Summary
Nous présentons ici un protocole pour effectuer le polysome profilage sur le cœur isolé perfusé souris. Nous décrivons des méthodes pour la perfusion cardiaque polysome profilage et analyse des fractions polysome en ce qui concerne les ARNm, miARN et le protéome polysome.
Abstract
Études des changements dynamiques dans la traduction des protéines nécessitent des méthodes spécialisées. Ici, nous avons examiné les changements dans les protéines nouvellement synthétisées en réponse à l’ischémie et reperfusion en utilisant le cœur isolé perfusé souris couplé avec le profilage polysome. Pour mieux comprendre les changements dynamiques dans la traduction des protéines, nous avons caractérisé l’ARNm qui étaient chargés de ribosomes cytosoliques (polyribosomes ou polysomes) récupéré polysomes mitochondriales et comparativement les répartition ARNm et de protéines dans le fractions de haut rendement (nombreux ribosomes attachés à l’ARNm), faible rendement (moins ribosomes attachés) qui comprenait également les polysomes mitochondriales et les fractions non-traduction. miARN peut également être associé ARNm qui est en cours de traduction, ce qui réduit l’efficacité de la traduction, nous avons étudié la distribution des miARN dans les fractions. La distribution des miARN, ARNm et de protéines a été étudiée dans des conditions basales perfusées, à la fin des 30 min de global ischémiques et après 30 min de reperfusion. Nous présentons ici les méthodes utilisées pour réaliser cette analyse, en particulier, l’approche à l’optimisation de l’extraction de la protéine de la gradient de saccharose, car cela n’a pas été décrite avant — et fournissent des résultats représentatifs.
Introduction
Le cœur répond à la lésion d’ischémie (I) et de la reperfusion (R) de manière dynamique. Cependant, il y a petit aperçu des changements aigus dans la synthèse des protéines au cours de la réponse. Pour y remédier, nous avons profité de la méthode bien établie de polysome1 pour identifier les changements dans l’abondance des protéines qui reflètent la redistribution des ribosomes et des facteurs de régulation traductionnelle du cytosol aux polysomes, le profilage et le augmentation des protéines nouvellement synthétisées (NSP). Dans le cadre d’I / R, l’augmentation de la synthèse des protéines nouvelles se produit dans un laps de temps qui est incompatible avec la transcription de l’ARNm nouveau2; en outre, une discordance entre les niveaux d’expression de mRNA et l’abondance de la protéine a été rapporté3. Pour ces raisons, nous avons choisi d’analyser les changements dans le protéome dynamique comme en témoigne la traduction des protéines. Pour ce faire, nous quantifier des ARNm dans les fractions de polysome et d’analyser la composition en protéines dans les fractions de polysome. Enfin, parce que les microARN (miRs) réglemente la disponibilité d’ARNm pour traduction et peut interférer avec l’efficacité de la protéine traduction4,5, nous avons examiné la distribution des miRs dans les fractions de polysome, mettant l’accent sur la réponse à I / r.
Nous avons choisi d’utiliser le modèle de perfusion de Langendorff isolés de souris et tissus récoltés dans des conditions basales de la perfusion continue, après 30 min global ischémiques et après 30 min d’ischémie suivie d’une reperfusion de 30 min. Nous avons ensuite solubilisée le tissu cardiaque et séparés des polysomes sur un gradient de sucrose, suivie de l’analyse protéomique et détection sélective des ARNm et des miARN par PCR et microarray, respectivement. Cette combinaison de méthodes représente une approche puissante pour comprendre le protéome dynamique, qui permet la détection simultanée des ARNm, miRNA et fournisseurs de services réseau, ainsi que la redistribution des protéines régulatrices, miRNA et ARNm entre fractions nontranslating, polysomes de faible rendement et les polysomes de haute efficacité (voir Figure 1). Aperçus de la régulation dynamique de ce processus seront prolongées par une analyse plus approfondie de la phosphorylation des facteurs réglementaires clés tels qu’eIF2α ou mTOR. Maintenant, ces différentes étapes sont décrites en détail.
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Protocol
Toutes les études animales ont été effectués conformément aux lignes directrices et approuvés par l’animalier institutionnel et utilisation Comité du Cedars-Sinai Medical Center.
1. Langendorff Perfusion du cœur de souris
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Perfusion de Langendorff de coeur de souris avec ischémie et reperfusion
- Administrer intrapéritonéale pentobarbital sodique 70 mg/kg à la souris adulte (âgés de 8 semaines, mâle, C57BL6/j). Confirmer une anesthésie profonde par l’absence de retrait à l’orteil pincée.
- Anticoagulate avec de l’héparine intrapéritonéale 500 U/kg.
- Ouvrir le coffre par incision sternal. Ouvrir le diaphragme et couper le long de la frontière côtière à l’axe axillaire antérieure. Ensuite, couper l’axe axillaire antérieure jusqu'à la patte avant d’ouvrir complètement la cage thoracique. Après, visualisation des coeur, serrer l’aorte ascendante avec une pince et exciser rapidement le cœur. La mort est due à l’exsanguination. Placer le cœur au froid Krebs (NaCl 6,9 g/L de KCl, 0,35 g/L, NaHCO3 2,1 g/L, KH2PO4 0,16 g/L, MgSO4 0,141 g/L, glycémie 2 g/L et CaCl2 0,373 g/L).
- Canule dans l’aorte avec une aiguille à pointe arrondie et perfuse le cœur marqués avec une solution de Krebs en mode de pression constante.
- Après une période de stabilisation de 15 min, sous réserve du cœur un global ischémiques pendant 30 min, suivie d’une reperfusion pendant 30 min.
- Récolter les cœurs après perfusion de base de 15 min, 30 min d’ischémie ou 30 min de reperfusion. Coupez les oreillettes et clin d’oeil-gel le tissu dans l’azote liquide.
