Summary
여기 선물이 polysome 끼얹는다 절연된 마우스 마음에 프로 파일링을 수행 하는 프로토콜. 우리 심장 관류, 프로 파일링, polysome polysome 분수 mRNAs, miRNAs, 및 polysome 프로테옴의 분석에 대 한 방법을 설명 합니다.
Abstract
단백질 번역에 동적 변화에 연구 전문된 방법 필요합니다. 여기 우리는 국 소 빈 혈과 reperfusion polysome 프로 파일링과 함께 끼얹는다 절연된 마우스 마음을 사용 하 여 응답에서 새로 합성 된 단백질에 변화를 검사 합니다. 단백질 번역의 동적 변화를 더 이해 하기 우리 mRNAs cytosolic 리보솜 (polyribosomes 또는 polysomes)와 함께 로드 된 또한 미토 콘 드리 아 polysomes 복구 하 고 비교에서 mRNA와 단백질 분포 특징에 높은-효율성 분수 (수많은 리보솜 mRNA에 부착), 낮은-효율성 (적은 리보솜 부착) 또한 미토 콘 드리 아 polysomes, 그리고 번역 비 분수를 포함 하는. miRNAs는 번역 되 고, 번역의 효율성을 줄일 mRNAs와 연결할 수도, 우리는 분수에 걸쳐 miRNAs의 분포를 조사. MRNAs, miRNAs, 및 단백질의 분포는 글로벌 아니 흐름 허 혈과 reperfusion의 30 분 후 30 분 후에 기저 끼얹는다 조건 하에서 시험 되었다. 여기에 우리가이 분석을 수행 하는 데 사용 하는 방법을 제시-특히,이 자당 기온 변화도에서 단백질 추출의 최적화에 대 한 접근은 하지 설명 하기 전에-몇 가지 대표적인 결과 제공.
Introduction
마음은 (I) 허 혈과 reperfusion 동적 방식에서 (R)의 부상에 응답합니다. 그러나, 응답 하는 동안 단백질 합성의 급성 변화에 약간의 통찰력이 있다. 이 해결 하기 위해 우리가 했다 polysome1 단백질 풍부 리보솜 및 polysomes, cytosol에서 변환 규제 요인의 재분배를 반영 하는 변화를 식별 하기 위해 프로 파일링의 기초가 튼튼한 방법의 장점 및 새로 합성된 단백질 (NSPs)에 증가. 나의 설정에서 / R, 새로운 mRNAs2;의 전사와 일치 하지 않는 시간에 발생 하는 새로운 단백질 합성의 증가 또한, mRNA 식 수준 및 단백질 풍부 사이 부조화 보고3되었습니다. 이러한 이유로, 우리는 동적 프로테옴에서 변경 내용을 분석 하는 단백질 번역에 의해 반영 하기로 결정 했다. 이렇게 하려면, 우리는 polysome 분수에서 mRNA를 계량 하 고 polysome 분수의 단백질 구성을 분석. 마지막으로, microRNAs (미르) 번역에 대 한 mRNAs의 조절 및 단백질 번역4,5의 효율을 방해할 수 있습니다, 때문에 우리 검사 polysome 분수에 미르의 배포에 초점을 맞추고는 내가 응답 / R.
우리는 지속적인 관류, 그리고 국 소 빈 혈 reperfusion의 30 분 뒤의 30 분 30 분 글로벌 아니 흐름 허 혈 후의 기저 상태에서 수확 조직과 격리 마우스 Langendorff 관류 모델을 사용 하기로 결정 했습니다. 우리 심장 조직의 solubilized 그리고 자당 기온 변화도 통해 polysomes를 분리 proteomic 분석 및 선택적 검출 mRNAs와 PCR 및 microarray, miRNAs의 각각 다음. 방법의이 조합은 mRNA, 미르, NSPs의 동시 검출 뿐만 아니라 nontranslating 분수 사이 규제 단백질, 미르, 그리고 mRNA의 재배포 가능 동적 프로테옴을 이해 하는 강력한 접근 방식을 나타냅니다. 낮은 효율 polysomes, 그리고 높은 효율 polysomes ( 그림 1참조). 이 프로세스의 동적 규칙에 eIF2α 또는 mTOR 등 규제 요인의 인 산화의 더 분석 하 여 연장 됩니다. 이러한 개별 단계 이제 자세히 설명 합니다.
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Protocol
모든 동물 연구 기관 지침에 따라 수행 하 고 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 삼목 시 나이 의료 센터에 의해 승인 했다.
1. Langendorff 마우스 심장의 관류
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국 소 빈 혈과 reperfusion 마우스 마음의 Langendorff 관류
- 관리 복 pentobarbital 나트륨 70 mg/kg 성인 마우스 (8 주 오래 된, 남성, C57BL6/j). 핀치를 발 끝에 철수의 부족에 의해 깊은 마 취를 확인 합니다.
- 복 덤플링 500와 Anticoagulate U/kg.
- Sternal 절 개를 통해 가슴을 엽니다. 횡 경 막 열고 앞쪽 액 축에 늑 골 경계를 따라 잘라. 그런 다음 완전히 흉부 새 여 forelimb까지 앞쪽 액 축 잘라. 후, 마음을 시각화, 집게와 오름차순 대동맥을 클램프 하 고 마음을 빠르게 삭제할. 죽음은 exsanguination 때문 이다. 차가운 Krebs에서 마음을 배치 (NaCl 6.9 g/L, KCl 0.35 g/L, NaHCO3 2.1 g/L, KH2포4 0.16 g/L, MgSO4 0.141 g/L, 포도 당 2 g/L와 CaCl2 0.373 g/L).
- 블런트 팁 바늘으로 대동맥을 cannulate 하 고 perfuse retrogradely 일정 한 압력 모드로 Krebs 솔루션으로 마음.
- 안정화 기간 후 15 분, 30 분 뒤에 30 분 동안 reperfusion 글로벌 아니 흐름 허 혈을 심장 주제.
- 초기 관류 15 분, 30 분 허 혈, 또는 30 분 reperfusion 마음을 수확. 심 방에서 트리밍합니다 그리고 스냅-동결 조직 액체 질소.
