay. Gab es keine signifikanten Änderungen in dieser Methode notwendig. Jedoch um die besten Ergebnisse zu erhalten, unbedingt nicht die Zellen zu lange brüten, oder alle Zellen des monozytären Ursprungs werden TRAP-positiv.

Um die Reaktion in Vivo zu begegnen, verwendet wir β-TCP/C Schaum als eine beispielhafte Biomaterial, weil es β-TCP, enthält, die verwendet wurde, in der in-vitro- Assays und Kollagen und fördert die Knochenheilung13. Obwohl β-TCP/C Schaum kommerziell verfügbar und klinisch für Knochen Reparatur17,18 ist, es ist nur eine von vielen verschiedenen Arten von Materialien, das wäre interessant zu untersuchen, zB., biphasisches Kalziumphosphat () Hydroxylapatit/β-TCP) sowie entmineralisiertem Menschenknochen in diesen Tests um festzustellen, wie sich die biologischen Reaktionen unterscheiden sich zwischen den Materialien. Für die in-Vivo -Antwort wir β-TCP/C Schaum in eine kritische Größe calvarial Knochendefekt bei Mäusen implantiert und 12 Wochen später beurteilt Histologie und zeigte Unterschiede im Vergleich zu Schein-Kontrollen. Es ist auch möglich, die Antworten mit MicroCT bietet kostenlose Informationen19zu bewerten. Die Defekt in der Sham-Kontroll-Mäusen hatte keine signifikanten Knochenbildung, wie erwartet, während β-TCP/C Schaum induziert eine entzündliche Reaktion, Fibrose und Angiogenese, die Beweise für die frühe Phase der Knochenbildung ist. Diese Methode wurde früher in Jupiter20nachgewiesen. Jedoch Unterschied sich unser Ansatz, in dem wir eine modifizierte "Aufzug" Technik mit einer periostalen Aufzug verwendet, um das Risiko der Verletzung der Dura Mater durch den gilt. Wir begründen, dass der Dura Mater eine bedeutende Rolle bei der Heilung der calvarial Mängel spielt durch die Herstellung von knochenbildenden Zellen und osteoinduktiv Faktoren3,21,22,23. Bemerkenswert ist, beeinflusst das Material implantiert, die Größe der defekt und Methode für die Erstellung des Mangels Knochenregeneration calvarial Mängel. Eine weitere Änderung im Verfahren beteiligt die Stabilisierung von Biomaterial in der calvarial Defekt mit einem biokompatiblen Gewebekleber, die routinemäßig klinisch für Wundverschluss verwendet wird. Diese Modifikation garantiert, dass das Material im Bereich defekt während der Heilung nicht verdrängt werden würden.

Entzündung die frühe Phase der Knochenheilung regelt, aber zuviel Entzündungen oder allergische Reaktionen können Reparatur11reduzieren. Die ideale Immunantwort auf Biomaterialien ist eine entzündliche Kaskade zu initiieren, die Knochenbildung fördert. Jedoch möglicherweise bestimmte Biomaterialien eine Fremdkörper-Reaktion führt zu einer Reihe von entzündlichen Signalen, die Fibrose oder allergische Sensibilisierung führen. In unseren Studien wir Immunantworten auf β-TCP/C Schaum ausgewertet und fand, dass es nicht giftig für naive Milzzellen und nicht mit T-Lymphozyten Erweiterung stören oder Funktion (Zytokin-Sekretion) wenn Kulturen mit ConA hinzugefügt. In die intraperitoneale Experimente β-TCP/C Schaum induzierte Entzündung und gab einige Hinweise auf eine Zunahme der Eosinophilie und Makrophagen mit damit einhergehenden Anstieg der Th1 - und Th2-Typ Zytokine. In die subkutane Implantation Experimente β-TCP/C Schaum auch induziert Entzündung, aber es gab keine Anzeichen für chronische, destruktive entzündliche oder allergische Reaktionen, was darauf hindeutet, dass β-TCP/C Schaum biokompatibel ist. Diese Modelle liefern Informationen über die Immunantwort auf Biomaterialien. Zunächst befasst sich mit der in-vitro- Modell die Wirkung der Biomaterial auf naive Immunzellen in der Gegenwart ein Mitogen, nachzuweisen, dass es keine Unterdrückung der mitogenen Antwort verursacht durch das Biomaterial gibt. Zweitens die intraperitoneale Modell bietet eine schnelle 7 Tag Auslesen von der Art der Immunantwort, zB., allergische und Entzündungen wie durch die Art der entzündlichen Zelle eindringen und das Zytokin-Profil zu beobachten. Drittens die subkutane, subchronische Modell veranschaulicht die Gewebe Reaktion über einen längeren Zeitraum, ermöglicht die Auswertung von chronischer Entzündung, Fibrose, Antikörpertiter und kann verwendet werden, um wiederholte Implantation für immunologisches Gedächtnis Antworten zu testen. Diese Modelle sind bereits veröffentlicht worden und werden hier ohne irgendwelche Änderungen13gezeigt. Es ist wichtig, dass gibt es entsprechende negative und positive Kontrollen für diese Modelle. Wir empfehlen die Durchführung aller drei Modelle, um die Grenzen der einzelnen Methoden zu vermeiden. Während die gezeigten Modelle in anderen Bereichen der Immunologie etabliert sind, ist der Ansatz für die Prüfung von Biomaterialien neu.