- Conserver à-80 ° C jusqu'à l’utilisation
2. tissu homogénéisation, solubilisation et la densité de saccharose sédimentation dégradée
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Préparation de gradient
- Préparer 2 solutions (15 % et 50 %) de saccharose de 100 mL, mélanger 4 mL de NaCl 2,5 M ;
0,8 mL MgCl2 1,25 M ; 1 mL de Tris-HCl 1 M, pH 7,5 ; 15 g ou 50 g de saccharose (15 % et 50 %, respectivement) ; eau ultrapure pour atteindre 100 mL ; et à la couleur de la solution de 15 % de xylène cyanol 0,02 mg/mL) - Filtrer chaque solution (0,22 µm filtres)
- Le jour où que le gradient est à servir, préparer 40 mL de chaque solution de sucrose et ajouter cycloheximide à chaque solution pour obtenir une concentration finale de 100 µg/mL
- Un fabricant de gradient permet de préparer un mélange entre les solutions de saccharose de 15 % et 50 %
- Remplir le compartiment gauche avec 5 mL de la pente de 15 % de saccharose
- Remplissez le compartiment droit avec le gradient de sucrose à 50 %
- Ouvrir le robinet et de mettre en marche la pompe à agiter les deux petits compartiments avec agitateur magnétique
- Utiliser un tube relié au deuxième robinet pour permettre à la solution de saccharose mixtes à l’écoulement dans un tube de centrifugation-ultra avec parois minces. Volume final sera d’environ 10 mL.
- Garder les gradients à 4 ° C (une nuit ou plus si nécessaire, mais pas plus)
- Préparer 2 solutions (15 % et 50 %) de saccharose de 100 mL, mélanger 4 mL de NaCl 2,5 M ;
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Homogénéisation du tissu cardiaque
- Homogénéiser le coeur frais ou congelé avec un polytron dans le tampon de lyse filtrée (modifié pour fractionnement gradient de saccharose) contenant 100 mM KCl, 20 mM Tris pH 7.5, 5 mM MgCl2, 0,4 % NP-40. Inclure le cycloheximide 100 µg/mL pour maintenir la structure de polysome, inhibiteur de RNase U 0,1 et inhibiteur de la protéase cocktail (1 comprimé pour 50 mL).
- Incuber le lysat de glace en 15 min.
- Centrifuger à 18 000 x g pendant 15 min à 4 ° C pour enlever la matière insoluble et recueillir le surnageant.
- Réserve 50 µL pour détermination des protéines, ARN et analyse d’intégrité RNA (voir Figure 2).
- Le surnageant (500 – 100 µL) de couche sur le dessus les gradients et équilibrer les tubes avec tampon de lyse.
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Sédimentation et collection des fractions
- Effectuer ultracentrifugation pendant 120 min à 37 000 tr/min à 4 ° C dans un rotor oscillant de seau. Selon le fabricant, ce qui correspond à 228 000 x g au rayon maximal.
- Collecter chaque dégradé sous forme de 17 fractions (fraction environ 600 µL de chaque) dans des tubes de microcentrifuge avec une surveillance continue de l’absorbance à 254 nm (OD254).
- Le collecteur de fraction du programme comme suit :
- Jeter les premières min 3 de collection (correspondant à du liquide contenu dans les tubes avant le gradient)
- Du 4 au 19 min, recueillir les fractions à la vitesse de 1 mL/min dans les 17 fractions.
- Placer les fractions sur la glace dès que chacun est recueillie. Congeler les échantillons à-80 ° C, si elles ne sont pas traités immédiatement. Un tracé densitométrique typique de UV du dégradé comme elle est collectée est illustré Figure 1.
3. isolement et analyse des ARNm de Polysome et Fractions Nontranslating
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Extraction d’ADN messagère
- Décongeler les fractions sur la glace, s’ils étaient congelés flash après le prélèvement
- Transférer 200 µL de chacune des fractions dans un nouveau tube
NOTE : À cette étape, deux ou plusieurs fractions consécutives peuvent être regroupées ensemble. Il doit être fait soigneusement après avoir analysé le graphe de254 OD afin que les fractions polysome et non-polysome ne se mélangent. - Ajouter 10 ng de la luciférase RNA comme contrôle interne à chaque échantillon dans but de normalisation.
NOTE : Amorces luciférase devraient être utilisés comme témoin interne pour normaliser les résultats. - Ajouter 700 µL de réactif d’extraction d’ARN (monophasique solution de phénol et guanidine isothiocyanate ; voir Table des matières) dans chaque tube. Bien mélanger et laisser incuber les tubes pendant 5 min à ta (température ambiante).
- Ajouter 140 µL chloroforme et le vortex pour 15 s. Incuber pendant 2-3 min à température ambiante.
- Centrifuger les échantillons pendant 15 min à 12 000 x g à 4 ° C.
- Transvaser avec soin la phase aqueuse supérieure dans un nouveau tube.
- Étant donné que la teneur en ARN des fractions n’est pas élevée, ajouter 10 µg de glycogène comme transporteur dans chaque tube.
- Ajouter 350 µL isopropanol dans chaque tube. Bien mélanger et laisser incuber à-20 ° C pendant 1 h augmenter le rendement.
- Centrifuger pendant 15 min à 12 000 x g à 4 ° C.
- Jeter le surnageant et ajouter 700 µL d’éthanol 75 % pour laver le culot de RNA.
- Centrifuger pendant 5 min à 7 500 g à 4 ° C.
- Supprimer l’éthanol et laissez l’air pellet sécher pendant 10 à 15 min.
Remarque : Trop sécher le culot de RNA empêchera sa solubilisation complète dans l’eau. - Resuspendre le culot de RNA dans 50 μL de RNase-libre ultrapure H2O.
- Incuber les échantillons pendant 10 min à 55 ° C.
- 2 μL de chaque échantillon permet de mesurer la qualité et la quantité de l’ARN extrait et stocker le reste à-80 ° C.
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QPCR et transcription inverse
- Utiliser 4 μL de synthèse de cDNA de transcriptase inverse nécessaire (voir la Table des matières) pour une réaction de 20 μL. Préparer le supermix selon le nombre d’échantillons. Transférer le volume requis dans chaque tube et ajouter 5 μl de l’entrée de RNA dans chaque tube. Ce volume peut être corrigé pour être pertinents pour la plage des Taq polymérase des conditions de travail.
- Incuber les tubes dans un thermocycleur avec le programme suivant, recommandé par le fabricant : 5 min à 25 ° C, 20 min de transcription inverse pendant 20 min à 46 ° C et l’inactivation de la transcriptase inverse pendant 1 min à 95 ° C.
- Exécutez le programme optimisé pour chaque paire d’amorces qPCR.
Remarque : Pour détecter la présence de certains ARNm dans les fractions, un volume égal de chaque fraction (de l’ARN isolé) devrait servir pour la transcription inverse.