- 사용까지-80 ° C에서 저장
2. 조직 균질, 가용 화, 그리고 자당 밀도 그라데이션 침전
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그라데이션 준비
- 100ml 자당, NaCl 2.5 M; 4 mL를 혼합의 2 솔루션 (15%, 50%)를 준비
0.8 mL MgCl2 1.25 M; 1 mL Tris HCl 1 M, pH 7.5; 15 g 또는 자당의 50 g (15%와 50%, 각각); 100 mL; 도달 초순 그리고 15% 솔루션을 자일 렌 cyanol (0.02 mg/mL) - 각 솔루션 (0.22 μ m 필터) 필터
- 그라디언트 사용 될 것 이다 날 각 자당 솔루션의 40 mL를 준비 하 고 cycloheximide 100 µ g/mL의 최종 농도 달성 하기 위해 각 솔루션에 추가
- 그라데이션 메이커를 사용 하 여 15%와 50% 자당 해결책 사이 혼합을 준비
- 15% 자당 기온 변화도의 5 mL와 함께 왼쪽된 칸 채우기
- 오른쪽 구획 50% 자당 그라데이션으로 채우기
- 수도 꼭지를 열고 자력으로 두 개의 작은 구획을 저 어을 펌프에 전환
- 튜브를 사용 하 여 혼합된 자당 솔루션 얇은 벽 울트라 원심 분리 관에 흐름을 허용 하도록 두 번째 탭에 연결. 마지막 볼륨 약 10 mL를 있을 것입니다.
- 4 ° C에서 그래디언트를 유지 (필요한 경우, 하룻밤 하지만 되지 더 이상)
- 100ml 자당, NaCl 2.5 M; 4 mL를 혼합의 2 솔루션 (15%, 50%)를 준비
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심 혼 직물의 균질 화
- 균질 (자당 그라데이션 분별에 대 한 수정)는 필터링 된 세포의 용 해 버퍼에서 polytron와 신선 또는 냉동 하트 100 m m KCl, 20 mM Tris pH 7.5, 5 mM MgCl2, 0.4% 포함 된 NP-40. Cycloheximide 100 µ g/mL polysome 구조, 0.1 U RNase 제와 프로 테아 제 억제 물 칵테일 (1 태블릿 50 ml)을 유지 하기 위해 포함 됩니다.
- 품 어는 lysate에 15 분을 얼음.
- 불용 성 물질을 제거 하는 상쾌한 수집 4 ° C에서 15 분 18000 x g 에서 원심.
- 단백질 결정, RNA 격리 및 RNA 무결성 분석 ( 그림 2참조)에 대 한 50 µ L를 보유 합니다.
- 그래디언트 위에 상쾌한 (500-100 µ L) 레이어를 세포의 용 해 버퍼 튜브를 균형.
-
침전 및 분수의 컬렉션
- 37000 rpm 진동 물통 회전자에 4 ° C에서 120 분 ultracentrifugation를 수행 합니다. 제조 업체에 따라이 최대 반경에서 228000 x g 에 해당합니다.
- 254에서 흡 광도의 지속적인 감시와 함께 microcentrifuge 튜브에서 17 분수 (분수 약 600 µ L)으로 각 그라디언트를 수집 nm (OD254).
- 다음과 같이 분수 수집기 프로그램:
- (그라데이션 하기 전에 튜브에 포함 된 액체에 해당) 하는 컬렉션의 첫 번째 3 분 삭제
- 19 분 4, 17 분수에 1 mL/min의 속도로 분수를 수집 합니다.
- 각 수집 되 자 마자 얼음에는 분수를 놓습니다. 그들은 즉시 처리 되지 않는 경우-80 ° C에서 샘플을 동결. 그라데이션의 전형적인 UV densitometric 추적 수집은 그림 1에 표시 됩니다.
3. 절연 및 Polysome Nontranslating 분수에서 mRNAs의 분석
-
MRNA의 추출
- 만약 그들이 플래시-냉동 컬렉션 후 얼음에 분수를 녹여
- 신선한 튜브 각 분수의 200 µ L 전송
참고:이 단계에서 두 개 이상의 연속 분수 수 수 풀링된 함께. 그것은 행해져야 한다 신중 하 게 polysome 및 비 polysome 분수 혼합 하지 않습니다 있도록 OD254 그래프를 분석 후. - 10 추가 luciferase 정규화 목적을 위해 각 샘플에 내부 제어로 RNA의 ng.
참고: Luciferase 뇌관 해야 사용 내부 통제로 결과 정상화. - 각 튜브를 RNA 추출 시 약 (페 놀 및 guanidine isothiocyanate monophasic 솔루션; 참조 테이블의 재료)의 700 µ L를 추가 합니다. 잘 혼합 하 고 RT (실내 온도)에서 5 분 동안 튜브를 품 어.
- 실시간에 2-3 분 15 미 품에 대 한 140 µ L 클로 프롬 및 소용돌이 추가
- 4 ° c.에 12000 x g 에서 15 분에 대 한 샘플을 원심
- 신중 하 게 새로운 튜브 위 수성 단계 전송.
- 분수의 RNA 콘텐츠 높은 이므로, 각 튜브를 캐리어로 glycogen의 10 µ g을 추가 합니다.
- 각 튜브를 350 µ L 소 프로 파 놀을 추가 합니다. 잘 혼합 하 고 수익률을 높이기 위해 1 시간-20 ° C에서 품 어.
- 4 ° c.에 12000 x g 에서 15 분 동안 원심 분리기
- 삭제는 상쾌한 고 추가 700 µ L 에탄올 75 %RNA 펠 릿을 세척 합니다.
- 4 ° c.에 7500 x g 에 5 분 동안 원심 분리기
- 에탄올을 제거 하 고 펠 릿 어 10-15 분 동안 건조 하자.
참고:-RNA 펠 릿 건조 물에 그것의 완전 한 가용 화가 되지 것입니다. - RNase 무료 초순 H2o.의 50 μ에 RNA 펠 릿 resuspend
- 55 ° c.에서 10 분에 대 한 샘플을 품 어
- 각 샘플의 2 μ를 사용 하 여 추출 된 RNA의 양과 품질을 측정 하 여-80 ° c.에 나머지를 저장
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반전 녹음 방송 및 정량
- 반전 녹음 방송 cDNA 합성의 4 μ를 사용 하 여 20 μ 반응 ( 재료의 표참조)을 키트. 샘플의 수에 따라 supermix을 준비 합니다. 각 관에 필요한 볼륨을 전송 하 고 각 관에 입력 RNA의 5 μ를 추가 합니다. 이 볼륨은 Taq 중 합 효소 근무 조건 범위에 대 한 관련성이 수정 될 수 있습니다.
- 제조업체에서 권장 하는 다음 프로그램으로 열 cycler에 튜브를 품 어: 25 ° C에서 5 분, 20 분 반전 녹음 방송에서 46 ° C, 20 분 동안 95 ° c.에 1 분 동안 역전사 비활성화
- 정량 Pcr 뇌관의 각 쌍에 대 한 최적화 된 프로그램으로 실행 합니다.
참고: 분수에 특정 mRNAs의 존재를 감지, (격리 된 RNA)의 각 부분에서 동일 볼륨 반전 녹음 방송에 대 한 사용할 수 한다.