Zusammenfassend lässt sich sagen bieten Knochen- und immunes Assays eine biologische Verträglichkeit Profil auf Biomaterial. Für Knochen liefern OB und OC Antworten auf das Biomaterial vorläufige Daten notwendig, bevor Sie komplizierte und teure Tierversuche durchführen und zur Einhaltung der 3R-Prinzips. Immunologische in-vitro- Tests liefern Daten über Antigen Kreuzreaktivität und Zytotoxizität, die auch weitere Tierversuche ausschließen kann. Die schnelle Hochdurchsatz-Experimente bieten Ergebnisse auf entzündliche und Zytokin-Antwort (zB., Art der T-Lymphozyten Antworten), während die subchronische Modell auf die Dauer der Entzündung und das Potenzial für Schäden aufgrund von Daten nützlich ist Fibrose. Dieser neuartige interdisziplinäre Ansatz umfasst Knochen und Immunantworten auf Biomaterialien bietet eine hervorragende prä-klinischen Bewertung der Biokompatibilität für zukünftige Anwendungen im Bereich Materialien.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Dieses Forschungsprojekt wird finanziell von der Europäischen Union siebten Rahmenprogramms (RP7/2007-2013) unter Grant Agreement Nr. 263363.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Biomaterials
β-tricalcium phosphate disks (β-TCP, 14 mm) Disks were sintered in a muffle furnace at a temperature of 1150 °C. A detailed description of the production can be found in Zimmer et al (doi: 10.1002/jbm.a.34639). Samples were UV-irradiated (15 min for each side) before using in cell cultures.
Orthovita Vitoss foam (β-TCP/C foam) Orthovita 2102-1405
Mouse osteoblast culture
Alizarin Red S Sigma-Aldrich A5533
ALP assay buffer (2x) pH 10.4 Dissolve 200 mM glycine, 2 mM magnesium chloride, 2 mM zinc chloride in ultrapure water and adjust to pH 10.
Bone growth medium (BGM) α-MEM + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin/streptomycin
Cell lysis buffer: CyQuant cell lysis buffer 20x concentrate Thermo Scientific C7027 Dilute the concentrated cell lysis buffer stock 20-fold in ultrapure water. 
Cell viability reagent: Presto Blue cell viability reagent Invitrogen, Thermo Fisher Scientific A13261
Collagenase type IV from clostridium histolyticum Sigma-Aldrich C5138
DC protein assay kit II Bio Rad 5000112 DC protein assay kit contains reagent A, reagent B, reagent S and BSA for the reference standard. For reagent A', add 20 µL reagent S to 1000 µL reagent A. 
Dimethylsulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D8418 Steril-filter DMSO before usage. 
Dispase II (neutral protease, grade II) Roche 4942078001
EnzCheck Phosphatase Assay Kit for alkaline phosphatase activity  Invitrogen, Thermo Fisher Scientific E12020 EnzCheck Phosphatase Assay Kit contains 6,8-difluoro-4-methylumbelliferyl phosphate (DiFMUP), N,N-dimethylformamide and 6,8-difluoro-7-hydroxy-4-methylcoumarin (DiFMU). 