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Analyse des résultats
- Utilisez la valeur de Ct du gène intéressé et la luciférase pour calculer les valeurs de Ct de delta
- Exprimer chaque delta fraction valeur Ct comme le pourcentage de la valeur totale de mRNA contenue dans toutes les fractions de visualiser la distribution de l’ARNm dans les différentes fractions (tableau 1)
4. isolement et analyse des miARN de Polysome Fractions et Fractions Nontranslating
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Extraction d’ADN messagère et miRNA
Remarque : Ce protocole suit les instructions du fabricant, avec quelques changements.- Décongeler le glycogène et le contrôle à spike. Rester sur la glace.
- Ajouter 700 µL de réactif d’extraction miRNA à 200 µL de l’échantillon.
- Ajouter 1 µg/µL de glycogène et homogénéiser à l’aide de la pipette. Il incuber pendant 5 min à température ambiante.
- Ajouter 3,5 µL de 1,6 x 108 épi-en contrôle et mélanger.
- Ajouter 200 µL de chloroforme et vortex il pendant au moins 15 sec.
- Incuber pendant 3 min à température ambiante.
- Centrifuger à 12 000 x g pendant 15 min à 4 ° C.
- À l’aide d’une pipette, transférer le surnageant dans un nouveau tube de 1,5 mL. Jeter les phases intermédiaire et inférieur.
- Ajouter 1,5 x volume d’éthanol à 100 % au surnageant et mélanger.
- Transférer 700 µL de ce mélange dans la colonne d’extraction de miRNA et il centrifuger à pleine vitesse pendant 15 s à RT et jeter le cheminement ; Répétez cette étape avec n’importe quel échantillon restant.
- Ajouter 700 µL de tampon de 1 à la colonne et il centrifuger à pleine vitesse pendant 15 s à ta ; jeter le cheminement.
- Ajouter 500 µL de tampon 2 à la colonne et il centrifuger à pleine vitesse pendant 15 s à ta ; jeter le cheminement.
- Ajouter 500 µL d’éthanol à 80 % à la colonne et il centrifuger à pleine vitesse pendant 2 min à ta ; jeter le cheminement.
- Transférer la colonne pour une nouvelle 2 mL non écrêtée de tube, ouvrez le couvercle et il centrifuger à RT pendant 5 min à pleine vitesse ; jeter le cheminement.
- Ajouter 16 µL d’eau exempte de RNAse dans la colonne et centrifuger à pleine vitesse pendant 1 min à la RT. garder l’éluat sur glace ou stocker à-80 ° C pour des analyses.
Remarque : Deux microlitres de chaque échantillon peuvent être utilisés pour l’analyse de l’OD.
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Transcription inverse
- Préparer sur la glace. Pour chaque réaction de RT-PCR de 20 µL, ajouter 4 µL de tampon RT miRNA, 2 µL d’acides nucléiques, 9 µL d’ARN total, 2 µL d’enzyme et 3 µL d’eau exempte de RNAse ; mélanger et tourner brièvement vers le bas.
- Définissez le thermocycleur comme suit :
37 ° C pendant 60 min ;
95 ° C pendant 5 min ;
Cale de 4 ° C. - Retirer les tubes du thermocycleur et ajouter 200 µL d’eau exempte de RNAse. Conserver à-20 ° C ou procéder à la PCR en temps réel.
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PCR en temps réel
Remarque : Ce protocole suit 96 puits plaque format. Préparer le mélange de réaction sur la glace.- Préparer le mélange de réaction PCR et ajouter des ADNc (à partir de miARN ci-dessus) selon la plage acceptée par le protocole. Plusieurs réactions peuvent être préparées dans le lot.
- Ajouter un total de 25 µL du mélange PCR + ARNC dans chaque puits.
- Sceller la plaque à l’aide d’un joint de la plaque optique.
- Centrifuger la plaque pendant 1 min à 1 000 x g à la température ambiante.
- Programmez le cycler en temps réel comme suit :
Étape d’activation initiale à 95 ° C pendant 15 min ;
3-étape cyclisme : dénaturation à 94 ° C pendant 15 s ; recuit à 55 ° C pendant 30 s ; extension à 70 ° C pendant 30 s (effectuer la collecte de données de fluorescence) ; Ajouter 40 cycles ;
Courbe de fusion selon la valeur par défaut de cycler.
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Analyse comparative
- Exemple de normalisation (voir tableau 2) :
- Trouver la valeur minimale de la SCM.
- Normaliser toutes les valeurs SCM à ce minimum.
- Soustraire cette valeur à partir des valeurs de Ct de miARN d’intérêt (MOI) et le gène de référence (REF).
- Analyser les données à l’aide de la formule 2-ΔCt .
- Exemple de normalisation (voir tableau 2) :
5. analyse protéomique
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Extraction des protéines des fractions de polysome
- Combiner les fractions collectées saccharose en trois fractions finales. Marquer les fractions comme lourd (polysomes de rendement élevé dans les fractions commun 4, 5, 6 et 7 la plus forte concentration de saccharose, fond du tube dégradé), lumière (polysomes de faible efficacité en fraction mise en commun, 8, 9, 10 et 11 ; milieu de la tube de gradient) et non-traduction (fractions commun 12, 13, 14 et 15 avec la plus faible concentration de saccharose ; sommet du tube dégradé). Effectuer dosage protéique sur des fractions commun.
- Préparation 100 % stock d’acide trichloracétique (TCA) et conserver à 4 ° C dans l’obscurité. 0,5 mL de l’échantillon se mêlent 60 µL de 100 % TCA et incuber à-20 ° C durant la nuit dans l’obscurité.
Remarque : Utiliser des tubes de rétention de faible teneur en protéines de 1,5 mL (voir Table des matières). - Après une nuit d’incubation, décongeler l’échantillon sur la glace et centrifuger à 15 000 x g, 4 ° C pendant 30 min. jetez surnageant.
Remarque : 100 µg de protéines dans l’échantillon donne pellet protéine visible dans le bas du tube. - Acétone pré refroidissement dans le congélateur-20 ° C. Ajouter 0,5 mL d’acétone froid au culot de protéine et centrifuger à 15 000 x g, 4 ° C pendant 15 min. jetez surnageant. Répéter cette étape deux fois.
- Sécher à l’air le culot. Resuspendre le culot dans 360 µL de tampon Tris-HCl à 50 mM (pH 8).
Remarque : Si nécessaire, utilisez un sonicateur impulsion pour Resuspendre le culot. - Ajouter 40 µL de 0,1 M le dithiothréitol (concentration finale 10 mM) et incuber à 55 ° C sur l’agitateur pendant 45 min. Ajouter 50 µL de 0,15 M iodoacétamide (concentration finale 17 mM) et incuber à température ambiante sur l’agitateur pendant 30 min dans l’obscurité.