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결과의 분석
- 관심 있는 유전자와는 luciferase Ct 값을 사용 하 여 델타 Ct 값 계산
- 다른 분수 (표 1)에 걸쳐 있는 mRNA의 분포를 시각화 하는 모든 분수에 포함 된 총 mRNA 값의 백분율로 각 분수 델타 Ct 값을 표현
4. 절연 및 Polysome 분수와 Nontranslating 분수에서 miRNAs의 분석
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MRNA와 미르 추출
참고:이 프로토콜 몇 가지 변화 제조업체의 지침을 따릅니다.- 글 리 코겐 및 스파이크 컨트롤 해 동. 얼음에 계속.
- 풀링된 샘플의 200 µ L를 미르 추출 시 약의 700 µ L를 추가 합니다.
- Glycogen의 µ 1 µ g/L을 추가 하 고는 피 펫을 사용 하 여 균질. 실 온에서 5 분 동안 그것을 품 어.
- 1.6 제어 스파이크에서 108 x의 3.5 µ L을 추가 하 고 그것을 혼합.
- 클로 프롬 및 소용돌이의 200 µ L 추가 적어도 15 초 동안 그것.
- 실내 온도에 3 분 동안 품 어.
- 4 ° c.에 15 분 동안 12000 x g 에서 원심 분리기
- 피 펫을 사용 하 여, 새로운 1.5 mL 튜브에는 상쾌한 전송. 중간 및 아래 단계를 삭제 합니다.
- 100% 에탄올 1.5 x 볼륨은 상쾌한을 추가 섞는다.
- 미르 추출 열에이 혼합물의 700 µ L를 전송 및 15에 대 한 최고 속도로 원심 RT와 흐름; 통해 삭제 s 나머지 모든 예제와 함께이 단계를 반복 합니다.
- 열에 버퍼 1의 700 µ L을 추가 하 고 15 최고 속도로 원심 RT; s 흐름을 통해 삭제 합니다.
- 열에 버퍼 2의 500 µ L을 추가 하 고 15 최고 속도로 원심 RT; s 흐름을 통해 삭제 합니다.
- 열에 80% 에탄올 500 µ L을 추가 하 고 RT;에서 2 분에 대 한 최고 속도로 원심 흐름을 통해 삭제 합니다.
- 세척제 새로운 2 mL 튜브, 뚜껑을 열고 5 분 최고 속도로 실시간에 원심을 열을 전송 흐름을 통해 삭제 합니다.
- 열 및 원심 분리기 전체에 얼음에는 eluate 실시간 유지에 1 분 동안 속도 또는 미래의 분석-80 ° C에서 저장 RNAse 무료 물 16 µ L를 추가 합니다.
참고: 각 샘플의 두 microliters OD 분석에 사용할 수 있습니다.
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반전 녹음 방송
- 얼음에 준비 합니다. 각 20 µ L RT-PCR 반응에 대 한 추가 미르 RT 버퍼의 4 µ L, 핵 산의 2 µ L, 총 RNA 2 µ L의 효소, RNAse 무료 물; 3 µ L의 9 µ L 그것을 혼합 하 고 짧게 스핀 다운.
- 다음과 같이 열 Cycler 설정.
60 분;에 대 한 37 ° C
95 ° C 5 분;
4 ° C를 개최. - 열 cycler에서 튜브를 제거 하 고 물 RNAse 무료 200 µ L를 추가 합니다. -20 ° C에서 저장 또는 실시간 PCR로 진행.
-
실시간 PCR
참고:이 프로토콜은 96 잘 접시 형식을 따릅니다. 얼음에 반응 혼합을 준비 합니다.- PCR 반응 혼합을 준비 하 고는 프로토콜에 의해 허용 하는 범위에 따라 (위의 miRNAs) 로부터 cDNA를 추가. 여러 반응 일괄 처리에서 준비 될 수 있습니다.
- 각 잘에서 PCR 믹스 + cDNA의 25 µ L의 합계를 추가 합니다.
- 광 판 인감을 사용 하 여 접시를 봉인.
- 실 온에서 1000 x g 에서 1 분 동안 접시 원심
- 프로그램 실시간 cycler 다음과 같습니다.
15 분 동안 95 ° C에서 초기 활성화 단계
3 단계 자전거: 15 94 ° C에서 변성 s; 30 55 ° C에 어 닐 링 s; 30 70 ° C에서 확장 s (형광 데이터 수집을 수행); 추가 40 주기;
녹는-cycler 기본에 따라 곡선입니다.
-
비교 분석
- 정규화의 예 ( 표 2참조):
- SCM의 최소 값을 찾을.
- 모든 SCM 값이이 최소한을 정상화.
- (나) 관심과 참조 유전자 (REF)의 miRNAs의 Ct 값에서이 값을 뺍니다.
- 2-ΔCt 수식을 사용 하 여 데이터를 분석 합니다.
- 정규화의 예 ( 표 2참조):
5. Proteomic 분석
-
Polysome 분수에서 단백질의 추출
- 수집 된 자당 분수를 결합 하 여 3 개의 마지막 조각으로. 무거운 (4, 5, 6 및 7 자당의 높은 농도 함께 풀링된 분수에 고효율 polysomes; 그라데이션 튜브의 아래쪽), 분수 표시 빛 (낮은 효율 polysomes 풀링된 분수 8, 9, 10, 11;의 중간에 그라데이션 튜브) 번역 비 (자당의 풀링된 분수 12, 13, 14 및 15 낮은 농도로, 그라데이션 튜브의 상단). 풀링된 분수에 단백질 분석을 수행 합니다.
- 100% 재고 trichloroacetic 산 (TCA)를 준비 하 고 어둠 속에서 4 ° C에서 그것을 저장. 100%의 60 µ L 샘플의 0.5 mL 혼합 TCA와 어둠 속에서 하룻밤-20 ° C에서 품 어.
참고: 1.5 mL 낮은 단백질 보존 튜브 ( 재료의 표참조)를 사용 합니다. - 밤새 부 화 후 얼음에 15000 x g30 분 삭제 상쾌한 4 ° C에서 원심 분리기 샘플을 녹여.
참고: 샘플에서 총 단백질의 100 µ g 튜브 하단에 보이는 단백질 펠 릿을 제공합니다. - 사전-20 ° C 냉장고에 아세톤을 진정. 단백질 펠 릿 및 15000 x g15 분 삭제 상쾌한 4 ° C에서 원심 분리기에 찬 아세톤의 0.5 mL를 추가 합니다. 이 단계를 두 번 반복 합니다.
- 공기 건조는 펠 릿. 50 mM Tris HCl 버퍼 (pH 8)의 360 µ L에 펠 릿을 resuspend.
참고: 필요한 경우 사용 하 여 펄스 sonicator resuspend 펠 릿을. - 0.1 m M dithiothreitol의 40 µ L을 추가 (최종 농도 10 m m)와 0.15 M iodoacetamide의 45 분 추가 50 µ L에 대 한 셰이 커에 55 ° C에서 품 어 (최종 농도 17 m m)와 어둠 속에서 30 분 통에 실 온에서 품 어.