Fetal bovine serum (FBS) Sigma-Aldrich F7524
Formalin solution neutral buffered 10% Sigma-Aldrich HT501128
Glycine Sigma-Aldrich G8898
Hexadecylpyrdinium (cetylpyridinium) chloride monohydrate Sigma-Aldrich C9002
L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate Sigma-Aldrich A8960
Magnesium chloride hexahydrate Sigma-Aldrich M2670
MEM alpha medium (α-MEM) Gibco Life Technologies  11900-073
Osteogenic mineralization medium (MM) α-MEM + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin-streptomycin + 50 µg/mL ascorbic acid + 5 mM β-glycerophosphate
Penicillin-streptomycin   Sigma-Aldrich P4333
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 Gibco, Thermo Fisher Scientific  10010023
Sigmafast BCIP/NBT Sigma-Aldrich B5655
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red (10x) Gibco, Thermo Fisher Scientific  15400054 Dilute the concentrated stock solution 10-fold in 1x PBS. 
Tween20 Sigma-Aldrich P1379
Ultrapure water: Cell culture water pyrogen free VWR L0970-500
Wash buffer Add  0.05% Tween20 to 1x PBS.
Zinc chloride Sigma-Aldrich 1.08816
β-Glycerophosphate disodium salt hydrate Sigma-Aldrich G5422
24-well suspension culture plate Greiner bio-one 662102
24-well tissue culture plate Greiner bio-one 662160
50 mL conical tube Greiner bio-one 227261
96-well black plate Greiner bio-one 655076
96-well transparent plate Greiner bio-one 655001
Centrifuge: VWR Mega Star 600R VWR
CO2-Incubator: HeraCell 240 Thermo Scientific
Cryovial 2 mL Greiner bio-one 122263
Disposable filter unit FP30/0.2 CA-S GE Healthcare Life Sciences Whatman 10462200 For sterile filtration of enzyme solution.
Flatbed scanner: Epson Perfection 1200 Photo Epson
Infinite M200 Pro microplate reader Tecan
Microcentrifuge tube: Eppendorf tube safe-lock 0.5 mL VWR 20901-505
Microcentrifuge tube: Eppendorf tube safe-lock 1.5 mL VWR 21008-959
Shaker Swip (orbital and horizontal)  Edmund Buehler 
Shaking incubator GFL3032 GFL  3032
Single-use pipet: serum pipet Greiner bio-one 612301
Sterile instruments (scissors, tweezer, curved forceps)
Tissue culture plate (10 cm) Greiner bio-one 664960
Mouse osteoblast-osteoclast co-culture
1α,25-Dihydroxyvitamin D3 Sigma-Aldrich 17936 1000x concentrated stock (10 µM in ethanol 100%)
Acetone VWR Chemicals 22065.327
Bone growth medium (BGM) α-MEM + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin-streptomycin
Distilled water Carl Roth 3478.4
Ethanol (100% vol/vol) VWR Chemicals 20821.365
Ethanol (70% vol/vol) VWR Chemicals 93003.1006
Fast red violet LB salt Sigma-Aldrich F3381
Fetal bovine serum (FBS) Sigma-Aldrich F7524
Formalin solution neutral buffered 10% Sigma-Aldrich HT501128
MEM alpha Medium (α-MEM) Gibco Life Technologies  11900-073
N,N-Dimethylformamide Sigma-Aldrich D4551
Naphthol AS-MX phosphate Sigma-Aldrich N4875
Osteoclast differentiation medium (DM) α-MEM + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin-streptomycin + 1 nM 1,25-(OH)2-vitamin D3 + 1 µM prostaglandin E2 
Penicillin-streptomycin  Sigma-Aldrich P4333
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 Gibco, Thermo Fisher Scientific  10010023
Prostaglandin E2 (PGE2) Cayman Chemical Company 9003016 1000x concentrated stock (1 mM in ethanol 100%)
Sodium acetate trihydrate Sigma-Aldrich S7670
Sodium tartrate dibasic dihydrate Sigma-Aldrich S8640
Sterile instruments (scissors, forceps, scalpel)
TRAP buffer pH 5.0 Dissolve 40 mM sodium acetate, 10 mM sodium tartrate in ultrapure water and adjust to pH 5.