- Préparer la solution de trypsine : resuspendre 20 µg de trypsine dans 100 µL de bicarbonate d’ammonium 50 mM. Ajouter un volume correspondant d’une solution de trypsine à échantillon à 01:50 (w/w) rapport de la trypsine : protéine, veiller à ce que le pH est de 8 et incuber sur agitateur à 37 ° C pendant la nuit.
NOTE : Ajouter le bicarbonate d’ammonium 1 M pour amener le pH à 8. - Après la digestion trypsique, cool l’échantillon, centrifuger brièvement dans la centrifugeuse de paillasse, ajouter 10 % d’acide formique à pH 2 et 3 à étancher l’activité de la trypsine et aller de l’avant avec l’échantillon de dessalage.
Remarque : Utilisez la plaque de µ-élution pour échantillon de dessalement. - Condition de sorbant dans les puits de 96 puits plaque avec 200 µL du méthanol à l’aide de vide trois fois suivie par le conditionnement 200 µL d’acide formique 0,1 % trois fois. Charger l’échantillon et d’effectuer un lavage de l’échantillon avec 200 µL d’acide formique 0,1 % trois fois. Éluer l’échantillon avec 100 µL de 50 % d’acide formique acetonitrile/0.1% deux fois dans le tube de 0,5 mL de rétention faible en protéines.
NOTE : Éluer l’échantillon lentement dans un premier temps à l’aide de gravitation suivi par vide bas. - Évaporer l’éluat échantillon à sec à l’aide de concentrateur et soit procéder directement analyse par spectrométrie de masse ou de magasin à-80 ° C jusqu'à l’utilisation.
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Analyse par spectrométrie de masse
- Reconstituer chaque pellet (comprenant les peptides tryptiques) dans 50 à 100 µL et injecter 1 µL de spectromètre de masse.
Remarque : Optimiser la reconstitution et l’injection de volumes pour obtenir l’intensité maximale du signal LC/MS/MS. Dans notre cas, le signal maximal (ion totale actuelle ; TIC) dans le cœur de l’analyse se situait dans la fourchette de 1E8 à 2E9. - Utiliser un piège à colonne C18 (300 µm d.i. x 5 mm, 5 µm, 100 a) suivi par séparation de peptide à l’aide de la colonne C18 (75 µm d.i. x 250 mm, 2 µm, 100 a) avec un réglage de taux de débit à 300 nL/min Set la température capillaire de nano-source à 275 ° C et la tension de pulvérisation à 2 kV.
- Appliquer un dégradé linéaire B de 5 à 35 % pendant 90 min, 35 – 95 % B pendant 3 min, attente à 95 % B pendant 7 minutes et équilibrage à 5 % B pendant 25 min (r : 0,1 % d’acide formique/eau et B: 0,1 % d’acide formique dans l’acétonitrile). Acquérir des spectres de MS2 15 ions plus haute intensité de chaque scan MS1 mode de CID. Utiliser 3 répétitions de spectrométrie de masse pour chaque échantillon analysé.
NOTE : Optimiser et utiliser les conditions expérimentales et les paramètres qui conviennent à vos échantillons sur l’instrument de spectrométrie de masse particulière. Les conditions et les paramètres mentionnés à l’article 5.2. ont été utilisés et optimisés dans notre laboratoire.
- Reconstituer chaque pellet (comprenant les peptides tryptiques) dans 50 à 100 µL et injecter 1 µL de spectromètre de masse.
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Identification de protéines/dosage
- Après analyse de spectrométrie de masse, convertir les fichiers raw de spectres en fichiers compatibles mzXML à l’aide du logiciel MSConvert (http://proteowizard.sourceforge.net/tools/msconvert.html).
- Soumettre les fichiers convertis dans moteur de recherche SEQUEST avec les critères de recherche, par exemple, UniProtKB/Swiss-Prot souris de base de données (plus à jour revue canonique) ; digest de semi enzymatique à l’aide de la trypsine (après KR /-) ; avec jusqu'à 2 raté clivages ; gamme de masses précurseur : 400 à 4 500 amu ; modification statique : carbamidomethyl (C) 57,021465 UMA ; la masse tolérance peptide : 50 ppm ; fragment de type masse : monoisotopique.
Remarque : Autres recherche de base de données de protéine moteurs et données pipelines peut être utilisés. Si vous utilisez la base de données pour par exemple le rat, qui est moins complète que les bases de données pour les souris et les humains, vous devrez peut-être Rechercher contre la souris (ou homme) bases de données pour accroître la couverture du protéome. Dans ce cas, redondance dans les noms de protéines devront être retirés. - Effectuer une analyse de la recherche. Configurez les filtres d’affichage des données. Par exemple, définir une probabilité minimale en protéines (seuil de protéines) dans le 95 ou 99 %, c'est-à-dire seulement les protéines pour lesquels une analyse statistique implique 95 ou 99 % de probabilité d’être présents dans l’échantillon seront affichera. Positionnez le filtre seuil de peptide (par exemple, 95 %), soit une probabilité minimale qui sera utilisée pour déterminer si un spectre identifie un peptide. Sélectionnez le nombre minimal de peptides qui permettra de déterminer si une protéine est présente (2 peptides au minimum pour l’identification des protéines est recommandé).
- Évaluer des protéines identifiées pour la qualité/quantité. Veiller à ce que les peptides proteotypic sont utilisées pour la quantification. Si l’isoforme est identifié s’assurer que c’est base sur l’observation d’un peptide trypsique constitué en une séquence d’acides aminés unique à l’isoforme spécifique. Toutes les protéines « semblables » ou hypothétiques devraient subir une comparaison pour voir si l’observé peptides correspondent à une protéine connue.
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Representative Results
analyse de l’ARNm
résultats de l’ARNm peuvent être exprimées comme une distribution d’un ARNm spécifique dans chacune des fractions (Figure 3 a) ; pour la quantification, combiner des fractions de traduction polyribosomiques et comparer à la fraction non-traduction (Figure 3 b), présentant un rapport de l’abondance d’ARNm dans la traduction des fractions nontranslating. Des informations supplémentaires sont acquise en examinant les fractions de polysome haute efficacité séparément des fractions de faible rendement polysome (et séparé des fractions nontranslating). Ceci est particulièrement important lorsqu’on analyse les miARN, qui est enrichis dans les fractions de faible rendement (où ils interfèrent avec la traduction des protéines de leurs ARNm cible).