- 트립 신 솔루션 준비: trypsin의 20 µ g 50 m m 염화 중 탄산염의 100 µ L에서 resuspend. 1:50 (w/w) trypsin 솔루션의 해당 볼륨 샘플을 추가 트립 신: 단백질 비율을 pH 8을 확인 하 고 37 ° C에서 셰이 커에 하룻밤 사이 품 어.
참고: 추가 1 M 염화 중 탄산염 pH 8 하 려 합니다. - 트립 신 소화 후 멋진 벤치 원심 분리기에서 짧게 원심 분리기 샘플 추가 10% 개미 산 트립 신 활동을 끄다 샘플 담 진행을 pH 2-3에.
참고: 샘플 담 대 한 µ 차입 플레이트를 사용 합니다. - 상태는 매 우물에 세 번 뒤 컨디셔닝 0.1% 개미 산의 200 µ L에 의해 세 번 진공을 사용 하 여 메탄올의 200 µ L 96 잘 접시의. 샘플을 로드 하 고 세 번 0.1% 개미 산의 200 µ L를 사용 하 여 샘플 세척을 수행 합니다. 낮은 단백질 보존 0.5 mL 튜브에 두 번 50 %acetonitrile/0.1% 포 름 산의 100 µ L로 샘플을 elute.
참고: 샘플 Elute 천천히 처음에 인력을 사용 하 여 다음 낮은 진공. - 집중 장치를 사용 하 여 건조를 샘플 eluate 증발 하 고 하거나 직접 수행 질량 분석 분석 또는 저장소 사용까지-80 ° C에서.
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질량 분석 분석
- 50-100 µ L에서 각 펠 릿 (tryptic 펩 티 드로 구성 된)를 다시 구성 하 고 1 µ L을 질량 분석기에 주입.
참고: 최대 강도 LC/MS/MS 신호를 재구성 및 사출 볼륨을 최적화 합니다. 우리의 경우, 최대 신호 (총 이온 전류; TIC)에 스캔의 2E9에 1E8의 범위에서 했다. - 트랩 열 C18 (300 µ m 아이디 x 5 m m, 5 µ m, 100Å) 다음 펩타이드 분리 C18 열 (250 m m, 2 µ m, 100Å x 75 µ m 아이디)를 사용 하 여 흐름 속도 설정은 300 nL/분 세트 나노 소스 모 세관 온도에서 275 ° C와 2 스프레이 전압 kV.
- 5-35% B 90 분, 7 분 및 25 분 (a: 0.1% 포 름 산/물과 이기에 b: 0.1% 포 름 산) 5 %B 평형에 대 한 95 %B 3 분 35-95 %B 선형 그라데이션이 적용 됩니다. CID 모드를 사용 하 여 각 MS1 스캔에서 15 높은 강도 이온에 대 한 MS2 스펙트럼을 취득. 3 질량 분석 복제를 사용 하 여 분석 하는 각 샘플에 대 한.
참고: 최적화 하 고 실험 조건 및 특정 질량 분석 악기에 샘플에 대 한 적합 한 매개 변수를 사용 하 여. 조건/매개 변수 섹션 5.2에서에서 언급입니다. 사용 하 고 우리의 실험실에 최적화 되었다.
- 50-100 µ L에서 각 펠 릿 (tryptic 펩 티 드로 구성 된)를 다시 구성 하 고 1 µ L을 질량 분석기에 주입.
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단백질 식별/정량
- 질량 분석 분석 후 원시 스펙트럼 파일 MSConvert 소프트웨어 (http://proteowizard.sourceforge.net/tools/msconvert.html)를 사용 하 여 호환 mzXML 파일으로 변환.
- SEQUEST 검색 엔진 검색 기준으로 예를 들어, UniProtKB/스위스-보호 마우스 데이터베이스 (가장 최신 정식 검토);로 변환 된 파일을 제출 트립 신을 사용 하 여 세미 효소 다이제스트 (KR 후 /-); 최대 2 놓친 분열; 선구자 질량 범위: 400 4500 amu; 정적 수정: carbamidomethyl (C) 57.021465 amu; 펩 티 드 대량 허용 오차: 50 ppm; 조각 대량 유형: monoisotopic.
참고: 다른 단백질 데이터베이스 검색 엔진 및 데이터 파이프라인 사용할 수 있습니다. 예: 쥐, 마우스 및 인간의 데이터베이스 보다 덜 완전 한 인에 대 한 데이터베이스를 사용 하 여 마우스 (또는 인간)에 대 한 검색을 할 수 있습니다 프로테옴 범위 증가 데이터베이스. 이 경우에, 단백질 이름 중복 제거 해야 합니다. - 포스트 검색 분석을 수행 합니다. 데이터를 보기 위한 필터를 설정 합니다. 예를 들어 95% 또는 99%, 즉, 통계 분석 의미 95% 또는 99% 확률의 샘플에 존재 하는 단백질만이 표시 됩니다 확률을 최소 단백질 (단백질 임계값)를 설정 합니다. 펩 티 드 임계값 (예: 95%)에 대 한 필터 설정 즉, 스펙트럼은 펩 티 드를 식별 하는 여부 결정에 사용 될 최소 확률. 펩 티 드 단백질 존재 인지를 결정 하는 최소 수 선택 (2 펩 티 드 단백질 식별을 위한 최소 권장).
- 품질/수량에 대 한 확인 된 단백질을 평가 합니다. Proteotypic 펩 티 드 정량화에 사용 되는 확인 하십시오. Isoform 식별 확인 그것 특정 isoform에 고유한 아미노산 시퀀스의 구성 tryptic 펩 티 드의 관찰에 기초 합니다. 어떤 "비슷한" 또는 가상 단백질 있는지 비교 받아야 한다 관찰 알려진된 단백질에 해당 하는 펩 티 드.
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Representative Results
mRNA 분석
mRNA 결과 각 분수 (그림 3A); 특정 mRNA의 배포로 표현 될 수 있습니다. 정량화, polyribosomal 번역 분수를 결합 하 고 nontranslating 분수 번역 mRNA 풍부의 비율을 제시 번역 비 분수 (그림 3B), 비교. 추가 정보는 별도로에서 낮은 효율 polysome 분수 (그리고 nontranslating 분수에서 별도) 고효율 polysome 분수를 검사 하 여 얻었다. (그들은 그들의 표적 mRNAs의 단백질 번역 방해 어디에) 낮은 효율 분수에 농축 miRNAs를 분석할 때 특히 중요 하다.