Ultrapure water: Cell culture water pyrogen free VWR L0970-500
24-well suspension culture plate Greiner bio-one 662102
24-well tissue culture plate Greiner bio-one 662160
50 mL conical tube Greiner bio-one 227261
Centrifuge: VWR Mega Star 600R VWR
CO2-Incubator: HeraCell 240 Thermo Scientific
Diamond wafering blade (10.2 cm x 0.3 cm) Buehler
Isomet low-speed saw Buehler
Petri dish (6 cm) Greiner bio-one 628,161
Screw cap glass bottle 20 mL Carl Roth EXY4.1
Single-use sterile syringe 1 mL Henry Schein Animal Health 9003016
Single-use pipet: serum pipet Greiner bio-one 612301
Sterile needle: Hypodermic needle RW 27 G x 3/4'' Henry Schein Animal Health 9003340
Mouse calvarial defect model
Analgesia: Buprenorphine (Bupaq) Richter Pharma AG
Anesthesia: Ketamine (Ketamidor), Xylazine (Rompun) Richter Pharma AG/Bayer HealthCare
Cold sterilant: SafeSept Max Henry Schein Animal Health 9882765
Ethanol (70% vol/vol) VWR Chemicals 93003.1006
Eye ointment: VitA POS 5 g Ursapharm
Normal saline solution (0.9% sodium chloride solution) Fresenius Kabi
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 Gibco, Thermo Fisher Scientific  10010023
Povidone iodine solution: Braunol 1000 mL B. Braun 3864154
Roti-Histofix 4.5% buffered formalin Carl Roth 2213.6
Tissue adhesive: Histoacryl 5 x 0.5 mL  B. Braun Surgical 1050060
Personal protective equipment: surgical gloves, cap and mask, gown Henry Schein Animal Health 1045073, 1026614, 9009062, 370406
Sterile instruments (scalpel, scissors, forceps, needle holder)
Sterile needles: Hypodermic needles RW 27 G x 3/4'' and 30 G x 1/2''  Henry Schein Animal Health 9003340, 9003630
Single-use sterile syringe 1 mL Henry Schein Animal Health 9003016
Heating plate: Physitemp Rothacher Medical TCAT-2LV
Sterile gauze swabs Henry Schein Animal Health 220192
Sterile disposable scalpel (Figur 20) Henry Schein Animal Health 9008957
Surgical/dental drill: Implantmed SI-923 W&H Dentalwerk Bürmoos GmbH 16929000
Handpiece type S-II W&H Dentalwerk Bürmoos GmbH 30056000
Trephine, diameter 4 mm Hager&Meisinger GmbH 229040
Irrigation tubing set 2.2 m W&H Dentalwerk Bürmoos GmbH 4363600
Periosteal elevator 2 mm / 3 mm Henry Schein Animal Health 472683
Non-resorbable suture: Polyester green, DS19, met. 1.5, USP 4/0 75 cm Henry Schein Animal Health 300715
In vitro immune responses
Anesthesia for euthanasia: Ketamine (Ketamidor), Xylazine (Rompun) Richter Pharma AG/Bayer HealthCare
Cell Proliferation ELISA, BrdU (colorimetric) Assay Kit Sigma-Aldrich 11647229001 The kit contains BrdU labeling solution, fixation solution (FixDenat), Anti-BrdU antibody solution, washing buffer and substrate solution. 