Représentant des résultats pour un ARNm particulier évolution sa répartition entre les fractions traduction et nontranslating après que le coeur de souris ont été soumis à l’ischémie et ischémie/reperfusion par rapport au simulacre affichés dans la Figure 4.
analyse de tableau de miRNA
Résultats représentatifs d’une analyse de tableau de miRNA sont indiquées à la Figure 5. Ici, un sous-ensemble des miARN (plaque personnalisés tableau) ont été analysés dans les fractions lourdes mis en commun, indiquant que les 22 miARN était associées aux polysomes pendant l’ischémie, 9 miRNas durant l’ischémie et reperfusion, avec 7 qui étaient communs aux deux conditions. Cela montre que l’association des miARN est dynamique en réponse aux contraintes de l’ischémie et reperfusion.
Analyse protéomique
Analyse des fractions lourdes, légères et non-traduction d’échantillon de sham (contrôle) :
881 des protéines totales ont été identifiés par spectrométrie de masse ; 3, protéines 46 et 208 du total étaient uniques aux fractions lourdes, la lumière et non-trans, respectivement (Figure 6 a). La majorité (88 %) des protéines ribosomales mitochondriales (28 et 39 s) ont été identifiée dans la fraction légère (36 des 41) et une majorité (88 %) des protéines ribosomales cytosoliques (40 s et 60 s) ont été couramment identifiés dans les fractions lourdes et légères (53 sur 60) confirmant la protéomique et la séparation efficace capacité d’identifiés plus lourd cytosoliques vs briquet mitochondriales protéines ribosomiques. Le sous-ensemble de protéines ribosomiques mitochondriales et cytosoliques identifiées est illustré à la Figure 6 b.
Figure 1 : profil d’absorbance UV typique des fractions de polysome sur gradient de saccharose. Les trois premières fractions représentent un volume vide dans le tube. La haute efficacité (poids moléculaire élevé, HMW) fractions sont collectées dans les fractions 4-7, le faible rendement (faible poids moléculaire, FPM) fractions 8-11 et la non-traduire (et cytosolique matière restante) est recueilli dans les fractions 12-15 ( nontranslating, NTR). La ligne rouge indique la conductivité, et la trace bleue absorbance UV à 254 nm. Sur la droite est une caricature d’un tube à essai avec saccharose dégradé, affichage répartition des polysomes après sédimentation. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : analyse de contrôle de l’intégrité de RNA sur Bioanalyzer. Numéro de l’intégrité RNA (RIN) de l’ARN total isolé de lysat de tout cœur. RIN est calculée selon les pics de 18 s et 28. Gamme RIN : 1-10 et RIN = 10 représente une très bonne intégrité. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : profil représentatif de distribution de l’ARNm en gradient de saccharose. Coeurs ont été soumis à la perfusion de Langendorff basale ou ischémie et reperfusion (I / R). (A) les lysats de coeur ont été résolus sur gradient de sucrose et contenu d’ARNm de GAPDH (à gauche) et COX4 (à droite) ont été déterminées dans chaque fraction. Intrigue montre l’abondance relative de chaque fraction (fraction nombre sur l’axe des abscisses) ARNm pour perfusion basale (sham, ligne rouge et diamants) et une ischémie/reperfusion (I / R, la ligne bleue et carrés). Superposé sur le terrain sont absorbance UV indiquant le contenu total ARNm (courbe gris clair) et conductance (ligne en pente droite grise). Les cases indiquent comment les fractions ont été regroupées. (B) parcelle de graphique à barres montre ratio d’ARNm dans la traduction des fractions de (polysomes) vs nontranslating (NT) de GAPDH (à gauche) et COX4 mRNA (à droite). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : résultats représentatifs mRNA. Dosage d’un ARNm dans les fractions commun (HMW, FPM, NTR) montrant des changements selon le groupe expérimental. Fractionnement de polysome de coeurs de souris a été réalisé après la perfusion de Langendorff. Résultats sont tracés en % du total ARNm (panneau du haut) et comme rapport de polysomes (HMW + FPM) fraction nontranslating (NTR). Barres d’erreur représentent les résultats de 5 coeurs par groupe (trompe-l'œil, ischémie ou j’ai / R). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : résultats représentant miRNA. Diagramme de Venn d’une voie axée miRNA analyse montrant et miRNAs réprimés dans les piscines de la fraction lourde d’échantillons de souris selon le cœur ischémie ou ischémie et reperfusion. Valeur limite : 1,5 fois. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : protéines identifiées par spectrométrie de masse. (A) diagramme de Venn des protéines communes et distinctes des fractions lourdes, la lumière et non-trans. (B) sous-ensemble des protéines ribosomiques mitochondriales et cytosoliques identifiés. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 7 : les workflows schématiques pour les méthodes d’extraction de protéines testée. Les méthodes d’extraction de protéines ont été testées en utilisant l’échantillon factice (contrôle) et lourds (polysomes haute efficacité) fraction à plus haute teneur en saccharose. Chiffres en rouge indiquent le nombre de protéines qui ont été identifiés par spectrométrie de masse ; Lorsque les deux nombres sont affichés, ils sont des deux expériences distinctes. La description détaillée est donnée dans le texte. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| FRACTIONS | GENE Ct | LUCIFÉRASE Ct | ΔCt | 2ΔCt | SOMME DE TOUTES LES FRACTIONS | % DE CHAQUE FRACTION | Ratio de polysome/NTR |
| Rendement élevé (HMW) | 28,75 | 22,79 | 5.96 | 0,016 | 0,046 | 34,64 | 2,77 |
| Faible efficacité (FPM) | 28.43 | 22.63 | 5,80 | 0,018 | 38,81 | ||
| Traduction non (NTR) | 29.12 | 22.77 | 6.35 | 0,012 | 26.55 | ||
| Polysome/NTR Ratio = (HMW + FPM) / NTR |
Tableau 1 : Analyse de l’ARNm de l’échantillon. Méthode d’analyse d’un ARNm est indiquée pour les différentes fractions commun (HMW, FPM, NTR) après PCR quantitative. ΔCt = gène Ct - luciférase Ct, et la 2ΔCt est 2ΔCt.