담당자 변경 마우스 마음 허 혈 및 국 소 빈 혈 또는 reperfusion 대상이 됐다 후 번역 및 nontranslating 분수의 분포 사기에 비해 그림 4에 나와 있는 특정 mRNA에 대 한 결과.
miRNA 배열 분석
MiRNA 배열 분석에서 대표적인 결과 그림 5에 표시 됩니다. 여기, miRNAs (맞춤형 배열 판)의 일부는 22 miRNAs와 연결 된 polysomes 허 혈, 9 miRNas 동안 국 소 빈 혈과 reperfusion, 두 조건에 일반적인 7 동안 나타내는 풀링된 무거운 분수에 분석 되었다. 이 miRNAs의 협회는 국 소 빈 혈과 reperfusion의 스트레스에 대 한 응답에서 동적 보여줍니다.
Proteomic 분석
가짜 (제어) 샘플의 무거운, 빛과 비 번역 분수의 분석:
881 총 단백질의 질량 분석;에 의해 확인 되었다 3, 46 및 208의 총 단백질은 중, 빛과 비 트랜스 분수, 독특한 각각 (그림 6A). 미토 콘 드 리아 ribosomal 단백질 (28S와 39S)의 대다수 (88%) 빛 분수 (41 중 36)에서 확인 되었다 고 cytosolic ribosomal 단백질 (40와 60)의 대다수 (88%)는 일반적으로 무거운 및 빛 분수 (53의 60)에 발견 했다 효율적인 분리 및 proteomic 확인 확인 된 무거운 cytosolic vs 수 미토 콘 드 리아 ribosomal 단백질 라이터. 확인 된 미토 콘 드리 아와 cytosolic ribosomal 단백질의 부분 집합 그림 6B에 나와 있다.
그림 1: 자당 기온 변화도에 polysome 분수의 전형적인 UV 흡 광도 프로필. 처음 세 개의 분수는 튜빙에서 무효 볼륨을 나타냅니다. 높은 효율 (높은 분자량, HMW) 분수 분수 4-7, 낮은에 수집 효율성 (저 분자 무게, LMW) 8-11, 비 번역 (및 나머지 cytosolic 소재) 분수 분수 12-15 (에서 수집 nontranslating, NTR). 레드 라인 전도도, 나타내고 파란색 추적 254에서 UV 흡 광도 나타냅니다 nm. 오른쪽에 자당 그라데이션, 보여주는 배포와 polysomes 침전 후 테스트 튜브의 만화가입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: RNA 무결성 제어 분석 Bioanalyzer. RNA 무결성 번호 (린) 심장 전체 lysate에서 분리 된 총 RNA의. 린 계산 18S와 28S 봉우리에 따르면. 린 범위: 1-10, 그리고 린 = 10 매우 좋은 무결성. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 자당에서 mRNA 유통의 대표 프로필. 마음 기저 Langendorff 관류 또는 국 소 빈 혈과 reperfusion 대상이 됐다 (I / R). (A) 심장 lysates 자당 기온 변화도에 해결 했다 고 GAPDH (왼쪽)와 COX4 (오른쪽)에 대 한 mRNA 콘텐츠 각 분수에 결정 했다. 플롯 기저 관류 (가짜, 운용 및 다이아몬드) 및 국 소 빈 혈 또는 reperfusion 각 분수 (분수 수 x 축에) 상대 mRNA 풍부를 보여준다 (I / R, 블루 라인, 사각형). 줄거리에는 UV 흡 광도 전체 mRNA 콘텐츠를 나타내는 (밝은 회색 곡선) 계수 (바로 회색 경사진 선). 상자 분수 했다 풀링 하는 방법을 나타냅니다. (B) 막대 그래프 플롯 GAPDH (왼쪽)와 COX4 (오른쪽) mRNAs에 대 한 (polysomes) vs nontranslating (NT) 분수를 번역 mRNA 풍부의 비율을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 대표 mRNA 결과. 실험적인 그룹에 따라 변화를 보여주는 풀링된 분수 (HMW LMW, NTR)에서 한 mRNA의 정량. 쥐 심 혼의 polysome 분류는 Langendorff 관류 후 수행 되었다. 결과 총 mRNA (위 패널)의 %와 nontranslating 분수 (NTR) polysomes (HMW + LMW)의 비율으로 그려집니다. 오차 막대는 그룹 당 5 마음에서 결과 나타냅니다 (가짜, 허 혈, 또는 I / R). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 대표 미르 결과. 통로의 벤 다이어그램 마음 미르 분석 표시와 마우스 샘플의 무거운 분수 풀에서 downregulated miRNAs 초점을 국 소 빈 혈 또는 국 소 빈 혈과 reperfusion. 컷오프 값: 1.5 배. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6: 단백질 질량 분석에 의해 확인 된. (A) 일반적이 고 무거운, 빛과 비 트랜스 분수 독특한 단백질의 벤 다이어그램. (B) 미토 콘 드 리아 cytosolic ribosomal 단백질 식별의 하위 집합입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 7: 단백질 추출 방법에 대 한 도식 워크플로 테스트. 단백질 추출 방법을 가짜 (제어) 샘플 및 무거운 (고효율 polysomes)를 사용 하 여 시험 되었다 높은 자당 콘텐츠 부분. 빨간색에서 숫자는 단백질 질량 분석;에 의해 파악 된 수를 나타냅니다. 어디에 두 개의 숫자가 표시 됩니다, 그들은 두 개의 별도 실험에서 있습니다. 자세한 내용은 텍스트에서 제공 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 분수 | 유전자 Ct | LUCIFERASE Ct | ΔCt | 2ΔCt | 모든 분수의 합계 | 각 분수의 % | Polysome/NTR 비율 |
| 높은 효율 (HMW) | 28.75 | 22.79 | 5.96 | 0.016 | 0.046 | 34.64 | 2.77 |
| 낮은 효율 (LMW) | 28.43 | 22.63 | 5.80 | 0.018 | 38.81 | ||
| 비 번역 (NTR) | 29.12 | 22.77 | 6.35 | 0.012 | 26.55 | ||
| Polysome/NTR 비율 = (HMW + LMW) / NTR |
표 1: MRNA의 분석 샘플. 하나의 mRNA의 분석의 방법 다른 풀링된 분수 (HMW LMW, NTR) 정량 PCR 후 표시 됩니다. ΔCt = Ct-luciferase Ct, 유전자는 2ΔCt 2ΔCt이며.