Concanavalin A (ConA) MP Biomedicals 150710
Culture medium splenocytes RPMI medium + 10% heat-inactivated FBS + 1% penicillin-streptomycin solution + 0.1% gentamicin + 0.2% ß-mercaptoethanol + 1% non-essential amino acids
Ethanol (70% vol/vol) VWR Chemicals 93003.1006
Fetal bovine serum (FBS) Gibco, Thermo Fisher Scientific  10500064
Gentamicin Gibco, Thermo Fisher Scientific  15750037
Mouse IL-1β ELISA Ready-SET-Go! Invitrogen, Thermo Fisher Scientific 88-7013-88
Mouse IL-2 ELISA MAX Standard BioLegend 431001
Mouse IL-4 ELISA MAX Standard BioLegend 431101
Mouse INF-γ ELISA MAX Standard BioLegend 430801
Non-essential amino acids solution Gibco, Thermo Fisher Scientific  11140050
Penicillin-streptomycin  Gibco, Thermo Fisher Scientific  15140122
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 Gibco, Thermo Fisher Scientific  10010023
Red blood cell (RBC) lysis buffer: BD Pharm Lyse BD Bioscience 555899
RPMI 1640 medium, HEPES Gibco, Thermo Fisher Scientific  52400025
β-Mercaptoethanol Gibco, Thermo Fisher Scientific  31350010
50 mL conical tube Greiner bio-one 227261
96-well tissue culture plate Greiner bio-one 655180
Centrifuge: VWR Mega Star 600R VWR
Cell strainer 40 µm BD Bioscience 352340
Infinite M200 Pro microplate reader Tecan
Single-use sterile syringe 1 mL Henry Schein Animal Health 9003016
Sterile surgical instruments (forceps, glass slides)
High throughput intraperitoneal model
Anesthesia: Ketamine (Ketamidor), Xylazine (Rompun) Richter Pharma AG/Bayer HealthCare
Cold sterilant: SafeSept Max Henry Schein Animal Health 9882765
Ethanol (70% vol/vol) VWR Chemicals 93003.1006
Eye ointment: VitA POS 5 g Ursapharm
Mouse IL-1β ELISA Ready-SET-Go! Invitrogen, Thermo Fisher Scientific 88-7013-88
Mouse IL-2 ELISA MAX Standard BioLegend 431001
Mouse IL-4 ELISA MAX Standard BioLegend 431101
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 Gibco, Thermo Fisher Scientific  10010023
Povidone iodine solution: Braunol 1000 mL B. Braun 3864154
Shandon Rapid-Chrome Kwik-Diff Staining Kit Thermo Scientific 9990700 For differential cell count.
Heating plate: Physitemp Rothacher Medical TCAT-2LV
Hemocytometer: Neubauer chamber Carl Roth PC72.1
Non-resorbable suture: Ethibond Excel 4-0 Ethicon 6683H
Resorbable suture: Polysorb Covidien SL-5628
Shandon centrifuge for cytopsin Thermo Scientific
Single-use sterile syringe 1 mL Henry Schein Animal Health 9003016
Sterile gauze swabs Henry Schein Animal Health 220192
Sterile needles: Hypodermic needles RW 27 G x 3/4'' and 25 G Henry Schein Animal Health 9003340, 420939
Sterile surgical instruments (scalpel, scissors, forceps, needle holder)
Trypan blue solution 0.4% Gibco, Thermo Fisher Scientific  15250061
Subchronic subcutaneous model
Anesthesia: Ketamine (Ketamidor), Xylazine (Rompun) Richter Pharma AG/Bayer HealthCare
Cold sterilant: SafeSept Max Henry Schein Animal Health 9882765
Ethanol (70% vol/vol) VWR Chemicals 93003.1006
Eye ointment: VitA POS 5 g Ursapharm
Phosphate-buffered saline 1x (PBS) pH 7.4 Gibco, Thermo Fisher Scientific  10010023
Povidone iodine solution: Braunol 1000 mL B. Braun 3864154
Roti-Histofix 4.5% buffered formalin Carl Roth 2213.6
Heating plate: Physitemp Rothacher Medical TCAT-2LV
Non-resorbable suture: Ethibond Excel 4-0 Ethicon 6683H
Personal protective equipment: surgical gloves, cap and mask, gown Henry Schein Animal Health 1045073, 1026614, 9009062, 370406
Single-use sterile syringe 1 mL Henry Schein Animal Health 9003016
Sterile gauze swabs Henry Schein Animal Health 220192
Sterile instruments (scalpel, scissors, forceps, needle holder)
Sterile needle: Hypodermic needles RW 27 G x 3/4''  Henry Schein Animal Health 9003340, 420939

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References

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Biologische Verträglichkeit Profil auf Biomaterialien für Knochenregeneration
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Kampleitner, C., Obi, J., Vassilev, N., Epstein, M. M., Hoffmann, O. Biological Compatibility Profile on Biomaterials for Bone Regeneration. J. Vis. Exp. (141), e58077, doi:10.3791/58077 (2018).More

Kampleitner, C., Obi, J., Vassilev, N., Epstein, M. M., Hoffmann, O. Biological Compatibility Profile on Biomaterials for Bone Regeneration. J. Vis. Exp. (141), e58077, doi:10.3791/58077 (2018).

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