| Trouver la valeur minimale de la SCM : 22.77 | |||
| Échantillon 1 | Échantillon 2 | Exemple 3 | |
| CT MOI | 22.92 | 22.36 | 22.58 |
| CT SCM | 22.81 | 22.77 | 22,9 |
| CT Réf | 23.27 | 23.55 | 23.19 |
| Normaliser toutes les valeurs SCM à ce minimum | |||
| Échantillon 1 | Échantillon 2 | Exemple 3 | |
| CT SCM | 0.05 | 0 | 0,13 |
| Soustraire ces valeurs à partir des valeurs de Ct de MOI et REF | |||
| Échantillon 1 | Échantillon 2 | Exemple 3 | |
| CT MOI | 22,87 | 22.36 | 22.45 |
| CT Réf | 23.22 | 23.55 | 23.06 |
Tableau 2 : exemple de calcul de PCR en temps réel pour comparaison de miRNA expression polysome et fractions nontranslating. miARN d’intérêt (MOI) et le gène de référence (REF) ont été analysés dans les fractions lourdes mise en commun des souris après une ischémie ou une ischémie/reperfusion. Le Ct tout d’abord, les valeurs ont été normalisées pour le contrôle de pointe à valeur de Ct (SCM), puis la formule 2-ΔCt a été utilisé pour comparer les miRNA expression.
| Méthode | Volume de l’échantillon [mL] | # des protéines identifiées | Commentaires |
| FASP | 1 | 227 | en masse de saccharose a précipité sur filtre |
| précipitation de l’acétone | 0,6 | 372 | boues visqueuses de saccharose dans la partie inférieure du tube ; volumes de réactif (échantillon : 4 / 1) ; aucune granule de protéine visible |
| précipitation de chloroforme/méthanol | 0,32 | 389 | boues visqueuses de saccharose dans la partie inférieure du tube ; volumes de réactif (échantillon : 8 / 1) ; aucune granule de protéine visible |
| Précipitation de TCA (à 4 ° C) | 0,5 | 405, 415 | aucune précipitation de saccharose ; 0.12:1 (réactif : échantillon) volumes ; pellet visible dans le bas du tube |
| re-précipitations | 85, 60 | précipitation de TCA supplémentaire du surnageant après que première boulette a été recueilli | |
| Précipitation de TCA (à-20 ° C) | 0,5 | 440, 430 | aucune précipitation de saccharose ; 0.12:1 (réactif : échantillon) volumes ; pellet visible dans le bas du tube |
| re-précipitations | 81, 55 | précipitation de TCA supplémentaire du surnageant après que première boulette a été recueilli |
Tableau 3 : Comparaison des méthodes d’extraction de protéine. FASP, acétone précipitations, précipitations de chloroforme/méthanol et précipitation de TCA à 4 ° C et -20 ° C ont été évalués. Le but était de maximiser le nombre de protéines identifiées. Précipitations de la TCA ont été évaluées sur un second lot de matériel pour confirmer la reproductibilité.
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Discussion
Analyse du profil de polysome permet l’étude de la traduction des protéines en analysant l’État translationnelle d’un ARNm spécifique ou le transcriptome ensemble6,7. Il est également d’une grande aide lorsque la traduction locale doit être étudié comme synaptosomes8. Traditionnellement, cette méthode consiste à séparer des mono - et polyribosomes et les ARNm associés sur un gradient de saccharose peut être couplée à génomiques ou protéomiques techniques pour obtenir les résultats escomptés6,9. Par exemple, une étude récente réalisée par notre groupe a révélé un mécanisme de régulation post-transcriptionnelle exécuté dans le cœur de patients subissant un OPC, qui imite la lésion d’ischémie/reperfusion. Profitant de l’analyse du profil de polysome, nous avons montré une augmentation dans la traduction des protéines mitochondriales codées en coeur après CPB procédure2.
L’approche de profilage polyribosomiques proteome dynamique présentée ici peut révéler des changements dans la population des ARNm associé aux polyribosomes et les protéines qui sont activement en cours de traduction. Comme la traduction des ARNm est régie en partie par les miARN, analyse des miARN dans ces fractions peut révéler des idées supplémentaires. En effet, plusieurs études ont modifié cette méthode et a prouvé qu’il est une approche adaptée et fiable pour enquêter sur le mode de miRNA du règlement10,11.
De nombreuses études ont été menées dans la dernière décennie se plonger dans le rôle de miARN, compte tenu de leur importance dans plusieurs fonctions biologiques12,13. Étant donné que les miARN agissent par appariement de bases avec homologue ARNm afin de marquer leur dégradation, analyse du profil de polysome est effectué et montré que les miARN se retrouvent en effet dans les fractions de polysome, ciblant pour la traduction des ARNm14, 15 , 16. miR-21 est un bon exemple où il est associé à une répression faible et faibles polysomes contraignant dans les cellules normales, tandis que dans les cellules cancéreuses, la liaison avec les polysomes est augmentée et l’effet répressif est beaucoup plus forte17.
Dans cette étude, l’analyse de PCR en temps réel a été fait en utilisant les valeurs de Ct de la miARN d’intérêt (MOI), les valeurs de Ct de l’épi-en miRNA (SCM) pour réduire les variations de la techniques et la valeur de Ct d’un gène de référence ou miRNA (REF), qui est stable dans les échantillons de contrôle. La première étape consistait à normaliser les valeurs de Ct de la MOI et la REF pour les valeurs de Ct de l’accord SMC. Puis, il y avait une deuxième normalisation étape du ministère de l’intérieur avec la REF et la valeur résultante a été utilisée pour calculer la formule 2-ΔCt . Ces valeurs ou pli-changement peut servir à démontrer les différences entre les groupes.
Depuis l’extraction des protéines est difficile à partir des fractions de polysome, la plupart des études effectuées jusqu'à présent, ont utilisé les fractions directement pour analyse par western blot. Ils ont simplement des sédiments la teneur en protéines de chaque fraction et la mélanger avec SDS-chargement de la mémoire tampon à utiliser pour l’analyse de SDS-PAGE8,18. Ici, nous avons développé une méthode qui nous permet non seulement des ARNm extrait et des miARN après fractionnement, mais aussi pour obtenir des peptides et des protéines avec une haute qualité de procéder à l’analyse par spectrométrie de masse.
Cette approche pourrait être élargie davantage en mesurant activement des protéines nouvellement synthétisées à l’aide de marquage métabolique comme l’homologue d’acides aminés établies, telles qu’azidohomoalanine (AHA) pour la méthionine19,20. AHA incorporation suivie de chimie de clic permet l’incorporation d’une balise de biotine suivie de streptavidine purification des protéines incorporé AHA. Cela permet une identification définitive des protéines nouvellement synthétisées — l’autre partie du protéome dynamique. Détection des miARN redistribuant parmi les fractions traduction et nontranslating en réponse à un stimulus (ici avec I / R) permet l’interrogation de la régulation dynamique de la traduction des protéines. Cependant, les facteurs qui recrutent des miARN au voisinage de l’ARNm de ribosomes liés restent à être identifiés et étudiés systématiquement.