| SCM의 최소 값을 찾을: 22.77 | |||
| 샘플 1 | 샘플 2 | 샘플 3 | |
| Ct 나 | 22.92 | 22.36 | 22.58 |
| Ct SCM | 22.81 | 22.77 | 22.9 |
| Ct REF | 23.27 | 23.55 | 23.19 |
| 모든 SCM 값이이 최소를 정상화 | |||
| 샘플 1 | 샘플 2 | 샘플 3 | |
| Ct SCM | 0.05 | 0 | 0.13 |
| 나 및 REF의 Ct 값에서이 값을 빼기 | |||
| 샘플 1 | 샘플 2 | 샘플 3 | |
| Ct 나 | 22.87 | 22.36 | 22.45 |
| Ct REF | 23.22 | 23.55 | 23.06 |
표 2: 미르 식 비교 polysome와 nontranslating 분수에 대 한 실시간 PCR 계산 샘플. (나) 관심과 참조 유전자 (REF)의 miRNAs 허 혈 또는 국 소 빈 혈 또는 reperfusion 후 쥐의 풀링된 무거운 분수에 분석 되었다. Ct 값 했다 스파이크-컨트롤 (SCM) Ct 값, 다음 2-ΔCt 수식으로 정규화 처음 미르 식 비교 하 사용 되었다.
| 메서드 | 샘플 볼륨 [mL] | 단백질 식별의 # | 코멘트 |
| FASP | 1 | 227 | 필터에 침전 하는 자당의 대량 |
| 아세톤 강 수 | 0.6 | 372 | 튜브 아래쪽에 자당의 점성 슬러지 4:1 (시 약: 샘플) 볼륨; 아니 보이는 단백질 펠 릿 |
| 클로 프롬/메탄올 강 수 | 0.32 | 389 | 튜브 아래쪽에 자당의 점성 슬러지 8:1 (시 약: 샘플) 볼륨; 아니 보이는 단백질 펠 릿 |
| TCA 강수량 (4 ° C)에서 | 0.5 | 405, 415 | 아니 자당 강 수; 0.12:1 (시 약: 샘플) 볼륨; 튜브 하단에 보이는 펠 릿 |
| 다시 강 수 | 85, 60 | 상쾌한 첫 펠 릿 수집 된 후의 추가 TCA 강수량 | |
| (-20 ° C)에서 TCA 강수량 | 0.5 | 440, 430 | 아니 자당 강 수; 0.12:1 (시 약: 샘플) 볼륨; 튜브 하단에 보이는 펠 릿 |
| 다시 강 수 | 81, 55 | 상쾌한 첫 펠 릿 수집 된 후의 추가 TCA 강수량 |
표 3: 단백질 추출 방법의 비교. FASP, 아세톤 강수량, 클로 프롬/메탄올 강 수 및 4 ° C와-20 ° C에서 TCA 강수량 평가 했다. 목표 확인 된 단백질의 수를 최대화 하는 것 이었다. TCA precipitations 재현성을 확인 하는 자료의 두 번째 배치에 평가 했다.
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Discussion
Polysome 프로필 분석 특정 mRNA 또는 전체 transcriptome6,7의 변환 상태를 분석 하 여 단백질 번역의 연구에 대 한 수 있습니다. 그것은 또한 큰 도움이 현지 번역 synaptosomes8같은 공부 될 필요가 있을 때입니다. 전통적으로,이 방법은 모노-및 polyribosomes 및 자당 그라디언트는 수와 결합 게놈 또는 의도 된 결과6,9를 proteomic 기술을에 관련 된 mRNAs의 분리를 포함 한다. 예를 들어, 우리의 그룹에 의해 수행의 최근 연구는 환자 CPB, 국 소 빈 혈 또는 reperfusion 상해 모방의 마음에서 실행 post-transcriptional 규제 메커니즘을 밝혔다. Polysome 프로 파일 분석을 이용해 우리 CPB 절차2후 마음에 인코딩된 핵 미토 콘 드리 아 단백질의 번역에서 증가 나타났습니다.
여기에 제시 된 동적 프로테옴 polyribosomal 프로 파일링 접근 polyribosomes 및 단백질 번역 되 고 그와 관련 된 mRNAs의 인구에서 변화를 밝힐 수 있다. MRNAs의 번역 일부 miRNAs에 의해 경 세 된다로이 분수에 miRNAs의 분석 추가 통찰력을 밝힐 수 있다. 사실, 여러 연구 결과이 방법은 수정 있고 미르 모드 레 귤 레이 션10,11의 조사에 적합 하 고 신뢰할 수 있는 접근을 할 그것을 증명.
많은 연구는 지난 10 년간 일 지라도, miRNAs의 역할에 다양 한 생물 학적 기능12,13에 그들의 중요성을 고려에서 실시 되었습니다. 이후 miRNAs 저하에 대 한 그들을 표시합니다 하기 위하여 대응 mRNAs와 자료 쌍을 통해 행동, polysome 프로필 분석 수행 되었으며 miRNAs는 사실 번역 mRNAs14, 을 타겟팅 polysome 분수 있는 표시 15 , 16. 미르-21 그것이 낮은 억제 및 정상 세포에서 암 세포에 polysomes와 함께 협회는 증가 하 고 억압 적인 효과 훨씬 더 강한17바인딩 약한 polysomes 관련 된 좋은 예입니다.
본이 연구에서는 실시간 PCR 분석 이루어졌다 (MOI)의 miRNAs의 Ct 값을 사용 하 여, 스파이크-Ct 값 제어 샘플 중 안정 미르 (SCM) 기술 변화와 참조 유전자 또는 miRNA (REF)의 Ct 값을 줄이기 위해. 첫 번째 단계는 나의 SCM의 Ct 값을 REF Ct 값을 정상화 했다. 다음 심판을 나의 두 번째 단계 표준화와 결과 값 2-ΔCt 수식을 계산 하는 데 사용 되었다. 이러한 값 또는 값 배 변경 그룹 간의 차이 보여 주기 위해 사용할 수 있습니다.
단백질의 추출 polysome 분수에서 어려운 이기 때문에, 지금까지 수행 하는 연구의 대부분은 서쪽 오 점 분석 대 직접 분수를 사용 했습니다. 그들은 단순히 각 분수 및 혼합 SDS-로드와 함께 그것은 SDS 페이지 분석8,18에 사용할 버퍼의 단백질 콘텐츠 침전 물. 여기, 우리는 뿐만 아니라 추출 mRNAs를 miRNAs 분류, 후 뿐만 아니라 펩 티 드 및 단백질 질량 분석 분석으로 진행 하는 높은 품질을 얻을 수 있는 방법을 개발 했습니다.
이 방법은 확장할 수 더 적극적으로 신진 대사 biorthogonal 아미노산 체, 메티오닌19,20azidohomoalanine (AHA) 등 같은 라벨을 사용 하 여 새로 합성된 단백질을 측정 하 여. 아 뒤 클릭 화학 설립 streptavidin AHA를 통합 하는 모든 단백질의 정화 다음 biotin 태그의 설립에 대 한 수 있습니다. 그러면 새로 합성된 단백질의 명확한 식별-동적 프로테옴의 다른 부분. 번역 및 nontranslating 분수는 자극에 대 한 응답에서 중 재배포 miRNAs의 탐지 (내가 여기 / R) 단백질 번역의 동적 규칙의 심문 수 있습니다. 그러나, 리보솜 바인딩된 mRNA의 부근에 miRNAs 모집 요인 식별 하 고 체계적으로 조사를 남아 있다.
우리의 연구는 TCA 강수량 외에 우리가 테스트 polysome 분수에서 단백질 추출에 대 한 세 가지 다른 방법: i) FASP (필터 지원 샘플 준비)21, 2) 아세톤 강 수, 및 iii) 클로 프롬/메탄올 강 수. 방법의 적합성 모두 자당의 높은 농도 가진 분수를 처리 능력에 따라 평가 되었다 (최대 50%까지) 및 단백질 질량 분석 (그림 7 및 표 3)에 의해 식별 번호.
FASP 방법에 대 한 우리 30 kDa의 상대 분자 질량 커트 오프와 함께 한 단위 고용 FASP 단백질 소화 키트에 의해 주어진 샘플 준비의 프로토콜을 따 랐 다. 이 필터 단위 세제 제거, 버퍼 교환, 단백질 소화 및 펩 티 드 차입 하기 위한 도구로 후속 펩타이드 분리 그렇지 않으면 방해는 높은 분자 무게 물질 (단백질 및 DNA)를 유지 하는 기능 제공 21. 샘플 포함 하는 요소와 함께 혼합 했다 짧게, 버퍼 및 iodoacetamide 솔루션으로 회전 하는 단계와 단위 회전 필터에 로드 트립 신 솔루션 및 나트륨 염화 물 솔루션 (차입) 이후에 추가 되었다. 소화 펩 티 드를 포함 하는 최종 filtrate TFA에 의해 산성화, desalted 이었고 질량 분석 분석을 위해 저장. 그러나이 방법을 사용 하 여,, 침전 된 자당의 대량 꾸준히 축적는 원심 분리를 렌더링 하 고 어려운 단계를 세척 필터 상단.
강 수 아세톤, 클로 프롬/메탄올 강수량에 대 한 용의 여러 볼륨 샘플의 단일 볼륨에서 단백질을 침전 시키기 위하여 필요 했다. 이 강 수 1.5 mL 튜브 (단백질 낮은 보존 관)에서 수행한 때 적용 샘플 볼륨의 크기를 제한 합니다. 뿐만 아니라, 자당의 점성 슬러지 두 방법에 대 한 강 수 후 튜브의 하단에 축적 하 고 아세톤 강수량 및 클로 프롬/메탄올 강 수 후 액체 인터페이스와 튜브 하단에 아무 표시 펠 릿 했다 각각.
표 3 및 그림 7 우리가 우리의 실험 워크플로우를 최적화 하는 데 사용 하는 4 개의 단백질 추출 방법의 비교를 보여준다. 각 방법 (그림 7)에서 빨간 숫자는 질량 분석에 의해 확인 된 단백질의 수를 나타냅니다 (섹션 5.2 및 5.3 참조). 각 방법에 사용 된 샘플 볼륨 다른 했지만, 클로 프롬/메탄올과 TCA precipitations 결과 확인 된 단백질의 높은 숫자. 그러나, (샘플 볼륨 제한 및 자당 강수량) 위에서 언급 한 단점 때문에 우리 이후의 실험에 대 한 TCA 강수량에 대 한 선택 했다.
샘플 처리에 대 한 최적의 조건을 찾으려고 TCA 강 수는 다양 한 온도와 TCA 농도22,,2324실시 됐다. 따라서, 우리는 10.7%와 강 수 수행 4 ° C와-20 ° C에서 TCA와 TCA의 추가 60 µ L과 supernatants에 추가 시 켰 던 (최종 19.4 %TCA) 펠 릿 수집 된 후. 이 4 개의 펠 릿 분석 했다 질량 분석으로 구분에서 결과. 또한, 우리는 두 번 얻은 결과 했다 재현할 수 있도록 전체 프로토콜 반복. 워크플로 및 2 개의 반복된 실험으로 4 ° C와-20 ° C 조건에서 펠 릿에서 확인 된 단백질의 수는 그림 7 (빨간색에서 숫자)에 표시 됩니다. 펠 릿의 분석에서 파생 된 supernatants 굴복 단백질 (85 그리고 4 ° C; 81에서 60-20 ° C에 55);의 추가 수 대부분 단백질의 첫 번째 알 약에 이미 발견 했다 따라서, 우리는 10.7%를 사용 하기로 하 고 모든 후속 실험에 대 한 TCA. 우리 여러 장점으로 인해 TCA 강수량을 선호 하는 클로 프롬/메탄올 강수량 TCA 강수량에 비해 단백질 식별의 유사한 수 귀착되 었 다, 비록: 나) 작은 양의 용 매 (60 µ L TCA의 단백질을 침전 하는 데 필요한 vs 클로 프롬/메탄올/물 1.28 mL) 강 수, ii에 대 한 1.5 mL 튜브를 사용 하 여 편리 하 게 하면서 필요한 경우 더 큰 샘플의 사용) 튜브 아래쪽, 및 iii에 펠 릿의 가시성) 동안 자당의 아무 축적 강 수 단계입니다.
변환 상태에 대 한 자세한 기능 정보를 제공 하 고에 불구 하 고이 방법의 주요 결점은 신선 하 고 큰 시작 물자에 대 한 필요. 많은 연구 결과 세포 또는 직물의 작은 볼륨을 사용 하 여 조건을 최적화 하거나 추출 RNA와 단백질25의 효율성을 증가 하는 단계를 추가 하려고 했습니다. 아직도, 조직 같은 실험 조건 하에서 다른 동물 로부터 얻은 수 뽑아 함께, 경우 필요 하다.