Dans notre étude, en plus de précipitation de TCA, nous avons testé trois autres méthodes d’extraction protéique des fractions de polysome :21i) FASP (préparation de l’échantillon assistée par filtre), les précipitations de l’acétone ii) et précipitations iii) chloroforme/méthanol. L’adéquation des méthodes a été évaluée basé sur la capacité de traiter les fractions avec forte concentration de saccharose (jusqu'à 50 %) et le nombre de protéines identifiées par spectrométrie de masse (Figure 7 et tableau 3).
Pour la méthode de la FASP, nous avons suivi le protocole de préparation de l’échantillon donné par un Kit de Digestion de protéines FASP qui employait une unité d’ultrafiltration avec un seuil de masse moléculaire relative de 30 kDa. Cette unité de filtration servi comme un outil de suppression de détergent, change de tampon, digestion des protéines et élution de peptide avec la capacité de retenir les substances high-molecular-weight (protéines et l’ADN) qui seraient interférer avec la séparation ultérieure de peptide 21. en bref, l’échantillon a été mélangé contenant de l’urée de la mémoire tampon et chargés sur filtre Centre de spin avec filature étapes comme iodoacétamide solution, solution de trypsine et de la solution de chlorure de sodium (élution) ont été ajoutés par la suite. Filtrat final contenant des peptides digérées a été acidifié par l’AGT, dessalé et stocké pour analyse par spectrométrie de masse. En utilisant cette méthode, cependant, la majeure partie de saccharose précipité régulièrement accumulé sur le dessus du filtre, rendu la centrifugation et le lavage des étapes difficiles.
Des précipitations de l’acétone et précipitation de chloroforme/méthanol, plusieurs volumes de solvants étaient nécessaires à précipiter les protéines à partir d’un seul volume de l’échantillon. Cela limite la taille du volume de l’échantillon appliqué lorsque les précipitations a été réalisée en tubes de 1,5 mL (tubes de faible rétention protéique). Ainsi, la boue visqueuse de saccharose accumulé au fond des tubes après précipitation pour les deux méthodes et il n’y a aucun plomb visible dans le bas du tube et à l’interface liquide après précipitation de l’acétone et de chloroforme/méthanol précipitation, respectivement.
Tableau 3 et Figure 7 montrent la comparaison des quatre méthodes d’extraction de protéine que nous permet d’optimiser notre flux de travail expérimental. Les chiffres rouges rendues à chaque méthode (Figure 7) représentent le nombre de protéines qui ont été identifiés par spectrométrie de masse (voir Section 5.2 et 5.3). En dépit des volumes d’échantillon utilisées pour chaque méthode, chloroforme/méthanol et des précipitations de TCA a donné lieu au plus grand nombre de protéines identifiées. Toutefois, en raison des inconvénients susmentionnés (limitation du volume échantillon et précipitation de saccharose), nous avons opté pour précipitation de TCA pour expériences ultérieures.
Pour trouver les conditions optimales pour le traitement des échantillons, des précipitations de TCA a été menée à différentes températures et les concentrations de TCA22,23,24. Ainsi, nous avons effectué une précipitation avec 10,7 % TCA à 4 ° C et -20 ° C et plus loin a précipité les surnageants avec supplémentaire 60 µL de TCA (final 19,4 % TCA) après les boulettes ont été recueillis. Il en est résulté quatre boulettes qui ont été analysés séparés par spectrométrie de masse. En outre, nous avons répété le protocole entier deux fois pour s’assurer que les résultats obtenus étaient reproductibles. Le flux de travail et le nombre de protéines identifiées dans les boulettes dans les conditions les 4 ° C et -20 ° C avec deux expériences répétées sont indiquées dans la Figure 7 (chiffres en rouge). Bien que l’analyse des boulettes dérivé les surnageants a produit un nombre supplémentaire de protéines (85 et 60 à 4 ° C ; 81 et 55 à-20 ° C) ; une majorité des protéines ont été déjà identifiés dans les premières pastilles et ainsi, nous avons opté pour utiliser 10,7 % TCA pour toutes les expériences ultérieures. Bien que les précipitations de chloroforme/méthanol a abouti à un nombre similaire de protéines identifiées par rapport à la précipitation de TCA, nous avons préféré la précipitation de TCA en raison de plusieurs avantages : J’ai) petit volume de solvant nécessaire pour précipiter les protéines (60 µL de TCA vs 1,28 mL de chloroforme/méthanol/eau) permettant l’utilisation de plus gros volumes d’échantillon si nécessaire tandis qu’idéalement à l’aide de tubes de 1,5 mL pour les précipitations, ii) visibilité de la pastille au fond du tube et iii) aucune accumulation de saccharose au cours pas de précipitation.
Malgré offrant des informations fonctionnelles approfondies concernant l’État translationnelle, un inconvénient majeur de cette méthode est la nécessité d’une matière douce et grande. De nombreuses études ont essayé d’optimiser les conditions à l’aide de petit volume de cellules ou tissus ou ajouter des étapes pour augmenter l’efficacité de l’extraction de l’ARN et de protéines,25. Pourtant, tissus obtenus à partir des animaux différents dans les mêmes conditions expérimentales pourraient être ressaisis, si nécessaire.