결론적으로,이 프로토콜은 mRNA, 미르, 그리고 분수 polysome 국 소 빈 혈 또는 reperfusion에 관련 된 규제 메커니즘 연구를 프로 파일링에서 얻은에서 단백질의 동시 분석에 대 한 수 있습니다. 그러나, 더 연구는 국 소 빈 혈 또는 reperfusion 후 번역 mRNAs는 유발 여부와 만약 그들이 해제 됩니다 스트레스의 제거에 따라 참조 해야 합니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
NIH P01 HL112730 (걸 레, JVE), NIH R01 HL132075 (걸 레, JVE), 바브라 스 트라이 샌드 여자의 심장 센터 (걸 레, JVE), 도로시와 E. 필립 리옹 분자 심장 (걸 레)에서 자, 에리카 글 레이저 부여 여성의 심장 건강 (JVE)에 체코 과학 아카데미의의 자 제도적 지원 RVO: 68081715 (MS)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pentobarbital | Vortech Phamaceuticals | 9373 | for euthansia |
| Heparin | Sagent | 103424 | used in langendorff preparation |
| forceps | Fine Science Tools | 91110-10 | used to hang the heart |
| Langendorff system | Radnoti + home made | n/a | A 'four heart' system consisting of custom blown glass, tubing and water baths |
| NaCl | Sigma | S7653-5KG | Krebs buffer and Sucrose gradient |
| KCl | Sigma | P5405 | Krebs buffer and Lysis buffer |
| KH2PO42 | Sigma | P-5504 | Krebs buffer |
| MgSO4 | Sigma | M7774-500G | Krebs buffer |
| Glucose | Sigma | G5767 | Krebs buffer |
| CaCl2 | Sigma | C1016-500G | Krebs buffer |
| Sucrose powder | Sigma | S0389-1KG | Sucrose gradient |
| MgCl2 | Sigma | 208337 | Sucrose gradient and Lysis buffer |
| Tris-base | Sigma | T1503-1KG | Sucrose gradient and Lysis buffer |
| Xylene Cyanole | Sigma | X-4126 | Sucrose gradient |
| Cycloheximide | Sigma-aldrich | 239763 | Sucrose gradient and Lysis buffer |
| RNaseOUT | Life Technologies | C00019 | RNAse inhibitor for Lysis buffer |
| Igepal CA-360 (NP40) | Sigma | I3021 | Lysis buffer |
| Protease Inhibitor Cocktail tablets, EDTA free | Roche | 5056489001 | |
| Tube, Thinwall, Ultra-Clear, 13.2 mL, 14 mm x 89 mm | Beckman Coulter | 344059 | |
| Ultracentrifuge | Beckman | LE-80K | Ultracentrifugation of the gradients |
| Rotor | Beckman | SW41 | Ultracentrifugation of the gradients |
| Biologic LP (pump) | Biorad | 731-8300 | Fractionation of the gradients |
| BioFrac | Biorad | 741-0002 | Fractionation of the gradients |
| Eppendorf RNA/DNA LoBind microcentrifuge tubes, 2 mL tube | Sigma | Z666513-100EA | Gradient fraction and RNA extraction |
| TRIzol Reagent | Life technologies | AM9738 | RNA extraction |
| Luciferase Control RNA | Promega | L4561 | RNA extraction |
| Chloroform | Fisher Scientific | C606-4 | RNA extraction |
| Glycogen, RNA grade | Thermo Fisher Scientific | R0551 | RNA extraction |
| Isopropanol | Sigma | I9516 | RNA extraction |
| Ethanol | Sigma | E7023-1L | RNA extraction |
| iScript cDNA Synthesis Kit | BioRad | 170-8891 | Reverse transcription |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | BioRad | 175-5122 | Quantative PCR |
| miRNeasy Micro Kit (50) | Qiagen | 217084 | Kit for total RNA isolation |
| miScript II RT Kit (50) | Qiagen | 218161 | Kit for miRNA reverse transcription |
| miScript Sybr Green PCR Kit (200) | Qiagen | 218073 | Kit for real-time PCR expression analysis of miRNAs |
| Centrifuge 5424R | Eppendorf | For centrifugation of 1.5 mL or 2.0 mL tubes at different temperatures. Max speed - 21130 x g | |
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | For real-time PCR plate centrifugation at different temperatures. Max speed - 2039 x g | |
| My Cycler Thermal Cycler | Bio-Rad | For reverse transcription | |
| CFX96 Real-Time System/C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | For real-time PCR analysis | |
| miRNeasy Serum/Plasma Spike-in Control | Qiagen | 219610 | For quality control of RNA isolation |
| Hard-Shell 96-Well PCR Plates, low profile, thin wall, skirted, green/clear | Bio-Rad | HSP9641 | For real-time PCR analysis |
| Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical | Bio-Rad | MSB1001 | For real-time PCR plate sealing |
| Research plus Single-Channel Pipette, Gray; 0.5-10 µL | Eppendorf | UX-24505-02 | For pipetting |
| PIPETMAN Classic Pipets, P20 | Gilson | F123600G | For pipetting |
| PIPETMAN Classic Pipets, P200 | Gilson | F144565 | For pipetting |
| Rainin L-1000XLS Pipet-Lite XLS LTS Pipette 100-1000 µL | Gilson | 17011782 | For pipetting |
| Glycogen, RNA grade | Thermo Fisher Scientific | R0551 | Improves total RNA isolation efficiency |
| Posi-Click 1.7 mL Tubes, natural color | Denville | C2170 | RNA isolation and storage; reagent mix |
| Thermal Cycling Tubes -0.2 mL Individual Caps, Standard 0.2 mL tubes with optically | Denville | C18098-4 (1000910) | Reverse transcription reaction |
| Sharp 10 Precision barrier Tips | Denville | P1096-FR | For pipetting |
| Sharp 20 Precision barrier Tips | Denville | P1121 | For pipetting |
| Sharp 200 Precision barrier Tips | Denville | P1122 | For pipetting |
| Tips LTS 1 mL Filter | Rainin | RT-L1000F | For pipetting |
| miScript Primer Assay (200) | Qiagen | (it changes according to the miRNA) | For real-time PCR analysis |
| Gradient Master ver 5.3 Model 108 | BioComp Instruments | For preparation of sucrose gradients | |
| trichloroacetic acid | Sigma Aldrich | T6399 | |
| acetone | Sigma Aldrich | 650501 | |
| Tris hydrochloride | Amresco | M108 | |
| dithiothreitol | Fisher Scientific | BP172 | |
| iodoacetamide | Gbiosciences | RC-150 | |
| sequencing grade modified trypsine, porcine | Promega | V5111 | |
| ammonium bicarbonate | BDH | BDH9206 | |
| formic acid, Optima LC/MS | Fisher Chemical | A117 | |
| methanol, Optima LC/MS | Fisher Chemical | A454 | |
| acetonitrile, Optima LC/MS | Fisher Chemical | A996 | |
| Protein LoBind tubes 0.5 mL | Eppendorf AG | 22431064 | |
| Protein LoBind tubes 1.5 mL | Eppendorf AG | 22431081 | |
| HLB µElution plate 30 µm | Oasis | 186001828BA | |
| SpeedVac concentrator | Thermo Scientific | Savant SPD2010 | |
| sonicator | Qsonica | Oasis180 | |
| centrifuge | Thermo Scientific | Sorvall Legend micro 21R | |
| LC trap column PepMap 100 C18 | Thermo Scientific | 160454 | |
| LC separation column PepMap RSLC C18 | Thermo Scientific | 164536 | |
| mass spectrometer | Thermo Scientific | Orbitrap Elite ion trap mass spectrometer | |
| MSConvert software | ProteoWizard Toolkit | ||
| Sorcerer-SEQUEST software | Sage-N Research, Inc. |
References
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