En conclusion, ce protocole permet l’analyse simultanée des ARNm, miRNA et protéine de fractions obtenues à partir de polysome profilage pour étudier les mécanismes de régulation impliquées dans l’ischémie/reperfusion. Cependant, plus amples études sont nécessaires pour voir si les traduction ARNm sont induits après ischémie reperfusion et si ils se fermera après l’élimination du stress.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
NIH P01 HL112730 (RAG, JVE), NIH R01 HL132075 (RAG, JVE), centre du cœur féminin Barbra Streisand (RAG, JVE), Dorothy et E. Phillip Lyon chaise en cardiologie moléculaire (RAG), Erika Glazer doté de chaire en santé de la femme de cœur (JVE) et l’Académie tchèque des Sciences Appui institutionnel RVO : 68081715 (MS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pentobarbital | Vortech Phamaceuticals | 9373 | for euthansia |
| Heparin | Sagent | 103424 | used in langendorff preparation |
| forceps | Fine Science Tools | 91110-10 | used to hang the heart |
| Langendorff system | Radnoti + home made | n/a | A 'four heart' system consisting of custom blown glass, tubing and water baths |
| NaCl | Sigma | S7653-5KG | Krebs buffer and Sucrose gradient |
| KCl | Sigma | P5405 | Krebs buffer and Lysis buffer |
| KH2PO42 | Sigma | P-5504 | Krebs buffer |
| MgSO4 | Sigma | M7774-500G | Krebs buffer |
| Glucose | Sigma | G5767 | Krebs buffer |
| CaCl2 | Sigma | C1016-500G | Krebs buffer |
| Sucrose powder | Sigma | S0389-1KG | Sucrose gradient |
| MgCl2 | Sigma | 208337 | Sucrose gradient and Lysis buffer |
| Tris-base | Sigma | T1503-1KG | Sucrose gradient and Lysis buffer |
| Xylene Cyanole | Sigma | X-4126 | Sucrose gradient |
| Cycloheximide | Sigma-aldrich | 239763 | Sucrose gradient and Lysis buffer |
| RNaseOUT | Life Technologies | C00019 | RNAse inhibitor for Lysis buffer |
| Igepal CA-360 (NP40) | Sigma | I3021 | Lysis buffer |
| Protease Inhibitor Cocktail tablets, EDTA free | Roche | 5056489001 | |
| Tube, Thinwall, Ultra-Clear, 13.2 mL, 14 mm x 89 mm | Beckman Coulter | 344059 | |
| Ultracentrifuge | Beckman | LE-80K | Ultracentrifugation of the gradients |
| Rotor | Beckman | SW41 | Ultracentrifugation of the gradients |
| Biologic LP (pump) | Biorad | 731-8300 | Fractionation of the gradients |
| BioFrac | Biorad | 741-0002 | Fractionation of the gradients |
| Eppendorf RNA/DNA LoBind microcentrifuge tubes, 2 mL tube | Sigma | Z666513-100EA | Gradient fraction and RNA extraction |
| TRIzol Reagent | Life technologies | AM9738 | RNA extraction |
| Luciferase Control RNA | Promega | L4561 | RNA extraction |
| Chloroform | Fisher Scientific | C606-4 | RNA extraction |
| Glycogen, RNA grade | Thermo Fisher Scientific | R0551 | RNA extraction |
| Isopropanol | Sigma | I9516 | RNA extraction |
| Ethanol | Sigma | E7023-1L | RNA extraction |
| iScript cDNA Synthesis Kit | BioRad | 170-8891 | Reverse transcription |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | BioRad | 175-5122 | Quantative PCR |
| miRNeasy Micro Kit (50) | Qiagen | 217084 | Kit for total RNA isolation |
| miScript II RT Kit (50) | Qiagen | 218161 | Kit for miRNA reverse transcription |
| miScript Sybr Green PCR Kit (200) | Qiagen | 218073 | Kit for real-time PCR expression analysis of miRNAs |
| Centrifuge 5424R | Eppendorf | For centrifugation of 1.5 mL or 2.0 mL tubes at different temperatures. Max speed - 21130 x g | |
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | For real-time PCR plate centrifugation at different temperatures. Max speed - 2039 x g | |
| My Cycler Thermal Cycler | Bio-Rad | For reverse transcription | |
| CFX96 Real-Time System/C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | For real-time PCR analysis | |
| miRNeasy Serum/Plasma Spike-in Control | Qiagen | 219610 | For quality control of RNA isolation |
| Hard-Shell 96-Well PCR Plates, low profile, thin wall, skirted, green/clear | Bio-Rad | HSP9641 | For real-time PCR analysis |
| Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical | Bio-Rad | MSB1001 | For real-time PCR plate sealing |
| Research plus Single-Channel Pipette, Gray; 0.5-10 µL | Eppendorf | UX-24505-02 | For pipetting |
| PIPETMAN Classic Pipets, P20 | Gilson | F123600G | For pipetting |
| PIPETMAN Classic Pipets, P200 | Gilson | F144565 | For pipetting |
| Rainin L-1000XLS Pipet-Lite XLS LTS Pipette 100-1000 µL | Gilson | 17011782 | For pipetting |
| Glycogen, RNA grade | Thermo Fisher Scientific | R0551 | Improves total RNA isolation efficiency |
| Posi-Click 1.7 mL Tubes, natural color | Denville | C2170 | RNA isolation and storage; reagent mix |
| Thermal Cycling Tubes -0.2 mL Individual Caps, Standard 0.2 mL tubes with optically | Denville | C18098-4 (1000910) | Reverse transcription reaction |
| Sharp 10 Precision barrier Tips | Denville | P1096-FR | For pipetting |
| Sharp 20 Precision barrier Tips | Denville | P1121 | For pipetting |
| Sharp 200 Precision barrier Tips | Denville | P1122 | For pipetting |
| Tips LTS 1 mL Filter | Rainin | RT-L1000F | For pipetting |
| miScript Primer Assay (200) | Qiagen | (it changes according to the miRNA) | For real-time PCR analysis |
| Gradient Master ver 5.3 Model 108 | BioComp Instruments | For preparation of sucrose gradients | |
| trichloroacetic acid | Sigma Aldrich | T6399 | |
| acetone | Sigma Aldrich | 650501 | |
| Tris hydrochloride | Amresco | M108 | |
| dithiothreitol | Fisher Scientific | BP172 | |
| iodoacetamide | Gbiosciences | RC-150 | |
| sequencing grade modified trypsine, porcine | Promega | V5111 | |
| ammonium bicarbonate | BDH | BDH9206 | |
| formic acid, Optima LC/MS | Fisher Chemical | A117 | |
| methanol, Optima LC/MS | Fisher Chemical | A454 | |
| acetonitrile, Optima LC/MS | Fisher Chemical | A996 | |
| Protein LoBind tubes 0.5 mL | Eppendorf AG | 22431064 | |
| Protein LoBind tubes 1.5 mL | Eppendorf AG | 22431081 | |
| HLB µElution plate 30 µm | Oasis | 186001828BA | |
| SpeedVac concentrator | Thermo Scientific | Savant SPD2010 | |
| sonicator | Qsonica | Oasis180 | |
| centrifuge | Thermo Scientific | Sorvall Legend micro 21R | |
| LC trap column PepMap 100 C18 | Thermo Scientific | 160454 | |
| LC separation column PepMap RSLC C18 | Thermo Scientific | 164536 | |
| mass spectrometer | Thermo Scientific | Orbitrap Elite ion trap mass spectrometer | |
| MSConvert software | ProteoWizard Toolkit | ||
| Sorcerer-SEQUEST software | Sage-N Research, Inc. |
References
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